JPH02161357A - 免疫測定用材料の安定化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、免疫ａＰＩ定に用いる抗体を結合させた担体
の安定化方法に関するものである。更に詳しくは、免疫
測定に用いる抗体を結合させた担体をより長きに渡って
、かつ、抗体等の劣化を生じさせないようにするための
安定化方法に関するものである。

（従来の技術とその課題） 一般に、血清や尿等の生体試料液中の、例えば蛋白質や
ホルモン等の免疫反応における抗原として機能する微量
生体物質の含有量を測定するために、ｍ体に抗体を結合
させた免疫測定用材料を用いることが多い。

このような免疫測定材料は、例えば牛血清アルブミン等
の蛋白質を含む適当な緩衝液中で安定化され、保存され
ることが多い。しかし、このような安定化方法では、例
えば製造者か・ら使用者へ免疫反応測定用材料が渡るま
での比較的長い期間を通しての性能の維持に課題があっ
た。即ち、長い期間の間に、例えば担体からの抗体の剥
離が生じたり、又例えば抗体自体の性能（抗原との特異
的親和性能等）が劣化する。

他に、凍結乾燥を行う安定化方法も知られているが、該
方法では、凍結乾燥の操作の際に抗体の失活が起り易く
又操作時のわずかな条件の違いにより、安定化の度合い
に変化が生じるため、操作に先立っての凍結乾燥操作の
条件の設定と、操作中の条件の監視等煩わしい操作が必
要である。

このような状況にあって、前記した凍結乾燥による安定
化方法において、牛血清アルブミン等の蛋白質を安定化
剤として含むリン酸緩衝戒等と共に免疫反応Ａ−１定用
材料を凍結乾燥する方法もまた知られている。しかし、
該方法においては、製造される免疫反応７１＄１定用材
料中に牛血清アルブミン等の蛋白質に由来する白色の粉
体が共存することとなるために見栄えが悪いこと、その
ような粉体が溶解し難いため、使用する際に多少の準備
時間が必要になること又材料の輸送中に不測の事態が生
じた場合に、乾燥され、粉体状態にされた蛋白質等が飛
散し易い等の課題がある。

以上のような現状に鑑み、本発明者らは、担体に結合さ
せた抗体の失活が少なく、長期間に渡って材料を保存で
き、更には使用する際に容易に溶解可能な凍結乾燥材料
を提供すべく鋭意研究した結果本発明を完成させた。即
ち本発明は、抗体を結合させた担体を安定化剤を含有す
る洗浄液で洗浄した後凍結乾燥することを特徴とする免
疫測定用材料の安定化方法を提供するものである。

以下に本発明を詳細に検討する。

（課題を解決するための手段） 本発明で、抗体とは、公知の方法によって得られる種々
の抗体を指す。例えば、抗原を動物に免疫することで得
られるポリクローナル抗体や抗体産生細胞と***細胞の
融合細胞（ハイブリドーマ）により産生されるモノクロ
ーナル抗体等がある。

抗体は、そのクラス、サブクラス更にはその由来等、同
等制限はない。

担体とは、抗体を結合するための表面を提供できるもの
であれば良い。

抗体と担体を結合させる方法としては、化学的結合を利
用する方法、担体の吸着力を利用する方法がある。この
方法では、例えばポリスチレン等の抗体と親和性をａす
る担体等を使用するか、あるいは表面を抗体と親和性を
有する樹脂等で被覆された担体を使用すれば良い。更に
担体は、例えば磁性粒子等を含有していてもよく、その
寸法等においても制限はない。

本明細書中でいう免疫測定用材料とは、前記した担体自
体あるいは前記の担体を含む免疫反応容器である。具体
的には、免疫反応用プレート等の、それ自体抗体を結合
させる表面を提供する担体であって同時に免疫反応用材
料であるものがある。

他の具体的な形態として、その表面に抗体を結合させた
ビーズ（本明細書中でいう担体に該当する）をその中に
有する反応カップがある。

本発明の安定化方法は、抗体を結合させた担体を安定化
剤を含有する洗浄液で洗浄し、その後凍結乾燥すること
からなる。ここで、洗浄とは、例えばｌ′１１体を洗浄
液中に浸し、抜液と分離することにより行えばよい。従
って、本発明では使用する安定化剤の量は少量ですみ、
洗浄操作も簡ｔｌｉなもので実施可能である。免疫／ｌ
ｌ１１定用材料がそれ自体担体である例えばプレートの
ようなものである場合には該材料を洗浄し、凍結乾燥す
れば良く、材料が担体と担体を収容する容器等からなる
場合には、ｔｕ体体刑別個若しくは担体を容器等に収容
した状態で洗浄し、別個にした場合にはそれらを一体に
して凍結乾燥すれば良い。凍結乾燥は、公知の条件下で
行えばよく、例えば−８０〜−２０℃のインキュベータ
ー中で２〜２４時間かけて材料を凍結させた後、０．０
１〜Ｑ、２ｔｏｒｒの減圧下−２０〜Ｑ℃で、３〜１６
時間乾燥させ、更に室温で２〜４時間乾燥させる方法が
例示できる。

本発明では、安定化剤として例えば、グルコース、フル
クトース等の単糖類、ショ糖、乳糖等の二単糖又はデキ
ストラン、ポリビニルピロリドン専を使用することがで
きる。

洗浄液は、例えば生理食塩水や結合された抗体を変性さ
せないｐＨを釘する緩衝液等、格別の制限なく使用でき
る。

本発明の方法に従って得られた凍結乾燥材料は、例えば
乾燥空気や窒素ガスを充填した状態で包装することで、
更に長期に渡って安定的に保存することができる。

（発明の効果） 本発明によれば、免疫反応用材料を長期に渡って安定化
できる。このことは、結合された担体の劣化を防ぎ、該
材料の性能を低下させることなしに保存できることを意
味するものである。

本発明の方法では、従来、担体と共に凍結乾燥している
安定化剤が洗浄液と共に大部分回収されることから、安
定化の際の使用量を少なくすることができる。また、こ
のように洗浄の後、洗浄液を回収することにより、材料
中の水分を従来に比較【、て少なくできることから、凍
結乾燥操作自体に要する時間を短縮化できる。又、安定
化剤の使用量を少なくできることから、製造された材料
を運搬中に不測の、！１１態が生じたとしても、安定化
剤の飛散は少なくて済むこととなる。

更に、本発明の方法に従って安定化した免疫反応用材料
は、熱に対しての安定性も良好であり、実施例に示す条
件では５０℃で３６０時間放置した場合にもその劣化は
微量である。

更には、安定化剤として単糖類、二糖類、デキストラン
又はポリビニルピロリドン等を用いた場合には、材料を
使用する際の材料の溶解を担持間で行うことができる。

又、安定化剤に糖類を用いることにより、製造された材
料の見栄えを良くすることができる。

凍結乾燥した材料を乾燥空気や窒素ガスを充填した後包
装することにより、免疫反応材料を更に長期に渡り保存
することができる。

（実施例） 以下に本発明を更に詳細に説明するために実施例を示す
が、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１　（ヒトαフェトプロティンの酵素免疫測定用
材料の安定化） 本実施例において使用した溶液は、 Ａ液；５０ｍＭ炭酸すトリウム緩衝液（ｐＨ９，６） Ｂ液；以下の組成のｐＨ７，４の緩衝液塩化ナトリウム
−５ｇ／ｌ。

リン酸水素カリウム−０，２ｇ／ｌ。

リン酸水素２ナトリウムー１．１５ｇ／ｌ塩化カリウム
−０，２ｇ／ｌ ｔｗｅｅｎ　　２０−０．５ｍｌ／１ ポリスチレン性マイクロタイタープレート（ヌンク社製
イムノプレート■）の各ウェルに、通常の方法に従って
調製されたヒトαフェトプロティン（以下ＡＦＰという
）のマウスモノクローナル抗体５μｇ　／　ｍ　ｌを２
００ｕｌずつ分注した。

この時、Ａ液を抗体の溶解液として使用した。

該プレートを４℃にて一晩放置した後、Ｂ液にて洗浄し
、更にブロッキングのため、牛血清アルブミンを０．１
爪口％となるように添加したＢ［を各ウェルに３００ｕ
ｌずつ分注し、４℃で一晩放置した。

各ウェルを０．８５重量％の塩化ナトリウム水溶液で洗
浄し、更に１０重置火のシュークロースを含む生理食塩
水で洗浄した後、抜液を除去し、通常の方法に従って該
プレートを凍結乾燥した。

対照として、同様の処理を施したプレートを凍結乾燥し
ていない物を用いた。

凍結乾燥されたプレートについては、プレート中の各ウ
ェルにＢ液を満たし、これを除去して以下の測定に使用
した。

ＡＰＩ定は、各ウェルに２０ｕｌのＡＦＰ抗原液（０，
６，２５，１２，５，２５，５０，１００゜２００．４
００．１０００．４０００　ｎ　ｇ／ｍ　１濃度の抗原
液を使用した）を添加した後、西洋ワサビペルオキシダ
ーゼで標識した抗ＡＦＰマウス抗体を３００ｕｌ添加し
、室温にて１時間放置し、Ｂ液にて３回洗浄し、ペルオ
キシダーゼの基質液（ＡＢＴＳ及び過酸化水素の溶液）
２００ｕｌを添加し、３０分間放置してからシコウ酸溶
液（ｐＨ１，０）を１００ｕｌ添加して反応を停止させ
、各ウェルの４１５ｎｍにおける吸光度を測定して行っ
た。

図１に対照例及び凍結乾燥を施した本発明の方法により
作製されたプレートでの結果を示す。

比較例　１ 凍結乾燥前のウェルの洗浄を、シュークロースを含まな
い生理食塩水で行った以外は実施例１の凍結乾燥を施し
たプレートと同様に作製されたプレートについて、実施
例１と同様の８９１定を行った。

結果を図１に合わせて示す。

実施例　２ 実施例１と同様に作製されたプレートを凍結乾燥後、ア
ルミニウム袋（トーフジバック■製アルミニウム無地袋
１７０Ｘ２４０本）でパウチし、５０℃にて３６０時間
インキュベートした。また、対照として同様に作製され
たプレートを凍結乾燥せずに実施例２と同様にパウチし
、４℃で３６０時間インキュベートしたプレートを用い
た。

これらのプレートについて、実施例１と同様の方法で測
定を行った。結果を図２に示す。尚、凍結乾燥されたプ
レートについては、測定に先立って各ウェル中にＢ液を
満たし、これを除去する操作を行っている。

比較例　２ 凍結乾燥前のウェルの洗浄を、シュークロースを含まな
い生理食塩水で行った以外は実施例１の凍１＋’ｉ乾燥
を施したプレートと同様に作製されたプレートについて
、実施例２と同様にパウチし５０℃で３６０時間＼イン
キュベートした後測定を行った。結果を図２に合わせて
示す。

実施例　３ ヒトＡＦＰウサギ抗体を実施例１と同様の方法によりマ
イクロタイタープレートに結合させ、実施例１と同様に
ブロッキングを行った。プレートを生理食塩水で３回洗
浄した後、表、１に示す試薬を含む生理食塩水を用いて
１回洗浄し、接液を除去した。このプレートを凍結乾燥
した後、窒素ガス存在下で実施例２と同様にパウチした
。

前記の様に準備されたプレートを、−２０℃又は５０℃
のインキュベーター中に１２０時間放置した。プレート
中の各ウェルにＢ液を満たし、これを除去した後、４０
０ｎｇ／ｍｌ濃度のＡＦＰ抗原′ｔｔｌを用いて実施例
１と同様の測定を行った。

その結果を表１に示す（ただし、表１における結果は、
４１５ｎｍでの、４００ｎｇ／ｍＮａ度の抗原液を添加
した時の吸光度から抗原液を添加していない時の吸光度
を差し引いた値を示す）。

表　　１ ただし、ＢＳＡは牛血清アルブミンを、ＰＥＧはポリエ
チレングリコールを、ｐｖｐはポリビニルピロリドンを
それぞれ示す。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例１及び比較例１の結果を示す図であり、図
２は実施例２及び比較例２の結果を示す図である。両図
中、（ロ）は各実施例における対照を、（○）は各実施
例における本発明の方法に従って作製されたプレートを
用いた場合の結果を、（△）は各比較例の結果をそれぞ
れ示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体を結合させた担体を安定化剤を含有する洗浄
   液で洗浄した後凍結乾燥することを特徴とする免疫測定
   用材料の安定化方法。
2. （２）安定化剤が少なくとも単糖類、二糖類、デキスト
   ラン又はポリビニルピロリドンから選ばれる１種以上で
   ある請求項第（１）項記載の方法。
3. （３）担体が免疫反応用プレートであることを特徴とす
   る請求項第（１）項又は第（２）項記載の方法。
4. （４）請求項第（１）項記載の方法で得られる免疫反応
   用材料に乾燥空気又は窒素ガスを充填し包装することを
   特徴とする免疫測定用材料の安定化方法。