JPH02234666A - アスペルギルス・ソーヤ形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はアスペルギルス・ソーヤ（＾ｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓｓｏｊａｅ）の形質転換体に関する。

〔従来の技術〕

アスペルギルス（以下、Ａと略記する）・ソーヤは、醤
油等の醸造工業の他、酵素製造工業、医薬品製工業及び
食品工業等に用いられている。その使用は該微生物の分
泌能力に基づくものである。

Ａ・ソーヤは、上記工業に、大屋に、商業的規模で用い
られる微住物である。Ａ・ソーヤに遺伝子工学技術を応
用するためには、得られる形質転換体がさらに有用な生
成物を発現し、これを大量に分泌するように、ＤＮＡを
Ａ・ソーヤに移入する必要がある。

多くの遺伝子が種々の原核性ベクター（例えば大腸菌を
利用しての）でクローン化され、コードされたタンパク
質に関して高い発現レベルを得るための努力がなされて
いる。遺伝子を、その遺伝子が本来属している種と同じ
か、または非常に良く似た宿主に導入した場合、これら
の遺伝子はより効率良く発現され、加工され易く、本来
のタンパク質にさらによく似たタンパク質を産生し易い
。

Ａ・ソーヤは種々の工業的に重要な蛋白質、酵素、およ
び他の製品のもとを製造する微生物である。これはまた
、効率よく発現されたタンパク質を分泌することができ
る。しかし、Ａ・ソーヤの形質転換は非常に困難である
ことが判明している。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明は、Ａ・ソーヤに遺伝子工学的手法により所定の
選択マーカーを付与した、有用なＡ・ソーヤの形質転換
体を開発することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明は、所定の選択マーカーが欠損（［欠損Ｊとは、
元来目的とする所定の選択マーカーを有する場合を含む
）したアスペルギルス・ソーヤ株を前記所定の選択マー
カーのＤＮＡ配列を含有するＤＮＡベクターで形質転換
して得られる所定の選択マーカーＤＮＡを含むアスペル
ギルス・ソーヤの形質転換体にある。

上記Ａ・ソーヤ株の菌体はその少なくとも１部としてＡ
・ソーヤのプロトプラストを用いることができ、ＤＮＡ
ベクターとしては、環状、線状のいずれもが用いられる
。また、所定の選択マーカーのＤＮＡとしてはアスペル
ギルス属由来のものが用いられ、好ましくはオルニチン
カルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇ　Ｂ“
）が用いられる。このオルニチンカルバモイルトランス
フェラーゼ遺伝子はＡ・ソーヤまたはＡ・ニドランス由
来のものが用いられる。

本発明の形質転換体は、形質転換前のＡ・ソーヤの細胞
には存在しない選択マーカーＤＮＡを含有するＤＮＡベ
クターを用いて、宿主Ａ・ソーヤを形質転換することに
より調製される点に特徴がある。上記ＤＮＡベクターは
Ａ・ソーヤに導入され、その選択マーカーのタンパク質
の発現を高めるものであるが、このＤＮＡベクターには
修飾するのに必要な他の外来性ＤＮＡを含んでいてもよ
い 次いで、この様にして形成された形質転換体は、組込ま
れた選択マーカーに基づいて、非形質転換細胞から選択
し、単離し、通常の方法で増殖および培養することによ
り得られる。

第１図は、本発明に従ったＡ・ソーヤ形質転換体の調製
に用いるＤＮＡベクターｐＳａ　ｌ　４３及び同ｐＳａ
　ｌ　２３の構築図である。

本発明において用いられる選択マーカーは、野生型Ａ・
ソーヤと比較して、形質転換体に存在していることがそ
の性質に実質的に影響しない様に、Ａ・ソ・−ヤに天然
に存在しているものが適している。

このことか−ら、本発明の形質転換体は、Ａ・ソーヤの
野生株、好ましくはその突然変異株を形質転換の宿主と
して用いた形質転換体である。元来、野生株型Ａ・ソー
ヤ株において所望の選択された遺伝子マーカーを欠損し
ている（即ち、有しない）場合は、これをそのまま形質
転換の宿主として用いることができる。しかし、この様
な場合は稀れである。従って野生型Ａ・ソーヤ株を突変
異処理し、選択された遺伝子マーカーが欠損した突然変
異株を用いることが好ましい。該形質転換体は、選択マ
ーカーおよび組込に必要な外来性ＤＮＡを含存ずるベク
ターで形質転換され、Ａ・ソーヤの選択マーカーのタン
パク質の発現が高められるものである。

野生型Ａ・ソーヤを形質転換するためには、優性選択マ
ーカー、即ち、通常Ａ・ソーヤによって代謝されない代
謝物質を代謝する能力、または化学物質または抗生物質
の有害な作用に対する耐性等の新規表現型を特定する遺
伝子を用いることができる。野生型Ａ・ソーヤの形質転
換体は、導入された優性選択マーカーに基づいて選択す
ることができる。

選択マーカーの好ましい例として、酵素オルニチントラ
ンス力ルハミラーゼをコードするａｒｇ　Ｂ“遺伝子が
挙げられる。この酵素は、野生型Ａ・ソヤに存在ずる。

この酵素が欠損している突然変異体（ａｒｇ　Ｂ一株）
は、通常の技術、例えば、紫外線照射で処理することに
より調製することができ、アルギニン含有培地」二では
増殖できるが、最小培地上では増殖できないことにより
選択される。本発明の方法に従って、Ａ・ソーヤのａｒ
ｇ　Ｂ−株およびａｒｇ　Ｂ＋遺伝子を含有するベクタ
ーからつくられた形質転換体は、従ってａｒｇ　Ｂ”で
あり、標準的なプレーティングおよび培養技術により、
形質転換されていないａｒｇ　Ｂ−株から容易に選択お
よび単離することができる。

前記の如く、野生型Ａ・ソーヤに天然に存在する選択マ
ーカーを用いるのが好ましいが、ベクターにおいて用い
る選択マーカーが実際にＡ・ソーヤ由来のものである必
要はない。発現の条件下で所望の遺伝子を含有する他の
類催した株からも同様に得ることができる。

本発明の形質転換体を調製するために用いるＤＮＡベク
ター構築の好ましい態様においては、先ず、第１図にお
ける選択マーカーａｒｇ　Ｂ”　ｒイ」又は「口」を、
Ａ・ニトランス株の全ＤＮＡを適当な制限酵素で処理す
ることにより得、次いでこれをＡ・ソーヤ（ａｒｇ　Ｂ
−）を形質転換するのに適当なベクター・ブラスミドｐ
ＢＢ　８又はｐＢＢ２９に連結することからなる。

本発明の好ましい具体例においては、宿主微生物のＡ・
ソーヤとして該Ａ・ソーヤのプロトプラストが用いられ
る。このプロトプラストの好ましい調製法は、例えば、
β−１，３−グルカナーゼ及び／又はキヂナーゼを用い
て細胞壁を酵素で溶解することによる。Ａ・ソーヤを酵
素で溶解しそのブロトプラス１・を得るのに適した酵素
の選択は、公知である。上記酵素ぱ、複雑なポリサッカ
ライドを溶解できるものであって、広範囲にわたるＡ・
ソーヤの真菌ブロトプラストを調製するのに有効である
。

上記β−１，３−グルカナーゼとしては生化学工業社販
売ザイモリアーゼ（Ｚｙｍｏｌｙａｓｅ）　２０Ｔ、同
１００Ｔ及び本発明者らが微生物ハチラス・サーキュラ
ンスＩＡ肘１６５及びストレフ゜トマイセス０１４３（
ＦＥＲＭ　Ｐ７２７６）のそれぞれの培養液から調製し
た２つの粗酵素等が挙げられる。

また上記キチナーゼとしては、キチナーゼ活性を有する
酵素剤が用いられ、例えば米国ＩＣＮ社製キチナーゼＮ
ｏ．１００４６６、米国シグマ社製キチナーゼＮｏ．　
Ｃ−６１３７　、生化学工業社版売キチナーゼ・ファン
ガル（ｆｕｎｇａｌ）ＮＯ．１００２９０等が挙げられ
る。他の適当な方法を用いてプロトプラストを形成して
もよい。さらにベクターを細胞内に取り込ませる適当な
方法に関しては、プロトプラストのかわりにＡ・ソーヤ
の胞子、菌糸等の全細胞を用いても良い。

本発明の形質転換は、適当に選択したＤＮＡベクター（
例えば、第１図においてｐＳａ　Ｉ！．４３及びｐＳａ
　ｉ　２３）を用いて行なわれる。本発明の形質転換体
の調製のためのベクターは特定の選択マーカー（例えば
、ａｒｇ　Ｂ“）を含有していな＆，ｌればならず、ま
た、形質転換体に含まれるべき他の有用な遺伝子を含有
していなげればならない。ＤＮＡベクターは、前述の通
り線状または環状ＤＮＡのいずれであってもよい。好ま
しくは、ＤＮＡベクターは、選択マーカー等を導入し、
Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において適当な量のベクター
を産生ずるために、操作および複製ができるように、Ｅ
・コリ・レプリコン（模写因子）を含有するものが用い
られる。

次に、一興体例として、本発明は、典型的には細胞壁を
酵素（例えばβ−１，３−グルカナーゼとキチナーゼ）
で溶解し、続いて精製することにより得られるプロ１・
プラストを、プラスミドの形態のＡ・ニドランスのオル
ニチン力ルハモイルトランスフェラーゼ構造遺伝子を含
有するＤＮＡで、ポリエチレングリコール（以下、ＰＥ
Ｇと略記する）　４０００又は同６０００およびＣａＣ
１ｇの存在下で処理することによりＡ・ソーヤ・アルギ
ニン要求株（Ａ・ソーヤＷ２０−４）からアルギニンを
要求しない形質転換体Ａ・ソーヤ株を調製することがで
きる。これらの形質転換体は、ＤＮＡのａｒｇ　Ｂ”″
部をその染色体に組み込み、この遺伝子を発現できる。

該形質転換体は、親株（宿主株）には存在しないｐＢＲ
３２７由来のＤＮＡとハイブリッドを形成することから
、形質転換体に存在する配列より明らかな如く、ＤＮＡ
ベクターに存在するａｒｇ　Ｂ”以外の他のＤＮＡも取
り込む。

従って、本発明に記載した形質転換を行なうためには、
レシピエント株（宿主株）、およびその一部（プロトブ
ラスト）が、この株において選択可能なＤＮＡ、即ち、
選択マーカーを含有するＤＮＡを必要とする。しかし、
ＤＮＡをレシピエントに取り込むことにより得られる形
質転換体が、容易に選択し得る表現型を有するように、
該受容体株（レシピエント株）および形質転換ＤＮＡを
選択しなければならない。

以下本発明を詳細に説明する。

アスベノレギノレス・ソーヤ（八ＴＣＣ　４２２５１）
をＵＶで突然変異誘発し、得られた単離物は、所定の最
小培地における増殖にシトルリンまたはアルギニンを必
要とする。この単離物の中からオルニチンカルバモイル
トライスフェラーゼの欠損した株を選択し、これをａｒ
ｇ　Ｂ−と称する。

上記アスペルギルス・ソーヤのプロトプラストの調製法
については、特開昭６０−７５２８１に記載されている
のと同様である。

即ち、Ａ・ソーヤの株を試験管のスラント培地（米麹汁
寒天培地）に接種し、室温で分生胞子の着生が充分にな
るまで培養し、分生胞子を得る。

１ｌ 次にこの分生胞子を、ＩＸＩＯ’個／Ｉｄとなるように
、０．０１％ソルビタン脂肪酸エステル溶液「ソルゲン
ＴＷ−６０（第一工業製薬社製）」に分散懸濁する。

次に、この分生胞子の分散懸濁液ＩＩｄを、液体栄養培
地［ツアベック培地に酵母エキス０．５％及びカザミノ
酸０．２％加え、ｐＨ６．０に調製し、これを水で１０
倍に希釈し得られたもの］３ｏｍｉに接種し、１５０戚
容三角フラスコ内で、３０゜Ｃで、発芽した胞子の長さ
かもとの胞子外径の約１０倍となるのに充分な時間、振
盪培養し、発芽胞子懸濁液を得、該懸濁液は更に遠心分
離（４５００ｇ　、２０分）して、そこから発芽胞子を
分離する。

次に、こうして得られた発芽胞子は充分水洗浄したのち
、これに細胞壁溶解酵素液ＩＩｄを加え、２７℃で２時
間、ゆるく振盪（毎分５０〜６０往復）して酵素処理し
、Ａ・ソーヤ・ａｒｇ　Ｂ一株のプロトプラストを得る
。

ここに用いた細胞壁溶解酵素は、バチラス・サーキュラ
ンス起源の粗酵素と市販のキチナーゼ（米国ＩＣＮ社製
）をそれぞれ溶液１　ｍｌに３０■及び５■の割合で溶
解し得られたものである。

次に、こうして得たプロトプラストをＧ−３規格のガラ
スフィルターにより分離し、これを高張液（０．８Ｍソ
ルビトール溶液）で数回繰り返し洗浄し、洗浄プロトプ
ラストを得る。

（ＤＮＡベクターの調製法〕 本発明の形質転換体の調製において用い、第１図に示す
ＤＮＡベクターｐＳａ　！！　４３及びｐＳａ　ｌ　２
３の調製は、ドモチョウスカら（ＤＭＯＣＨＯＷＳＫＡ
　ｅｔ　ａＬＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ（１９８６），　１３２１７
２９〜１９３７）に記載されている方法により得られ、
また上記２つのＤＮＡベクターの調製に用いられるプラ
スミドｐＢＢ２９　（大腸菌プラスミドｐＢＲ３２７と
酵母由来のＤＮＡフラグメントを連結して調製）及びｐ
ＢＢ１１６　（大腸菌ブラスミドｐＢＢ８とＡ・ニドラ
ンス由来のａｒｇ　Ｂ＋を有するフラグメントを連結し
て調製）の調製は、パースら、ジーン（Ｂｅｒｓｅｅｔ
　ａｌ，Ｇｅｎｅ），２５，１０９〜１１７（１９８３
）に記載されている方法により得られる。

ｌ３ また、本発明に用いられるＳａｌ　Ｉ　，　ＢａｍＨ　
Ｔ　、及びＥｃｏＲ　Ｔ等の制限酵素は、宝酒造株式会
社より入手し、製造者の指示に従って用いた。

次に本発明の方法において有用な前記２種のＤＮＡベク
ターの調製および構成を第１図に示す。

第１図に酵素ＢａｍｌｌＴを用いて公知の技法によりＡ
・ニドランスのＤＮＡから抽出したａｒｇ　Ｂ”遺伝子
を用いる方法を示す。

Ａ・ニドランスのフラクション（ＤＮＡ遺伝子の断片［
イＪ）を、まずＴ４リガーゼ（直結酵素）を用いて公知
のＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌ　ｉ）プラスミドｐＢＢ８と連
結して、公知のプラスミドｐＢＢ１１６を形成ずる。

次いでブラスミドｐＢＢＩＩ６を制限酵素ＳａｌＴで処
理して、Ａ・ニドランス由来のａｒｇ　Ｂ”遺伝子を含
有するフラグメント「口」を形成する。このａｒｇＢ゛
遺伝子を含有するフラグメントは、通常の方法、例えば
、アガロース電気泳動法および電気塘出法により単離、
精製してもよい。

一方、公知のプラスミドｐＢＢ２９　（斜線部は酵母由
来のＤＮＡフラグメントを意味する）を制限酵素Ｓａｌ
■で切断して得られる、フラグメン１・にリガーゼを用
いて、前記フラグメント「口」を連結し、プラスミドｐ
Ｓａ　Ｉ！．４３を得る。尚、上記においてフラグメン
トの単離は省略してもよく、連結工程は全フラグメント
を用いて行い、リガーゼで処理したものの中から所望の
配列を含有するプラスミドを公知の方法により選択して
もよい。

ｐＳａ　ｌ　４３は、アスペルギルスにおける選択マー
カーとして、ａｒｇ　Ｂ”遺伝子を含有し、また公知の
技術による形質転換によりＡ・ソーヤａｒｇ　Ｂ一突然
変異体のプロトプラストに導入することができる他のＤ
ＮＡ配列を有する。

こうして得られた形質転換体は、ａｒｇ　Ｂ”の特性に
基づいて、形質転換ざれていない突然変異体（ａｒｇ　
Ｂ→から選択され、単離され、培養され得る。

次に、Ａ・ソーヤ株ａｒｇ　Ｂ−の形質転換を行なうた
めのＤＮＡベクターｐｓａ　Ｉ！．２３の形成法につい
て説明する。

上記で得られたＤＮＡベクターｐＳａ　Ｑ　４３を制限
酵素ＥｃｏＲ　Ｔで切断し、２つのフラグメント、即ち
斜線部分で示す酵母由来のＤＮＡフラグメント及びａｒ
ｇ　Ｂ’遺伝子を含むフラグメントを得る。

次に」二記ａｒｇ　Ｂ”遺伝子を含むフラグメントをＴ
４リガーゼを用いて、連結し、プラスミドｐＳａ！２３
を得る。

こうして得たＤＮＡベクターｐＳａ　ｌ　４３及び同ｐ
Ｓａ　４２　２３は、それぞれ長さ約９．２キロ、約５
、９キロ塩基対でｐｌ’ｌｆ１２９由来のアンビシリン
耐性（Ａｐ　｝ｌ）遺伝子およびｐＢ８１１６由来（Ａ
・ニドランス由来）のａｒｇ　Ｂ”遺伝子を含有する。

これをＡ・ソーヤのａｒｇ　Ｂ一突然変異体のプロトプ
ラストでの形質転換に用いることができる。

ＤＮＡベクターｐＳａ　ｊ２　４３および同ｐＳａ　４
２　２３の両方とも、そのＤＮＡ配列中に、選択マーカ
ーａｒｇＢ゛およびＡ　ソーヤに組込まれるＡ・ソーヤ
に内在しない他のＤＮＡを含有する。

この外来性ＤＮＡは、Ａ・ソーヤ形質転換体に新規でか
つ有用な性質を付与する有用な遺伝子を含んでもよい。

本発明に関して、外来性ＤＮＡを含むベクターは、Ａ・
ソーヤ宿主株の染色体ＤＮＡ　（ゲノム）に組込まれる
。即ち、プラスミドとしてではなく、染色体または核Ｄ
ＮＡの一部となり、従って、外来性ＤＮＡの発現はその
後永続的になり、形質転換細胞からその配列が欠損する
ことは殆んどない。

形質転換体の新規表現型は従って非常に安定である。

〔発明の効果〕

本発明のＡ・ソーヤの形質転換体は選択マーカー以外に
天然のＡ・ソーヤには存在しない他のＤＮＡを含むもの
であり、この形質転換体は蛋白質、酵素及び他の製品の
開発及び生産のために有用な微生物である。

〔実施例〕

以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。但し
、本発明はこの実施例により限定されるものでない。

実施例１ −Ａ・ソーヤのノ　ー Ａ・ソーヤ（ＡＴＣＣ　４２２５１）の胞子懸濁液に、
常法により紫外線照射処理し、該処理液を適当に滅菌水
で希釈して、最小培地にアルギニンを添加した培地にプ
レートして３０℃で３〜７日間培養した。

ここで出現したコロニーを最小培地に植え換えて、この
培地で３０゜Ｃで、３〜７日間培養する。そして、前記
アルギニンを添加した培地では生育するが、最小培地で
は生育できない株を、アルギニン要求性変異（ａｒｇ　
Ｂ−）株として選択、分離する。

本発明では、この株をＡ・ソーヤＷ２０−４と略記する
。そして、この変異株はアスペルギルス・ソーヤＷ２０
−４は工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第
１０６０４号として寄託している。

Ａ・ソーヤ警２０−４（ａｒｇ　Ｂ−）株を試験管のス
ラント培地（米麹汁寒天培地）に接種し、室温で分生胞
子の着生が充分になるまで培養し、分生胞子を得た。

次にこの分生胞子を、ＩＸＩＯ７個／一となるように、
０．０１％ソルビタン脂肪酸エステル溶液［ソルゲンＴ
Ｗ−６０（第一工業製薬社製）］に分散懸濁した。

次に、この分生胞子の分散懸濁液１戚を、液体栄養培地
［ツアベック培地に酵母エキス０．５％及びカザミノ酸
０．２％加え、ｐＨ６．ｏに調製し、これを水で１０倍
に希釈し得られたもの］３０ｄに接種し、１５０戚容三
角フラスコ内で、３０℃で、発芽した胞子の長さがもと
の胞子外径の約１０倍となるに充分な時間、振盪培養し
、発芽胞子懸濁液を得、該懸濁液は更に遠心分離（４５
００ｇ　、２０分）して、そこから発芽胞子を分離した
。

次に、こうして得られた発芽胞子は充分水洗浄したのち
、これに細胞壁熔解酵素１滅を加え、２７゜Ｃで２時間
、ゆるく振盪（毎分５０〜６０往復）して、Ａ・ソーヤ
ー２０−４（ａｒｇ　Ｂ−）株のプロトプラストを得た
。

ここに用いた細胞壁溶解酵素は、バチラス・サーキュラ
ンス起源の粗酵素と市販のキチナーゼ（米国ＩＣＮ社製
）をそれぞれ溶液１　ｒｄに３０ｍｇ及び５■の割合で
溶解し得られたものである。

次に、こうして得たプロトプラストをＧ−３規格のガラ
スフィルターにより分離し、これを高張液（０．８Ｍソ
ルビトール溶液）で洗浄し、洗浄プロトプラストを得た
。

次に、プロトブラストを０．８Ｍ　ＭＣＩ，　ＩＯｍＭ
　ＣａＣＩｚ、１０ｍＭ　｝リス／ＨＣＩ、ｐＨ７．５
中に最終濃度１０　’　／　ｍａｌとなるように再懸濁
する。この０．　２　ｄの懸濁液を容量１．　５　ｍｌ
プラスチック製試験管に入れ、前記方法で調製したＤＮ
Ａベクターｒ　ｐＳａ　ｌ　４３　」または同ｒ　ｐＳ
ａ　４２　２３　」のいずれかのＤ　ＮＡ　１０　〜１
００ｕｇ（総容量：ＴＥバッファ−１０μ！中）を添加
し、氷温にて３０分間インキユベートする。これに２５
％ＰＥＧ４０００、５０ｍＭ　ＣａＣＩ４、１０ｍＭ　
｝リス／ＨＣＩ，ｐＨ１．５の溶液ｌｍを添加し、静か
にかつ充分に攪拌し、次いで室温にてさらに１５分間イ
ンキユベートする。以上のようにして形質転換を行う。

ＤＮＡベクターｐＳａ　Ｉ！．　４３で形質転換された
本発明のアスペルギルス・ソーヤ形質転換体はＡ・ソー
ヤＫＴＲ−３として工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌寄第１０６０３号として寄託している。

次に、こうして形質転換されたプロトプラスト懸濁液全
量を、０．８Ｍ　ＫＣＩ、１０ｍＭ　ＣａＣＩｚ、ｌｏ
ｍＭ　トリス／ＨＣＩ、ｐＨ７．５溶液６ｄと混和希釈
し、７００ｇで５分間遠心分離する。更に、分離された
形質転換体のプロトプラストに同容量の上記希釈液を加
え、遠心分離して、洗浄されたものを得る。

次に、洗浄された形質転換体のプロトプラストを１　ｍ
ｌの上記希釈液に懸濁し、このｌＯｔｔ１〜１００μｌ
を、０．６Ｍ　ＫＣＩを含む最小培地（２．０％寒天）
にプレートする。またその上に同培地（但し、０．５％
寒天）を重層する。次いで３０゜Ｃにて３〜１０日間培
養する。

ａｒｇ　Ｂ＋およびＤＮＡベクターｐＳａ　ｌ　４３お
よび同ｐＳａ　ｌ　２３由来の他のＤＮＡをとりこんだ
形質転換体は、最小培地＋ＭＣＩ　（塩化カリウムはプ
ロトプラストが破裂するのを防ぐのに必要である）上で
増殖する。

未変化の細胞、未変化のプロトプラスト、形質転換体、
および復帰突然変異体を含むあらゆる生存可能な細胞お
よびプロトプラストは、最小培地士アルギニン十Ｋ．Ｃ
Ｉ上で増殖する。かかる増殖培地により、生存可能な物
質の生存率を調べることができる。これらの実験におい
て１０　ｌｌ／　ｍｌのうち、上記アルギニンを含む培
地で生存可能な物質の生育できた割合は３０％以上であ
った。最小培地＋アルギニン」二では、汚染された非ブ
ロ１・ブラスト物質のみが増殖する。この様な非浸透圧
感受性細胞でのｌη染は、本実験においては１％未満で
あった。

実施例２ 上記で得られたＡ・ソーヤＷ２０−４の形質転換体が復
帰突然変異体ではなく、真正の形質転換体であるかどう
かを調べるために、該形質転換体を完全培地中で増殖さ
せ、これからＤＮＡを調製し、放射性標識プラスミトで
検査ずる。

杉貫輯換婆■舟灸 下記ポリペプトン・デキストリン培地４００ｄに、１０
５分生子／成となるように接種し、３０゜Ｃで１６時間
増殖させた菌糸体を、ファルコンフィルター（ファルコ
ン社製造）を用いてフィルター上に回収し、蒸留水で洗
浄し培地を除去する。

［ポリペプトン・デキスＩ・リン培地］デキストリン　
　　　　　２％ ボリペブＩ・ン　　　　　１．０％ Ｋ｝ｌ２Ｐｏ４０．５％ ＮａＮＯ３０．１％ 九ＳＱ４−７１ｈＯ　　　　　　　Ｏ．０５％カザミノ
酸　　　　　　０．１％ ｐＨ　　　　　　　　　　　５．５〜６．０水道水で調
整 次いで、上記洗浄菌糸体を０．６Ｍ　ＫＣＩを含む０．
１Ｍリン酸ハッハア−（ｐＨ５．５）で再び洗浄（除培
地）し、水切りしたのち、該菌体をファルコンチューブ
（ファルコン社製造）に移し、これに上記ＫＣＩを含む
リン酸パンファ−２０ｍｌを加え、更に細胞壁溶解酵素
、バチラスサーキュランス起源の粗酵素と市販のキチナ
ーゼをそれぞれ｝容？１　１　ｍｇ．当り３０ｍｇ及び
５ｍｇとなるように加え、２７’Ｃで２時間、ゆるやか
に振盪（毎分５０〜６０往復）して酵素処理し、菌体の
消化物を得た。

この　消化液を２，　０００ｒ．ｐ．ｍ．で２０分遠心
分離し、沈澱物と上澄液とに分離し、その上澄液を再度
５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で３０分遠心分離し、得られた
沈澱部を前記沈澱部と混ぜて、菌体を集めた。この集め
た菌体を再度０．６Ｍ　ＭＣＩバッファ−で２回洗浄し
た。

洗浄菌体に、滅菌後、６５゜Ｃに保温した下記バッフブ
ーＡ１０成を加え、６５゜Ｃで１時間振盪し、プロトプ
ラスト及び細胞の破壊と、細胞内のＤＮＡ、ＲＮＡ及び
蛋白質の溶出を行う。

「バッファ一Ａ」 トリスヒト■キシアミノメタン　　　　　　　　　５０
ｍＭＮａＣＩ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　Ｏ．１５ＭＥＤＴＡ　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　１．ＯＯｍＭＳＤＳ　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　２％ｐＨ　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　７．５次に、プロティナーゼ
Ｋ（ベーリンガー・マンハイム社製）を熔解した下記Ｔ
Ｅバッファ一（１０ｍｇ　／　ｍｆｌ　）を５ｍｌ．添
加し、３７゜Ｃで１夜保持し、蛋白質の分解を行う。

［ＴＥハッファ−］ トリス／ＨＣ１　　　　　　　　１０ｍＭＥＤＴＡ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　Ｉ．ｍＭ
ｐＨ　　　　　　　　　　　　　　　　７．６プロティ
ナーゼ処理液に冷フェノール１０雁を加え、５，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で３０分遠心分離し、その水相部を分取ず
る。この水相部にフェノール、クロロボルム１；１の混
和液１０　ｍｌを加え、５，　ＯＯＯｒ．ｐ．ｍ．で３
０分遠心分離し、水相部（上部）を分取する。得られた
水相部にクロホルム、イソアミルアルコール２４：１の
混和液ｌ　Ｑ　ｒｒｄｌを加え、５，　０００ｒ．　ｐ
．ｍ，で３０分遠心分離し、水相部を分取する。得られ
た水相部にジエチルエーテル１０ｄを加え、氷温下で、
５，０００ｒ．ｐ．ｍ．で５分遠心分離し、水相部を分
取する。得られた水相部を湯せんで５５〜６０゜Ｃに数
分保持し、該水相部の表面にわずかに浮遊するジエチル
エーテルを蒸発させて取除き、除蛋白された高分子物質
溶液を得る。

この高分子物質溶液に５０％ＰＥＧ、　２ＭＮａＣ］の
溶液ＬＯｄを加え、氷温下（氷中）で２時間保持し糖類
は溶液側に移行させ、ＲＮＡ及びＤＮＡ等の高分子物質
は沈澱させる。その沈澱物をとり出すために、１０，Ｏ
ＯＯｒ．ｐ．ｍ，で３０分遠心分離し、沈澱物を回収す
る。

この沈澱物を冷（−２０゜Ｃ）９５％エタノールで洗浄
し、ＰＥＧを充分に除き、次いでエタノールを吸引によ
り蒸発し、取り除く。

そして、得られた沈澱物をＴＥバッファ一（１０ｌトリ
ス／ＨＣＩ，　　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　，　　ｐＨ７．６
）５ｍｔ！に溶解し、ＲＮａｓｅｉ液（ベーリンガー・
マンハイム社製）５ｍｇを添加し、３７゜Ｃで１夜保持
してＲＮＡを分解する。

上記保持液に冷フェノール５−を加えて、１０，０００
ｒ．ｐ．ｍ．で２０分遠心分離し、水相部を回収する。

上記処理物に、冷（−２０″Ｃ）エタノールを加え、８
０゜Ｃで３０分以上保持して、ＤＮＡを沈澱させ、この
沈澱物を１０．００Ｏｒ．ｐ劃．で３０分遠心分離して
、精製されたＤＮＡを得る。

この精製ＤＮＡを前記ＴＥバッファ−１ｄに溶解してｐ
Ｓａ　ｌ　４３の形質転換体から得たＤＮＡを調製した
。

サザントランスフ　ー　びハイブリッドこの方法は、サ
ザーン「ジャニナル・モレキュラー・バイオロジー（Ｓ
ｏｕｔｈｅｒｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．＋９８，５０
３　（１９７５））に記載されている方法に準じて行な
われる。

即ち、ｐＳａ　ｌ　４３の形質転換体（Ａ・ソーヤＫＴ
Ｒ３）から得たＤＮＡと、コントロールとして、上記と
同様にして調製された、Ａ・ソーヤＡＴＣＣ　４２２５
及び親株（宿主株）のＡ・ソーヤＷ２０−４（ａｒｇ　
Ｂ−）から得たＤＮＡについて、それぞれ制限酵素Ｂａ
ｍＨ　Ｔ、ＥｃｏＲ　Ｉ、又はＳａｌＩで切断する。

前記３株の切断ＤＮＡを平板状アガロース・ゲル電気的
に泳動する。条件は２０ボルトで１４時間である。

次いで、後述のハイブリッドを形成しやすくするために
、上記泳動したゲルを０．２５Ｍ　ＨＣＩ溶液に３０分
浸し、次いでアルカリバッファ−１．５Ｍ　ＮａＣＩ、
０．５Ｍ　ＮａＯＨで３０分処理し、アルカリ化（ＤＮ
Ａを変性）する。

次いで、中和バッフｙ　−（３Ｍ　ＮａＣｌ，　０．５
Ｍ　トリスＨＣＩ、ｐＨ７．０）に３０分浸す。

次いで、中和した平板ゲルの上に、ニトロセルロースフ
ィルターを重ね、１夜保持して泳動したＤＮＡを移し取
る。

次いで、移し取ったニトロセルロース・フィルターを乾
燥する。

次いで、ビニール袋内で乾燥したニトロセルロース・フ
ィルターを放射性標識プラスミド（探針）（ｐＢＲ３２
２）の溶液５μｌ及びハイブリダイゼーション・バッフ
ァ−２戚の混合液に浸し、シールして、４２゜Ｃで１夜
保持する。放射性標識プラスミドとしてｐＢＲ３２２を
用いた理由は以下の通りである。

即ち、本発明の形質転換体の作成に用いたＤＮＡベクタ
ーｐＳａ　ｌ　４３における大腸菌由来のプラスミドベ
クターは、ｐＢＲ３２７であり、また該ｐＢＲ３２７は
、前記ｐＢＲ３２２の塩基対が０．６ｋｂだけ欠失した
誘導体である。従ってｐＢＲ３２７の塩基配列はｐＢＲ
３２２のそれと一致している。それゆえ、ｐＢＲ３２２
を放射性標識プラスミドとして用いれば、大腸菌由来の
プラスミドベクターｐＢＲ３２７遺伝子の組込が判る。

次いで、ＮａＣ１及びクエン酸ソーダを含む溶液（Ｓ　
Ｓ　Ｃｍ液）でニトロセルロース・フィルターを洗浄す
る。

次いで、洗浄したニトロセルロース・フィルターをラジ
オオートグラフィーで感光する。サザンハイブリダイゼ
ーションでは、ニトロセルロース・フィルターに少な《
ともその一部が相同であるＤＮＡがあると、そこに標識
したプラスミド・ベクターＤＮＡが吸着され、ハイブリ
ッドが形成され、従ってそこに放射性のバンドが形成さ
れる。

従って、一部でも塩基配列が相同する部分があれば、そ
こにハイブリッドを形成してバンドができる。

Ａ・ソーヤＡＴＣＣ　４２２５１及びＡ・ソーヤＷ２０
−４（ａｒｇ　Ｂ−）はハイブリッド形成したバンドを
示さなかった。

これに対し、形質転換体（Ａ・ソーヤＫＴＲ−　３　）
は分離したバンドを呈し、同じ座における異なる組込み
、またはゲノムの異なるサイドにおける組込みが示され
た。

以」一は、Ａ・ソーヤの任意の菌株、アルギニン要求性
変異株（Ａ・ソーヤＷ２０−４）及び形質転換体（Ａ・
ソーヤＫＴＲ−　３　）の、大腸菌由来のプラスミドヘ
クタ−ｐＢｌｉ’３２２に関したサザンハイブリダイゼ
ーションの結果である。

同様にして、今度は上記放射性標識プラスミドｐＢＲ３
２２に代えて放射性標識プラスミドｐＳａ　１４３につ
いても調べた。

即ちｐＳａ　Ｊ２　４３の形質転換体（Ａ−ソーヤＫＴ
Ｒ−　３　＞から得たＤＮＡと、コントロールとして、
上記と同様に調製して得たＡ・ソーヤＡＴＣＣ　４２２
５１及び親株のＡ・ソーヤー２０−４から得たＤＮＡに
ついて、上記と同様にザザンハイブリダイゼーションを
行った。

即ち、これらの株のＳａ冊消化ＤＮＡを処理し、ｐＳａ
　１４３をＢａｍＨ　Ｉを用いて１箇所で切断したもの
を放射性標識プラスミドとして調べた。Ａ・ソーヤＡＴ
ＣＣ　４２２５］　はハイブリッドを形成したハンドを
示し、ａｒｇ　Ｂ’遺伝子と相同なＳａｌＩフラグメン
トを有することが判明した。洗浄状態で、Ａ・ソーヤＷ
２０−４はハイブリンドを形成したハンドを示さなかっ
た。これに対しｐＳａ　１４３の形質転換体（Ａ・ソー
ヤＫＴＲ−　３　＞　　は分離したハンドを呈し、同じ
座における異なる組込み、またはゲノムの異なるサイド
における組込みがされたことが判明した。

一方、上記と同様にｐＳａ　Ｉ！．２３を用いて得られ
た形質転換体も放射性標識ブラスミトｐＢＲ３２２とハ
イブリッドを形成し、該ｐＳａ　ｌ　２３を調製する際
用いたベクターｐＢＲ３２７遺伝子の取込みを示す。

従ってＡ・ソーヤＷ２０−４株はＡ・ニドランスａｒｇ
Ｂ゛遺伝子で形質転換される。即ちこの遺伝子はＡ・ソ
ーヤにおいても発現される。ベクターｐＢＲ３２７もａ
ｒｇ　Ｂ”遺伝子とともに、これらの形質転換体に組込
まれ、従って外来性ＤＮＡをＡ・ソーヤに形質転換する
方法が提供される。

実施例３ 前記の如く調製した形質転換された株の表現型の安定性
を調べた。形質転換体を、最小培地から完全培地上に接
種し、３０゛Ｃで４日培養した。培養物の胞子を取り出
し、再び完全培地に接種し上記と同様に培養した。これ
を合計３０回繰り返した。

この最終の分生子をコロニーからとり出し、適当に希釈
し、最小培地＋１０ｍＭアルギニン上で３０゜Ｃで平板
培養する。３日後、コロニーを最小培地および最小培地
士アルギニン上でレプリカ平板培養する。１つの形質転
換体から試験した１００コロニのうち、全てが原栄養体
（アルギニンを要求しない）であり、形質転換された表
現型が、ゲノムに組込まれるあらゆる遺伝子に関して予
期される如く、この増殖期間中完全に安定である。即ち
、形質転換されたａｒｇ　Ｂ”遺伝子がもともとゲノム
にあった麹菌本来の遺伝子と同じように、組込まれた遺
伝子も完全に安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＤＮＡベクターｐＳａ／．４３及び同ｐＳａ　
Ｅ２３の構築法を示す図である。図中、ｐＢ８２９及び
ｐＳａ　４２　４３における斜線部は酵母由来のＤＮＡ
フラグメントを意味し、Ｕ）及び（口）はＡ・ニドラン
ス由来のａｒｇ　Ｂ“遺伝子を含有ずるフラグメントを
意味する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、所定の選択マーカー遺伝子が欠損したアスペルギル
   ス・ソーヤ株を、前記所定の選択マーカーのＤＮＡ配列
   を含有するＤＮＡベクターで形質転換して得られる所定
   の選択マーカーＤＮＡを含むアスペルギルス・ソーヤ形
   質転換体。 ２、アスペルギルス・ソーヤ株が、プロトプラスト化さ
   れた細胞である請求項１記載のアスペルギルス・ソーヤ
   形質転換体。 ３、ＤＮＡベクターが環状である請求項１記載のアスペ
   ルギルス・ソーヤ形質転換体。 ４、ＤＮＡベクターが線状である請求項１記載のアスペ
   ルギルス・ソーヤ形質転換体。 ５、所定の選択マーカー遺伝子を欠損したアスペルギル
   ス・ソーヤ株が野性型アスペルギス・ソーヤの突然変異
   株である請求項１又は２記載のアスペルギルス・ソーヤ
   形質転換体。 ６、所定の選択マーカーのＤＮＡが、野生型アスペルギ
   ルス属微生物由来のものである請求項１記載のアスペル
   ギルス・ソーヤ形質転換体。 ７、所定の選択マーカー遺伝子が、オルニチンカルバモ
   イルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＢ＾＋）である
   請求項１又は５記載のアスペルギルス・ソーヤ形質転換
   体。 ８、ＤＮＡベクターが、選択マーカーＤＮＡとしてオル
   ニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝子を含む請
   求項１、３及び４のいずれかの項記載のアスペルギルス
   ・ソーヤ形質転換体。 ９、所定の選択マーカーのＤＮＡがオルニチンカルバモ
   イルトランスフェラーゼ遺伝子（ａｒｇＢ＾＋）を含む
   請求項１又は６記載のアスペルギルス・ソーヤ形質転換
   体。 １０、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ遺伝
   子が、アスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギルス・
   ニドランス由来のものである請求項８記載のアスペルギ
   ルス・ソーヤ形質転換体。