JPH02265984A - 物質の貯蔵 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は物質の安定化および保存に関する。主として想
定している適用分野は、生化学的分野で用いられる物質
やある種の医薬品類である。

（従来の技術） ある種のタンパク質のような生物学的活性物質は、単離
、精製し次いて室温で溶液中に保σできるほどに充分な
安定性を示す。しかしながら、はとんどの物質について
は、これが不可能であり、安定／貯蔵化方法により精密
につくられた形態を用いねばならない。

レバードアー（ｒｅｏｐｅｒｔｏｉｒｅ）なる技術が知
られている。これらの全てが、貯蔵問題を引き起こして
いる物質全てに対し、有用なわけではない。

単離後の物質の水性＠濁液または水溶液に対し、適用さ
れる公知の貯蔵／安定化技術は、以下のとおりである。

■高濃度の化学的安定剤の、水溶液または水性懸副液へ
の添加 代表的には、３Ｍ［酸アンモニウムを用いる。

しかしながら、かかる添加物は、酵素を測定方法に用い
る場合、測定される酵素の活性を変化させ、不明瞭で誤
った結果を与えうる〔７−１エイチ・エム・ハートレイ
およびエフ・フランクス（Ｒ，Ｉｌ、Ｍ、ｌ１ａｔｌｅ
ｙ　　ａｎｄ　　Ｆ、Ｆｒａｎｋｓ）、２つの酵素ｈｔ
（における見掛は酵素活性の変化二本スキエノールビル
ヘート・カルボ゛Ａンラーゼおよび７レート・ジしドロ
ゲナーゼ、バイオチクノール・７ブを・バイオケム（［
３ｉｏＬｅｃｈｎｏ１．ａｐｐｌ、Ｂｉｏｃｈｍ）、１
１巻、３６３〜３７０頁（１９８９年）〕。マルチ・エ
ンザイム・アッセイに基づく診断用キットの製造では、
かかる添加物を、しばしば最終の配合前に除去せねばな
らない。透析によるかかる除去は、しばしば酵素の活性
を減少させる。

■凍結／融解方法 これは、通常添加物（以下、クリオプロテクタントと呼
ぶ）を混合した製品を、通常は一５０’Ｃ以下にて、し
ばしば液体窒素中で凍結、保存する。

全てのタンパク質が、凍結／融解サイクルの後に生存で
さるわけではない。

■冷却貯蔵法 これは、凍結点を貯蔵温度以下に下げて凍結を防止すべ
く、充分な濃度で存在するクリオプロテクタント添加物
（例えば、グリセリン）を用いている。例えば、制限エ
ンドヌクレアーゼの場合には、かかる酵素は、高濃度の
グリセリンの添加により＝２０℃に維持して、凍結に対
し保護仕ねばならない。高濃度の添加物の使用は、同時
に制限酵素の特異性を減じ、いわゆるスターアクティビ
ティ（ｓｔａｒａｃｔｉｖｉｔｙ）を生じさせる〔ビイ
・ポリス屓ら（Ｂ、Ｐ。

１ｉｓｋｙ　ｅｔ、ａｌ、）、ＰＮＡＳ　ＵＳＡ、７２
巻、３３１０頁（１９７５年）〕。

■凍結乾燥法 この方法は、単離タンパク質製品の最ら１１１通の安定
化法であるが、これは、凍結安定性の生成物に対しての
み適用することができる。適当なｐｌ（緩衝液中、クリ
オプロテクタントの存在下にて、活性物質の水性弔離物
を、まず代表的には−・１０〜−５０°Ｃで凍結し、次
いで水を真空下に−ζ低いサブゼロ温度で昇華させて除
去し、その後、乾燥製品の５０％に達する残留水分を脱
着により除去し、この間に温度が徐々に上昇する。完全
な凍結乾燥サイクル（よ、数日間かかり、資本およびエ
ネルギーの費用か大である。凍結乾燥は、また（１丁現
性が２仁いため、技術的に不１＋ｊな点をａしている。

凍結乾燥タンパク質生成物の供給者は、股的に室温より
も、むしろ−２０°Ｃでの保存を指定している。数日〜
数個間、室温に置くと、音しい活性の置火か生じる。

■過冷 これは、ヨー［翻ソバ特許０１３６０３０号ｊ；よびハ
ートレイら（ｌｌａｔｌｅｙ　ｅｔ、ａｌ、）の文献〔
プロ鯨・バイｔケム（Ｐｒｏｃｅｓｓ　　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、）２２’ＪＩ６９頁（１，９８７年）〕　ζこ記載
のように、添加物を必要とｔ！′−）Ｉこ、長期間（数
年）のタンパク質の安定化が可能である。しかしながら
、この方法は、前記したレバードアー法の可能性を拡大
しているらのの、適冷製品は、＋５℃を越えない温度で
輸送しなげればならず、また、好ましくは一２０℃で貯
蔵せねばならない。これらは、最終的用途のｉｉηに、
Ａｂ中水から回収Ｕ゛ねばならない。

以上の説明から明らかなように、現時点で行なわれてい
る低温貯蔵の必要性を回避するような、室温での貯蔵が
可能な貯蔵、／安定化法の出現が、待望されている。し
かし、これまで、室温での貯蔵は、多数の物質に関し、
不＋＋Ｊ能であった。

実在するレバードアー貯蔵／安定化法の利点に加え、あ
る種の打利な点を有する。なぜなら、ある種の実在する
方法は、その用途が限られ、まノ六その後の除去が困難
な安定化剤を混合せねばならないような、不利な点を受
は入れねばならないからである。

さらに、現在の凍結乾燥法よりらコストがかからない方
法を提供する点で、白（りである。

本発明者らによれば、驚くべきことに、単離後室温で溶
液中に保持すると不安定な物質を、水溶性または水膨潤
性物質から形成したガラス状物質に、組み込み、その後
回収しうろことに、成功したのである。ガラス状物質中
では、かかる物質は固定され、安定である。

（発明の概説） 本発明の第１の聾様によれば、アモルファス、ガラス状
またはやや好ましくないがゴム状の水溶性または水膨潤
性物質中に溶解された、貯蔵されるへき少なくとも１種
以上の物質、好ましくはタンパク質類、ペプチド類、ヌ
クレオチド類、ヌクレオチド類および酵素コファクター
類からなる群から選ばれる物質を含む貯蔵安定性組成物
を提供紺ろ。

以下に詳述するように、該組成物は、少なくとも２０°
Ｃ１好ましくは少なくとも３０℃のガラス転位点を示す
。

該組成物は、４　！ｌ’ｉ　ｊｉｉ％以ドの水分を含む
ことができる。

本発明は、単一の物質またはｔｌ］ＴＪｌ胃こ殆ど若し
くは全く作用しない物質の、昆合物に関４−る安定な貯
Ｗｌに使用することができる。

しかし、本発明の析規な知見によれば、！１１−組成物
は、反応系の一部または全部を形成する）９敗の物質を
含む。これらは、事実上竿−の化学物質とすることがで
きるのである。

本発明の付加的な態様によれば、貯蔵に適しノー物質の
製法を提供し、該製法は、該物質を、水溶性らしくは水
膨潤性物質またはそれらの溶液中に溶解し、次いで得ら
れた混合物をガラス状物質に形成することからなる。

本発明の方法は、いす゛れの非水性自機溶媒をら用いる
ことな〈実施することができ、該方法は、かかる溶媒が
多数の物質に有害であることが証明されているので、特
に￥ｆ伺である。また、有機溶媒で処理したり、該溶媒
を除去４−ろことは、環境的な理由から望ましくない。

付加的な特徴は該方法はエネルギー功率が良く、凍結乾
燥よりも必要なエネルギーが少ないことである。

（発明の詳説） 睨依ｔり質 貯蔵用に安定化される物質は、化学反応（これよ、反応
種の拡散に依ｒｔする）を、本質的に受けや４゛い、潜
在的に広範な任αの物質とすることができる。

本発明に適用される物質の１つのカテゴリーは、タンパ
ク質およびペプチドであり、糖タンパク質のよう／、ｊ
：それらの誘導体ら含まれる。かかるタンパク質および
ベブヂ）・は、任行の酵素、輸送タンパク質、例えばヘ
モグロビン、イムノグロブリノ、ホルモン、血液凝固因
子および薬理活性タンパク質またはベブヂトである。

本発明に適用される物質の別のカテゴリーは、ヌクレオ
ノド、ヌクレオチド、ノヌクレオチド、オリゴヌクレオ
チド（例えば、４つまでのヌクレオチドを含むしの）お
よび酵素コファクター類（これらは、ヌクレオチドであ
るか否かを問わない）である。本発明に〕内用されろ物
質は、一般に酵素物質である。

貯蔵／安定化用の物質は、天然源、動物、植物、菌類、
真菌類、細菌類から単離したもの、または人工的な培地
において発酵により増殖させた細胞によ２て生産したも
の、若しくはかかる細胞から単離したものとすることが
できる。かかる細胞は遺伝学的に形質転換したものまた
はそうではないものとすることができる。

該物質は、ガラス形成物質中への組み込みに使用しうる
ような希薄溶液を形成しうる程度まで、水溶液中に可溶
性なものとすべきである。

前記したように、本発明の新規な知見は、反応系の１以
上の成分をガラス中に保存することである。これは、例
えばアッセイや診断剤キットにおけるように、−緒に使
用することが必要な物質に対し、有用なものとすること
ができる。

物質を単一のガラス状製品として保存することにより、
該物質は、偶発的な使用に都合のよい形態を得ることが
できる。例えば、アッセイにおいて、所定の物質または
コファクターおよび酵素の組み合わせが必要な場合、２
つまたは３つ全てを、必要な濃度比でガラス中に保存す
ることができ、アッセイにすぐ使用できる。

多数の物質を保存する場合、これらは、水溶液中に一緒
に混合し、次いで一緒にガラス中に組み込むことができ
る。別法として、これら各々を、別々のガラス中に組み
込み、これらガラスを一緒に混合することができる。

多数の物質を単一の組成物（−緒に混合される２つのガ
ラスでもよい）として貯蔵する場合、１またはそれ以上
の物質は、タンパク質、ペプチド、ヌクレオシド、ヌク
レオチドまたは酵素コファクター類とすることができる
。また、該物質は単純な物質であるこら可能である。例
えば、標準的アッセイ法は、共存させねばならないピル
ビン酸塩またはエステルとＮＡＤＩＩが必要である。両
者とも、単独では許容可能な安定性でもって保存するこ
とができろ。しかしながら、これらは、−緒に水溶液中
に入れると、反応を開始する。これらは、−緒に必要な
割合でガラス状態中に入れれば、相互に反応せずに、ガ
ラス中に保存することができる。

ガラス形成物質 ガラスは、非常に高い粘度（即ち、少な（ともｌ　０１
３Ｐａ−ｓ、恐らくは１０１４Ｐａ−８またはそれ以上
）を有する適冷液体として定義される。

通常、ガラスは、外観上均一、透明な壊れやすい固体で
、粉末に粉砕または破砕することができろ。ガラスでは
、拡散過程は、例えば１年当たり敗ミクロンはどの非常
にゆっくりとした速度で生じる。したがって、！または
それ以上の反応基を宵する化学的または生化学的変化は
、実際上抑制される。

ガラス転位点Ｔｇとして知られている温度以」二では、
粘度が急に落下し、ガラスはゴム状になり、次いで変形
可能な可塑性となり、より高温では、液体になる。

本発明に使用されるガラス形成物質は、親水性、すわわ
ち水溶性または水膨潤性としなければならず、したがっ
て水は可塑剤として作用することができる。多数の親水
性物質、すわわちモノマー物質およびポリマー物質は、
両方とも、アモルファス高分子のガラス／ゴム転位特性
を示すようなアモルファス状態で存在するかまたはかか
る状態に変化ケることかできる。これらは、明確に定ま
るガラス転位点′Ｆｇを有し、Ｔｇは、ガラス形成物質
の分子量および分子の複雑さに依存する。Ｔｇは、希釈
剤の添加により下がる。水は、かかる親水性物質全てに
対し、音遍的な可塑剤である。そのため、ガラス／ゴム
転位点は、水または水溶液の添加により調節することが
できろ。

一般的には、本発明では、無水またはほぼ無水であるガ
ラス形成物質は、２０〜１５０℃、好ましくは２５〜７
０°Ｃ範囲のガラス転位点Ｔｇを示すことが必要である
。Ｔｇが、該範囲の上限近くであれば、低いＴｇは、水
の添加によって達成することができる、かかる水は、貯
蔵される物質をガラス中に組み込んだ後に、除去するこ
とができる。ガラス形成物質からなる混合物も、該成分
が固溶体として混和可能ならば、使用することができる
。かかる場合、低Ｔｇ物質は、高Ｔ圧質の可塑剤として
役立つ。

最終組成物のＴｇが充分に高げれば、室温で貯蔵するこ
とができる。しかし、該組成物のＴｇが室温付近または
室温以下であって長期間保存する場合、ガラス状組成物
の凍結が必要であるか、または望ましい。これは、あま
り都合よいものではないが、凍結乾燥よりも、より経済
的である。

該組成物は貯蔵中に７ｇ以上に加熱されると、そのゴム
状態に変化しうる。この条件でさえも、貯蔵物質は、長
期間安定である。その結果、例えば輸送の間のように、
限られた時間なら、貯蔵物質の温度が７ｇ以上になって
ら、全く存寄ではない。

組成物が７ｇ以上に保持され、そのためゴム状態になっ
た場合、貯蔵寿命は限られるが、未だ著しいしのであり
、本発明のｆす点は、減じられた限りにおいて、得るこ
とができる。

反対に、組成物のＴｇが室温よりもかなり高ければ、該
組成物は、高温、例えば熱帯地方での貯蔵に良好な耐性
を示すことができる。

前記したように、配合組成物のＴｇは、代表的には無水
ガラス形成物質のＴＥより０５°Ｃ低い。

ガラス形成物質は、その中に組み込まれるべき物質に対
し、充分に化学的に不活性なものとずべきである。しか
し、化学的反応性の絶対的な欠如は、化学反応による激
しい崩壊を伴うことなく該物質をガラスに組み込み貯蔵
し次いで該物質を回収することができる限り、必須では
ない。

多数の有機物質および物質混合物は、溶融体の冷却によ
り、ガラス状態を形成することができる。

炭水化物は、重要な群のガラス形成物質である。

ケなわち、キう・ンデイは、糖類、例えばブドウ糖やシ
ョ糖のガラス形態である。ブドウ糖、麦芽糖、マルトリ
オースのＴｇは、各々３１，４．３および７６°Ｃであ
る　〔エル・大レイドおよびエイチ・レビン（Ｌ、５ｌ
ａｄｅａｎｄ　ｌ目−６ｖｉ＋＋ｅ）、小さな炭水化物
−水分系の非平衡挙動、ビｘ７−・７ブルン・ケム（Ｐ
ｕｒｅ　　Ａｐｐｌ、Ｃｈｅｍ、）、６０巻、１８４１
頁、１９８８年〕。水分は、Ｔｇを下げ、これら炭水化
物ノこ関し、少肴の水分によるＴｇの低下は、添加水分
１％当たり、約６℃である。本発明考らの測定によれば
、ショ糖のＴｇ値は、５５℃であった。

そのままの炭水化物に加え、他のポリヒドロキン化合物
も使用することができ、例えば、ソルビトールのような
炭水化物誘導体や化学的変性炭水化物も使用することが
できる。

別の重要な部類のガラス形成物質は、水溶性または水膨
潤性合成ポリマー、例えばポリビニルピロリドン、ポリ
アクリルアミド、ポリエチレンイミンなどである。Ｔｇ
は、分子量の関数である。

これらの部類のガラス形成物質は、両方とｔ）本発明に
適している。

特に使用することができるガラス形成物質の１群は、米
国特許第３３００４７４号記載の市販の糖コポリマー類
（ファラマシア、商標名ｉ″′′フイコールｉｃｏｌ　
１）Ｊ）である。この米国特許は、該物質は、分子ｆｆ
１５０００−１００００００−７？、：Ｌ　−７−Ｊｌ
／　栗橋を介し２官能基に結合されたシａ糖残１ｋを含
有する旨、開示する。かかる基は、炭素数２．３または
それ以上、とくに炭素数１０以上のアルキレンとするこ
とができろ。２官能基は、糖残基を相互に結合させるの
に役立つ。これらのポリマー類は、糖をハロヒドリンま
たはビス−エポキシ化合物と反応させることで、製造す
ることかできる。

本発明に従い、物質の貯蔵安定化法の１つの方法は、物
質（以後、活性物質と呼ぶ）の水溶液から出発し、次い
でそれを組み込む物質を供給するが、この物質は、すで
にアモルファス状態で、ガラス状またはゴム状である。

次いで、所定量の該活性物質含有水溶液を、ガラス状物
質内に、組み込み、ゴム状に変形する。

これらの物質を混合して、活性物質を含むガラス形成物
質を均一にする。ゴム形態は、ドウのコンシスチンシー
を有し、ロールまたはミルにより薄層シートに成形する
ことができる。次いでこのゴムを、場合により穏やかに
加熱しながら、減圧させて、添加した水分のほとんどを
除去する。最終生成物は、純粋なガラス形成物質よりも
わずかに低い、例えば約５℃低いガラス転位点のガラス
である。該生成物は、透明なフィルムの形態にするか、
または粉砕して微粉末とするか、または錠剤形に打錠す
ることができる。１ｇ以下のガラス状聾では、いかなる
メカニズムによる該活性物質の崩壊でも、実際上の時間
スケールに関し、遊離の状態では著しく不安定な物質で
さえも長い製品寿命が得られる程度に、遅延させること
ができる。

完全な生化学的活性は、１ｇ以下の温度でこの期間の間
中、維持、固定されるが、該ガラスを水性媒体中に再溶
解させることで、急速に解放させることができる。

ガラス形成物質およびそこに添加される溶液の量は、該
添加物から得られるゴム物質がそのＴｇ以上の温度とな
るように（または別の言い方によれば、そのＴｇが室温
以下となるように）、選択されるが、水分が除去される
につれて、Ｔｇの値は、室温以上に増加する。

好ましくは、出発物質はまた室温よりも高い′ｒｇを有
し、したがって水溶液の添加によるガラス転位点の低下
は、この値を室温以上からそれ以下に低下させる。しか
し、ガラス転位点がすでに室温以下の水分含有物質を用
いて開始させ、組み込まれるべき物質の水溶液の添加に
より該ガラス転位点をさらに低下させ、最終的には、乾
燥により、該ガラス転位点を室温以上に上昇させること
ができるものと思われる。

添加によりゴム状ドウを形成しうる水溶液の量は、試行
錯誤により決定した。それは、ガラス形成物質に基づき
５重量％以下のようである。ゴム状ドウを形成するため
の溶液添加工程およびこれをガラス状態に戻すための乾
燥工程を繰り返して、該ガラス中の活性物質の濃度を徐
々に増加させることができる。

所望により、ガラス形成物質の試料の、ガラス転位点を
測定し、次いで種々の量の水の混合後に再び測定するこ
とができる、これにより、水分含量に対するガラス転位
点のグラフをプロットすることができる。

ガラス転位点の値は、示差走査熱分析器で測定すること
ができ、温度に対する熱人力のプロットが、第１温度誘
導の最大値を与える変曲点を通過するポイントとして検
出することができる。

水分のゴム状ドウからの除去を促進するのに適用される
真空は、特に激しいものである必要はない。好ましくは
、それは、標準空気圧の９０％以下である。標準空気圧
の８０％の圧力で充分であることか、判明した。しかし
、より激しい真空でも、これが都合よければ、使用する
ことができる。

水分を除去するためのドウ混合物の加熱は、８０℃を越
えない温度とすることができる、タンパク質については
、好ましくは、６０℃を越えない。

加熱は、必要でないものとすることができ、例えば、約
２０℃の室温でら減圧下で水分の蒸発を行って水分含量
を充分に低下させることができるが、もちろん、加熱は
蒸発を促進させる。

本発明の物質の貯蔵／安定化方法の別法は、物質を、担
体物質に関しより高い活性物質濃度で貯蔵、回収するこ
とができる。この方法では、所定量の担体物質またはそ
の溶液を活性物質の溶液に添加する。添加した担体物質
が完全に溶解すると、該溶液を適当な部分、例えば０　
、１−１　ｒｔｔＱに分けることかできる。溶液の試料
を減圧下に置き、これにより水分をそこから、該担体物
質がガラス状聾になるまで蒸発させる。代表的な条件は
、４０°Ｃを越えない温度、好ましくは２０〜３０℃で
蒸発を開始し、数時間、例えば２４〜３６時間続ける。

蒸発を続けるにつれて、残りの物質のガラス転位点は、
上昇する。」二足した期間での蒸発は、３０℃を越える
ガラス転位点を達成するのに充分である。−旦、このよ
うな充分に高いガラス転位点を達成すれば、蒸発を続け
る間に温度は上昇する。例えば、−旦、ガラス転位点が
、３０℃のレベルに達すれば、その温度は、４０〜７０
℃の範囲内に、例えば６０℃まで、２時間のような短い
時間で上昇する。この方法についてら、水分の蒸発に用
いられる真空は、特に激しいものである必要はない。加
熱することなく長時間蒸発させれば、充分に低い水分含
量を達成することができる。

前記したように、担体物質は、乾燥状態、例えば粉末ま
たは溶液として添加することができる。

貯蔵物質の回収（即ち、再活性化）は、水または水溶液
をその中に活性物質を含む所定量のガラスに単に添加す
ることで、行うことかでΔる。担体物質が水溶性である
場合、得られるものは、物質および担体物質の溶液であ
る。

クロマトグラフィにより貯蔵、活性物質をガラス形成物
質から単離することもできる。しかしながら、一般に、
これは、望ましくなく、また不要である。その代わり、
ガラス形成物質は、貯蔵、活性物質の使用（例えば、ア
ッセイ）に影響を及ぼさないように、選択される。

水膨潤性ガラス形成物質の場合、該物質は、溶液外に、
恐らくはゲルとして残り、該物質の溶液は、要すれば遠
心分離により分離することができる。

所定のガラス形成物質の安定性およびその中に物質を組
み込むだめの条件は、両者とら、組み込んだ物質を含む
ガラスを製造し次いで組み込んだ物質を実質的な貯蔵期
間なしに回収することで、調べることができる。

所望により、貯蔵安定性を、３５°Ｃまたは５０℃のよ
うな高温で貯蔵することからなる促進テストにより、テ
ストすることができる。

（実施例） っぎに、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明する
が、これらに限定されるものではない。

以下の実施例によれば、実施例１〜４は、前記の第１方
法を説明するが、これは、活性物質を含む溶液をガラス
状担体物質中に組み込み、これを−時的にゴム状態に変
換させることからなる。さらに、実施例５は、前記した
第２方法を示すしので、これは、担体物質を活性物質の
溶液に添加し、次いで得られた溶液をガラス状態に蒸発
させることからなる。

いくつかの実施例ごは、物質を室温以上の温度で貯蔵し
て、貯蔵寿命の促進テストを行った。

実施例Ｉおよび２は、ＮＡＤＨおよびピルベートの組み
合わせを用いて分析される、ラクテート・デヒドロゲナ
ーゼ（ＬＤＩＩ８乳酸脱水素酵素）の貯蔵を記載する。

実施例４は、ＮＡＤＨとピルベートからなる不安定な、
混合物の貯蔵を示す。これは、Ｌ　Ｄ　Ｈ分析の実施に
使用されるのに適した物質が得られるが、実施例４では
、かかる分析法を用いて、貯蔵後のＮ　、Ａ　Ｄ　＋−
１／ピルベートの活性を確認した。

実施例３は、制限酵素の貯蔵を開示し、貯蔵した酵素の
活性は、ＤＮＡに対する作用が変化しないことを調べる
ことで、確認した。

害施例１ 用いたガラス形成物質は、フィコール４００１）ｒ、（
ファラマシア、登録商標）で、これは、ショ糖とエビク
ロロヒドリンのコポリマーである。これは、水溶性で、
ガラス転位点はり７°Ｃである。

フィコール４ｇを、乾燥ユニバーサル・チューブに秤量
した（Ｗｓ）。約５０％を乾燥乳鉢に入れ、０．０１Ｍ
リン酸塩緩衝液（ρＩ−１７、０）中ｌ０００単位／ｌ
ラクテート・デヒドロゲナーゼｉ、　Ｄ　！４　（例え
ば、ウサギの筋肉）含有溶液０，２村を添ｊノｉ＋　ｌ
、、該フィコール中に充分に混合した。次いで、ＬＤ■
１溶液０　、２　ｙ（ｌを該混合物中に添加した。受端
のフィコールを、ｉ譜られるドウが乳棒に付着し、なく
なるまで、添加した。得られたドウをタイル上に押し広
げ、約１　悶厚のンートを得た。これをタイルからナイ
フで分離し、該タイル１−にそっと乗せ、次いでオーブ
ンにより３０分間、４５〜５０℃で加熱した。シートを
オーブンから取り出し、自由流動性の微粉末に粉砕し、
これをシールチューブに保存した。未使用のフィコール
を秤量した（Ｗｅ）。

ＬＤＨ含有粉末を、温度が２０〜３５℃の間で変化する
実験室で、貯蔵した。

該粉末のＬ　Ｄ　Ｈ活性は、ＬＤＨ活性の損失が全くな
かったとすれば、以下の式で得られる。

ＬＤＨ活性（単位／９）＝約０　、４　Ｘ　Ｉ　／　（
Ｗｓ　−Ｗｅ）式中、■は、溶液中のＬＤＨの初期濃度
（単位／村）を意味する。

該粉末の実際のＬＤＨ活性を測定した。該粉末がわずか
な水分を含むと仮定し、該粉末をリン酸塩緩衝液（０，
０１Ｍ５ｐＨ７）中に溶解して、当初の溶液のｌ／１０
００の希釈として算出されるテスト溶液を得た。これは
、酵素活性が完全に保持されるとすると、１Ｉ１１２当
たりＬＤＨＩ単位を含む。

その実際の活性は、以下の方法で測定した〔ハートレイ
、フランクおよびマチアス、プロセス・バイオケミスト
リイ（Ｈａｔｌｅｙ、Ｆｒａｎｋｓ　ａｎｄ　Ｍａｔｈ
ｉａｓ、Ｐｒｏｃｅｓｓ　ＢｉｏｃｈｅＩＩｌｉｓｔｒ
ｙ）、１９８７年１２月、１７０頁〕。

０．０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）２．７村、２肩９
／村ＮＡＤＨＯ，Ｉ、ｍ１７２および１０ｘＭピルベー
ト０　、　ｌ　ｗＱを路長１０ｘｙｔのクベットに入れ
た。クベットに蓋をかぶせ、振とうした。テスト溶液０
．１ｊｌＱを添加して、再び蓋をかぶせ、振とうした。

３４０ｎ−の吸光度を３０秒間隔で、合計３分間記録し
た。溶液の温度も記録した。時間に関し、吸光度変化が
直線である期間を選び、１分間当たりの吸光度変化、Δ
Ａを算出した。酵素活性は以下のように算出した。

ＬＤＨ活性（単位／１ｊＩ９）＝ΔＡＸＴＣＦ／８．２
５ＸＣΔＡ＝３４０ｎｍにおける１分間当たりの吸光度
変化 ６．２５＝ＮＡＤＨのモル吸光度の補正ファクター ＴＣＰ＝２５℃以外の温度で行ったアッセイについて適
用せねばならない温度補正ファクターＣ−タンパク質の
濃度（ｍ９／ｘｉ２）ＬＤＨ活性の損失は、５ケ月後、
全く検出できなかった。

生成物の安定性を２．１Ｍ硫酸アンモニウム中の市販の
ＬＤＨ製品（タイプ■、ｔｏｏｏｏ単位／ＩＩＱ、例え
ばシグマ）と比較すべく、この製品を２５℃で保存し、
前記した方法で分析した。この市販の製品の活性は、最
初の４５日間にわたり、１日当たり平均１．２％減少し
た。

実施例２ 所定量のショ糖を、ホットプレート上に、乾燥下、無酸
素条件で穏やかに加熱溶融させた。（乾燥窒素を用いた
。）ショ糖を冷却して、透明なガラスを得、次いで、引
き続き乾燥雰囲気下にて微粉末に粉砕し、ふた付きチュ
ーブに保存した。０゜０１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）
中、４０００単位／Ｒ（ｌ含有ＬＤＨ溶液０　、４　ｚ
（ｌをシＢ糖ガラ７、４９１ニー添加し、乳鉢および乳
棒を用いて混合した。得られたペーストをタイル上に押
し広げ、薄膜シートを得、これを分離し、該タイル上に
そっと乗せた。

次いでこれをオーブンにより３０分間、４５〜５０℃で
加熱し、その後、これを冷却した。これを自由流動性の
微粉末に粉砕した。全ての操作は水分の排除条件下で行
った。粉末を気密ストッパー付きチューブに２５℃で保
存した。該粉末のＬＤＨ活性は、活性の損失が全くない
とすると、以下の式で得られる。

ＬＤＨ活性（単位／固体生成物１ｇ）・約０．ＩＸＩ■
は、ガラスの製造に用いた溶液中の初期のしＤＨ活性（
単位／籾）である。

生成物を実施例１と同様に、Ｌ　Ｄ　Ｈ活性について定
期的に分析した。活性の損失は、２５℃の１ケ月の保存
後でも、全く検出されなかった。

該生成物のガラス転位点は、示差走査熱分析器により、
３２℃として測定された。

実施例３ フィコール４００（１９）に、５０％水性グリセリン中
ＥｃｏＲＥ制限エンドヌクレアーゼの溶液１００μｇを
添加し、ガラスを実施例！と同様に製造した。最終生成
物をＩＯ日日間実験室において２０℃と３０℃の間で変
動する温度で保存した。

酵素２単位と等価の所定量の生成物（酵素の活性は完全
に活性であると仮定）を、以下の緩衝液に溶解した。

１００ｍＭ）リス−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭ
ｇｃｌ＊、５０ｍＭＮａｃ１，０．１ｙｒ９／ｚＱウシ
血清アルブミン。酵素活性の分析は、以下の方法で行っ
た（これは、　ＬＫＢラボラトリイ・７ニエ７＆：ＬＫ
Ｂミニ本７−・サブマリン・エレクトロネレシス・］ニ
ニットＬＫＢ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　　Ｍａｎｕａ
ｌ；　　ＬＫＢ　　２０１３Ｍ１ｎｉｐｈｏｒ　Ｓｕｂ
ｍａｒｉｎｅ　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓυｎ１
ｔ）　ｔ９８５年、６章から採用）。溶液をλ−ＤＮＡ
１μ９と３７℃で１時間インキュベートした。次いで、
インキュベート混合物の電気永動を、トリス／ボレート
緩衝液中０．５％寒天ゲル上にて標準法で行った。ゲル
上で観察されたＤＮＡの破断帯は、新鮮な酵素溶液での
対照実験のものと、正確に対応した。

実施例４ １００肩ｇ／ｘ（ｌＮ　Ａ　Ｄ　ｌ−１および３３Ｍ９
／肩Ｑピルベート含有溶液を調製した。この溶液０．４
ｔｌ（ｌをショ糖ガラス４ｇに添加し、混合物を実施例
２と同様に処理した。混合物ガラスを２０ｍｇの量でス
ペクトロホトメーター・クベット中に保存し、これをシ
ーリングフィルムで密封し、温度が２０〜３０°Ｃで変
動する実験室に放置した。ガラスを１４日間保存した。

分析のために、クベットの内容物を０．０１Ｍリン酸塩
緩衝液（ｐｉ−１７，０）２．７ｘＱに溶解し、１単位
／ｊｌＲ含有Ｌ　Ｄ　Ｈ溶液０　、　Ｉ　ｘ（ｌを添加
した。３４０ｎｍの吸光度を３０秒間隔で、合計３分間
記録し、溶液の温度を測定した。見掛けＬ　Ｉ）　Ｈ酵
素活性は、時間に関し吸光度変化が直線的である期間か
ら決定した。活性は、実施例１と同様に算出した。対照
の分析は、Ｎ　Ａ、　Ｄ　Ｉ−ｉおよびピルベートの新
鮮な溶液で実施した。溶解ガラスを用いて得られた見掛
は活性は、対照値と緊密に整合した。

実施例４− 活性物質は、グルタメート・デヒドロゲナーゼである。

実施例１に用いたようなフィコール４００ＤＬ５３２ｇ
９を、１３　、３　ｙ、９／ｘ（ｌタンパク質含有グル
タメート・デヒドロゲナーゼ溶Ｋ　２０　ｚＱに添加し
た。したがって、タンパク質：フィコールの比率は、ｌ
：２である。次いで、試料を８０の部分０．２５ｍ（に
分け、３７℃にて減圧下（大気圧の８０％）で、２４時
間乾燥させた。試料を４０バイアルの２つのバッチに分
けた。一方のバッチを減圧下でさらに２時間、６０℃で
加熱した。該バッチをさらに細かく分け、以下の条件下
で保存した。バイアルを定期的に、５０ｍＭトリス／Ｈ
引緩衝液（ｐＨ７，５Ｘ０．３＋ｎＭＥＤＴＡ含有）添
加により再水和して、Ｉｘａ当たり１００単位の酵素を
含む溶液（活性の損失は無かったと仮定）を得た。これ
を、同様な緩衝液で連続的にｌ単位／耐に希釈した。回
収した酵素の実際の活性を測定した。回収酵素の分析方
法に用いた溶液は次の通りである。

溶液 （１）５０ｍＭトリス／ＩＩＣＱ　ｐＨ７，５＋０．３
ｍＭＤＴＡ （２）溶液！中４．５次ｇ／ｚＱ、　Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｈ（
３）ＨｔＯ２５ｘＱ中ＮＨ，ＣＣ４，０１２５９（４）
溶液！（５０次１２）中α−ケ（・ゲルタレ−）・にナ
トリウム塩）９７ｒ７ 溶液４．　（２、６ｉｃ）の分析を行うために、溶液３
（０，２ｉσ）および溶液２（０，Ｉｙ□を３πＱのク
ベットに混合した。回収酵素溶液０．ｆｆσを加えた。

３４０ｒｖの吸光度を５分間にわたり観察し、酵素の活
性を５分間の吸光度変化（ΔＡ）から産出した。

活性は以下の式を用いて計算した。

活性（単位／ｘＱ＞−Δ、ＡＸ３１５Ｘ０．６２２得ら
れた結果を以下の第１表に示した。該表において初期活
性は最少の貯蔵期間のみののちに回収した酵素の活性を
示す。活性は、これが完全に保持されたしのと仮定した
場合の活性の理論値の割合を示す。所定量の市販の凍結
乾燥グルタメート・デヒドロゲナーゼ（凍結乾燥前のそ
の活性は供給者によって示されたものである）をいくつ
かの部分にわけ、種々の期間２５℃で保存し、同様な方
法で分析した。また、その活性を理論的活性の割合とし
て示した。この物質の結果は以下の第１表に含まれる。

第１表 ３７℃　室温　９７％　　９５％　　９９％　　　９８
％　　１１８３７℃　３５℃　９７％　　７８％　　　
８２％　　　　８７％　８４％３７℃　２５℃　１３０
５１２２％　１２１％　　８３％　６９％　　　　７４
％６０℃　室温１０３％　１０９％　９６％　　　８５
％　９８％　９７％６０℃　３５℃　１０３％　１０２
％　１０５％　　　　９６％１１６％６０℃　２５℃　
１２１％　１１４％　１２５％　８４％　８１％　　　
　８９％これらの結果かられかるように、実験的誤差が
いくつかの形態での変形例について生じたが、それにも
かかわらず、これらの結果は、長期間の貯蔵に対し著し
く長い活性の保持を示し、かつ凍結乾燥物質よりも非常
に良好な活性の保持を示した。

実施例６ アスコルベート・オシキダーゼ（タンパク質２１．２５
１９）溶液２．５０１１２を調製した。これに、フィコ
ール４．００（２１，，２５ｊ！９）含有トリス緩衝液
（ｐＨ７，６）２．５０好（タンパク質：フィコールの
重量比＝１：Ｉ）を加えた。これを１０個の０５Ｒｆｆ
部分にわけ、３７℃にて大気圧の約８０％の減圧下で２
４時間乾燥した。次に試料を、引き続き減圧下でさらに
２時間６０℃にて加熱した。貯蔵は実験室の棚で行った
（１７℃と２８°Ｃの間で変動する温度）。種々の貯蔵
期間を、試料を、０゜５％ウシ血血清アルミミノ含有０
．４ＭＮａ、ＨＰＯ４２、５ｙ＋Ｑの添加により、再水
和した。次いでこれを、多数の同じ溶液に連続的に希釈
すると、その活性は、完全に保持されると仮定すると０
．２単位／ｄであると分析された。出発時の値に対する
活性を測定した。

分析は、ボエリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｒ　ｉ　ｎ
ｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｅｍ）により記載された標準的分
析法を用いて行−〕た。該分析は、該酵素が既知のアス
コルビン酸溶液の酸化を触媒することによる、２４５ｎ
ｌ！１の吸光度の減少をモニターした。２力月間、３５
℃で貯蔵した酵素は、実験誤差範囲内において、ごく短
期間のみ貯蔵した酵素と同じ活性をＹＴすることが判明
した。

実施例７ ラクテート・デヒドロゲナーゼをフィコール４００中に
、実施例５の方法を用いて組み込んだ。

フィコール：酵素の比率は０．２３＋０．２６であった
。試料を種々の期間保存し、次いで、理論活性１単位／
ｘｄ（活性は完全に保持されると仮定）が得られる所定
量の０．０１Ｍリン酸塩緩衝液の添加により、回収した
。回収した溶液を、実施例１に示した方法を用い、分析
した。回収物質の活性測定値を、理論活性の割合とし、
て以下の第２表に示す。

第２表 貯蔵期間　（ｉコ） 乾燥面　Ｉ　　　１４　　２１．　　２８　　３５　　
１８０１００％　　　９１％　　８１％　　９１％　　
１１２％　　９７％　　９８％実施例８ シトクロムＣレダクターゼをフィコール４００中に、実
施例５の方法により組み込んだ。酵素：フィコールの比
率は１＋Ｉであった。試料を促進テスト（１４日間、３
５℃で貯蔵）に付し、次いで、０　、２　Ｍ　Ｋ　ＨＣ
Ｏｓ　４　Ｉｌｌ！の添加により回収し、理論活性値０
．８７噂位／ｊｌｃ（完全な活性保持と仮定）を有する
溶液を得た。回収物質を、メソッド・イン・エンザイモ
ロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
）Ｃメーラー（Ｍａｈｌｅｒ）、２巻、１９５５年、６
８８頁〕に記載の方法を用い、分析した。回収物質の活
性は、理論値の８８％であることが判明した。

実施例９゜ グリセロール−３−ホスフェート・デヒドロゲナーゼを
フィコール４００中に、前記実施例の方法により組み込
んだ。酵素：フィコールの比率はｌ：２であった。試料
を促進テスト（３５℃で貯蔵）に付した。７日間の貯蔵
後、該物質を０．０５Ｍ）リス／ＨＣＩ緩衝液（ｐ）１
７．６）の添加により回収した。これは、また２１９／
ｘＱアルブミンおよび０７４　ｙ９／ｘＱ、Ｅ　Ｄ　Ｔ
　Ａを含有する。回収物質をバイオジム・ラボラトリイ
（Ｂｉｏｚｙｍｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により
開示の方法により分析した。該酵素は以下の反応を触媒
する。

ノヒド［Ｉ今ン７セトン・本スフｚ−）　　　−◆グリ
セ叶ルー３−本ス７エート＋ＮＡＤＨ＋ＮＡＤ またＮ　Ａ　Ｄ　１１の酸化を分光光度計により、３４
０ｒ＋＋ｓでモニターした。

３５°Ｃで７日間の貯蔵後、活性は、フィコール中に組
み込んだのも直ちに再水和した対照試料活性の９６％で
あることが判明した。

実施例１Ｏ α−グルコシダーゼをフィコール４００中に、実施例５
の方法を用い、組み込んだ。フィコール酵素の比率はｌ
：１であった。促進テストとじて、試料を種々の期間、
３５℃で保存し、次いで、００６７Ｍリン酸塩緩衝液（
ｐｉ−（７、０）４　ｍＱの添加により回収すると、そ
の理論活性値が２単位／２Ｑ＜完全な活性保持と仮定）
の溶液を得た。回収溶液をエイヂ・ハルボーソン、メソ
ッド・イン・エンザイモロジイ（Ｉｌ、Ｈａｌｖｏｒｏ
ｓｎ、ＭｅＬｌｌｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
。

８巻５５９頁、１９６６年）記載の方法により分析した
。理論値に対する回収物質の実際の活性を以下の第：３
表に示す。

第３表 １００％　　　　１．００％　　　１０３％　　　　９
５％　　　　７０％Ｘ胤帆１１．− ピルベート：フィコール４００（５ｇ）をｌＯ内Ｍピル
ビン酸大トリウム溶液２０村に添加した、１ついで、溶
液を４０の部分に分（Ｊた。各々は、０２５１Ｑを含有
し、これらを実施例５記載の方法で処理ｌ、て、ガラス
を得た。

Ｎ　Ａ　Ｄ　Ｉ（：フイコール４００（５９）を２０＋
ｇの２ｍ９　／　ｘ（ｌ　Ｎ　Ａ　Ｄ　１４溶液に添加
した。これを４０の部分に分けた。各々は、０．２５＋
（を含有し、これらを実施例５記載の方法で処理してガ
ラスを得た。

貯蔵後、時々、各試薬の１つの試料を再水和し、溶液を
混合した。これらを、実施例４記載の標準法により分析
した。室温で３箇月の貯蔵後、ＬＤＨアッセイで反応す
るためのその活性は、初期貯蔵で得られた対照の値の１
００％であった。

実施例１２ ＮＡＤＨおよびピルベートを実施例１１と同様に処理し
た。得られた各ガラス粉末部分を一緒に混合した。１つ
のかかる混合物を直ちに再水和し、実施例４の方法で分
析した。反応混合物は、２８ｘ（ｌの０．０１Ｍリン酸
塩緩衝液、０，１πＱの再水和ＮＡＤＨ／ピルベート混
合物、および０．ＩＲρのｌ単位／Ｒり酵素溶液を含む
。３分間にわたろ３４０ｎｆｆｌにおける吸光度の変化
は１００％であった。

さらに、混合物を１週間貯蔵し、次いで同様な方法で再
水和し、分析した。実験誤差の範囲内では、その活性は
、同じであった。したがって、貯蔵の間、ＮＡＤとピル
ベートは全く反応しなかった。

実施例１３ 担体物質の範囲は、貯蔵活性物質がラクテート・デヒド
ロゲナーゼである標準法で使用したものである。各々に
おいて、０．０１Ｍリン酸塩緩衝液１００＋Ｑ中に溶解
した担体０．０５９を含む溶液を調製した。次いで、Ｉ
　Ｏｙｒｇ／ｘＱラクテート・デヒドロゲナーゼ溶液１
ｘＣを該調製溶液２０ｉθに添加した。得られた溶液を
ガラスバイアル中に０゜５ｄのアリコートに分けた。こ
れらを大気圧の約８０％の減圧下に、真空オーブンで３
６℃で２４時間乾燥した。乾燥後、バイアルをシールし
、室温で貯蔵した。生成物は担体：タンパク質の重量比
がＩ：０．２２であった。

いくつかの試料をリン酸塩緩衝液の添加により直ちに再
水和した。他のものは、種々の期間貯蔵し、次いで再水
和した。実施例１と同様に、酵素の活性を測定した。酵
素の活性は、乾燥後最初の１週間で再水和した酵素の活
性に対する活性として、示した。結果を以下の第４表に
示す。該表において、 ＰＶＰは、ポリビニルピロリドン、 ＧＰＳは、６−０−α−Ｄ−グルコピラノシルーＤ−ソ
ルビトール、 パラニチットは、シューズッケル・アクチェンゲゼルシ
ャフ　ト　〔マンハイムーオＡセンフルト（Ｓｕａｚｕ
ｃｋｅｒ　　ＡｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔＳ
Ｍａｎｎｈｅｉｍ−Ｏｃｈｓｅｎｆｕｒｔ）、トイ７〕
の製品で、α−Ｄ−グルコピラノシルー１．６−マンニ
トールとα−Ｄ−グルコピラノシルー１，６−ソルビト
−ルの等モル混合物である。

第４表 １．３２　　　１２３　　　１０３１１６１４８１０３
マルトリ　　　１００ オース ボリデキス　１００ トロース イヌリン　　ｔｏｏ　　９９ スタキオース１００１２２ デキストラン１００　　ｇ！ ソルボース　ｔｏｏ　　９３ ポリアクリル＋００１００ アミド ＰＶｒ’　　　　１００　７５ ＧＰＳ　　　　１００１２４ パラチニヅト１００　９９ ９５　１１４　９８　９＋ 特許出顆人

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ｉ）水溶性または水膨潤性であってガラス状また
   はゴム状のアモルファス状態である担体物質、および （ｉｉ）該担体物質に溶解された、少なくとも１つの貯
   蔵される物質 からなる安定性組成物。 ２、貯蔵される物質が、タンパク質類、ペプチド類、ヌ
   クレオシド類、ヌクレオチド類、ヌクレオシド類または
   ヌクレオチド類のダイマー類またはオリゴマー類、酵素
   コファクター類、および１またはそれ以上の付加的な結
   合基を有する上記物質の誘導体からなる群から選ばれる
   請求項１記載の組成物。 ３、貯蔵される溶解物質が、部分的または全体的に反応
   系を形成するような、複数の物質である請求項１記載の
   組成物。 ４、４重量％を越えない水分含量を有する前記請求項の
   １つに記載の組成物。 ５、ガラス転位点が少なくとも３０℃である前記請求項
   の１つに記載の組成物。 ６、担体物質が、炭水化物類およびポリヒドロキシ化合
   物であるその誘導体からなる群から選ばれる前記請求項
   の１つに記載の組成物。 ７、担体物質が、炭水化物以外の２官能基にエーテル架
   橋を介して結合する糖類残基を含有する糖ポリマーであ
   る請求項６記載の組成物。 ８、担体物質が、合成ポリマーである請求項１〜５の１
   つに記載の組成物。 ９、物質を、貯蔵に適したものにさせるにあたり、 該物質を、水溶性または水膨潤性である担体物質または
   それらの溶液に溶解し、次いで得られた混合物をガラス
   状またはゴム状のアモルファス状態にさせることからな
   ることを特徴とする方法。 １０、該混合物のアモルファス状態への形成が、減圧下
   での蒸発によって行う請求項９記載の方法。 １１、該蒸発が、温度２０〜４０℃で開始し、その後、
   温度４０〜７０℃で継続する請求項１０記載の方法。 １２、該減圧が、大気圧の９０％以下である請求項１０
   または１１記載の方法。