JPH02161357A - 免疫測定用材料の安定化方法 - Google Patents
免疫測定用材料の安定化方法Info
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- JPH02161357A JPH02161357A JP31497388A JP31497388A JPH02161357A JP H02161357 A JPH02161357 A JP H02161357A JP 31497388 A JP31497388 A JP 31497388A JP 31497388 A JP31497388 A JP 31497388A JP H02161357 A JPH02161357 A JP H02161357A
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- Medical Preparation Storing Or Oral Administration Devices (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
(産業上の利用分野)
本発明は、免疫aPI定に用いる抗体を結合させた担体
の安定化方法に関するものである。更に詳しくは、免疫
測定に用いる抗体を結合させた担体をより長きに渡って
、かつ、抗体等の劣化を生じさせないようにするための
安定化方法に関するものである。
の安定化方法に関するものである。更に詳しくは、免疫
測定に用いる抗体を結合させた担体をより長きに渡って
、かつ、抗体等の劣化を生じさせないようにするための
安定化方法に関するものである。
(従来の技術とその課題)
一般に、血清や尿等の生体試料液中の、例えば蛋白質や
ホルモン等の免疫反応における抗原として機能する微量
生体物質の含有量を測定するために、m体に抗体を結合
させた免疫測定用材料を用いることが多い。
ホルモン等の免疫反応における抗原として機能する微量
生体物質の含有量を測定するために、m体に抗体を結合
させた免疫測定用材料を用いることが多い。
このような免疫測定材料は、例えば牛血清アルブミン等
の蛋白質を含む適当な緩衝液中で安定化され、保存され
ることが多い。しかし、このような安定化方法では、例
えば製造者か・ら使用者へ免疫反応測定用材料が渡るま
での比較的長い期間を通しての性能の維持に課題があっ
た。即ち、長い期間の間に、例えば担体からの抗体の剥
離が生じたり、又例えば抗体自体の性能(抗原との特異
的親和性能等)が劣化する。
の蛋白質を含む適当な緩衝液中で安定化され、保存され
ることが多い。しかし、このような安定化方法では、例
えば製造者か・ら使用者へ免疫反応測定用材料が渡るま
での比較的長い期間を通しての性能の維持に課題があっ
た。即ち、長い期間の間に、例えば担体からの抗体の剥
離が生じたり、又例えば抗体自体の性能(抗原との特異
的親和性能等)が劣化する。
他に、凍結乾燥を行う安定化方法も知られているが、該
方法では、凍結乾燥の操作の際に抗体の失活が起り易く
又操作時のわずかな条件の違いにより、安定化の度合い
に変化が生じるため、操作に先立っての凍結乾燥操作の
条件の設定と、操作中の条件の監視等煩わしい操作が必
要である。
方法では、凍結乾燥の操作の際に抗体の失活が起り易く
又操作時のわずかな条件の違いにより、安定化の度合い
に変化が生じるため、操作に先立っての凍結乾燥操作の
条件の設定と、操作中の条件の監視等煩わしい操作が必
要である。
このような状況にあって、前記した凍結乾燥による安定
化方法において、牛血清アルブミン等の蛋白質を安定化
剤として含むリン酸緩衝戒等と共に免疫反応A−1定用
材料を凍結乾燥する方法もまた知られている。しかし、
該方法においては、製造される免疫反応71$1定用材
料中に牛血清アルブミン等の蛋白質に由来する白色の粉
体が共存することとなるために見栄えが悪いこと、その
ような粉体が溶解し難いため、使用する際に多少の準備
時間が必要になること又材料の輸送中に不測の事態が生
じた場合に、乾燥され、粉体状態にされた蛋白質等が飛
散し易い等の課題がある。
化方法において、牛血清アルブミン等の蛋白質を安定化
剤として含むリン酸緩衝戒等と共に免疫反応A−1定用
材料を凍結乾燥する方法もまた知られている。しかし、
該方法においては、製造される免疫反応71$1定用材
料中に牛血清アルブミン等の蛋白質に由来する白色の粉
体が共存することとなるために見栄えが悪いこと、その
ような粉体が溶解し難いため、使用する際に多少の準備
時間が必要になること又材料の輸送中に不測の事態が生
じた場合に、乾燥され、粉体状態にされた蛋白質等が飛
散し易い等の課題がある。
以上のような現状に鑑み、本発明者らは、担体に結合さ
せた抗体の失活が少なく、長期間に渡って材料を保存で
き、更には使用する際に容易に溶解可能な凍結乾燥材料
を提供すべく鋭意研究した結果本発明を完成させた。即
ち本発明は、抗体を結合させた担体を安定化剤を含有す
る洗浄液で洗浄した後凍結乾燥することを特徴とする免
疫測定用材料の安定化方法を提供するものである。
せた抗体の失活が少なく、長期間に渡って材料を保存で
き、更には使用する際に容易に溶解可能な凍結乾燥材料
を提供すべく鋭意研究した結果本発明を完成させた。即
ち本発明は、抗体を結合させた担体を安定化剤を含有す
る洗浄液で洗浄した後凍結乾燥することを特徴とする免
疫測定用材料の安定化方法を提供するものである。
以下に本発明を詳細に検討する。
(課題を解決するための手段)
本発明で、抗体とは、公知の方法によって得られる種々
の抗体を指す。例えば、抗原を動物に免疫することで得
られるポリクローナル抗体や抗体産生細胞と***細胞の
融合細胞(ハイブリドーマ)により産生されるモノクロ
ーナル抗体等がある。
の抗体を指す。例えば、抗原を動物に免疫することで得
られるポリクローナル抗体や抗体産生細胞と***細胞の
融合細胞(ハイブリドーマ)により産生されるモノクロ
ーナル抗体等がある。
抗体は、そのクラス、サブクラス更にはその由来等、同
等制限はない。
等制限はない。
担体とは、抗体を結合するための表面を提供できるもの
であれば良い。
であれば良い。
抗体と担体を結合させる方法としては、化学的結合を利
用する方法、担体の吸着力を利用する方法がある。この
方法では、例えばポリスチレン等の抗体と親和性をaす
る担体等を使用するか、あるいは表面を抗体と親和性を
有する樹脂等で被覆された担体を使用すれば良い。更に
担体は、例えば磁性粒子等を含有していてもよく、その
寸法等においても制限はない。
用する方法、担体の吸着力を利用する方法がある。この
方法では、例えばポリスチレン等の抗体と親和性をaす
る担体等を使用するか、あるいは表面を抗体と親和性を
有する樹脂等で被覆された担体を使用すれば良い。更に
担体は、例えば磁性粒子等を含有していてもよく、その
寸法等においても制限はない。
本明細書中でいう免疫測定用材料とは、前記した担体自
体あるいは前記の担体を含む免疫反応容器である。具体
的には、免疫反応用プレート等の、それ自体抗体を結合
させる表面を提供する担体であって同時に免疫反応用材
料であるものがある。
体あるいは前記の担体を含む免疫反応容器である。具体
的には、免疫反応用プレート等の、それ自体抗体を結合
させる表面を提供する担体であって同時に免疫反応用材
料であるものがある。
他の具体的な形態として、その表面に抗体を結合させた
ビーズ(本明細書中でいう担体に該当する)をその中に
有する反応カップがある。
ビーズ(本明細書中でいう担体に該当する)をその中に
有する反応カップがある。
本発明の安定化方法は、抗体を結合させた担体を安定化
剤を含有する洗浄液で洗浄し、その後凍結乾燥すること
からなる。ここで、洗浄とは、例えばl′11体を洗浄
液中に浸し、抜液と分離することにより行えばよい。従
って、本発明では使用する安定化剤の量は少量ですみ、
洗浄操作も簡tliなもので実施可能である。免疫/l
l11定用材料がそれ自体担体である例えばプレートの
ようなものである場合には該材料を洗浄し、凍結乾燥す
れば良く、材料が担体と担体を収容する容器等からなる
場合には、tu体体刑別個若しくは担体を容器等に収容
した状態で洗浄し、別個にした場合にはそれらを一体に
して凍結乾燥すれば良い。凍結乾燥は、公知の条件下で
行えばよく、例えば−80〜−20℃のインキュベータ
ー中で2〜24時間かけて材料を凍結させた後、0.0
1〜Q、2torrの減圧下−20〜Q℃で、3〜16
時間乾燥させ、更に室温で2〜4時間乾燥させる方法が
例示できる。
剤を含有する洗浄液で洗浄し、その後凍結乾燥すること
からなる。ここで、洗浄とは、例えばl′11体を洗浄
液中に浸し、抜液と分離することにより行えばよい。従
って、本発明では使用する安定化剤の量は少量ですみ、
洗浄操作も簡tliなもので実施可能である。免疫/l
l11定用材料がそれ自体担体である例えばプレートの
ようなものである場合には該材料を洗浄し、凍結乾燥す
れば良く、材料が担体と担体を収容する容器等からなる
場合には、tu体体刑別個若しくは担体を容器等に収容
した状態で洗浄し、別個にした場合にはそれらを一体に
して凍結乾燥すれば良い。凍結乾燥は、公知の条件下で
行えばよく、例えば−80〜−20℃のインキュベータ
ー中で2〜24時間かけて材料を凍結させた後、0.0
1〜Q、2torrの減圧下−20〜Q℃で、3〜16
時間乾燥させ、更に室温で2〜4時間乾燥させる方法が
例示できる。
本発明では、安定化剤として例えば、グルコース、フル
クトース等の単糖類、ショ糖、乳糖等の二単糖又はデキ
ストラン、ポリビニルピロリドン専を使用することがで
きる。
クトース等の単糖類、ショ糖、乳糖等の二単糖又はデキ
ストラン、ポリビニルピロリドン専を使用することがで
きる。
洗浄液は、例えば生理食塩水や結合された抗体を変性さ
せないpHを釘する緩衝液等、格別の制限なく使用でき
る。
せないpHを釘する緩衝液等、格別の制限なく使用でき
る。
本発明の方法に従って得られた凍結乾燥材料は、例えば
乾燥空気や窒素ガスを充填した状態で包装することで、
更に長期に渡って安定的に保存することができる。
乾燥空気や窒素ガスを充填した状態で包装することで、
更に長期に渡って安定的に保存することができる。
(発明の効果)
本発明によれば、免疫反応用材料を長期に渡って安定化
できる。このことは、結合された担体の劣化を防ぎ、該
材料の性能を低下させることなしに保存できることを意
味するものである。
できる。このことは、結合された担体の劣化を防ぎ、該
材料の性能を低下させることなしに保存できることを意
味するものである。
本発明の方法では、従来、担体と共に凍結乾燥している
安定化剤が洗浄液と共に大部分回収されることから、安
定化の際の使用量を少なくすることができる。また、こ
のように洗浄の後、洗浄液を回収することにより、材料
中の水分を従来に比較【、て少なくできることから、凍
結乾燥操作自体に要する時間を短縮化できる。又、安定
化剤の使用量を少なくできることから、製造された材料
を運搬中に不測の、!11態が生じたとしても、安定化
剤の飛散は少なくて済むこととなる。
安定化剤が洗浄液と共に大部分回収されることから、安
定化の際の使用量を少なくすることができる。また、こ
のように洗浄の後、洗浄液を回収することにより、材料
中の水分を従来に比較【、て少なくできることから、凍
結乾燥操作自体に要する時間を短縮化できる。又、安定
化剤の使用量を少なくできることから、製造された材料
を運搬中に不測の、!11態が生じたとしても、安定化
剤の飛散は少なくて済むこととなる。
更に、本発明の方法に従って安定化した免疫反応用材料
は、熱に対しての安定性も良好であり、実施例に示す条
件では50℃で360時間放置した場合にもその劣化は
微量である。
は、熱に対しての安定性も良好であり、実施例に示す条
件では50℃で360時間放置した場合にもその劣化は
微量である。
更には、安定化剤として単糖類、二糖類、デキストラン
又はポリビニルピロリドン等を用いた場合には、材料を
使用する際の材料の溶解を担持間で行うことができる。
又はポリビニルピロリドン等を用いた場合には、材料を
使用する際の材料の溶解を担持間で行うことができる。
又、安定化剤に糖類を用いることにより、製造された材
料の見栄えを良くすることができる。
料の見栄えを良くすることができる。
凍結乾燥した材料を乾燥空気や窒素ガスを充填した後包
装することにより、免疫反応材料を更に長期に渡り保存
することができる。
装することにより、免疫反応材料を更に長期に渡り保存
することができる。
(実施例)
以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例1 (ヒトαフェトプロティンの酵素免疫測定用
材料の安定化) 本実施例において使用した溶液は、 A液;50mM炭酸すトリウム緩衝液(pH9,6) B液;以下の組成のpH7,4の緩衝液塩化ナトリウム
−5g/l。
材料の安定化) 本実施例において使用した溶液は、 A液;50mM炭酸すトリウム緩衝液(pH9,6) B液;以下の組成のpH7,4の緩衝液塩化ナトリウム
−5g/l。
リン酸水素カリウム−0,2g/l。
リン酸水素2ナトリウムー1.15g/l塩化カリウム
−0,2g/l tween 20−0.5ml/1 ポリスチレン性マイクロタイタープレート(ヌンク社製
イムノプレート■)の各ウェルに、通常の方法に従って
調製されたヒトαフェトプロティン(以下AFPという
)のマウスモノクローナル抗体5μg / m lを2
00ulずつ分注した。
−0,2g/l tween 20−0.5ml/1 ポリスチレン性マイクロタイタープレート(ヌンク社製
イムノプレート■)の各ウェルに、通常の方法に従って
調製されたヒトαフェトプロティン(以下AFPという
)のマウスモノクローナル抗体5μg / m lを2
00ulずつ分注した。
この時、A液を抗体の溶解液として使用した。
該プレートを4℃にて一晩放置した後、B液にて洗浄し
、更にブロッキングのため、牛血清アルブミンを0.1
爪口%となるように添加したB[を各ウェルに300u
lずつ分注し、4℃で一晩放置した。
、更にブロッキングのため、牛血清アルブミンを0.1
爪口%となるように添加したB[を各ウェルに300u
lずつ分注し、4℃で一晩放置した。
各ウェルを0.85重量%の塩化ナトリウム水溶液で洗
浄し、更に10重置火のシュークロースを含む生理食塩
水で洗浄した後、抜液を除去し、通常の方法に従って該
プレートを凍結乾燥した。
浄し、更に10重置火のシュークロースを含む生理食塩
水で洗浄した後、抜液を除去し、通常の方法に従って該
プレートを凍結乾燥した。
対照として、同様の処理を施したプレートを凍結乾燥し
ていない物を用いた。
ていない物を用いた。
凍結乾燥されたプレートについては、プレート中の各ウ
ェルにB液を満たし、これを除去して以下の測定に使用
した。
ェルにB液を満たし、これを除去して以下の測定に使用
した。
API定は、各ウェルに20ulのAFP抗原液(0,
6,25,12,5,25,50,100゜200.4
00.1000.4000 n g/m 1濃度の抗原
液を使用した)を添加した後、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識した抗AFPマウス抗体を300ul添加し
、室温にて1時間放置し、B液にて3回洗浄し、ペルオ
キシダーゼの基質液(ABTS及び過酸化水素の溶液)
200ulを添加し、30分間放置してからシコウ酸溶
液(pH1,0)を100ul添加して反応を停止させ
、各ウェルの415nmにおける吸光度を測定して行っ
た。
6,25,12,5,25,50,100゜200.4
00.1000.4000 n g/m 1濃度の抗原
液を使用した)を添加した後、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識した抗AFPマウス抗体を300ul添加し
、室温にて1時間放置し、B液にて3回洗浄し、ペルオ
キシダーゼの基質液(ABTS及び過酸化水素の溶液)
200ulを添加し、30分間放置してからシコウ酸溶
液(pH1,0)を100ul添加して反応を停止させ
、各ウェルの415nmにおける吸光度を測定して行っ
た。
図1に対照例及び凍結乾燥を施した本発明の方法により
作製されたプレートでの結果を示す。
作製されたプレートでの結果を示す。
比較例 1
凍結乾燥前のウェルの洗浄を、シュークロースを含まな
い生理食塩水で行った以外は実施例1の凍結乾燥を施し
たプレートと同様に作製されたプレートについて、実施
例1と同様の891定を行った。
い生理食塩水で行った以外は実施例1の凍結乾燥を施し
たプレートと同様に作製されたプレートについて、実施
例1と同様の891定を行った。
結果を図1に合わせて示す。
実施例 2
実施例1と同様に作製されたプレートを凍結乾燥後、ア
ルミニウム袋(トーフジバック■製アルミニウム無地袋
170X240本)でパウチし、50℃にて360時間
インキュベートした。また、対照として同様に作製され
たプレートを凍結乾燥せずに実施例2と同様にパウチし
、4℃で360時間インキュベートしたプレートを用い
た。
ルミニウム袋(トーフジバック■製アルミニウム無地袋
170X240本)でパウチし、50℃にて360時間
インキュベートした。また、対照として同様に作製され
たプレートを凍結乾燥せずに実施例2と同様にパウチし
、4℃で360時間インキュベートしたプレートを用い
た。
これらのプレートについて、実施例1と同様の方法で測
定を行った。結果を図2に示す。尚、凍結乾燥されたプ
レートについては、測定に先立って各ウェル中にB液を
満たし、これを除去する操作を行っている。
定を行った。結果を図2に示す。尚、凍結乾燥されたプ
レートについては、測定に先立って各ウェル中にB液を
満たし、これを除去する操作を行っている。
比較例 2
凍結乾燥前のウェルの洗浄を、シュークロースを含まな
い生理食塩水で行った以外は実施例1の凍1+’i乾燥
を施したプレートと同様に作製されたプレートについて
、実施例2と同様にパウチし50℃で360時間\イン
キュベートした後測定を行った。結果を図2に合わせて
示す。
い生理食塩水で行った以外は実施例1の凍1+’i乾燥
を施したプレートと同様に作製されたプレートについて
、実施例2と同様にパウチし50℃で360時間\イン
キュベートした後測定を行った。結果を図2に合わせて
示す。
実施例 3
ヒトAFPウサギ抗体を実施例1と同様の方法によりマ
イクロタイタープレートに結合させ、実施例1と同様に
ブロッキングを行った。プレートを生理食塩水で3回洗
浄した後、表、1に示す試薬を含む生理食塩水を用いて
1回洗浄し、接液を除去した。このプレートを凍結乾燥
した後、窒素ガス存在下で実施例2と同様にパウチした
。
イクロタイタープレートに結合させ、実施例1と同様に
ブロッキングを行った。プレートを生理食塩水で3回洗
浄した後、表、1に示す試薬を含む生理食塩水を用いて
1回洗浄し、接液を除去した。このプレートを凍結乾燥
した後、窒素ガス存在下で実施例2と同様にパウチした
。
前記の様に準備されたプレートを、−20℃又は50℃
のインキュベーター中に120時間放置した。プレート
中の各ウェルにB液を満たし、これを除去した後、40
0ng/ml濃度のAFP抗原′ttlを用いて実施例
1と同様の測定を行った。
のインキュベーター中に120時間放置した。プレート
中の各ウェルにB液を満たし、これを除去した後、40
0ng/ml濃度のAFP抗原′ttlを用いて実施例
1と同様の測定を行った。
その結果を表1に示す(ただし、表1における結果は、
415nmでの、400ng/mNa度の抗原液を添加
した時の吸光度から抗原液を添加していない時の吸光度
を差し引いた値を示す)。
415nmでの、400ng/mNa度の抗原液を添加
した時の吸光度から抗原液を添加していない時の吸光度
を差し引いた値を示す)。
表 1
ただし、BSAは牛血清アルブミンを、PEGはポリエ
チレングリコールを、pvpはポリビニルピロリドンを
それぞれ示す。
チレングリコールを、pvpはポリビニルピロリドンを
それぞれ示す。
図1は実施例1及び比較例1の結果を示す図であり、図
2は実施例2及び比較例2の結果を示す図である。両図
中、(ロ)は各実施例における対照を、(○)は各実施
例における本発明の方法に従って作製されたプレートを
用いた場合の結果を、(△)は各比較例の結果をそれぞ
れ示す。
2は実施例2及び比較例2の結果を示す図である。両図
中、(ロ)は各実施例における対照を、(○)は各実施
例における本発明の方法に従って作製されたプレートを
用いた場合の結果を、(△)は各比較例の結果をそれぞ
れ示す。
Claims (4)
- (1)抗体を結合させた担体を安定化剤を含有する洗浄
液で洗浄した後凍結乾燥することを特徴とする免疫測定
用材料の安定化方法。 - (2)安定化剤が少なくとも単糖類、二糖類、デキスト
ラン又はポリビニルピロリドンから選ばれる1種以上で
ある請求項第(1)項記載の方法。 - (3)担体が免疫反応用プレートであることを特徴とす
る請求項第(1)項又は第(2)項記載の方法。 - (4)請求項第(1)項記載の方法で得られる免疫反応
用材料に乾燥空気又は窒素ガスを充填し包装することを
特徴とする免疫測定用材料の安定化方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP31497388A JPH02161357A (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫測定用材料の安定化方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP31497388A JPH02161357A (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫測定用材料の安定化方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02161357A true JPH02161357A (ja) | 1990-06-21 |
Family
ID=18059897
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP31497388A Pending JPH02161357A (ja) | 1988-12-15 | 1988-12-15 | 免疫測定用材料の安定化方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH02161357A (ja) |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005062050A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited | A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) |
JP2006501441A (ja) * | 2002-08-02 | 2006-01-12 | グリコマインズ リミテッド | 多発性硬化症を診断するための方法 |
JP2008105973A (ja) * | 2006-10-24 | 2008-05-08 | Toyo Kohan Co Ltd | ポリペプチド固定化担体の保存方法 |
US8048639B2 (en) | 2009-02-12 | 2011-11-01 | Glycominds Ltd. | Method for evaluating risk in multiple sclerosis |
JPWO2011158759A1 (ja) * | 2010-06-16 | 2013-08-19 | ウシオ電機株式会社 | 生産装置、生産方法、抗体チップ、プログラム及び記録媒体 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58123459A (ja) * | 1982-01-19 | 1983-07-22 | Mitsui Toatsu Chem Inc | 安定化された固相試薬及びその製造方法 |
JPS6035263A (ja) * | 1983-08-05 | 1985-02-23 | Wako Pure Chem Ind Ltd | 不溶性担体に固定化された免疫活性物質の安定化法及び該物質を構成単位として含む生理活性物質測定用試薬 |
JPS61241665A (ja) * | 1985-04-18 | 1986-10-27 | Toyobo Co Ltd | 安定化された固相試薬 |
-
1988
- 1988-12-15 JP JP31497388A patent/JPH02161357A/ja active Pending
Patent Citations (3)
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WO2005062050A1 (en) * | 2003-12-23 | 2005-07-07 | Maharashtra Hybrid Seeds Company Limited | A method for the preparation of ready-to-use solid support for rapid enzyme-linked immunosorbent assay (elisa) |
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