JPH02275359A

JPH02275359A - 腎疾患の診断方法、診断試薬およびキット

Info

Publication number: JPH02275359A
Application number: JP9645689A
Authority: JP
Inventors: Yukiya Koike; 小池　行也; Yataro Ichikawa; 市川　弥太郎
Original assignee: Teijin Ltd
Current assignee: Teijin Ltd
Priority date: 1989-04-18
Filing date: 1989-04-18
Publication date: 1990-11-09

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（ω　産業上の利用分野本発明は腎疾患の診断方法、診断試薬およびキットに関
するものである。更に詳しくはヒト尿中のヒト組織因子
を測定することによる腎疾患の診断方法、診断試薬およ
びキットに関するものである。

＋ｂ＋　　従来技術従来、腎疾患の診断方法としては、まずヒト尿中の総タ
ンパク量を測定し、タンパク量が高いものについて更に
検査を進めていく方法がとられている。しかしながら、
ヒト尿中の総タンパク量の測定は患者が採尿前に食べた
食物の影響を受けやすく、採尿時期を考慮しなければな
らなかった。

また、測定方法が煩雑であり、再現性が悪く、定性的で
あるという問題があった。更に、ヒト尿中の総タンパク
量の測定は腎疾患の診断のほか、肝疾患１発熱性疾患、
その他内臓全般の機能障害等の診断にも使われており、
より精度よく腎疾患の診断に用いることができる特徴的
かつ特異的なマ−カーを見つけることが必要とされてい
た。

（Ｃ）　　発明の目的そこで、本発明者らは、ヒト尿中のタンパク成分の中か
ら、特に腎組織の損傷の有効なマーカーとなりうる成分
について検討し、かつ操作が簡単で再現性のよい方法を
見い出すべり１２意研究を行った結果、ヒト尿中のヒト
組織因子を測定することにより、腎疾患の診断が可能で
あることを見い出し本発明に到達した。

（市　発明の構成すなわち、本発明はヒト尿中のヒト組織因子を測定する
ことによる腎疾患の診断方法、診断試薬およびキットで
ある。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において腎疾患とは、腎組織の損傷により、糸球
体組織障害を起こし、蛋白尿、血尿を発症させる疾患を
さす。一方、腎疾患の発症進展の機序に関しては、ｉｍ
ｍｕｎｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ　（Ｉ　Ｃ）が糸球体に沈着
することによって惹起される免疫反応が関与することが
知られていた。腎疾患としては今日数多くの疾患が知ら
れている。例えば、急速進行性腎炎、慢性腎炎、糸球体
腎炎、　Ｈｅｎｏｃｈ−３ｃｈ６ｎｌｅｉｎ紫斑病性腎
炎等の腎炎、腎不全、ネフローゼ症候群、ＩＩｊＡ腎症
等が挙げられる。これらのなかで本発明の方法は、腎不
全、ネフローゼ症候群、腎炎の診断に有利である。

本発明で用いられるヒト尿は、腎疾患の診断を行おうと
する人の体内にあるものを直接用いるのではなく、被検
試料として採取したものを使用する。

ヒト組織因子（Ｔ　１ｓｓｕｅ　Ｆ　ａｃｔｏｒ　）は
組織トロンボプラスチンとも呼ばれ、外因系凝固の開始
物質として重要な働きを示すことが知られている。

すなわち、第Ｖｌ因子と複合体を形成し、第Ｘ因子や第
１Ｘ囚子を活性化する物質である。ヒト組織因子は全身
諸臓器に存在するが、特に肺、脳、胎盤に多く、血管内
皮細胞も組織因子を産生ずることが知られている［Ｃｏ
１ｕｃｃｉ　　Ｍ、ｅｔ　　ａｌ：Ｊ。

ＣＩｉｎ、　　Ｉ　　ｎｖｅｓｔ、７１．　　１８９３
−１８９６　　（１９８３）　　参照　コ　。

１ｎｔａｃｔな細胞ではヒト組織因子は細胞膜中に表面
を覆われた状態で存在すると考えられ、特にガンなどに
おける組織・血管の損傷によって、細胞表面に組織因子
が露呈し、血管向凝固が起こり易くなる。またＴＮ　Ｆ
　（Ｔｕｍｏｒ　　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ　
）やＩ　Ｌ　（Ｉ　ｎｔｅｒ　　Ｌ　ｅｕｋｉｎ　）　
、サイト力イン類が、ある種の細胞を刺激して細胞表面
に組織因子活性が発現すると報告されている［Ｐ、Ｒ。

Ｃｏｎｋｌｉｎａ　、　Ｃ，Ｓ、　Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ
、　ａｎｄ　Ｊ　、　Ｂ　。

Ｗｅｉｎｂｅｒｕ　：　Ｂ　ｆｏｏｄ、　ｖｏｌ　７２
．　Ｎ（１１、１２８−１３３（１９８８）参照］。ヒ
ト組織因子あるいはヒト組織因子類似蛋白が血液中また
は尿中にも存在することが報告されている［８．　Ｋｕ
ｒｏｓａｗａ　ｅｔ　ａｌ　　；ＴＨＲＯＭＢＯ８Ｉｓ
　　ＲＥＳＥＡＲＣＩ−１３３゜５９５−６０６　（１
９８４）参照］。ヒト組織因子は脂質部分と蛋白部分〈
アポ蛋白）よりなる糖脂質蛋白であるが本発明において
、測定されるヒト組織因子は完全な型のヒト組織因子は
もちろん、ヒト組織因子と第■囚子との複合体、ヒト組
織因子アポ蛋白およびヒト組織因子の消化物あるいは分
解物受には、ヒト組織因子とＭＡ造が類似している物質
ら含められる。

腎組織は絶えず代謝と***が行われていることから何ら
かの疾患によって組織に損傷が与えられ、細胞表面に露
呈したヒト組織因子が細胞表面から分離し、尿中に遊離
していると考えられる。

本発明におけるヒト組織因子の測定方法としては特に限
定はないが、例えばサンドイツチ法による免疫学的測定
、方法、免疫沈降法、免疫拡散法、免疫電気泳電法等が
挙げられる。これらのなかでサンドイッチ法による免疫
学的測定方法が好ましい。具体的な測定方法としては本
発明者らによって既に提案されている方法（特願平１−
３６２２８号「ヒト組織因子の測定方法、試薬およびキ
ットＪ）が用いられる。これは、それぞれ異なる抗原決
定部位を認識する２種類の抗ヒト組織因子モノクローナ
ル抗体の一方を不溶性担体に結合して第１吹拭体とし、
他方を第２吹拭体として用いることを特徴とする方法で
ある。ここで、それぞれ異なる抗原決定部位を認識する
２種類の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体としては、
具体的には徴工研寄託番号ＦＦＲＭ　　ｒ’−１０５０
５（ＧＸ３を産生する＞、ｒ’ＥＲＭＰ−１０５０６（
ＧＸ４を産生する）。

ＦＥＲＭ　　Ｐ−１０５０７（ＥＸ６を産生ずる）のハ
イブリドーマ細胞が産生する抗体およびそれと同等の結
合特性を有する抗ヒト組織因子モノクローナル抗体であ
る。

次に該モノクローナル抗体を用いてヒト尿中のヒト組織
因子を検出し、腎疾患の診断を行う方法についで述べる
。

抗ヒト組織因子モノクローナル抗体の一方を吸りさせた
プレート、ビーズ等の不溶性担体をブ［Ｊッキング試薬
でブロッキングした。ここで用いる不溶性担体の材質は
免疫反応が行いうるもであれば、特に限定しない。また
ブロッキング試薬も生血清アルブミン（ＢＳＡ）の他に
、他の動物血清アルブミンあるいはゼラチン、スキムミ
ルク等も使用できる。

続いて、検量線作成の為、ヒト組織因子アポ蛋白を種々
の濃度になるように希釈し、添加した。

また、被検試料（ヒト尿）は適当な濃度に希釈し、添加
した。室温で一定時間、免疫反応後、Ｔｗｃｃｎ２０を
含む溶液で不溶性担体を洗浄した。次に標識化したもう
一方の抗ヒト組織因子モノクローナル抗体を添加し、室
温で一定時間反応後、洗浄し、基質溶液を加えて発色さ
けた。各検体について波長４１５ｒｖにおける吸光度を
測定した。ヒト組織因子アポ蛋白を用いて作成した検酊
線からヒト尿中のヒト組織因子の含酸を定量した。ヒト
尿中のヒト組織因子の含量表示は、尿１−当りの偵（μ
３／ｄ）、２４時間（１日）採取したヒト尿中の届（１
１ｇ／日）どちらでも良い。ここでヒト尿中のヒト組織
因子の債が尿１威当り５μｇ／ｄ以上、好ましくは１０
μｇ／ｄ以上であれば腎疾患であると診断され、２４時
間（１日）採取したヒト尿中のけが５η／日以上、好ま
しくは１０■／日以上であれば腎疾患であると診断され
る。

本発明における腎疾患の診断試薬は、それぞれ異なる抗
原決定部位を認識する２種類の抗ヒト組織因子モノクロ
ーナル抗体の一方を不溶性担体に結合した第１次抗体試
薬と他方の第２次抗体試薬とより主として構成される。

また、この試薬を能率よく且つ簡便に利用するために、
これら抗体以外に種々の補助剤を含めてキットを形成す
ることができる。かかる補助剤としては、例えば固体状
の試薬を溶解させるための溶解剤、不溶化担体を洗浄す
るために使用される洗浄剤、抗体の標識物質として酵素
を使用した場合、酵素活性を測定するための基質、その
反応停止剤イ１どの免疫学的測定試薬のキットとして通
常使用されるものが挙げられる。

〈０）　　発明の効果本発明によれば、ヒト尿中のヒト組織因子を測定するこ
とによって腎疾患の診断が可能となり、かつ、本発明に
よる診断方法は容易であり、また再現性も良く、有効な
ものである。

（ｆ）　　実施例以下、本発明について実施例を挙げて説明する。

実施例１モノクローナル抗体ＧＸ３を２０μｇ／ｍｅの濃度にな
るようにＰＢＳ（１０ｍＭリン酸緩衝液−〇、１５　Ｍ
　　Ｎａ　Ｃ１ｐｆ−１７，４＞　テ希釈し、？−１’
クロタイタープレートのウェルに１００ｕＵ加えて、晩
装置し、抗体を固相に吸着させた。１％１３ｓＡ（牛血
清アルブミン）を含むＰＢＳを１５０μＮ／ウェル加え
て室温で２時間放置した。続いて０．０５％ｌ”　ｗｃ
ｅｎ２０と０．１％ＢＳΔを含むＰＢＳ（洗浄用バッフ
ァー）で洗浄した。次にヒト胎盤由来組織因子アポ蛋白
を洗浄用バッファーで２５ｎｇ／ｒｄ、　５０ｎｇ／威
、　１１００ｎ／ｄの濃度になるように希釈し、またヒ
ト尿を８０倍および４０倍希釈して各々１００μｌ／ウ
エル加え、３７℃で１時間反応させた。３回洗浄用バッ
ファーで洗浄した復、パーオキシダーゼ標識化モノクロ
ーナル抗体ＧＸ４を洗浄用バッファーで３００ｎ（１／
ｄの′ａ度になるように希釈し、１００μす／ウェル加
え、３７℃で１時間反応させた。３回洗浄用バッファー
で洗浄した侵、基質溶液（ＡＢＴＳ）を１００μＵ／ウ
ェル加えて波長４１５ｎｍにおける吸光度を測定した。

図１にヒト胎盤由来組織因子アポ蛋白を用いて作成した
検量線を示した。じト組織囚子濶度（横軸）と吸光度＜
ｍ軸）とは直線関係にあり、この検量線を用いて溶液状
態（ヒト尿中）にあるヒト組織因子の定量が可能である
。

図２に、測定結果をまとめて示す。健常人のヒト尿中に
はヒト組織因子が２〜３μｇ／ｒｄの濃度ひ含まれてい
た。一方、腎不全、ネフローゼ症候群および各種腎炎を
伴なう患者のヒト尿中においては１０〜２５μｇ／ｒｒ
ｔｌとＵ常人に比べて顕著に高く検出、定量された。

【図面の簡単な説明】

図１はヒト組織因子測定用の検量線を示したものであり
、図２は各種腎疾患とヒト尿中のヒト組織因子含ｆｆ１
との関連をまとめたものである。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）ヒト尿中のヒト組織因子を測定することによる腎
疾患の診断方法。
（２）上記ヒト尿中のヒト組織因子の測定方法がサンド
イッチ法による免疫学的測定方法である請求項１記載の
方法。
（３）上記腎疾患が腎不全である請求項１記載の方法。
（４）上記腎疾患がネフローゼ症候群である請求項１記
載の方法。
（５）上記腎疾患が腎炎である請求項１記載の方法。
（６）２種類の抗ヒト組織因子抗体の一方を不溶性担体
に結合した第１次抗体試薬と、他方の第２次抗体試薬と
からなる腎疾患の診断試薬。
（７）請求項６記載の診断試薬を構成要素の一部とする
腎疾患の診断用キット。