JPH02145187A - ２機能性キメラ抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 奮栗上旦剋里圀野 本発明は、ヒト癌胎児性抗原および金属キレートに対す
るモノクローナル２機能性抗体に関するものである。さ
らに詳しくは、本発明は、インビトロおよびインビボで
の利用のための、上記抗原に対する新規な２Ｒ能性キメ
ラモノクロ一ナル抗体、および該抗体をコードしている
ＤＮＡ構築物に関するものである。

従来技術とその課題 モノクローナル抗体は、インビトロにおいてはイムノア
ッセイでの利用、およびインビボにおいては疾患の診断
および治療にと、両分野においてますます重要性を増し
つつある。ヒト癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に対するモノク
ローナル抗体は、結腸直腸癌や乳癌などのある種の癌腫
に関連する腫瘍のインビボイメージングおよび治療にと
くに有用である。臨床面への適用に応じて、これらのモ
ノクローナル抗体は、一般に放射性核種、薬物またはト
キンン（毒素）と結合（コンジュゲート）されるもので
ある。

しかしながら、最も利用可能なモノクローナル抗体は、
不ズミ、即ちマウスのハイブリドーマから導かれる。イ
ンビトロでのイム／アッセイにネズミ抗体を適用するこ
とには、血清成分とネズミ免疫グロブリンとの反応によ
る偽陽性結果を伴うという問題が起こり得る。また、さ
らに重要なことは、ネズミ抗体のヒト用医薬中へのイン
ビボ適用は、それに固有の免疫原性によってしばしば制
限されるということである。ネズミ抗体の適用は、多く
の患者で免疫応答を誘発し、多数回投与治療の間に抗体
の効果が徐々に減少してしまう。この効果減少の原因は
、少なくとも部分的には、循環系からの迅速なりリアラ
ンス（清掃）、または患者の免疫応答によるネズミ抗体
の薬物動態学的性質の変化にあるとすることができる。

したがって、ネズミモノクローナル抗体は関連の免疫原
性により、長期的な複数回投与から除外されることとな
り、実質上、その潜在的な治療上の価値は打撃を受ける
。ヒトモノクローナル抗体を臨床使用すると、ネズミモ
ノクローナル抗体の使用に伴う制限を克服し得ることが
示唆されている。しかし、腫瘍関連抗原、例えばヒト癌
胎児性抗原に対する所望の特異性および親和性を有する
ヒトモノクローナル抗体は、その製造が技術的に困難で
ある。

ａＢを解決するための手段 １つの種から導かれた抗体の結合領域すなわち可変領域
と、別の種から導かれた抗体の定常領域とが結合してい
るキメラ抗体が、組換えＤＮＡ法で構築されている。キ
メラ抗体は、たとえば、ヨーロア　ハ特許公開第ｔ　７
３４９４　号；ショーラ（Ｓｈａｗ）、ジャーナル・オ
ブ・イムノ、（Ｊ、Ｉｎ５ｕｎ、）、１３８：４５３４
（１９８７）；サンら（ＳｕｎＬ。

Ｋ、）、プロシーデインゲス身オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシイズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ｔＪｓＡ）　、８４：
２１４　２１８（１９８７）；ニューバーガーら（Ｎ　
ｅｕｂｅｒｇｅｒ。

Ｍ、Ｓ、）、ネイチャー（Ｎ　ａｔｕｒｅ）、３１４：
２６８（１９８５）；ボーリアンら（Ｂ　ｏｕｌｉａｎ
ｎｅ、　Ｇ　、　Ｌ　、　）、ネイチャー、３１２：６
４３−６４６（１９８４）；およびモリソンら（Ｍｏｒ
ｒｉｓｏｎ、　Ｓ　、　Ｌ　、　）、プロシーデインゲ
ス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシ
イズＵＳＡ、８１二６８５１−６８５５　（１９８４）
に記載されている。通常は、不ズミ抗体の可変領域とヒ
ト抗体の定常領域とが結合されている。そのようなキメ
ラ抗体の大部分はヒト成分であるために、実質上、ネズ
ミ抗体よりも免疫原性が低いと考えられる。したがって
、インビボでの適用にはキメラモノクローナル抗体が極
めて望ましい。

キメラ抗体の構築の重要性に加え、さらに２機能性抗体
を構築することが望ましい。２機能性抗体は、第１の特
異的抗原を認識する１つの抗体由来のＬ鎖（軽鎖）およ
びＨ鎖（重鎮）を、第２の特異的抗原を認識する別の抗
体由来のＬ鎖およびＨ鎖と共に含有している抗体である
。このような二元性の特異性を有する抗体は、病的状態
を予測、診断および治療する上で非常に有用である。た
とえば、２機能性抗体のし鎖およびＨ鎖の１つの組が腫
瘍関連抗原を認識するとともに、対応するＬ鎖およびＨ
鎖が金属キレートを認識する場合、この２機能性抗体は
腫瘍のイメージングおよび治療に使用することができる
。

この２機能性抗体を患者の身体に導入すると、抗体の１
部分のし鎖およびＨ鎖は腫瘍関連抗原に特異的に結合す
る。金属キレートを患者身体に導入すると、２機能性抗
体の金属キレートと結合するアームが反応し得る抗原の
量を知ることができる。非常に小さな分子である遊離の
金属キレートは急速に患者システムを通り抜けるので、
２機能性抗体が結合した腫瘍部位のイメージングが増強
される。

本発明は、具体的には、ある１つのＬ鎖およびＨ鎖がＣ
ＥＡを認識すると共に、別のＬ鎖およびｌ（鎖が金属キ
レートを認識するキメラ２機能性抗体を提供するもので
ある。本発明の２機能性キメラ抗体の金属キレートと特
異的に結合するＬ鎖およびＨ鎖可変領域は、モノクロー
ナル抗体ＣＨＡ２５５　［レードン（Ｒｅａｒｄｏｎ）
らのネイチャー３１６・２６５−２６８（１９８５）に
開示されているコから誘導された。このＣＨＡ２５５抗
体は、インジウム（１ｍ）のＥＤＴＡキレートと最も効
率良（結合するか、鉄（Ｈ）およびカドミウム（Ｉｆ）
のＥＤＴＡキレートをも認識するものである。

２機能性かつキメラの抗体についての一般的な概念は記
載されているが、前もって定める興味ある抗原、特にヒ
ト癌胎児性抗原および金属キレートに対する特異性、な
らびにアミノ酸配列が定義されている（分かっている）
可変領域を有する新規な２機能性キメラ抗体の開発が必
要とされている。さらに、新規な２機能性キメラ抗体を
構成するＬ鎖およびＨ鎖可変領域をコードする定義され
たＤＮＡｌｌｌｉ号配列を有するＤＮＡ構築物であって
、真核性細胞内でこれらの新規な２機能性キメラタンパ
ク質を発現することができるＤＮＡ構築物の開発が要望
されている。本発明は、これらの要望に応えるものであ
る。

本明細書に開示し、特許請求する発明の目的に従い、下
記のとおり用語を定義する。

ｒＡＪ−デオキシアデノシン。

ｒ　Ａ　１ａＪ−アラニン残基。

ｒ　Ａ　ｐ”Ｊ−アンピシリン耐性表現型またはそれを
付与する遺伝子。

ｒＡｒｇｊ−アルギニン残基。

ｒＡｓｒ＋」−アスパラギン残基。

「Δ５ｐＪ−アスパラギン酸残基。

「２機能性抗体」−第１の抗原と特異的に反応するし鎖
可変領域およびＨ鎖可変領域を、第２の異なる抗原と特
異的に反応するＬ鎖可変領域およびＨ鎖可変領域と共に
含有する抗体。

ｒＣＪ−デオキシシトシン。

「キメラ抗体」−ある１つの種、通常はマウス由来の可
変領域であって、別の異なる種、通常はヒト由来の定常
領域に結合している該可変領域を含有する抗体。

ｒｃｙｓＪ−システィン残基。

ｒＧＪ−デオキシグアノシン。

ｒＧｌｎＪ−グルタミン残基。

「ＧｌｕＪ−グルタミン酸残基。

ｒＧｌｙＪ−グリシン残基。

ｒＣＪ　１８”Ｊ　−Ｇ４１８耐性表現型またはそれを
付与する遺伝子。ｒＫｍ”Ｊとして定義されていること
もある。

ｒ　Ｈ１ｓＪ−ヒスチジン残基。

ｒ　Ｉ　ＩｅＪ−インロイシン残基。

ｒｌＶｓＪ−イントロンをコードしているＤＮＡであり
、「介在配列」とも呼ばれる。

ｒＬｙｓＪ−リジン残基。

ｒＭｅｔｊ−メチオニン残基。

ｒＭｏＡＢＪ−モノクローナル抗体。

［形成期タンパク質（ｎａｓｃｅｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ
）ｊ−翻訳後改変（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ
ａｌ　ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）以前に、５ＲＮＡ転
写体の翻訳時に調製されるポリペプチド。

ｒｐＡＪ−ポリアデニル化シグナルをコードしているＤ
ＮＡ配列。

ｒＰｈｅＪ　　フェニルアラニン残基。

ｒＰｒｏＪ−プロリン残基 ［プロモーターＪ−ＤＮＡのＲＮＡへの転写を指令する
ＤＮＡ配列。

「組換えＤＮＡクローニングベクター」−１つまたはそ
れ以上の付加的なりＮＡ上セグメント追加できるか、あ
るいは既にそれが追加されているＤＮＡ分子を含有する
自律的に複製可能な物質であり、これには例えばプラス
ミドまたはファージを挙げることができるが、これらに
限定されない。

「組換えＤＮＡ発現ベクター」−プロモーターが組み込
まれている組換えＤＮＡクローニングベクター 「レプリコン」−プラスミドまたは他のベクターの自律
的な複製を調節し、それを可能にするＤＮＡ配列。

［制限フラグメントＪ−１つまたはそれ以上の制限エン
ドヌクレアーゼ酵素の作用によって生成される線状ＤＮ
Ａ配列。

「感受性宿主細胞」−ある特定の抗生物質または池の毒
性化合物の存在下では、それに対する耐性を付与するＤ
ＮＡセグメントが無ければ増殖できない宿主細胞。

ｒｓｅｒＪ−セリン残基。

「構造遺伝子」−機能的ポリペプチドをコードしている
ＤＮＡ配列であって、翻訳開始および終止／グナルをも
含むＤＮＡ配列。

「Ｔ」−デオキシチミジン ｒＴａｌｌＪ−テトラサイタリン耐性表現型またはそれ
を付与する遺伝子。

ｒ′ｒｈｒＪ−スレオニン残基。

「Ｔｒｐ」−トリプトファン残基。

ｒＴｙｒＪ−チロシン残基。

ｒＶａｌＪ−バリン残基。

第１図は、プラスミドｐＭＬＣＥ−１ｏおよびプラスミ
ドｐＨＦＫ−１の制限部位および機能地図である。この
開示目的に照らし、図面は等尺で描いていない。

第２図は、プラスミドｐＦ（ＫＣＥ−１０およびプラス
ミドｐＧＣＥＭＫの制限部位および機能地図である。

第３図は、プラスミドｐＭＨＣＥ−３０およびプラスミ
ドｐＨＧＩＺの制限部位および機能地図である。

第４図は、プラスミドｐｉ−ＩＧＣＥＭ−３０およびプ
ラスミドｐＮｃＥＭＧｌの制限部位および機能地図であ
る。

第５図は、プラスミドｐＮｃＥＭＫＧｌの制限部位およ
び機能地図である。

第６図は、プラスミドｐＭＬｃＨ１およびｐＭＬＣＨｌ
ｄＢの制限部位および機能地図である。

第７図は、プラスミドｐＧＣＨＡＫの制限部位および機
能地図である。

第８図は、プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡおよびＩ
）ＨＧＩ−ＣＨＡの制限部位および機能地図である。

第９図は、プラスミドｐＧｃＨＡＧｌの制限部位および
機能地図である。

第１０図は、プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１の制限部位お
よび機能地図である。

本発明は、ある１つのＬ鎖可変領域および対応するある
１つのＨ鎖可変領域がヒト癌胎児性抗原を特異的に認識
するＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含有し、かつ別のＬ鎖可
変領域および対応する別のＨ鎖可変領域が金属キレート
を特異的に認識するし鎖およびＨ鎖可変領域を含有し、
さらに、すべてのし鎖およびＨ鎖の定常領域がヒト定常
領域を含有している２機能性キメラモノクローナル抗体
（および該抗体をコードしているＤＮＡ化合物）である
。ヒト癌胎児性抗原を認識するこの２機能性キメラモノ
クローナル抗体り鎖可変領域は、以下に記載のアミノ酸
配列と実質的に同じアミノ酸配列を有している： Ａｓｐ　−１１ａ　−Ｖａｌ　−Ｍｅｔ　−Ｔｈｒ　−
ＧＩＣＩ　−Ｓｅｒ　−Ｇｉｎ　−ＬｙｓＰｈｅ　−Ｍ
ａｔ　−Ｓａｔ　−’ｒｈｒ　−Ｓｅｒ　−Ｖａｌ　−
Ｇｕｙ　−Ａｓｐ　−ＡｒｇＶａｌ　−Ｓｅｔ　−１１
４！　−Ｔｈｒ　−Ｃｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ａｌａ　−Ｓ
ｅｒ　−Ｇｉｎ＾＠ｎ−Ｖａｌ−Ａｒｃ　−Ｔｈｒ　−
Ａｌａ　−Ｖａｌ　−Ａｌａ　−Ｔｒｐ　−ＴｙｒＧｌ
（１−ＧＩＥＩ　−Ｌｙｍ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ　−Ｇ
ｉｎ　−Ｓｅｒ　−Ｐｒｏ　−ＬｙｓＡｌａ　−Ｌｅｕ
　−Ｈｓ　−Ｔｙｒ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　−５ｅｒ−
Ａｓｎ　−ＡｒｇＴｙｒ　−Ｔｈｒ　−Ｇｌｙ　−Ｖａ
ｎ　−Ｐｒｏ　−Ａｓｐ　−Ａｒｇ　−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ
Ｇｌｙ　−Ｓｅｒ　−Ｇｌｙ　−Ｓ＠ｒ　−Ｇｌｙ　−
Ｔｈｒ　−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　−ＴｈｒＬｅｕ　−Ｔｈ
ｒ　−ＩＬａ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ｇｉ
ｎ　−Ｓｓｒ　−Ｇｌｕ＾ｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ａｌａ　
−Ａｓｐ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈｅ　−Ｃｙｓ　−Ｌａｕ　
−ＧｌｒｉＨｉｓ　−Ｔｒｐ−＾關−τｙｒ　−Ｐｒｏ
　−Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ　−Ｐｈｅ　−ＧｌｙＡｌａ　−
Ｇｌｙ　−Ｔｈｒ　−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ　−
Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ａｒｇ。

ヒト癌胎児性抗原を認識する２機能性キメラモノクロー
ナル抗体Ｈ鎖可変領域は、以下に記載のアミノ酸配列と
実質的に同じアミノ酸配列を有している： （以下余白） Ａｓｐ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｎ　−Ｌｅｕ　−Ｖａｌ　−
Ｇｌｕ　−Ｓｉｒ　−Ｇｌｙ　−ＧｌｙＧｌｙ　−Ｌａ
ｕ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｃｉ　−Ｐｒｏ　−Ｇｕｙ　−Ｇ
ｕｙ　−Ｓａｒ　−ＡｒｇＬｙｓ　−Ｌａｕ　−Ｓｉｒ
　−Ｃｙｓ　−Ａｌａ−Ａｌａ　−ｋｒ　−Ｇｌｙ　−
ＰｈａＴｈｒ　−Ｐｈａ　−５ｅｒ−Ａｓｎ　−Ｐｈａ
　−Ｇｕｙ　−Ｍｅｔ　−Ｈｉｓ−τ１１Ｉｓ　−Ａｒ
ｇ　−Ｇｉｎ　−Ａｌｍ　−１’ｒｏ　−Ｇｌｕ　−Ｌ
ｙｓ　−Ｇｌｙ−ムＵＧｌｕ　−Ｔｒｐ　−Ｖａｔ　−
Ａｌａ　−Ｔｙｒ　−ｌｉｅ　−ｓａｒ　−Ｇｌｙ　−
ＧｌｙＳｅｒ　−Ｓｅｔ　−Ｔｈｒ　−Ｈｓ　−Ｔｙｒ
　−Ｔａｒ−＾１ａ−＾ｓｐ　−ＴｈｒＶａｌ　−Ｌｙ
ｓ　−Ｇｕｙ　−Ａｒｇ　−！’ｈｅ　−Ｔｈｒ　−１
１ａ　−Ｓｅｔ　−ＡｒｇＡｓｐ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ
＋＾ｒｇ−Ａｓｎ　−’τｈｒ　−Ｌｅｕ　−Ｐｈａ　
−ＬａｕＧｉｎ　　−Ｍｅｔ　　＋　丁ｈｒ　　−Ｓｅ
ｒ　　−Ｌａｕ　　−Ａｒｃ　　−Ｓｅｔ　　−Ｇｌｕ
　　−＾ｓｐ丁ｈｒ　　−Ａｌａ　　−Ｍａｔ　　−Ｐ
ｈｓ　　−Ｔｙｒ　　−ＣＹ露　−Ａｌａ　　−Ａｒｇ
　　−ＡｓｐＴｙｒ　−Ｔｙｒ　−Ａｌａ　−Ａｓ１１
−＾ｓｎ−τｙｒ−τｒｐ　−Ｔｙｒ　−Ｐｈ＊Ａｓｐ
　−Ｖａｌ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｙ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ
　−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−Ｖａ１丁ｈｒ　　−Ｖａｌ　　
−Ｓａｒ　　−Ｓｅｒ　　−Ａ１ｍ金属キレートを認識
する２機能性キメラモノクローナル抗体し鎖可変領域は
、以下に記載のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配
列を有している： Ｇｉｎ　　Ａｌａ　　Ｖａｌ　　Ｖａｌ　　Ｔｈｒ　　
Ｇｉｎ　　Ｇｌｕ　　Ｓａｒ　　Ａｌｍ　　Ｌｅｕ　　
Ｔｈｒ　　Ｔｈｒ　　５ｅｒｉ’ｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ
　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　
Ａｒｇ　Ｓａｒ　Ｓｅｒ　ＴｈｒＧｌｙ　Ａｌａ　Ｖａ
ｌ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｓｅｔ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｌａ
　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　ＧｉｎＧｌｕ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌ
ｙ　Ｌａｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　ＧｌｙＴｈｒ　Ａｓｎ　
Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐ
ｒ＋）Ａｌｍ　Ａｒｇ　Ｐｈａ　５ｅｒＧｌｙ　Ｓｅｒ
　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｌａ　
Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｉｌｅ　ＴｈｒＧｌｙ　Ａｌ
ａ　ＧＬｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ａｌａ
　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　Ｃｙｓ　ＡｌａＬｅｕ　Ｔ
ｒｐ　Ｔｙｒ　！３ｅｒ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｔｔｐ　Ｖ
ａｌ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｇａｙ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＬｙｓ
　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ。

金属キレートを認識する２＠能性キメラモノクａ−ナル
抗体Ｉ（鎖可変領域は、以下に記載のアミノ酸配列と実
質的に同じアミノ酸配列を有している： 本発明の化合物は、組換え２機能性キメラモノクローナ
ル抗体ＣＥＭ／ＣＨＡを表すものである。

ＤＮＡ塩基対の相補性により、二重鎖のＤＮＡ分子の一
本鎖の配列を描けば、向かい合った鎖の配列を決定する
のに十分である。ヒト癌胎児性抗原を認識する２機能性
キメラモノクローナル抗体り鎖可変領域をコードしてい
る遺伝子のヌクレオチド配列は、式： ％式％） ＧＡＣ−ＡＴＴ　−ＧＴＧ　　−ＡＴＧ　−ＡＣＣ−Ｃ
ＡＧ　−ＴＣＴ　−ＣＡＡ　−ＡＡＡＴｒＣ−ＡＴＯ−
ＴＣＣ−ＡＣＡ　−ＴＣＡ　−ＧＴＡ　−ＧＧＡ　−Ｇ
ＡＣ−ＡＧＧＧＴＣ−ＡＧＣ−ＡＴＣ−ＡＣＣ−ＴＧＣ
−ＡＡＧ　−ＧＣＣ−ＡＧＴ　−ＣＡＧＭＴ　−釧了−
ＣＧＴ　−Ａｌπ−ＧＣＴ　−ＧＴＴ　−ＧＣＣ−ＴＧ
Ｏ−ＴＡＴＣＡＡ　−ＣＡＧ　−ＡＡＡ　−ＣＣＡ　−
ＧＧＧ　−ＣＡＧ　−ＴＣＴ　−ＣＣＴ　−ＡＡＡＣＣ
Ａ　−ＣＴＧ　−、ＡＴｒ　−’ｒＡＣ−ＴＴＧ　−Ｇ
ＣＡ　−ＴＣＣ−ＡＡＣ−ＣＧＧ丁ＡＣ−Ａ（ゴーＧＧ
Ａ　−釘Ｃ−αゴーＧＡＴ　−ＣＧＣ−ＴｒＣ−＾ムＧ
ＧＣ−ＡＧＴ　−ＧＧＡ　−ＴＣＴ　−ＧＧＧ　−ＡＣ
Ａ　−ＯＡＴ　−ＴｒＣ−ＡＣＴＣＴＣ−ＡＣＣ−ＡＴ
Ｔ　　−ＡＣＣ−ＡＡＴ　　−ＧＴＧ　　−ＣＡＡ　　
−ＴＣＴ　　−０ＡＡＣＡＣ−ＣＴＧ　−ＧＣＡ　−Ｇ
ＡＴ　−ＴＡＴ　−ＴＴＣ−ＴＧＴ　−ＣＴＧ　−ＣＡ
ＡＣＡＴ　−ＴＧＧ　−ＡＡＴ　−ＴＡＴ　−ＣＣＧ　
−ＣＴＣ−ＡＣＧ　−ＴＴＣ−ＣＧＴＧＣＴ　　−ＧＧ
Ｇ　　−ＡＣＣ−ＡＡＧ　　−ＣＴＧ　　−ＧＡＧ　　
−ＣＴＣ−ＡＡＡ　　−ＣＧＧで示される。

ヒト癌胎児性抗原を認識する２機能性キメラモノクロー
ナル抗体Ｈ鎖可変領域をコードしてζＸる遺伝子のヌク
レオチド配列は、式： ％式％（ 金属キレートを認識する２機能性キメラモノクローナル
抗体り鎖可変領域をコードしゼいる遺伝子のヌクレオチ
ド配列は、式； ％式％ 金属牛レートを認識する２機能性キメラモノクローナル
抗体Ｈ鎖可変領域をコードしている遺伝子のヌクレオチ
ド配列は、式： ％式％ 本発明の新規なりＮＡ化合物は、２つの別のハイブリド
ーマセルラインから調製されるゲノムＤＮＡクローンか
ら誘導される。ヒト癌胎児性抗原を認識する免疫グロブ
リン鎖を発現するＬ鎖および１（鎖可変領域遺伝子を、
ハイブリドーマＣＥＭ２３１．６．７のゲノムＤＮＡラ
イブラリーからクローンした。ネズミハイブリドーマＣ
ＥＭ２３１゜６７は、アメリカン・タイプ・カルチャー
・コレ／ｇン、ロックビレ、メリーランド（Ａｍｅｒｉ
ｃａｎ′Ｆｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉ
ｏｎ、　　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）のパーマネン
ト・ストック・カルチャー・コレクションの一部であり
、受託番号ＡＴｃｃ　ＨＢ９６２０の下で入手可能であ
る。金属キレートを認識する免疫グロブリン鎖を発現す
るＬ鎖およびＨ鎖可変領域遺伝子を、ハイブリドーマＣ
ＨＡ２５５．５°のゲノムＤＮＡライブラリーからクロ
ーンした。ネズミハイブリドーマＣｌ（Ａ　２５５　。

５は、レードンらのネイチャー３１６：２６５２６８　
（１９８５）に開示されている。ネズミハイブリドーマ
ＣＨＡ２５５．５はさらに、メアレス（Ｍｅａｒｅａ）
およびデイビット（Ｄａｖｉｄ）の米国特許第４．７２
２，８９２号［１９８８年２月２日発行］にも開示され
ている。すべてのＬ鎖およびＨ鎖のヒト定常領域をコー
ドしている遺伝子構築物をヒト赤血球細胞から誘導され
た遺伝子ライブラリーからクローンした。本発明は、大
量の２機能性キメラ抗体を生物学的に生産することがで
きるという、メディカルサイエンスにとって必要とされ
る利益を初めて提供するものである。

プラスミドｐＭＬＣＥ−１０は、ヒト癌胎児性抗原を認
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＬ鎖可変領域のゲ
ノム配列を含有している。プラスミドｐＭＬＣＥ−１０
は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレジョン、ロ
ックビレ、メリーランド（ＡＬＩｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐ
ｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ。

Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ）のパーマネント・コレク
ションの一部であり（１９８８年３月４日寄託）、受託
番号ＡＴＣＣ６７６３９の下で人手可能である。プラス
ミドｐＨＫＦ−１は、ヒト抗体のし鎖定常領域のゲノム
配列を含有する。プラスミドｐ１−Ｉ　Ｋ　Ｆ　−１は
、ＡＴＣＣパーマネント・コレクションの一部である（
１９８８年３月４日寄託、受託番号ＡＴＣＣ６７６３７
）。プラスミドｐＭＬＣＥ−１０およびｐＨＫＦ−１の
制限部位および機能地図を添付の第１図に示す。

プラスミドｐＨＫＣＥ−１ｏを、プラスミドｐＭＬＣＥ
−１０由来のＣＥＭＬ鎖可変領域遺伝子を含有する約３
．８　ｋｂ　Ｈｉｎｄ［［フラグメントを単離し、得ら
れたフラグメントをＨｉｎｄ［［消化プラスミドｐＨＫ
Ｆ−１にライゲートすることによって構築した。プラス
ミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ　（受託番号ＡＴＣＣ３７１４
５の下でＡＴＣＣから入手可能）を制限酵素ＥｃｏＲＩ
で消化し、Ｃ１ａｌリンカ−（配列：　ｄＣＡＴＣＣＧ
ＡＴＧ）をＥｃｏＲ１部位にライゲートしてプラスミド
ｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ　Ｃｌａを調製した。次に、プラス
ミドｐＨＫＣＥ−ＩＱを制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍ
ＨＩで消化し、ヒトＬ鎖定常領域遺伝子に結合したＣＥ
ＭＬ鎖可変領域遺伝子を含有する約９．Ｏｋｂ　Ｃ１ａ
ｌ／ＢａｍＨ［制限フラグメントを単離した。また、プ
ラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ−Ｃ１ａも制限酵素Ｃ１ａｌお
よびＢａ１ＨＩで消化し、約４．５ｋｂのＣ１ａｌリン
カｍＨＩ制限フラグメントを単離した。プラスミドｐＨ
ＫＣＥ−１０由来の約９．Ｏｋｂフラグメントをプラス
ミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−Ｃｌａの上記約４．５ｋ
ｂベクターフラグメントにうイゲートシ、発現プラスミ
ドｐＧＣＥＭＫを調製した。プラスミドｐＨＫＣＥ−Ｉ
ＱおよびｐＧＣＥＭＫの制限部位および機能地図を添付
の第２図に示す。

プラスミドｐＭＨＣＥ−３０は、ヒト癌胎児性抗原を認
識する、モノクローナル抗体ＣＥＭのＨ鎖可変領域のゲ
ノム配列（ｇｅｎｏｓｉｃ　５ｅｑｕｅｎｃｅ）を含有
している。プラスミドｐＭＨＣＥ−３０はＡＴＣＣコレ
クション（１９８８年３月４日に寄託）の一部を構成し
ており、受託番号ＡＴＣＣ６７６４０の下に入手可能で
ある。プラスミドｐＨＧＩＺはヒト抗体のＨ鎖可変領域
のゲノム配列を含有している。プラスミドｐＨＧＩＺは
受託番号ＡＴＣＣ６７６３８の下、ＡＴＣＣに寄託され
ている（１９８８年３月４日寄託）。プラスミドｐＭＨ
ＣＥ−３０およびｐｌ（ＧＩＺの制限部位および機能地
図を添付の第３図に示す。

プラスミドｐＨＧＯＥＭ−３０を、プラスミドｐＭＨＣ
Ｅ−３０由来のＣＥＭＨ鎖可変領域遺伝子を含有する約
５．３ｋｂ　Ｃ１ａｌ／Ｈｉｎｄｌｌｌフラグメントを
単離し、得られたフラグメントをＣ１ａｌ／Ｈｉｎｄｆ
ｆｌｌ肖化ベクターｐＨＧＩＺにライゲートすることで
構築した。プラスミドｐＭＨＣＥ−３０は１つ以上のＢ
ａｍＨ１部位を含有しているので、すべてＣ１ａＩ消化
した後にＢａａＨｌで部分消化すれば、プラスミドｐＭ
Ｈ’ＣＥ　−３０の５．３ｋｂＣ１ａ　［／　Ｈ１ｎｄ
ｌｌＴ制限フラグメントが最も容易に単離される。プラ
スミドｐＳＶ２ｎｅｏ（ＡＴＣＣ３７１４９）を制限酵
素ＥｃｏＲＩで消化し、Ｃ１ａｌリンツノ−（配列：　
ｄＣＡＴＣＣＧＡＴＧ）をＥｃｏＲ１部位にライゲート
してプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｎｅｏ　−Ｃ（ａを調製し
た。次いで、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ−Ｃ１ａを制限
酵素［３ａｍＨ１およびＣ１ａｌで完全消化し、約４．
５ｋｂベクターフラグメントを単離した。

プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０を制限酵素Ｃ１ａｌで完
全消化した後、制限酵素Ｂａｇ）（Ｉで部分消化するこ
とで、ヒトＨ鎖定常領域をコードしている遺伝子に連結
したＣＥＭ　Ｈ鎖可変領域をコードしている遺伝子を含
有する約１２．７ｋｂ制限フラグメントを単離した。プ
ラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０の約１２．７ｋｂ　Ｃ１ａ
ｆ／Ｂａ５Ｈｌ制限フラグメントを、プラスミドｐＳＶ
　２ｎｅｏ　−Ｃｌａの約４゜５ｋｂ　Ｃ１ａｌ　／Ｂ
ａ５ＨＩベクターフラグメントにライゲートし、発現ベ
クターｐＮＯＥＭＣＩを調製した。プラスミドｐＨＧＣ
ＥＭ−３０およびｐＮＣＥＭＧＩの制限部位および機能
地図を添付の第４図に示す。

プラスミドｐＧＣＥＭＫを制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、約８．９ｋｂ　Ｃ１ａｎ／　ＢａｍＨ
Ｉ制阻フラグメントを単離した。また、プラスミドｐＮ
ｃＥＭＧｌも制限酵素Ｃ１ａＩおよびＢａＨＨｌで消化
し、約１７．６ｋｂ　Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨｌ制限フラグ
メントを単離した。次いで、プラスミドｐＧＣＥＭＫの
約８．９ｋｂ　Ｃ１ａｌ／ＢａｎＨＩ制限）ラグメント
をプラスミドｐＮｃＥＭＧ１の約１７゜６ｋｂ　Ｃ１ａ
ｌ／ｌ３ａｎ＋ＨＩ制限フラグメントにライゲートし、
発現ベクターｐＮｃＥＭＫＧｌを調製した。プラスミド
ｐＮｃＥＭＫＧｌは、ヒトＬ鎖定常領域をコードしてい
る遺伝子に結合した、ＣＥＭ　Ｌ鎖可変領域をコードし
ている遺伝子、およびヒトＨ１！ｉ可変領域をコードし
ている遺伝子に結合した、ＣＥＭＨ鎖可変領域をコード
している遺伝子を含有している。プラスミドｐＮＣＥＭ
ＫＧＩはさらに、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有し
ている。プラスミドｐＮｃＥＭＫＧｌの制限部位および
機能地図を添付の第５図に示す。

プラスミドｐＭＬｃＨ１は、金属キレートを認識する、
モノクローナル抗体Ｃ１（ＡのＬ鎖可変領域をコードし
ているゲノム配列を含有している。

プラスミドｐＭＬｃＨ１は、ノーイン・リージョナル・
リサーチ・ラボラトリ−、ペオリア、イリノア（Ｎｏｒ
Ｌｈｅｒｎ　Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌ
ａｂｏｒａＬ。

ｒｙ（ＮＲＲＬ）、　　Ｐｅｏｒｉａ＋　　ｌ１ｌｉｎ
ｏｉｓ）のパーマネント・ストック・カルチャー・コレ
クションの一部として寄託されている菌株、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　Ｋ　１２ＨＢ　ｔｏ　１／ｐＭＬＣＨ１から簡単に
単離することができる。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　Ｈ
Ｂ　１０１／ｐＭＬＣＨＩ　（１９８８年１１月１４日
寄託）の培養物は、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４３
２の下、ＮＲＲＬから得ることができる。プラスミドｐ
ＭＬＣＨ１を制限酵素Ｂａ虐Ｈ１で消化した後、フレノ
ウ酵素で処理し、このプラスミドの構造遺伝子の５゛側
にあるＢａａＦ（１部位を除去した。このベクターフラ
グメントを再度ライゲートシ、プラスミドｐＭＬｃＨ１
ｄＢを創造した。プラスミドｐＭＬＣＨｌおよびｐＭＬ
ｃＨｌｄＢの制限部位および機能地図を添付の第６図に
示す。

プラスミドｐＭＬｃＨ１ｄＢを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌｒ
およびＢａｍＨｌで消化し、ＣＨＡ　Ｈ鎖可変領域をコ
ードしている遺伝子を含有する約５．７５ｋｂＨｉｎｄ
［Ｉ／Ｂａ鴎Ｈ１制限フラグメントを単離した。

プラスミドｐＢ　Ｒ３２２も制限酵素ＨｉｎｄＩ［Ｉお
よびＢａｍＨｌで消化し、大きなベクターフラグメント
を精製した。次いで、プラスミドｐＭＬＣＨｌｄＢの約
５．７５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＨ／ＢａａＨＩ制限フラグメ
ントをプラスミドｐＢＲ３２２のＨ１ｎｄｌｎ／　Ｂ　
ａｌｌＨ１１肖化ベクターフラグメントにライゲートし
、プラスミドｐ　Ｍ　Ｌ　ＣＨ２を調製した。次いで、
プラスミドｐＭＬＣＨ２を制限酵素ＣｔａｒおよびＢａ
ｍＨＩで消化し、約５．７５ｋｂのＣ１ａｌ／Ｈｉｎｄ
■制限フラグメントを単離し、Ｃ１ａｌ／Ｂａ５Ｈ［ｌ
白化）゛ラスミドルＳ　Ｖ　２ｇｐｔ−ｃ　ｌａｌこラ
イゲートしてプラスミドｐｃ　ＣＨＡを調製した。

プラスミドｐｃ　ＣＨＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し
、１１．２ｋｂフラグメントを精製した。ヒトし鎖定常
領域をコードしている遺伝子を含有するプラスミドｐＨ
ＫＦｌを制限酵素Ｈｉｎｄｎｌで消化し、フレノウで充
填し、リン酸化ＢａｍＨＩ　　（Ｎ　Ｅ　Ｂ）リンカ−
を加え、次いで得られたベクターをＢａＨＨｌで切断し
、約５．２ｋｂ　ＢａａＨＩ制限フラグメントを単離し
た。次いで、得られたプラスミドｐＨＫＦ　ｌの約５．
２ｋｂ　ＢａａＨＩ制限フラグメントをプラスミドｐｃ
　ＣＨＡのＢａｍＨ［消化ベクターフラグメントにライ
ゲートすることで、ヒトＬ鎖定常領域をコードしている
遺伝子に結合した、ＣＨＡ　Ｌ鎖可変領域をコードして
いる遺伝子を含有する発現プラスミドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋ
を調製した。

プラスミドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋの制限部位および機能地図
を添付の第７図に示す。

プラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＩＡは、金属キレートを
認識する、モノクローナル抗体ＣＨＡのＨ鎖可変領域を
コードしているゲノム配列を含有している。プラスミド
ｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＩＡは、ＮＲＲＬのパーマネント・
ストック・カルチャー・コレクションの一部を構成し、
寄託されている（１９８８年１１月１４日）菌株である
Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　ＨＢ　１０１／ｐＵＣＶＨＩ
ｎｃ−ＩＡから簡単に単離することかできる。Ｅ、ｃｏ
ｌｉ　Ｋ　１２　　ＨＢ　１０１／Ｉ）ＵＣＶＨＩｎｃ
−ＩＡの培養物は、受託番号ＮＲＲＬ　　Ｂ−１８４３
３の下で入手できる。

プラスミドｐＵＣＶＨＩ　ｎｃ　−Ｉ　Ａを制限酵素Ｈ
４ｎｄ■で消化し、ＣＨＡ　Ｈ鎖可変領域をコードして
いる遺伝子を含有する約３．４ｋｂのＨｉｎｄＩ［［制
限フラグメントを単離した。ヒトＨ鎖定常領域をコ−ド
している遺伝子を含有するプラスミドｐＨＧ１２　（Ａ
ＴＣＣ６７６３８）も、制限酵素Ｈｉｎｄ■で消化し、
次いで子牛腸内アルカリホスファターゼで処理し、平滑
末端を創製した。プラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ−１Ａの
約３．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄＨ［制限フラグメントを、Ｈ
ｉｎｄｌｌ［消化してリン酸化したプラスミドｐＨＧＩ
Ｚのベクターフラグメントにライゲートし、プラスミド
ｐＨＧｌ−ＣＨＡを調製した。プラスミドｐＵＣＶＨＩ
ｎｃ−ＩＡおよびｐＨＧｌ−ＣＨＡの制限部位および機
能地図を添付の第８図に示す。

ヒトＨ鎖定常領域をコードしている遺伝子に連結した、
ＣＨＡ　Ｈ鎖可変領域をコードしている遺伝子を含有す
るプラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡを、制限酵素Ｃ１ａｌお
よびＢａａＨＩで消化し、約１０５ｋｂのＣ１ａｌ／Ｂ
ａ＠ＨＩ制限フラグメントを単離した。次ぎに、プラス
ミドｐｓ　Ｖ　２ｎｅｏ　−Ｃｌａを制限酵素ＢａａＨ
ＩおよびＣ１ａｌで消化し、約５゜０ｋｂのＣ１ａｌ／
Ｂａ５ＨＩベクターフラグメントを精製した。プラスミ
ドｐＨＧ１−ＣＨＡの約１０．５ｋｂ　Ｃ１ａｌ／Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメントをプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇ
ｐｔ　−Ｃｌａの約５．ＱｋｂＣ１ａｌ／ＢａｍＨｒベ
クターフラグメントにライゲートし、発現ベクターｐＧ
ｃＨＡＧ１を調製した。プラスミドｐＧｃＨＡＧｌの制
限部位および機能地図を添付の第９図に示す。

プラスミドｐＧｃＨＡＧｌを制限酵素Ｃ１ａｌで消化し
、約］　５．０５ｋｂ　Ｃ１ａｌ制限フラグメントを単
離した。プラスミドｐＧＣＩ（ＡＫを制限酵素ＢａｍＨ
Ｉで消化し、Ｃ１ａｌリンカー：をそのＢａａ８１部位
にライゲートし、プラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　−Ｃｌ
ａを調製した。次いで、プラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　
　Ｃｌａを制限酵素Ｃ１ａｌで消化し、約１０．８５ｋ
ｂｃ１ａｌ制限フラグメントを単離した。次いで、プラ
スミドｐＧＣＨＡＫ−Ｃ１ａの約１０．８５ｋｂＣ１ａ
ｌ制限フラグメントをベクターｐＧｃＨＡＧｌの約１５
．０５ｋｂ　Ｃ１ａｌフラグメントにライゲートし、発
現プラスミドｐＧＣＨＡＫＧＩを調製した。プラスミド
ｐｃ　ＣＨＡ　ＫＧｌは、ヒトし鎖定常領域をコードし
ている遺伝子に結合した、ＣＨＡＬ鎖可変領域をコード
している遺伝子、およびヒトＨ鎖定常領域をコードして
いる遺伝子に結合したＣＨＡ可変領域をコードしている
遺伝子を含有している。プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１は
さらに、ミコフェノール酸ｊこ対する耐性を付与する遺
伝子を含有している。プラスミドｐＧＣＨＡＫＣ；ｌの
制限部位および機能地図を添付の第１０図に示す。

哺乳動物および他の真核性細胞を形質転換し、かつその
中で６種の抗体鎖を発現させるのに適したベクターを構
築するには、組換えＣＥＭおよびＣＨＡ免疫グロブリン
および誘導体をコードしている本発明のＤＮＡ化合物が
特に好ましい。多（の哺乳動物宿主細胞は、本発明で例
示される各種の抗体鎖のアミノ末端に存在するシグナル
ペプチドを認識し、適切にプロセッシングするために必
須の細胞機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ　ｍａｃｈｉｎｅｒｙ
）を有している。

幾つかの哺乳動物宿主細胞は、さらに、抗体分子内に認
められる翻訳後修飾（例えば、グリコジル化）を行うこ
とができる。真核性宿主細胞を形質転換するためのベク
ターの変種は広範囲で存在するので、以下で例示する特
定のベクターは本発明の範囲の限定を意図するものでは
ない。

本発明の各種発現ベクターは、各種の真核性、特に哺乳
動物の宿主細胞を形質転換することができ、その中で発
現することができる。さらに、本発明の発現ベクターは
、大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）内での複製を許容する配列を
含有している。抗体の発現は、その抗体の構造遺伝子と
関連性を有する特定のプロモーターが機能する宿主細胞
で起こる。

当業者ならば、本発明に係る各種の抗体鎖を発現するの
に各種の真核性宿主細胞を使用することができることを
理解するものである。ＳＰ２１０−Ａｇ１４セルライン
は、普通は抗体を分泌しないミエローマセルラインであ
る。プラスミドｐＧＣ）［ＡＫＧｌおよびｐＮＣＥＭＫ
Ｇｌでセルライン５Ｐ−２１０をトランスフェクトした
後では、トランスフェクトされたセルラインは、２機能
性キメラＣＥＭ／Ｃ）！Ａ抗体を培養液中に分泌する。

サブクローン実験の後、分泌性細胞を血清不含の培地に
転化することによって、２機能性抗体が１５μｇ／ｘＱ
／ｌｏ”細胞までのレベルで発現され得ることが証明さ
れた。Ｓ　Ｐ　２１０細胞は本発明の発現ベクターとし
ては好ましい宿主細胞であり、当業者は、本発明の２機
能性抗体または誘導体を発現させるのに広範囲の各種細
胞を利用できることを認識するものである。

本発明で使用される宿主細胞は、当業者周知の標準的な
トランスフェクション法を用い、様々な方法で形質転換
することができる。標準的なトランスフェクション法の
内、電気穿孔法、プロトプラスト融合法、およびリン酸
カルシウム沈澱法を用いることができる。そのような方
法は、概して以下の文献に記載されている；トネグッゾ
ーら（Ｔｏｎｅｇｕｚｚｏ、　Ｆ　、　）、モレキュラ
ー・アンド・セルラー・バイオロジー、６：７０３−７
０６（１９８６）；チョーら（Ｃｈｕ、Ｇ、）、ニュク
レイック・アシッズ・リサーチ、１５：１３１Ｈ３２５
（１９８７）；ライスら（Ｒｉｃｅ、Ｄ、）、プロシー
デイングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンシイズＬＩＳＡ、？９ニア８６２−７８６５（１
９７９）；およびオイら（Ｏｉ、Ｖ、）、プロシーデイ
ングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンシイズＵ−３Ａ、８０：８２５−８２９（１９８３）
。

本発明のＣＥＭおよびＣＨＡ構築物を含有する組換え発
現ベクターで、宿主細胞を連続的にトランスフェクトす
ることが好ましい。例えば、宿主細胞をまず、ＣＨＡ構
築物を含有する発現ベクターでトランスフェクトし、Ｃ
ＨＡ免疫免疫グロブリン弁現する形質転換宿主細胞を当
業界周知の方法で選択する［エングボールおよびバール
マンら（Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｅ、　ａｎｄ　Ｐｅｒｌｉａ
ｎ　Ｐ、）、イムノケミストリー（Ｉ　ｍｓ＋ｕｎｏｃ
ｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ）、８：８７１−８７４（１９７１
）、またはメアレスおよびデイビットの米国特許第４，
７２２，８９２号（１９８８年２月２日発行）を参照］
。その後、選択した宿主細胞を、ＣＥＭ免疫グロブリン
遺伝子構築物を含有する発現ベクターでトランスフェク
トする。しかしながら、ＣＨＡおよびＣＥＭ構築物の両
者を同時に宿主細胞に導入してもよく、または逆の順序
で導入してもよいことは、認められるであろう。

例えば、本明細書に記載する方法によれば、異なる特異
性の２つのし鎖または異なる特異性の２つのＨ鎖を含有
するベクターを構築し、これらのベクターで宿主細胞を
連続的に、あるいは同時にトランスフェクトすることが
可能であろう。別法としては、ＣＥＭおよびＣＨΔ遺伝
子構築物の両方を中−の発現ベクター上に結合すること
ができ、あるいはこの２つのＤＮＡ構築物を宿主細胞の
形質転換の前に線状化し、互いにライゲートすることが
できるであろう。トランスフェクションおよび選択のの
ち、標準的な分析を行い、ＣＥＡおよび金属キレートに
対する抗体を検出し、本発明の２機能性キメラ抗体を発
現する宿主細胞を同定する。

ｐＳ　ｖ　２クラスのベクターから構築された発現ベク
ターからＳＶ４０エンハンサ−を除去することにより、
より高レベルに発現させることができる。殆どすべての
ゲノム性免疫グロブリン遺伝子はエンハンサ−配列を含
有している。本発明のプラスミド上に見いだされるネズ
ミ可変領域遺伝子はすべて、ゲノムライブラリーから免
疫グロブリン遺伝子と共にクローンされるネズミエンハ
ンサー配列と結合して見いだされる。当業者ならば、こ
れらの免疫グロブリン鎖を産生ずべくトランスフェクト
された細胞の能力を変化させることなく、これらのエン
ハンサ−配列を発現ベクター上、種々の部位に移動させ
得ることが理解されるであろう。しかしながら、発現ベ
クターｐＮＣＥＭＫＧｌまたはｐＧｃｌ（ＡＫＧＩから
ＳＶ４０エンハンサ−を除去すると（これにより、プラ
スミドｐＮＣＥＭＫＧＩ（Ｅ−）およびｐＧＣＨＡＫＧ
　１（Ｅ−）が調製される）、５Ｐ２１０細胞からの２
機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体の発現レベルを増大さ
せることができる。

プラスミドｐＧＣＥＭＫ上に見いだされるＣＥＭカッパ
プロモーターもまた、ヘテロローガス免疫グロブリン鎖
の発現レベルを増大するのに有用である。本明細書で使
用する「ヘテロローガス免疫グロブリン鎖」とは、プラ
スミドｐＧＣＥＭＫ−Ｆにコードされているネズミカッ
パＬ鎖以外の免疫グロブリン鎖を意味するものとする。

５Ｖ４Ｑエンハンサ−含汀ヘクター上のＣＥＭカッパプ
ロモーターによって作動するネズミラムダＣＦ（Ａ可変
領域遺伝子とヒト定常領域遺伝子とを含有するプラスミ
ドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋ　−２は、実施例７に記載の方法に
従って構築される。ＳＶ４　Ｑエンハンサ−を欠如する
ベクター内のＣＥＭカッパプロモーターによって作動す
るネズミラムダＣＨＡ可変領域遺伝子とヒト定常領域遺
伝子とを含有するプラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　−３も
また、実施例７に記載の方法に従って構築される。プラ
スミドｐＧｃＨＡＫＧ１を構築する目的の方法において
プラスミドｐｃ　ＣＨ’Ａ　ＫをプラスミドｐＧＣ）Ｉ
ＡＫ−１と置き換えると、容易にプラスミドｐＧｃＨＡ
ＫＧ１２を構築することができる。同様の方法で、プラ
スミドｐＧｃＨＡＫＧ１を構築する方法において、プラ
スミドｐＧＣＨＡＧｌをプラスミドｐＧＣＩＡＧＩ（Ｅ
−）と置き換え、ｐｃ　ＣＨＡ　ＫをｐＧＣＨＡＫ−２
と置き換えると、プラスミドｐｃ　ＣＨＡＫＧ　１３を
構築することができる。プラスミドｐＧｃＨＡＫＧ１−
２またはｐＧＣＨＡＫＧｌ−３のいずれか一方でトラン
スフェクトした後、ベクターｐＮＣＥＭＫＧ１でトラン
スフェクトしたＳ　Ｐ　２１０細胞は、ベクターｐＧＣ
ＨＡＫＧ１およびｐＮｃＥＭＫＧｌでトランスフェクト
した細胞よりも高い、２ｆｉ能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ
抗体の発現レベルを示すものである。

トランスフェクトした宿主内で遺伝子を発現させると、
成熟２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体はその上清中に
分泌される。組換え技法により生産される多くの抗体が
不必要な異質性（幾つかのガンマ鎖のＣ−末端に発生す
る異質のアミノ酸またはアミノ酸群から生じる）を現わ
すので、培養液は一般に、採取した後、濃縮し、カルボ
キシペプチダーゼの溶液で処理する。次いで、この２機
能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体は当業界周知の方法によ
って精製することができる［カセリン（ＣａＬｈｅｒｉ
ｎｅ　Ｂ、　Ｂｅ１ｄｌｅｒ）、ジョンソン（Ｍ、　Ｊ
　、　Ｊ　ｏｈｎｓｏｎ）およびジエイムス（Ｊ　ａｗ
ｅｓ　Ｒ、Ｌ　ｕｄｗｉｇ）、キメリ、り・アンチボデ
ィーズ・ブイレフテッド・アゲインスト・メタル・キレ
イツ（Ｃｈｉｓｅｒｉｃ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ　Ｄｉ
ｒｅｃｔｅｄ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｍｅｔａｌ　Ｃｈｅｌ
ａｔｅＳ）、同日出願の米国特許出願筒０７／２７２，
５７７号、およびジョンソン（Ｍ、　Ｊ　、　Ｊ　ｏｈ
ｎｓｏｎ）、キメノック・アンチボディーズ・ブイレフ
テッド・アゲインスト・メタル・キレイツ、同日出願の
米国特許出願筒０７／２７４，１０６号参照］。

各種の方法によって、２Ｒ能性キメラＣＥＭ／Ｃ）ｌ　
Ａ抗体の存在を検出することができる。１つの方法は、
ポリスチレンビーズを、ＣＥＡを認識するモノクローナ
ル抗体ＣＥＶ１２４で被覆することである。次ぎに、Ｃ
ＥＡをポリスチレン／ＣＥＶ１２４？ｕ合体に結合させ
る。別法としては、抗体リンカ−を介さずに、ＣＥＡを
マイクロタイター・プレート・つ１ルに直接結合させる
こともできる。次いて、２機能性キメラＣＥＭ／Ｃ）（
Ａ抗体を含有する上清をこのビーズと共にインキュベー
トし、これによって、ＣＥＭ／ＣＨＡのＣＥＡ認識アー
ムを、ビーズに結合されたＣＥＡと結合させる。次いで
、放射標識化インジウム−ＥＤＴＡキレートをこれらビ
ーズに加える。２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体のＣ
ＨＡアームはインジウム−ＥＤＴＡ牛レートと結合する
ので、これによりガンマ−カウンターを使用すれば抗体
力価を測定することができる。インジウム−ＥＤＴＡキ
レートは米国特許第４，７２２，８９２号（１９８８年
２月２日発行）に開示されている。当業者であれば、分
泌された本発明のＣＥＭ／ＣＨＡ抗体を試験、検定する
のに利用できる方法には、実質的に無限にあることを認
識している。

本発明の抗体は、血清中または組織試料中のＣＥＡをイ
ンビトロ検出するのに広く利用できる一方、インビボの
ＣＥＡ検出にも極めて有用である。

抗体のキメラ部分は、架橋反応性および血清の病態の可
能性を減少させるので、疾患状態の発見および治療の両
者にとって複数回投与の方法を可能とする。２機能性キ
メラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体を注入すると、ＣＥＡが局在す
る腫瘍部位に局在化させることができる。その後、放射
性核種インジウム−ＥＤＴＡキレートを注入すればよ（
、この金属牛レートは小さい分子であるので、非結合性
の金属キレートは体から急速に消失し、従って非−腫瘍
組織への損傷の可能性を減じることができる。

腫瘍のイメージングを望む場合、放射性核種の選択に当
たっては、好ましくは、フォトスキャニング法によって
検出される得る、その放射線放出、通常はガンマ−フォ
トンに基づいて選択する。腫瘍の大きさを減少させるよ
うな腫瘍治療を望む場合は、放射性核種が電子またはα
−粒子を放出するのが好ましい。有用なγ−線放出同位
体の中では、１１＋ｉｎが好ましい。α−粒子を放出す
る有用な同位体の中では、”Ｙが好ましい。

他の適用法では、２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡ抗体を
注入し、それをＣＥＡに関連する腫瘍部位に局在化させ
る。次いで、金属キレートと結合（コンジユゲート）さ
せた毒素または薬物を注入し、抗体が腫瘍部位で結合す
るようにすることができる。この適用法では、金属が、
原子番号が抗体と強（は結合しないキレートの金属にま
で崩壊して変化する放射性核種の場合、その抗体は、腫
瘍細胞付近に、そのキレートおよび随伴薬物または毒素
を放出し、腫瘍細胞への侵入を容易にする。

このような場合、放射性核種の選択に当たっては、放出
の時期が早すぎず、または長すぎないような半減期を有
する核種を選択する。

本発明をさらに説明するため、以下に実施例を記載する
が、これらは、いかなる意味においても発明の範囲を限
定するものではない。本明細書に記載したアミノ酸およ
びヌクレオチド配列は、キメ９２機能性ＣＥＭ／ＣＨＡ
抗体の構築した成分を含有するが、これらの配列に若干
の改変を加えても、ＣＥＡまたは金属キレートの結合性
が実質的に同等であれば、改良法とみなすべきことは理
解できるであろう。本発明は、ＣＥＡまたは金属キレー
トに対する必須の特異性を保持する限りは、これらの改
変物も包含するものである。

実施例 下記実施例では、各種のＬ鎖およびＨ鎖可変領域を得る
ためにゲノムＤＮＡを誘導し、クローニングするのにＯ
ＥＭ２３１．６．７と命名されるネズミハイブリドーマ
細胞を使用した。ネズミハイブリドーマＣＥＭ２３１．
６．７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシ
ョン、ロックビレ、メリーランドに寄託番号ＡＴＣＣＨ
Ｂ　９６２０の下に寄託されている。ネズミハイブリド
ーマＣＥＭ２３１．６．７からクローニングしたゲノム
ＤＮＡおよびヒト抹消血リンパ球をキメラ遺伝子の構築
に用いた。

キメラ遺伝子のトランスフェクションは実質上、ト不グ
ノゾ・−ら、モレ牛ニラ−・アンド・セルラー・バイオ
ロジー、６：７０：３−７０６（１９８６）；およびチ
ョーら、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ、＋５：
１３１１１３２５（１９８７）に記載の方法に従い、電
気穿孔法で行った。宿主細胞ＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイ
ブリドーマ細胞をキメラ遺伝子の受容細胞とした。使用
したＳＰ２１０−Ａｇ１４ハイブリドーマ細胞は、アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビ
レ、メリーランドに寄託番号ＡＴＣＣＣＲＬ１５８１の
下に入手可能である。

実質上、ベルサーら（ｐ　６１１ｅｃｅｒ）、セル、４
１１３３（１９７８）の記載に従いＣＥＭ２３１．６７
からゲノムＤＮＡを単離した。遠心（１０分間、８００
ｒｐｓｌＥＣクリニ力ル遠心機）シテ約Ｉ×１０’細胞
を収穫した。次いで、細胞をリン酸緩衝化食塩水（ＰＢ
Ｓ）で２回洗浄した。次いで、細胞を、１１０ｌ１１ト
リス−ＨＣ（！（ＰＨ８，０）、２＋１１ＭＥＤＴＡ、
４０ＬＩＭ　ＮａＣ！２（ＴＥＮ）４１１２に再懸濁し
、１０％ＳＤＳ　　２００μＱおよび２０ｘｇ／肩Ｑの
プロテアーゼＫ（シグマケミカルス、Ｓｔ、Ｌ。

ｕｉｓｌＭ　１ｓｓｏｕｒｉ）　４２　ｕ　Ｑを加えて
細胞溶解した。

得られた試料を３７℃で一夜インキユベートした。

フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混１
伐（比率２５：２４：１）の等容量で２回抽出し、さら
にクロロホルム：アソアミルアルコール混液（比率２４
：ｌ）の等容量で２回以上抽出し、ＩＱｎＭ　　トリス
ート（Ｃ１２（ｐＨ８，０）、ｌ鍮Ｍ　ＥＤＴＡ（ＴＥ
緩衝液）に対して一夜透析した。次いで、ＤＮＡを５０
ｔｔｇ／ｍ（ｌのＲＮＡ５ｅＡ（シグマケミカルス、Ｓ
　ｔ、　Ｌｏｕｉｓ、　Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）により２時
間処理した後、２００ａｇ／ｘ（ｌのプロテアーゼＫに
より、３７°Ｃで１時間処理した。上で詳述した如くに
して再びＤＮＡを抽出し、−夜透析した。透析の後、１
／！０容量の２Ｍ酢酸ナトリウムと２容量の９５％エタ
ノールとを加丸でＤＮＡをエタノール沈澱させた。−２
０°Ｃで３０分間放置した後、８０００　ｒｐｍで３０
分間ＤＮＡを遠心した。得られたペレットをＴＥ緩衝液
に、最終濃度９５５μｇ／村で再懸濁した。

Ｂ　　Ｃ’ＥＭ２３１．６．７に関するゲノムライブラ
リーの構築 ＣＥＭ２３１ゲノムＤＮＡ　　ｔｏμｇをＴＥ緩衝液ｆ
ｌμ（、水２０μＮおよび１０×コア（ＣＯｒｅ）制限
消化緩衝液（５００ａＭ　ｐＨ８，０，１００ａＭＭ１
００ａ、５００ｍＭ　ＮａＣ（２）Ｌ　５ｔｔＱにとり
、試験管に分注することにより、ＤＮＡの部分消化を行
った。各管に制限酵素Ｍｂｏｌを単位として０゜００３
ａ単位から０．５単位／μＱに増加させながら加え、３
７℃で１時間、放置した。次いで、試料の一部をとり、
０，７％ＴＢＥ（８９ｍＭ　　）リス、８９ｍＭホウ酸
塩、２１ＭＥＤＴＡ）アガロースゲルにより、４０ボル
トで一夜電気泳動させた。

このゲルの写真から、どの消化フラクションが正しい分
子量領域（１２−２４ｋｂ）のＤＮＡを含有しているか
を決定した。次いで、上記の実験で規定した単位のＭｂ
ｏｌ（２０倍にスケールアップ）を用い、３７℃で一夜
インキユベートすることによりゲノムＤＮＡ２００μｇ
を消化した。このＤＮＡを用い、ストラッタジーン・イ
ンコーホレーテッド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ　　Ｉｎｃ
、）（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　　Ｃａ）から購入可能なＥ
ＭＢＬ−３フアージＤＮＡをストラッタジーン（Ｓ　Ｌ
ｒａｔａｇｅｎｅ）教示のプロトコールに従って使用し
てＥＭＢＬ−３フアージライブラリーを構築した。この
ストラッタジーンのプロトコールは、幾つかの実験手引
［例、分子生物学の基本的操作（Ｂａｓｉｃ　Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）
、デイビス（Ｌ　、　Ｃ、Ｄ　ａｖｉｓ）、デイブナ−
（Ｍ、Ｄ、Ｄｉｂｎｅｒ）およびパテ４−（Ｊ　、　Ｆ
、　Ｂａｔｔｅｙ）、Ｅ　ｌ５ｖｉｅｒ。

ＮｅｗＹｏｒｋ（１９８６）］記載の方法に従っている
。

／ヨ糖勾配により単離した後、大きい分子量のＯＥＭ２
３１．６．７ＤＮＡ（１２−２４ｋｂ）を、ＤＤＮＡｌ
ｏｏｎ、予め単離しておいたＥＭＢＬ−３ファージアー
ム１１００ｎ、ＩＯＸリガーゼ緩衝液［５００ｍＭｈリ
スーＨＣρ（ｐＨ８，０）、７０ａＭ　ＭｇＣ（ｂｌ　
１０ｍＭ　　ジチオトレイトール（ｄｔｔ）およびＴ４
　　ＤＮＡリガーゼ（２単位）コ０．５μＱを用い、４
°Ｃで一夜、ＥＭＢＬ−３フアージアームとライゲート
（結合）させた。パッケージングは、ストラッタジーン
から購入可能なギガパック−ゴールド（Ｇｉｇａｐａｃ
ｋ　−Ｇ　ｏｌｄ）インビトロパッケージングシステム
をその製品プロトコールに従って使用し、ストラノタジ
ーン供給の宿主細胞大腸菌（Ｅｃｏｌｉ）株Ｐ２．３９
２を使用して行い、Ｇ　ｉｇａｐａｃｋ−Ｇｏｌｄパッ
ケージングミックス５００μｅおよびライゲートしたフ
ァージ５μｇを２２°Ｃで２時間インキュベートした。

ファージ希釈緩衝液（１ｇ中にＮａＣＱ　５．８ｇ５Ｍ
ｇ５０４　６ＨｔＯ２ｇ−１Ｍ　トリス−ＨＣＱ、ｐＨ
７，５（５０酎）、２％ゼラチン５酎）０．５ｙ１２を
加えた。次いで、標準的なプロトコール［モレキュラー
・クローニング（Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ
）、マニアティス（Ｔ、ＭａｎｉａｔｉＳ）、フリッチ
ュ（Ｅ、　Ｆ、　Ｆ　ｒｉｔｓｃｂ）およびサンブロッ
ク（Ｊ　、　Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐ
ｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、
　　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＮｅｖＹ
ｏｒｋ（１９８２）］でファージの力価を検定した。検
定の後、ファージライブラリーをＰ２．３９２細胞を用
いた密度２０，０００プラ一ク／ｌｏＯｓＭ平板にプレ
ートし、３７℃にて一夜インキユベートした。

同定および単離 ＣＥＭ２３１．６．７Ｌ鎖（カッパ鎖）に関して、スト
ラッタジーン　Ｉｎｃ、（Ｌａ　Ｊｏｌｌａ、　ＣＡ）
から購入可能なＥ、ｃｏｌｉ　Ｐ　２．３９２中の４．
８Ｘ１０５の組換えファージをモレキュラー・クローニ
ング（前掲）のプロトコールに従ってスクリーニングし
た。この操作は、マーク・シュルマン博±［（Ｄｒ、Ｍ
ａｒｃ　Ｓｈｕｌｍａｎ）、トロント大学、トロント、
カナダ］から人手したプラスミドから誘導したネズミ力
、バおよびネズミＪＬプローブ、あるいはジェネラルバ
ンクデータベース（Ｇｅｎｅｒａｌ　ＢａｎｋＤａｔａ
　Ｂａ５ｅ、　　Ｎ　Ｉ　ＨＡｃｃｅｓｓｉｏｎ　＃　
Ｊ　００５４５）から得た配列を有する合成プローブを
用いて行った。用いたカッパオリゴヌクレオチドプロー
ブは、式； ％式％ で示される配列から構成され、モレキュラー・バイオシ
ステムズ、インコーポレーテッド（Ｍｏｌｅｃｕｊａｒ
　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、　　ｌ　ｎｃ、）、サン・
デイエゴ、カリフォルニア（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　　
ＣＡ）によって合成されたものである。

重複フィルターリフトを作り、モレキュラークローニン
グ（前掲）記載の方法に従い、３！Ｐ放射性標識したネ
ズミカッパおよびＪＬＬａ−１ブによるブロービングを
行う２重すザーンブロｙ　ト（ｄｏｕｂｔｅ　５ｏｕｔ
ｈｅｒｎ　ｂｌｏｔｓ）により両プローブとハイブリラ
イズ（雑種形勢）するファージを分析した。ノ＼イブリ
ザイゼーションは、モレキュラークローニング（前掲）
記載の方法で行った。Ｌ鎖可変領域遺伝子がＣカッパ遺
伝子領域と直接隣接した位置に再配列されたことを示す
、両プローブとのノ＼イブリライズに基いて単一のＯＥ
Ｍ２３１．６．７フアージクローンを選択した。この組
換えファージをφＭＬＣＥ−１０と命名した。

痣盆榎！ φＭＬＣＥ−１０ＤＮＡを単離し、その２０ｇｇをギブ
コーＢ　ＲＬ　（Ｇ　１ｂｃｏ　−Ｂ　ＲＬ　、　Ｇ　
ａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）供給の
反応緩衝液（Ｒｅａｃｔ　Ｂ　ｕｆｆｅｒ）＃３を用い
、全量２２０μｅとしてＢａ５ＨＩ（１中位／μｇ）で
消化した。Ｂａ＠ＨＩ消化ＤＮＡを、臭化エチジウム０
５μｇ／ｙｚ（ｌを含んだ０．７５％ＴＢＥアガロース
ゲルにより、４０Ｖで一夜電気泳動することによってｌ
　Ｏｋｂ　Ｂａｇ）（Ｉフラグメントを単離した。Ｕｖ
透過光ボックスで観察し、その１ｏｋｂフラグメントを
ＤＥＡＥ８１紙上に電気泳動し［シライヒャー（Ｓ　ｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ）およびシュエル（Ｓｃｈｕｅｌｌ）
、キーン（Ｋ　ｅｅｎｅ）、二！　−”　／’ンプシャ
ー（Ｎ　ｅｔｖ　Ｈａｉｐｓｈｉｒｅ）］、次いで、１
ＭＮａＣＱで溶離し、エタノール沈殿に付した。次いで
、溶出したフラグメントをＴＥＩ衝液６μＱに再懸濁し
た。得られたフラグメントを、実施例ＩＢに３己載のこ
゛とζ、ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　　１μ（！（５０ｎｇ）
、ＢａｎＨｌ　　１０ｋｂ組換えファージＤ　Ｎ　Ａ　
ｌ）ガーゼ６μｑ（３００ｎｇ）を用い、アメリカン・
タイプ・カルチャー・コレクンヨン（Ａ　ｍｅｒｉｃａ
ｎＴ　ｙｐａ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
）（Ａ　Ｔ　ＣＣ受託番号３１３４４）から入手可能な
りａｍＨ１消化したｐＢＲ３２２５０ｎｇとライゲート
した。ギブコ１３　ＲＩ−（Ｇ　ａｉＬｈｅｒｓｂｅｒ
ｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）から入手可能な、Ｅ、ｃｏｌ
ｉ　ＨＢ　１０１コンピテント細胞を標準的な手法で形
質転換した。まず、ＨＢＩＯＩ細胞を氷の上で解凍し、
次いでライゲーション反応物１０μＱを細胞２００μＱ
と混合し、水上で３０分間インキュベートした。次いで
、細胞を、４２°Ｃで９０秒間熱シトツクに付し、２分
間、水上に戻した。ＬＢＢａス（Ｈ２中、ＮａＣｌ２１
０ｇ、酵母エキス　５ｇ１　トリプトン　ｌＯｇ）ｌｘ
Ｑを加え、Ｎ　ｅ＊　Ｂ　ｒｕｎｓｗｉｃｋ空気振盪機
中で１時間、細胞をインキュベートした（２２５ｒｐｍ
、３７°Ｃ）。次いで、２００Ｉｎをアンピシリン（５
０ｇｇ／肩の含有しＢ−アガロース上で３７°Ｃで一夜
インキコベートすることにより平板培養した。モレキュ
ラー・クローニング（前掲）およびグルンシュタイン（
Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、　Ｍ、　）およびホグネス（Ｈｏ
ｇｎｅｓｓ、　Ｄ　、　）のＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ、　７２：３９６１（１９７５
）に詳しく記載されているコロニースクリーニング法で
アンピシリン耐性コロニーをスクリーニングした。再び
ＪＬおよびカッパ不ス゛ミブローブを用いて組換え体ｐ
ＢＲ３２２プラスミド（ｐＭ［、ＣＥ−１０と命名）を
同定し、ブダペスト条約に基づき、アメリカン−タイプ
・カルチャーφコレクションに１９８８年３月４日（Ａ
ＴＣＣ受託番号＃６７６３９）に寄託した。プラスミド
ｐＭＬＣＥ−１０の制限部位および機能地図を添付の第
１図に示す。

Ｅ、ヒトＤＮＡの単離 ヒトガンマハブロタイブｆ’ｂｎおよびａｚｇにホモ接
合性の個体から、３０！＋（！の試料中に全血試料を採
取した。ソーボール（Ｓ　ｏｒｖａｌｌ）　Ｇ　Ｌ　Ｃ
−２Ｂ中、２２°Ｃにおいて、２５０　Ｏｒｐｍで遠心
することにより血液試料からバフイー（Ｂｕｆｆｙ）コ
ート細胞を収穫した。パスツールピペットでバフィーコ
ート細胞を取り、ＰＢＳで１回洗浄した。得られた細胞
ペレットをｌＯｍＭ）リス−）ＩＣ＋２（ｐＨ８，０）
４０ｍＭ　ＮａＣｌ２５００　μｒｌ中に再懸濁し、１
０％ＳＤＳ　　３０μＱと２０ｇｇ／贋Ｑプロテアーゼ
Ｋ（シグマケミカルス、Ｓ　Ｌ、　Ｒｕ１ｓ、　Ｍｉｓ
ｓｏｕｒｉ）６　ｕＱを加えて細胞溶解した。得られた
試料を３７°Ｃで１５時間インキュベートした。ＤＮＡ
を等容量のフェノール：クロロホルム：イソアミルアル
コール（２５：２４：１）混液で２回抽出し、さらにク
ロロホルム；イソアミルアルコール（２４：１）混液で
２回以上抽出したのち、ＩＯＨＭ）リス−ＨＣｌ２（ｐ
Ｈ８，０）、ｌｓＭＥＤＴＡに対して透析した。次いで
、得られたＤＮＡを５０ｇｇ／＋（ｌのＲＮＡｇｅＡ（
シグマケミカルス）で２時間処理した後、２００μｇ／
ｚ（ｌのプロテアーゼにで１時間再消化した。得られた
ＤＮＡを上記の如く抽出し、透析し、ＯＤ、。で濃度測
定をおこなった結果１００２００ｓｇ　／ｙｔＱテあツ
タ。

Ｆ、ヒトゲノムファージライブラリーのＨｆｂｎハブロ
タイブのヒトＤＮＡ（実施例ＩＥで単離した２１０μｇ
）をＭｂｏｌで部分消化し、分子量域１２−２４　ｋｂ
のＤＮＡフラグメントを単離し、実施例ＩＢ記載のごと
くにしてＥＭＢＬ−３フアージにクローニングした。

Ｇ１組換えプラスミドｐＨＫＦ−１の単離ヒトカッパ定
常領域遺伝子を単離するために、実施例ＩＢ記載のごと
く、ヒーター博士（Ｄｒ、　　Ｐ。

Ｈｉｅｔｅｒ）（ジョン・ホブキンス大学、ボルチモア
、メリーランド）から提供されたヒトカッパプローブ（
その配列はＮＩＨデーターベースから受託番号ＪＯＯ２
４１の下で人手可能）を用いてＥＭＢＬ、−３ライブラ
リーをスクリーニングした。実施例ＩＣ記載のごとくに
して、合計５ＸｌＯ’個の組換えファージをスクリーニ
ングした。単一のクローンを単離し、φＨＫＦ−１と命
名した。φＨＫＦ−ＩＤＮＡ　　１５ａＱを反応緩衝液
（Ｒｅａｃｔ　Ｂｕｒｆｅｒ）　＃　３　（Ｇ　１ｂｃ
ｏ　−Ｂ　ＲＬ　、ガイザーズバーグ、メリーランド）
中で、Ｂａ５ＨＩおよびＨｉｎｄＩ［Ｉでｌ角化した。

ＤＥＡＥ８１紙上で５．２ｋｂフラグメントを単離し、
実施例１Ｄ記載のごとく、クローニングベクターｐＢＲ
３２２とライゲートした。ヒトカッパプローブを用いて
アンピシリン耐性組換えコロニーを再び同定し、単一の
クローンを単離し、それをｐＨＫＦ−１と命名した。ｐ
ＨＫＩ”−１は、ブダペスト条約の規定に従い、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・フレクン＋１ンに１９８８
年３月４日、ＡＴＣＣ受託番号＃６７６３７で寄託した
。プラスミドｐＨＫＦ−１の制限部位および機能地図を
添付の第１図に示す。

全ＯＥＭ２３１．６．７可変カッパ領域を有するｐＭＬ
ＣＥ−１０から得られた３、　８　ｋｂ　Ｈｉｎｄ［［
フラグメントを、実施例ＩＤ記載の方法に従い、実施例
ＩＥに記載のプラスミドｐＨＫＦ−１のＨｉｎｄ■部位
にさらにサブクローニングし、ヒト定常カッパ領域遺伝
子と融合したネズミＣＥＭ２３１．６゜７可変り鎖領域
を有するキメラプラスミドを構築した。ｐＭＬＣＥ−１
０ＤＮＡ　　１８ｇを反応緩衝液（Ｒｅａｃｔ　Ｂｕｆ
Ｔｅｒ）＃　２　（Ｇ　１ｂｃｏ　−Ｂ　ＲＬ、ガイザ
ーズバーグ、メリーランド）を用い、ｌＵ／μｇのＨｉ
ｎｄｌＩ［で消化し、また、ｐＨＫＦｌもその１８ｇを
同様に消化した。ｐＭＬＣＥ−１０消化ＤＮＡを上記の
如く電気泳動にかけ、ＤＥＡＥ８１紙上で３．８ｋｂＨ
ｉｎｄｌＨフラグメントを単離し、ＴＥ　　５μＱで溶
出した。１０×ライゲーション緩衝７夜、ｌｏｍＭＡＴ
Ｐ、およびＴ４ＤＮＡリガーゼ２単位の存在下、全ｆｔ
１ｏμｇとして、ＨｉｎｄＩ［［消化ｐＭＬＣＥ−１０
の１μｇ（２μ（りとＨｉｎｄ■消化ｐＨＫＦ−１の６
００ｎｇとをライゲートした。１２°Ｃで一夜ライゲー
ションを行い、実施例ＩＯに記載のごとく、再度、ＢＲ
Ｌ供給のＨＢｌｏｔコンピテント細胞をプラスミドで形
質転換した。プラスミドＤＮＡの制限マ・ノビングによ
ってｐＨＫＣＥ−１０と命名されたプラスミドを同定し
た。プラスミドｐＨＫＣＥ−１ｏの制限部位および機能
地図を添付の第２図に示す。

ヒトカッパ遺伝子に融合したネズミｖＬ領域を含有する
真核性発現ベクターを、ベクターｐＳＶ２ｇｐｔ（アメ
リカン・タイプ・カルチャー・コレクシ１ン、ＡＴＣＣ
番号＃３７１４５）を用いて構築した。反応緩衝液（リ
アクシラン緩衝液）＃３（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ガイザ
ーズバーグ、メリーランド）中、ｐｓｖ２シｐｔＤＮＡ
１μｇをＤＮＡ１単位／μｇの制限酵素ＥｃｏＲＩで消
化した。次いで、各５ｎＭの４種のデオキシリボヌクレ
オチド類、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＡＴ
ＰＩＱμｇ１クレノウ酵素２単位および１０×緩衝液（
０，５Ｍトリス−ＨＣＮ（ｐＨ７，５）、０　、　Ｉ　
Ｍ　ＭｇＣＱｔ、１０ｍＭ　ジチオトレイトール）中、
全１５０μｅとなるように加え、モレキユラー・クロー
ニング（前掲）記載の方法でＥｃｏＲＩ末端を平滑末端
化した。

室温で３０分間反応させたのち、リン酸化Ｃ１ａｌリン
カ−（２μｇ）にュー・イングランド・バイオラボ、ベ
バリー、マサチューセッツ）をＥｃｏＲ１平滑末端化ｐ
ＳＶ２ｇｐｔ　５００ｎｇとライゲートするライゲーシ
ョン反応を行い、本発明のキメラベクターを得るために
、新しいＣｌａｌ部位を創造した。Ｃ１ａｌリンカ−配
列はｄ（ｐＣＡ　Ｔ　ＣＣＧ　ＡＴＧ）であった。ライ
ゲーション反応は、実施例ＩＢ記載の方法に従って行な
った。ライゲーションの後、ＤＮＡを電気泳動に付して
過剰のリンカ−を除去し、実施例ＩＤ記載のように線状
ｐｓＶ２ｇｐｔ　　Ｃ１ａフラグメントをＤＥＡＥ８１
紙上に単離した。実施例ＩＢ記載の試薬を用い、単離し
たＤＮＡを自己ライゲーションさせた。ＨＢＩＱＬコン
ピテント細胞を実施例ＩＤ記載のごとくにして形質転換
し、アンピシリン耐性コロニーを制限酵素消化によって
分析した。

次いで、得られたベクターｐＳＶ　２　ｇｐｔ　−Ｃｌ
ａをＣ１ａｌおよびＢａ５ＨＩ制限酵素で消化した（１
単位／μｇ　　ＤＮＡ）。さらに、これら２つの制限酵
素でキメラベクターｐＨＫＣＥ−１０を消化した。

実施例１Ｄ記載のごと（，４，５ｋｂ　ｐＳ　Ｖ　２ｇ
ｐｔＣ１ａ−Ｂａ＋１１フラグメントと９ｋｂ　Ｃ１ａ
−Ｂａｎ　ｐＨＫＣＥ−１０フラグメントをＤＥＡＥ８
１紙で単離した。９ｋｂフラグメント挿入体ＤＮＡ３７
５１ｇと４　、５　ｋｂベクターＤＮＡ２００ｎｇとを
用い、上記のごとくにして標準的なライゲージジン反応
を行った。ＨＢＩＯＩの形質転換に続いて、ｐｃＣＥＭ
Ｋと命名した組換えプラスミドをプラスミドＤＮＡの制
限マツピングによって同定した。ＣＥＭキメラＬ鎖ポリ
ペプチドの生産に用いるキメラ発現ベク９−であるこの
プラスミドの制限部位を添付の第２図に示す。

ＯＥＭ２３１．６．７ガンマ鎖の同定のために、実施例
ＩＢ記載のＥＭＢＬ−３ライブラリーを２個のネズミＨ
鎖プローブでスクリーニングした。

プローブの内、１個はＪｈ３−４領域を示し、フィル・
タッカ−博士（Ｄｒ、　Ｐｈ１ｌ　Ｔａｕｃｋｅｒ）、
（テキサス大学、ダラス、テキサス）から人手した。も
う１個はネズミガンマー１遺伝子の配列を示す。

後者のプローブは、ジェネラルバンクデータベース（Ｇ
ｅｎｅｒａｌ　Ｂａｎｋ　Ｄａｔａ　Ｂａ５ｅ）（Ｎ　
［Ｈ受託番号ＪＯＯ４５３）によって決定された式：％
式％ で示される配列を有し、モレキュラー・バイオシステム
社（サンジエゴ、ＣＡ）によって合成されたものである
。合計４．８Ｘ１０’個の組換えファージプラークを、
これらの２種のプローブを用いて２回スクリーニングし
、Ｊｈ領領域ガンマ領域の両方を含有するクローンを同
定した。これもまたカッパクローンを有するので、これ
らの２領域の配列を含有するファージは、ＤＮＡが再配
列されていることを示し、か（して細胞系統（セルライ
ン）ＣＥＭ２３１．６．７内で発現される免疫グロブリ
ン遺伝子が同定された。この再配列に基づいて１個のＣ
ＥＭ２３１．６．７クローンを選択し、φＭＨＣＥ−３
０と命名した。

Ｈ鎖可変領域配列と、ネズミＨ鎖エンハンサ−を包含す
る大きいイントロンとを含有するφＭＨＣＥ−３０由来
の５．Ｏｋｂ　５ｓｔｌ　７ラグメントを制限マツピン
グによって同定した。このフラグメントをプラスミドで
サブクローンするために、ファージＤＮＡｌ０μｇを、
反応緩衝液＃　２　（Ｇ　ｉｂｃ。

−ＢＲＬ、ガイザーズバーグ、メリーランド）中、制限
酵素５ｓｔｌで消化し、実施例１Ｄ記載のＤＥＡＥ８１
法で電気泳動することにより、５．６ｋｂフラグメント
を単離した。ストラッタジーン（う・ジョーラ、ＣＡ）
から購入可能なブルースクリプト（Ｂ　ｔｕｅｓｃｒｉ
ｐｔ）ベクターＭ１３−３Ｋ＋をＳｓｔ！消化した。実
施例ＩＢに詳述したように、ベクターと単離した５、６
ｋｂ挿人体ＤＮＡとを、ｌ：１０の比率で、全量ｌＯμ
Ｑとしてライゲートさせた。ＨＢＩＯＩコンピテント細
胞の形質転換の後、制限消化マツピングし、適切な組換
体を同定し、それをｐＭＨＣＥ−３０と命名した。ｐＭ
ＨＣＥ−３０は、ブダペスト条約の規定に従い、アメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクシ１ンに１９８８年
３月４日、ＡＴＣＣ受託番号＃６７６４０で寄託した。

プラスミドｐＭＨＣＥ−３０の制限部位および機能地図
を添付の第３図に示す。

Ｌ、ヒトＤＮＡの単離 上記実施例１Ｅ記載のごとくにしてヒトＤＮＡを単離し
た。

Ｍ、ヒトプラスミドライブラリーの構築ａｚｇハブロタ
イブのヒトＤＮＡの各１０μｇを制限エンドヌクレアー
ゼＢａ５ＨＩおよびＨｉｎｄｎｌを各々３０単位使用し
、反応緩衝液＃　３　（Ｇ　ｉｂｃ。

−ＢＲＬ、ガイザーズバーグ、メリーランド）（５Ｏｎ
Ｍ　　ト’）　ス−ＨＣ（１，ｐ）１８．０．ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＭｇＣＱ＝、　　ｌ　ＯＯｍＭ　ＮａＣ１２）中、
全量２００μ１２として消化した。エタノール沈殿によ
り、消化フラグメントを２０μｇに濃縮し、０．６％低
ゲル化温度アガロース（ＦＭＣ）ゲルを用い、５０ｓＡ
ｍｐ（ミリアンペア）で１５分間泳動させた。６−７　
ｋｂの大きさのＤＮＡ断片をゲルから切り取った。クロ
ーニングベクターｐＵＣ１８［ヤニツシコ・ペロンら（
Ｙ　ａｎｉｓｃｈ　−Ｐ　ｅｒｒｏｎ、　Ｃ、）、Ｇｅ
ｎｅ３３：１０３（１９８５）に記載されている］も上
記の如（ＢａｇＨｌおよびＨｉｎｄｌＩ［で消化した。

３０１１Ｍトリス−ＨＣ＆　（ｐＨ７，６）、ｌ　Ｏｍ
Ｍ　ＭｇＣ（ｌ、、５１１μＭジチオトレイト−ル、１
ｍＭＡＴＰ、および１μ＆Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２単位
）を含有する全量４００μＱの反応溶液中で１５°Ｃで
７２時間、得られたｐＵｃ１８ベクター（５０ｎｇ）（
二ニー・イングランド・バイオラボ、ベバリー、マサチ
ューセッツ）にヒトＤＮＡフラグメン）（１５０ｎｇ）
をライゲートした。ライゲートしたＤＮＡ試料の半量（
１００ｎｇ）を用い、新しく調製したコンピテントなＥ
、ｃｏｌｉ　Ｍ　１５細胞５００μ１２を形質転換し、
得られた形質転換体をＸ　−ｇａｌ、　　Ｉ　ＰＴＧ、
　ＡＭＰプレート（４ｕ　ｇ／ｙｉＱ　Ｘ−ｇａｌ、２
ａｇ／ｘ（ＨＰＴＧ、１００μｇ／ｘ（ｌアンピシリン
）で平板培養した。

Ｎ１組換えプラスミドｐＨＧＩＺの単離ホンジジウ（Ｔ
　、　Ｈｏｎｊｏ）（大阪大学、日本）から提供された
、タカハシら（Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ｎ、）、セル（
Ｃｅｌｌ）、２９：６７１−６７９（１９８２）に記載
されているヒトガンマ２プローブを用い、実施例１に記
載のごとくにして組換ヒ）ＤＮＡを含有するアンピシリ
ン耐性のｐＵｃ１８コロニーをスクリーニングした。ヒ
トガンマ１遺伝子に相当する７、５ｋｂ挿入体を含有す
るクローンを同定し、それをＨＹＨＧｌと命名した。次
いで、実施例ＩＧ記載の方法を用い、ヒトガンマ定常領
域遺伝子を含有するこの同じ７．５ｋｂ　ＨｉｎｄｌＩ
ｒ−ＢａｍＨＥフラグメントをｐＢ　Ｒ３２２に再度ク
ローニングした。ヒトカンマｌ遺伝子を含有するｐＢ　
Ｒ３２２ベクターをｐＨＧＩＺと命名し、ブダペスト条
約の規定に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションに１９８８年３月４日、ＡＴＣＣ受託番号＃
６７６３８で寄託した。プラスミドｐ［（ＧＩＺの制限
部位および機能地図を添付の第３図に示す。

３０の」（隣 次のようにしてネズミ可変Ｈ鎖領域をヒトガンマ−１遺
伝子と融合させた。ｐＭＨＣＥ−３０（１０μｇ）をＣ
１ａｒ（１単位／μｇ）ｔ’消化し、次イで、Ｈｉｎｄ
ｎｉで部分消化し、ｖｈおよび大きいイントロンを含ん
だ５．３ｋｂフラグメントを得た。ＤＮＡの部分消化は
わずか０．１単位／μｇを用い、３７°Ｃで１時間の消
化時間を要して行った。また、ヒトガンマ１遺伝子を含
をする実施例ＩＮ記載のプラスミドｐＨＧＺ−１（ｌμ
ｇ）をＣ１ａｌおよびＨｉｎｄｍで消化した。実施例Ｉ
Ｄ記載のＤＥＡＥ８１プロトコールを使用し、ＴＢＥゲ
ルからｐＭＨＣＥ−３０の５．３ｋｂフラグメントを単
離した。このフラグメントを、挿入体５００ｎｇとベク
ターＤＮＡ２００ｎｇを用い、全量１０μ＆のライゲー
ション混合物中、ｐＨＧＺ−１のＣ１ａ−［（ｉｎｄ部
位にライゲートした。ライゲーション反応は、実施例Ｉ
Ｂの記載に従って行った。ＨＢＩＯＩの形質転換の結果
、生成された組換えプラスミドを制限消化マツピングに
よって分析し、ヒトガンマｌ遺伝子と融合したネズミ■
、領域を含有するプラスミドを同定し、それをｐＨＧＣ
ＥＭ−３０と命名した。プラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０
の制限部位および機能地図を添付の第４図に示す。

実質上、実施例ＩＮ記載の方法に従い、真核性発現ベク
ターにキメ９１ｇ遺伝子を挿入した。用いたベクターは
、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから
入手可能なｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（ＡＴＣＣ番号＃３７
１４９）であった。プラスミドｐｓ　ｖ　２　ｇｐｔに
関して記載したと全く同様にして、このベクターにＣｌ
ａｌ部位を付加した。次いで、ｐｓＶ２ｎｅｏ−Ｃ１ａ
　ＤＮＡｔμｇを酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨＩを１単
位／μｇＤＮＡの割合で用いて消化した。プラスミドｐ
ＨＧＣＥＭ−３０をＣ１ａ１で消化した後、Ｂａ５ＨＩ
（０，１単位／ａ　ｇ）で部分消化し、キメラｖｈおよ
びガンマｌ領域を含有する１２．７ｋｂフラグメントを
得た。このフラグメントをＤＥＡＥ８１紙上で単離し、
ＴＥ緩衝ｉ＆　ｌ　Ｏμぐで溶出した。このライゲーシ
ョンは、ベクターＤＮＡ　　５０ｎｇ、ならびに１２．
７ｋｂ挿入体ＤＮＡ、ＩＯＸライゲージ四ン緩衝液、ｌ
ＯｍＭＡＴＰおよびＴ４ＤＮＡリガーゼの４００ｎｇを
用い、実施例１Ｂ記載のごとくにして１２°Ｃで一夜行
った。ＨＢＩＯＩ細胞を形質転換し、キメラ発現ベクタ
ーｐＮｃＥＭＧｌを構成する適正な組換えプラスミドを
同定した。キメラＨ鎖免疫グロブリン遺伝子の発現に使
用される組換え発現ベクターを構成するプラスミドｐＮ
ｃＥＭＧ１の制限部位および機能地図を添付の第４図に
示す。

Ｑ、プラスミドｐＮＯＥＭＫＧｌの構築既述の方法に従
い、プラスミドｐＧＣＥＭＫを制限酵素Ｃ１ａｌおよび
Ｂａ５ＨＩで消化し、約８゜９ｋｂ　Ｃｔａｌ／Ｂａ５
ＨＩ制限フラグメントを単離した。類似の方法により、
プラスミドｐＮＣＥＭＧ１も制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢ
ａａＨＩで消化し、得られた約１７．６ｋｂのＣ１ａｌ
／　Ｂ５１１）１１制限フラグメントを精製した。次い
で、プラスミドｐＧＣＥＭＫの約８．９ｋｂ　Ｃ１ａｌ
／ＢａｍＨＩ制限フラグメントを、実質上、実施例ＩＢ
に記載の方法に従って、プラスミドｐＮＣＥＭＧｌの約
１７．６ｋｂＣ１ａｌ／ＢａａＨＩ制限フラグメントに
ライゲートした。Ｅ、ｃｏｌｉに形質転換した後、制限
マツピングによってプラスミドを再度単離し、適正な制
限マツプを示すプラスミドをプラスミドｐＮＯＥＭＫＧ
　ｌと命名した。プラスミドｐＮＣＥＭＫＧｌの制限部
位および機能地図を添付の第５図に示す。

実施例２ クローニングした遺伝子のＤＮＡ配列決定クローニング
したＣＥＭ可変り鎖およびＨ鎖遺伝子の配列決定は、配
列決定キ／　トＳ　ｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳ　バイオケ
ミカルズ、クリーブランド、オハイオから購入可能）、
およびＢ　１ｕｅｓｃｒｉｐｔ／　Ｄ　Ｎ　Ａ配列決定
システム（ストラッタジーン社、う・ジョーラ、ＣＡか
ら購入可能）に示されたプロトコールを用い、１本鎖お
よび２本鎖の両鋳型のための標準的手法により行なった
。クローニングしたＣ［シＭ可変り鎖およびＨ鎖領域遺
伝子に関して得られたＤＮＡ配列から、コンピューター
・ソフトウェア−・プログラム、ＭＡＰＳＥＱ　（ＤＮ
ＡＳｔａｒ。

マディソン、ライスコンシンから購入可能）により、コ
ードされているポリペプチドのアミノ酸配列を推定した
。

実施例３ Ａ、プラスミドｐＧｃＨＡＧｌの構築 プラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ　　ＩＡは、重金属結合性
モノクローナル抗体ＣＨＡ２５５．５のネズミ可変領域
をコードする遺伝子を含有している。

プラスミドｐＵｃＶＨＩｎｃ−ＬＡは、ＮＲＲＬのパー
マネント・ストック・カルチャー・コレクションの一部
を構成する菌株として、受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４
３３の下で入手可能なＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＨＢＩＯ
Ｉ／ｐＵｃＶＨ１ｎｃ−ＩＡから通常の方法で単離でき
る。プラスミドｐＨＧＩＺはヒトガンマ遺伝子を含有し
ており、ＡＴＣＣから、受託番号ＡＴＣＣ６７６３８の
下で入手可能である。プラスミドｐＵＣＶＨＥ　ｎｃ　
−Ｉ　Ａ約ｌμｇを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ！で消化し、
約３．４ｋｂのＨｉｎｄ■制限フラグメントを単離した
。さらに、プラスミドｐＨＧＩＺｖＪｌμｇも制限酵素
ＨｉｎｄＩ［［で消化し、当業界周知の方法で細菌性ア
ルカリホスファターゼで処理した。次いで、プラスミド
ｐＵＣＶＨ１ｎｃ−ＩＡの約３．４　ｋｂ　Ｈ１ｎｄｌ
Ｉｌフラグメントを、ＨｉｎｄｌＩ［消化してホスファ
ターゼ処理したプラスミドｐＨＧＩＺのフラグメントと
ライゲートし、プラスミドｐＨＧｌ−ＣＨＡを構築した
。プラスミドｐＵＣＶＨＩｎｃ−ＩＡおよびｐＨＧｌ−
ＣＨＡの制限部位および機能地図を添付の第８図に示す
。

ブラフ、　ミＦｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ−Ｃｌａ　（実施例
１で構築）を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａ５ＨＩで消化
し、約５゜Ｏｋｂ　Ｃ１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメ
ントを単離した。同様の方法により、プラスミドｐＨＧ
ＩＣＨＡも制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨ［で消化し
、約１０．５ｋｂの制限フラグメントを単離した。プラ
スミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−Ｃｌａの約５．０ｋｂ
Ｃ１ａｌ／ＢａａＨＩ制限フラグメントをプラスミドｐ
ＨＧ１−ＣＩ　Ａの約１０．５ｋｂ　Ｃ１ａｌ／　Ｂａ
ｍＨＩ制限フラグメントとライゲートさせ、プラスミド
ｐＧＣＨＡＧＩを構築した。ブラスミｔ’ｐＧＣＦ（Ａ
Ｇｌの制限部位および機能地図を添付の第９図に示す。

Ｂ、　　プラスミドｐＧＣＨＡＫの構築プラスミドｐＭ
ＬＣＨ−１（Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ　ｌ　２　　ＨＢＩＯＩ
／ｐＭＬＣＨ−Ｉ　　ＮＲＲＬ　　Ｂ”−１８４３２か
ら人手）約ｌμｇを制限酵素ＢａｍＨＩで３分間消化し
た。エタノール沈澱した後、４種類の５ｎＭデオ牛シリ
ボヌクレオチド（ｄＴＴＰ、、ｄＧ′ｒＰ、ｄＡＴＰお
よびｄＣＴＰ）各ｈｌＯａ（１，フレノウ酵素２単位、
およびＩＯＸ緩衝液（０，５ｍＭ　　ト！Ｊ　ス　）（
Ｃｆ２（ｐＨ７，５）　、Ｏ，ＩＭ　ＭｇＣＱｔ、およ
びｉｏ＋Ｍ　ＤＴＴ）５μＱを加え、全反応容量５０μ
ａ中でＢａ５ＨＩ末端を平滑末端化した。

３７℃で３０分間経過後、フェノール、クロロポルム抽
出によって反応を止め、得られたＤＮＡを自己ライゲー
トさせ、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉ細胞を形質転換した。Ｂａ
ｍＨｒ部位の欠失を示すプラスミドをプラスミドｐＭＬ
ｃＨ１ｄＢと命名した。プラスミドｐＭＬＣＨｌおよび
ｐＭＬｃＨｌｄＢ（７）制限部位および機能地図を添付
の第６図に示す。

次いで、プラスミドｐＭＬｃＨ１ｄＢを制限酵素Ｂａａ
！（ＩおよびＨｉｎｄｌＨで消化し、約５．７５ｋｂの
ＣＨＡラムダ遺伝子領域を単離することによって、プラ
スミドｐＭ　Ｌ　ＣＨ２を構築した。次いで、このフラ
グメントをＢ　ａａＨ［／　Ｈ１ｎｄｌ［［消化プラス
ミドｐＢ　Ｒ３２２にライゲートさせてプラスミドｐＭ
ＬＣＨ２を構築した。次いで、プラスミドｐＭＬＣＨ２
を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａａＨＩで消化し、約５．
７５ｋｂ制限フラグメントを単離した後、プラスミドｐ
ｓＶ２ｇｐＬ−Ｃ１ａ　（実施例ｉで構１）　＋７）Ｃ
ｌａ　Ｉ　／　Ｂ　ａｎＨＩ消化ベクターフラグメント
にライゲートし、プラスミドｐｃ　ＣＨＡを構築した。

プラスミドｐｃ　ＣＨＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し
、約１１．２ｋｂの制限フラグメントを単離した。プラ
スミドｐＨＫＦ　ｌ　（ＡＴＣＣから受託番号６７６３
７の下で入手可能）を制限酵素Ｂｉｎｄ■で消化し、フ
レ／つで充填し、リン酸化Ｂａ５ＨＩリンカ−（ＮＥＢ
）を加えた後、ベクターをＢａｍＨＩで切断し、約５．
２ｋｂの制限フラグメントを単離した。次いで、プラス
ミドｐｃ　ＣＩ　Ａの約１１゜２ｋｂ　ＢａｍＨＩフラ
グメントをプラスミドｐＨＫＦ　１の約５．２ｋｂ　Ｂ
ａｇ）Ｉ　Ｉ制限フラグメントとライゲートさせ、ヒト
ガンマ領域をコードしている遺伝子と結合した、ネズミ
ラムダＣＨＡ可変領域をコードしている遺伝子を含有す
るプラスミドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋを構築した。プラスミド
ｐｃ　ＣＨＡＫの制限部位および機能地図を添付の第７
図に示す。

Ｃ，プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１の構築プラスミドｐｃ
　ＣＨＡ　Ｋの約Ｉμｇを制限酵素ＢａｍＨＩで消化し
、実施例Ｉｆに記載の方法に実質的に従い、式： で示されるＣ１ａ［リンカ−を得られたＢａｍＨ［部位
にライゲートした。ライゲート反応の後、形質転換およ
び再単離して得られたプラスミドをｐｃＣＨＡＫ−Ｃ１
ａと命名した。従来技術に従い、プラスミドｐＧＣＨＡ
Ｋ−Ｃ１ａを制限酵素Ｃ１ａｌで消化し、約１０．８５
ｋｂＣ１ａｌ制限フラグメントを単離した。プラスミド
ｐＧｃＨＡＧ１を制限酵素Ｃ１ａｌで消化し、約１５．
０５ｋｂの制限フラグメントを単離した。次いで、プラ
スミドｐＧＣＨＡＫ−Ｃ１ａの約１０．８５ｋｂＣ１ａ
［制限フラグメントをプラスミドｐＧＣＨＡＧの約１５
．０５ｋｂＣ１ａｌフラグメントにライゲートした。形
質転換および再単離の後、適正な制限マツプを有するプ
ラスミドをプラスミドｐＧｃＨＡＫＧ１と命名した。プ
ラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１の制限部位および機能地図を
添付の第１０図に示す。

実施例４ 上記実施例３に記載のように、トランスフェクションに
用いたＣＨＡ免疫グロブリンプラスミドは、ｐＧＣＨＡ
ＫＧ１であった。ｐＧｃＨＡＫＧ１プラスミドを、まず
既述の電気穿孔法により、５Ｐ２１０ハイブリドーマ細
胞にトランスフェクトする。ＳＰ２１０−Ａｇ１４細胞
を５％ＦＣ８含有培地で培養し、電気穿孔法適用前３日
間、増殖の対数期に保持した。プラスミドベクターｐＧ
Ｃ１１ＡＫＧＩ　（２０μｇ）を制限酵素Ｐｖｕｌ（ｌ
ｕ／μｇ）および反応緩衝液＃７（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ
、ガイザーズバーグ、メリーランド）を用いて線状化し
た。トランスフェクションに際しては１．ＩＥＣクリニ
カル遠心機（８００ｒｐｍ、１０分間、室温）により、
５Ｐ２１０細胞を採取した。次いで、細胞を、６ａＭデ
牛ストロースを含んだＨａｎｋの緩衝化食塩水（Ｃ；　
１ｂｃｏ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、グランドアイ
ランド、ニューヨーク）を用いて３回６し浄し、終濃度
１．５Ｘ１０’細胞／ｚ（ｌに再懸濁した。キュベツト
に細胞０．３ｉ＋２を密度０．５　Ｘ　１０＠１０．３
村で分注し、線状化したＤＮＡを加えた。得られた混合
物を水上に１０分間装いた。０．８ｘｘギヤツプの電極
（Ｐ／Ｎ４７２）およびＢＴＸ１００トランスフェクタ
ー（ＢＴＸ　　Ｉｎｃ、サンジエゴ、ＣＡ）を用いて電
気穿孔を行った。条件は、２５０ボルトで、５ａ　５ｅ
ｃｏｎｄｓごとに１パルスである。

次いで、電気穿孔した細胞を密度２Ｘ１０５／ｆｆ（！
（Ｔ７５フラスコ中）で培地に７２時間、再懸濁させた
（３７℃、５％Ｃｏ、）。次いで、細胞を、２４ウエル
プレート中の適当な抗生物質に密度５Ｘ　１０　’／＊
（ｌ　テプレートし、ｐＧＣＨＡＫＧ１を含有するＳ　
Ｐ　２１０細胞をＨＭＡＸｌ、０培地（５０ｎｇ／ｘ（
ｌヒボキサンチン、２５０ｎｇ／ｘ（ミコフェノール酸
および５０μｇ／ｘＱキサンチン、シグマ、セントルイ
ス、ミゾリーから入手可能）に１ａｇ／ｘ（ｌでプレー
トした。ＨＭＡＸ耐性コロニーを含有する各ウェルから
上清２００μＱを収集した。次いで、この上清を、ｐＧ
ＣＨＡＫＧｌのキメラ免疫グロブリン遺伝子の発現を示
す、ヒトカッパ定常領域およびヒトガンマ定常領域の存
在に関して分析した。

Ｂ、キメラＣＨＡ　２５５を分泌する５Ｐ２１０胤狗ダ
鳳畢 キメラＣＨＡ−ヒト１ｇ遺伝子を発現するトランスフェ
クトされたＳ　Ｐ　２１０細胞を、エングバルおよびバ
ールマン［Ｅ　ｎｇｖａｌｌ、　Ｅ　、　ａｎｄ　Ｐ　
ｅｒｌｌｌＩａｎｎ、Ｐ、、　１ｍｓｕｎｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、８　：　８７１　８７４　（１９７１）］に
記載のごとく、ヒ）Ｉｇを対象とする標準的な酵素結合
免疫吸着検定（エリザ、ＥＬＩＳＡ）により、同定した
。

この検定の目的は、ネズミハイブリドーマＣＨＡ２５５
から単離し、ヒト定常領域遺伝子と融合させたネズミ可
変領域から構築されたｐｃ　ＣＨＡＫＧＩプラスミドベ
クターによってコードされているキメラカッパおよびガ
ンマ鎖ポリペプチドを公認・する細胞を同定することに
ある。ｌｏ＋＊Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ７−８）中、
ヤギ抗−ヒトガンマ鎖（Ｔａｇｏ　＃　４１００）の５
　ｕ　ｇ／ｘ（ｌ溶液を調製した。９６ウエルプレート
の各ウェルをこの溶液５０μｅで覆った。次いで、その
プレートを３７℃で一夜インキユベートした。次いで、
プレートを水およびＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ　（ｗ
／Ｖ）中でよく洗浄した。上清フラクシヨン５０μｇを
各ウェルに入れ、室温で２時間インキュベートした。上
で記載したように、プレートを再度洗浄した。上清物質
の培地と同じ培地でヤギ抗−ヒトカッパ鎖アルカリホス
ファターゼ結合体くコンジコゲート体、Ｔａｇｏ　　＃
２４９６）を１／１０００に希釈した。ウェルあたり１
００μｅを加え、室温で１時間インキュベートした。上
記のごとくプレートを洗浄した。包装容器の指示に従い
、アルカリホスファターゼの基質を調製し、蒸留水３ｘ
（ｌとこの基質１５０μｅ毎に錠剤１個を各ウェルに加
え、３７℃で３０分間インキュベートした。

５００５Ｍ　ＥＤＴＡ　（５０μ１２）を加えて反応を
停止（クエンチ）させ、次いで４０５ｎＭの吸光度を測
定した。最高レベルのＩｇ発現を示す上清を同定し、対
応するウェルから細胞を分取し、２機能性キメラ構築物
ｐＮＣＥＭＫＧＩの誘導のために増幅させた。

高レベルでＣＨＡ　　Ｉｇ鎖を発現した細胞をさらに、
金属キレートと特異的に反応する免疫グロブリンの産生
に関して検定した。金属キレートに対する抗体を検出す
るのに使用した検定操作法は、ウオン（ｆａｎｇ、　Ｒ
，、）らのＩ　ｍｍｕｎｏｌ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　ｌ
　８１５７−１６４（１９７７）、リードン（Ｒｅａｒ
ｄｏｎ）らのネイチャー３１６：２６５−２６８（１９
８５）、ならびにメアレスおよびデイピッドの米国特許
第４，７２２．８９２号（１９８８年２月２日発行）に
記載の方法に実質的に従った標準的な固相ラジオイムノ
アッセイである。

以下に記載の試薬をマイクロタイタープレートの各ウェ
ルに加え、混合しながら室温で一晩インキユベートした
：試薬−細胞培養上清２５μＱ１目’Ｉ　ｎ−ＥＤＴＡ
５０１１１２　、セファＣｆｆ−ス結合ヤギ抗−ヒト■
ｇＧ２０μｅ１および細胞培養培地２５μＱ０セファロ
ース−抗−ヒト１８Ｇに結合した免疫コンプレックス（
免疫複合体）をヘーハーフィルターに捕集した。フィル
ターをガンマ−カウンターで計数した。このラジオイム
ノアッセイの結果、キメラＣＨＡ抗体を分泌するクロー
ンが同定された。プラスミドｐＮｃＥＭＫＧ１でトラン
スフェクトするためにこれらのクローンを選択した。

実施例１に詳述した構築物から誘導したＯＥＭ免疫グロ
ブリンプラスミド、ｐＮｃＥＭＫＧｌを用いてＳ　Ｐ　
２１０細胞をトランスフェクトした。

次いで、採取したキメラＣＨＡ遺伝子を発現する細胞集
団（セル・ポピユレーション）をキメラＣＥＭ遺伝子を
含有するプラスミド構築物を用いて電気穿孔に付した。

ＣＩＡ遺伝子の電気穿孔については、５Ｐ２１０キメラ
ＣＨＡ産生細胞（ｓｐ２１０−Ｋ）を電気穿孔処理の前
、３日間対数増殖期に維持し、ておいた。プラスミドＤ
ＮＡ、ｐＮＣＥＭＫＧＩ　（２０μｇ）を反応緩衝液＃
６（Ｇｉｂｃｏ　−Ｂ　ＲＬ　Ｇ　ａｉｔｈｅｒｓｂｕ
ｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）中、酵素Ｐｖｕｌで線状化
した。細胞を集め、洗浄し、実施例２Ａに詳述したよう
に、密度１．５Ｘ１０’細胞／、ｗ１２に再懸濁した。

上記ＤＮＡを加え、電気穿孔の前に、得られた混合物を
水上に１０分間放置した。使用した条件は、ｌパルス１
５ｍ５ｅｃ、、２５０ボルトである。細胞を、密度２．
５ＸＩＯ５細胞／ｌ（ｌで、Ｉ−ＩＭＡＸｌ、Ｏを添加
した５％ＦＣ８を含有するＨＨ２（または他の市販され
ている培地）中、３７℃で５％ＣＯ，存在下、７２時間
培養した。次いで、これらの細胞を、ＨＭＡＸ　１０お
よび有効ａ度５００μｇ／村のＧ４１８抗生物質（ジェ
ネテシン、Ｇ　１ｂｃｏ　−Ｂ　ＲＬ　、　Ｇ　ａｉｔ
ｈｅｒｓｂｕｒｇ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ）を含有する培
地中、２４ウエルのプレートに５８ＩＯ’／ｆｆ！２で
プレートした。

１４日間、選択を維持した時点で、以後の分析のために
ＨＭＡＸ／Ｇ４１８耐性コロニーを有スるウェルを同定
した。

実施例５ Ａ−近應績令 キメラＣＥＭ　Ｌ鎖およびＨ鎖の両方の免疫グロブリン
遺伝子を発現し、ＣＥＡと結合する抗体を産生ずるトラ
ンスフェクトされた５Ｐ２１０細胞を同定するためにス
クリーニング検定を行った。

ＣＥＡに対する抗体の検出に用いた検定法は、ウオンら
（Ｗａｎｇ、　Ｒ，）［Ｉ　ｆｆｉｍｕｎｏｌ、　Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ、　ｌ　８　：　１５７−１６４　（１９７
７）］が詳細に説明した標準的な固相ラジオイムノアッ
セイである。

マイクロタイタープレートのウェルに以下の試薬を加え
、撹拌しながら、室温で一夜インキユベートシた：細胞
培養上清２５μｇ、目’Ｉ−ＣＥＡ（アフィニティー精
製）５０μｇ、セファロース結合ヤギ抗−ヒトＩｇＧ２
Ｑμρおよび細胞培１ｊ１２５μＱ０セファロース−抗
−ヒトＩｇＧと結合した免疫複合体をペーパーフィルタ
ー上に採取した。フィルターをガンマカウンターで計数
した。ラジオイムノアッセイの結果、ＣＥＡと特異的に
反応する抗体を発現しているクローンが同定された。

Ｂ９代体ｌフィニテ± ＣＥＡに対する２機能性キメラ抗体ＣＥＭ／ＣＨＡのＫ
ａを求めるためにアフィニティー検定（親和性検定）を
行った。２機能性キメラ抗体ＣＥＭ／ＣＨＡのＣＥＡに
対する親和性を実施例４Ａに記載の標準的なラジオイム
ノアッセイ操作およびスカッチャード分析（Ｓｃａｔｃ
ｈａｒｄ、Ｇ、、Ａｎｎ、ＮｅｗＹｏｒｋ　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ、、　５１　：６６０（１９４９））によって
測定した。

抗原結合検定は、実施例５Ａに記載のごとくにして行っ
た。阻害曲線の作成のために、各反応物に細胞培養培地
２５μｅの代わりにＣＥＡ２５μｇを加えた。競合物質
の添加量はｌｌ−１００ｎである。スカッチャード分析
に関しては、結合／遊離抗原を結合抗原に対してプロ・
４卜することにより、線の負の傾きから規定されるアフ
ィニティー定数を算出できた。キメラ抗体の親和性は少
なくとも本発明のキメラ抗体を誘導するのに用いたネズ
ミ抗体対応物のそれに匹敵していた。

同様にして、２機能性キメラ抗体ＣＥＭ／ＣＨＡのＩｎ
−ＥＤＴＡキレートに対するＫａをも測定した。

ＥＯＴＵＢＥのインジウム（［［）錯体に対する本発明
キメラ抗体のＫａを測定するため、抗体検定を行った。

ＥＯＴＵＢＥは、ｐ−（アミノベンジル）ＥＤＴＡの誘
導体であり、米国特許第１５１８５５号［アンダー、ソ
ン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）、フリンク（Ｊ。

Ｗ、　Ｐｒ１ｎｃｋｅ）およびメイアー（Ｄ、　Ｌ、　
Ｍｅｙｅｒ）、１９８８年２月３日発行］に記載されて
いる。

ＥＯＴＵＢＥの合成法およびその標準的なスカッチャー
ド分析における用途を以下に記載する。

１、ＥＯＴＵＢＥの合成 詳細ニハ、ＥＯＴＵＢＥｆ＊、Ｎ−（２−ヒト０キシエ
チル）−Ｎ’−（、−ベンジル）チオ尿素部分のベンジ
ル炭素によってＥＤＴＡの内部エチレン炭素の１つが置
換されているＥＤＴＡであるく置換されている炭素の立
体化学はＳである）。ＥＯＴＵＢＥの合成は、可能な限
り金属イオンを排除して行った（例えば、すべてのガラ
ス器具は６ＭＨＣ（ｌで洗浄し、脱イオン水だけを用い
た）。

米国特許筒４．６２２．４２０号およびメアレス［Ｍｅ
ａｒｅｓ、Ｃ，Ｆ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　
ｌ　４２　６８−７５（１９８４）］に記載のようにし
て、（Ｓ）−ｐ−二トロベンジルＥＤＴＡを調製し、（
Ｓ）−４−イソチオシアネートベンジルＥＤＴＡ　（以
下、ＩＴＣＢＥと略称する）に変換した。この凍結乾燥
したＩＴＣＢＥを０．３ＭのＨＣＱ　［ＵＩｔｒｅｘ、
　Ｊ、Ｔ、Ｂａｋｅｒ、　Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、
　Ｎ、　Ｊ、　］に再懸濁して終濃度がおよそ５０＋ａ
Ｍになるようにした。この溶液を一７０°Ｃで保存した
。他に特記事項がなければ、すべての反応は４０°Ｃの
水溶液中で行った。

２０１１ＭのＩＴＣＢＥ（２，５Ｊ１１２）を２００ｍ
Ｍエタノールアミン（１，３５ｘ１２）に加え、ＩＯＮ
のＮａＯＨでそのｐＩ−Ｉを１１．０に調節した。その
容量を水を用いて５１１２に調節し、混合物を１５分間
反応させ、この時点でＨＰＬＣ分析によりチエツクした
。ＩＴＣＢＥのすべてを、ＨＰＬＣ［ヒユーレット−パ
ラカード（Ｈｅｖｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０
機；Ｇ１８カラム：５０ｓＭ）リエチルアンモニウム争
アセテートの水性緩衝液から純メタノールへの直線グラ
ジェント（傾斜溶１）で溶出］で保持時間３．６分のＥ
ＯＴＵＢＥに変換させた。

得られた生成物を、Ｏ，ｌ−ＩＭのギ酸アンモニウム（
ｐＨ＝　６　）のグラジェント（１１０ｍ１２）で溶離
するＤＥＡＤセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ａ
　−２５カラム（１１ｚ＆）の陰イオン交換クロマトグ
ラフィーで精製したくこのカラムは２８０ｎ＋＋＋でモ
ニターした）。生成物を含むフラクションを集め、凍結
乾燥した。この生成物は、２４６ｎｍで極大吸収を示し
、吸光係数１８．０００であった。

その’ｔｌｌ造は、”Ｃ−ＮＭＲスペクトル法で調べた
［パリアン・インスッルメンツ（Ｖａｒｉａｎ　Ｉｎ５
ｔｒｕｃｅｎｔｓ）Ｘ　Ｌ　−３００型３００ＭＨｚ機
を使用］。このスペクトル法は重水中で行った。［ＴＣ
ＢＥのインチオシアネート部分における炭素に対応する
ピークは１３９　ｐｐｍのところにあり、これはＥＯＴ
ＵＢＥでは１８２　ｐｐａ＋のピークに換わった。この
ピークはチオ尿素結合における炭素に対応している。Ｉ
ＴＣＢＥのスペクトルの芳香族領域（１２８〜１３８ｐ
ｐｍ）は４つのピークを示すが、ＥＯＴＵＢＥでは３つ
である。脂肪族領域では、ＩＴＣＢＥとＥＯＴＵＢＥに
共通して５つのピークがあり、ＥＯＴＵＢＥスペクトル
にはさらに６４および４９ｐｐ−に２つのピークが存在
する。この後者ピークはそれぞれ、ヒドロキシおよびチ
オ尿素部分に隣接する炭素に対応している。

Ａ、９．９５４０ｘ　ＩＱ−’＋ｕｏｌのＥＯＴＵＢＥ
を６００μＣｉの１１１１０で標識する。

１、他のいかなる金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える・ ａ、０．０１５８ｓＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ　　６
３μＱ ｂ、０．２６Ｍの金属不含のクエン酸アンモニウム（ｐ
Ｈ＝６．０）６３μ５； ｃ、６００μＣｉの１目Ｉｎ（１，３０ｘｌｏ−＠ｍＬ
ｌｏｌ）。

２、室温で−・夜インキュベートする。

［３，／ａ射活性のない（コールド）インジウムを十分
に加え、ＥＯＴＵＢＥに対して１．０５モル比のインジ
ウム（１０Ｉｎと基底状態のＩｎの両方）として工程Ａ
を行う。

１、上記（１，Ａ、２）の試験管に０．０１２ａ＋Ｍの
基底状態１　ｎＣＱ、Ｉ　Ｏ，２μｍ２（１，０４４Ｘ
　１０１ｍｓ＋ｏｌ）を加える。

２、室温で４時間インキコベートする。

Ｃ０薄層クロマトグラフィー分析を行ってインジウムの
導入を調べる。

１、長さ１０．５インチのシリカゲルプレート（，０，
２５インチ帯（ストリップ）に区画してレーンとする）
の２つのレーンの底からｌｃｉに標識した試料Ｏ°、５
μＱをスポットする。

２、試料スポットを乾燥させる。

３．１０％酢酸アンモニウム：メタノール（１：ｌ）溶
媒系を入れたＴＬＣ槽にプレートを入れる。

４．９ｃｘの印のところまでプレートを展開させる。

５、プレートを取り出し、乾燥させる。

６．プレートの各レーンを３つの部分に切り分ける。

ａ、初めの部分は底から２ｃｍの印のところまで。

ｂ、真中の部分は２〜３．５ｃｍの部分。

Ｃ２後ろの部分は３，５ｃｔｘｈ−ら頂上の部分。

７、両レーンについて各部分のｃｐｍを計数する。

８、各レーンの後ろの部分の％は、キレートに導入され
たインジウム％に等しい。

Ｄ、インジウムが９０％以上導入されたときに、検定に
使用するためＥＯＴＵＢＥをＰ　Ｂ　Ｓ　＜ｐト！＝７
．５）で４．４０μｇ／μｇまで希釈する。

Ｈ、＝ｘ−＞ｋｌ’１金装ｑ１１ Ａ、５．５３０ｘｌＯ”’ｓ＋ｍｏｌのＥＯＴＵＢＥを
、ＥＯＴＵＢＥに対してモル比１．０２ｘｌｎＣ１２３
でコールド・インジウムを導入する。

１、いかなる汚染金属も導入することなく次の成分を金
属不含の試験管に加える： ａ、７．９＋ｎＭの金属不含のＥＯＴＵＢＥ７０μｍ２
（５，５３０ｘ　ｌ　Ｏ−’ｍｍｏｌ）　；ｂ、０．２
６Ｍの金属不含のクエン酸アンモニウム（ｐＨ＝６．０
）７０μＱ； ｃ、　　ｌＯ，２１１１Ｍの基底状態１　ｎｃＱ＊　５
５．３μＱ（５，６４１Ｘ　１０−’ｍｍｏｌ）。

２、室温で４時間インキュベートする。

Ｂ、後記■で使用するためＰＢＳ（ｐＨ７，５）で希釈
し、０．４０ｎｇ／μｃをｌ、ｍｌ！および０．３６ｎ
ｇ／μσをＬｍＱ調製する。

■、恢体感度典葬 Ａ、９６ウエルのマイクロタイタープレートに次の成分
を加える（３組）： １．４．４ｐｇ／、ｃｌのＥＯＴＵＢＥ−”’Ｉ　ｎ−
基底状態Ｉｎ　　２５μＱ ２．２０．１０．５．２．５、ｌ、２５．０゜６２３．
０．３１３．０．１５６．０．０８０．０．０２０、ま
たはＯμｇ／ｍ（ｌの抗体希釈液２５μｅ； ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭｌ　　５０μｇ；４．
２０μｇが０．５μｇの抗体と結合するような濃度にま
で希釈したセフ１０−スビーズに結合させたヒツジ抗−
マウス！ｇＧ　Ｃ７−チ等（Ｍａｒｃｈ、　ｓ、　ｃ、
　）　Ｐａｒｋｉｎ、　１．　ａｎｄ　Ｃｕａｔｒｅｃ
ａｃａｓ、Ｐ、　Ａｎａｌｙｔ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８
０゜１４９（１９７４））］　２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一夜インキユベートする。

Ｃ，ウェルの内容物をガラスファイバー濾紙に吸引する
。

Ｄ、濾紙ディスクを切り取り、計数する。

Ｅ、結合した分画と抗体希釈液＃の関係をグラフにする
。

Ｆ、どの点（希釈液＃）が最大結合の９０％と等しいか
を決定する。

Ｇ、上記により決定された希釈液をスカッチャード検定
に用いる。

■　スカッチャード検定 Ａ、９６ウエルのマイクロタイタープレートに次の成分
を加える（３組） ｔ、４．４ｐｇ／ｕＱのＥＯＴＵＢＥ”’Ｉｎ基底状態
Ｉｎ２５μＱ ２、上記■−Ｂで調製した０、４Ｑｎｇ／ｕＱおよび０
．３６ｎｇ／μ９の段階希釈のＥＯＴＵＢＥ−基底状態
Ｉｎ　２５ｕＱ、　ｌ　１種類の希釈にそれぞれＯを加
え、Ｉｏｎｇ／ウェルから下って４．４０μｇ／ウェル
の範囲に０を加えて２４個の点を得る。

１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩで希釈する。； ３．１０％ウマ血清を含むＲＰＭＩ　　２５μｇ；４、
目的の抗体２５μｔ２（、感度検定で測定した濃度）： ５、セファロースビーズと結合させたヒツジ抗−マウス
［ｇＧ（感度曲線検定で用いたものと同じ）２０μＱ０ Ｂ、室温の回転機で一夜インキユベートする。

Ｃ，ウェルの内容物をガラスファイノぐ一濾紙に吸引す
る。

Ｄ、　ｉ！＠紙ディスクを切り取り、計数する。

Ｅ、結合／遊離のモル数に対して結合モル数をプロット
する。

Ｆ１曲線の直線部分の直線回帰をとる；負の傾きがＫａ
である。

ｃ、２礁熊性キメラ抗体ＣＥＭ／ＣＨＡの２機能性活性
の検定 ポリスチレンビーズを、ＣＥＡと特異的に結合するモノ
クローナル抗体ＣＥＶ１２４で被覆した。

次いで、ＣＥＡを被覆ビーズに加え、３７°Ｃで１時間
インキュベートした後、得られたビーズをＰＢＳで洗浄
した。次いで、２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡを含有す
る上清をこのビーズに加え、３７°Ｃで１時間反応を進
行させた。ＰＢＳで洗浄した後、ビーズを”’　Ｉ　ｎ
−Ｅ　ＤＴＡと３７℃で１時間混合した。もう１回洗浄
した後、抗体ＣＥＭ／ＣＨＡを含有する免疫複合体をペ
ーパーフィルター上に採取し、それをガンマカウンター
で計数した。２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡであって１
つのアームがＣＥＡと結合し、他方のアームが金属キレ
ートを結合する抗体を産生ずるトランスフェクトしたＳ
　Ｐ　２１０細胞を同定し、サブクローニングした。血
清不含の培地（ＨＨ２）に適合するよう細胞を順応させ
た後、全レベルが６０μｇ／Ｍ（１／　ｌ　ＯＩｌ細胞
程に高いレベルのＩｇの発現性が得られた。

実施例６ ＳＶ４０エンハンサー不含のクローニングシステムの構
築 Ａ６　プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ　−）の構築
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ　−Ｃｌａ（実施例１
１で構築）（約２０μｇ；１０μｇ）を、水（２１μ（
１）、ギブコ反応緩衝液＃６（５μ１２）、制限酵素Ｐ
ｖｕｌｌ（２μＱ）および制限酵素５ｐｈＨ（２μのと
混合した後、３７℃で２時間インキュベートした。次い
で、反応混合物を０．５％ＴＢＥゲル電気泳動にかけ、
実質上、実施例ＩＤ記載の方法に従ってＤＥＡＥ８１紙
からＰｖｕｌｌ／５ｐｈＩ［消化ベクターフラグメント
を精製した。これら制限部位の３°突出部を充填するた
めに、Ｐｖｕ■／５ｐｈＩ［消化ｐＳＶ２ｇｐｔ−Ｃ１
ａベクター約２０ｔｔ（ｌを、１０ＸＴ４ポリメラーゼ
緩衝液（７００＋ｓＭ）リス（ｐＨ７，４）、１０Ｏｉ
１００ｉら、５０ｍＭ　　ＤＴＴ）３μＲＳ　ｄＮＴＰ
混合物（各０．５ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＴＴＰＳｄＣＴＰ
およびｄＧＴＰＳ　ｐＨ７，０）３μＱ１水３μＱ１お
よびＴ４ＤＮＡポリメラーセ（Ｂ　ＲＬ）　１μ１２（
５Ｕ）と混合した。この混合物を３７℃で１５分間イン
キュベートした後、７０℃で１０分間加熱した。フェノ
ール抽出およびエタノール沈澱の後、ＤＮＡをＴＥ緩衝
液５μｇに再懸濁した。このＤＮＡフラグメント（約ｌ
μｇ；約５００　ｎｇ）を水ｌＯμ（，５Ｘライゲーシ
ョン緩衝液５μａ、ｉｏ。

μＭ　ＡＴＰ２μＱ１およびＴ４リガーゼ２μｇと混合
した。室温で２時間インキコベートした後、実質上、実
施例ＩＰの方法に従って、ライゲーシッン混合物でＥ、
ｃｏｌｉ　ＨＢ　ｌ　０１細胞を形質転換した。この形
質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、５Ｖ４（ｌエ
ンハンサ−領域〜０．３ｋｂの適正な欠失を示すプラス
ミドをプラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｇｐｔ（Ｅ−）と命名
した。

Ｂ、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（Ｅ　−）の構築
ＳＶ４０エンハンサ−不含のｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏをも
構築した。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ−Ｃ１ａ（実施例
ＩＰで構築）（約２０μＱ　；１０μｇ）をギブコ反応
緩衝液＃３中、制限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌ
ｌにより、実質上、上記と同様にして消化した。電気泳
動にかけたのち、ネオマイシン耐性付与遺伝子を含有す
る約２．３ｋｂのＨ１ｎｄｌＩ［／　Ｂ　ａｍＨＩ　７
ラグメントをＤＥＡＥ８１紙から単離、精製した。

同様に、プラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ−）も、制
限酵素ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄｌｌ［で消化し、電気
泳動にかけて大きいベクターフラグメントを精製した。

次いで、実質上、上記の節に記載の方法に従ってプラス
ミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−ＣＩａの約２．３ｋｂＥ
（ｉｎｄｍ／　Ｂ　ａａＨＩ　ｎｅｏ含有フラグメント
をプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ　−）のＨ１ｎｄ
Ｉ［Ｉ／　Ｂ　ａｓＨＩ消化ベクターフラグメントにラ
イゲートした。Ｅ、ｃｏｌｉ　ＨＢｌｏｌｌ［［］胞を
形質転換し、プラスミドＤＮＡを単離した後、プラスミ
ドｐＳ　Ｖ　２ｇｐＬ（Ｅ−）ベクターバックボーンが
プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ　−ＣＩａの約２．３
ｋｂ　ＢａｍＨＩ／Ｈｉｎｄｆｌ［ｎｅｏフラグメント
と結合してなるこれらのプラスミドをｐＳＶ２ｎｅｏ（
Ｅ）と命名した。

プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ（Ｅ−）ＤＮＡ約ｌＯμｇ（
１００μＱ）を水４μに１ギブフ反応緩衝液＃１（１２
μ＋２）、制限酵素Ｃ１ａｌ　２ｔｔＱ　、および制限
酵素Ｂａ５ＨＩ（２μｇ）と混合し、次いで３７℃で一
夜インキユベートした。ＤＥＡＥ８１紙に電気泳動し、
た後、大きいベクターフラグメントを精製し、ＴＥＩＱ
μｇに再懸濁した。プラスミド１）ＨＫＣＥ−１０（実
施例ＩＨで構築）約２０μｍ２（５μｇ）を水２３ａＱ
１ギブコ反応緩衝液＃ｌ（５μ（り、および制限酵素Ｃ
１ａｌ　　２ｕＱと混合した。３７℃で５時間経過した
後、反応物をフェノール／クロロホルム抽出し、エタノ
ール沈澱に付した。次いで、消化したＤＮＡを水２５μ
Ｑに再懸濁し、ギブコ反応緩衝液＃３（３μＱ）および
制限酵素Ｂａ５ＨＩ２μＱと混合した。３７°Ｃで２時
間インキュベートした後、消化ＤＮＡを電気泳動にかけ
、約９．Ｏｋｂのネズミ可変、ヒト定常カッパをコード
しているＣ１ａｌ／ＢａｍＨＩ制限フラグメントをＤＥ
ＡＥ８１紙から精製した。

次いで、この約９．Ｏｋｂフラグメントを上記のごとく
、Ｃ１ａ［／ＢａｍＨＩ消化プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ
（Ｅ−）とライゲートさせ、Ｅ　、　ｃｏｔ　ｉ細胞を
形質転換した。プラスミドを単離した後、正しい制限地
図を有するプラスミドをプラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−
）と命名した。

同様に、プラスミドｐＨＧＣＥ−３０（、実施例１０で
構築）約４０μ１２（５μｇ）を水３μＱ。

ギブコ反応緩衝液＃ｌ（５μｍ２）および制限酵素Ｃ１
ａ１２μｇと混合した。３７℃で５時間経過した後、反
応物をフェノール／クロロホルム抽出口、エタ／−ル沈
澱に付した。次いで、消化したＤＮＡを水２６ａＱ１ギ
ブコ反応緩衝液＃３（３ａｇ）、および制限酵素Ｂａｍ
Ｈ１１μＱに再懸濁した。

３７℃で２分間経過後、反応混合物１５μＱをとり、２
５０μＭ　ＥＤＴＡＩμｆｆと混合した。３７°Ｃで５
分間経過後、反応混合物の残り１５μｅもとり、２５０
μＭＥＤＴＡＩμＱと混合した。

このＢａｍ８１部分消化により、すべての可能なＣ１ａ
ｌ／Ｂａｎ＋ＨＩ制限フラグメントが得られた。０゜５
％１’　Ｂ　Ｅゲル電気泳動にかけ、約１２．７ｋｂｃ
Ｉａ　Ｉ　／　Ｂ　ａｍＨ１制限フラグメントをＤＥＡ
Ｅ３１紙から精製し、た。この制限フラグメントは、ネ
ズミ可変、ヒト定常ガンマをコードしている遺伝子を含
有している。次いで、約１２．７ｋｂ　Ｃ１ａｌ／Ｂａ
ｍＨ１　　（部分）制限フラグメントをＣ１ａｌ／Ｂａ
ｍＨ１消化プラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ（Ｅ−）とライゲ
ートさせ、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。再度、’
ｌ’　：’ｔｔＥ　Ｌ、制限部位のマツピングを行い、
適正な制限地図を有するプラスミドをプラスミドｐＧＣ
ＥＭＧ　（Ｅ−）と命名した。

実質上、実施ＶＡ１５ｃ記載の方法に従い、ブラスミ　
ドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（Ｅ　−）Ｄ　Ｎ　Ａ約１０μ
ｇ　　（１００μのを制限酵素Ｃ１ａｌおよびＢａｍＨ
［で消化し、ベクターフラグメントを単離し、精製した
。次いで、ネズミ可変、ヒト定常カッパをコードしてい
る遺伝子を含有する、プラスミドｐＨＫＣＥ−１０（実
施例５Ｃで単ｐｌ）の約９．０ｋｂＣｌａｌ／Ｂａ５Ｈ
Ｉ制限フラグメントを、実質上、実施例５Ｃ記載の方法
に従い、プラスミドｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（Ｅ　−）の
Ｃ１ａｒ／ＢａａＨＩ消化ベクターフラグメントにライ
ゲートさせ、プラスミドｐＮＣＥＭＫ（Ｅ−）を構築し
た。また、実施例５Ｃの記載に従い、プラスミドｐｌ−
ＩＣ；ＣＥ−３Ｑの約１２．７ｋｂ　Ｃ１ａｌ／Ｂａ鳳
Ｈ１（部分）制限フラグメントをプラスミドｐＳ　Ｖ　
２　ｎｅｏ（Ｅ　　）のＣ１ａｌ／ＢａｍＨ１７肖化ベ
クターフラグメントにライゲートすることによりプラス
ミドｐＮＣＥＭＧ　ｔ　（Ｅ−）を構築した。従って、
プラスミドｐＮＣＥＭＧ　１（Ｅ−）は、ネズミ可変、
ヒト定常ガンマをコードする遺伝子をＳ■４０エンハン
サー不含発不含発現ベクタ歯上するものである。

プラスミドｐｓＶ２ｇＰＬの代わりにプラスミドｐＳ　
Ｖ　２ｇｐｔ（Ｅ−）を使用する以外は、実質上、ブラ
スミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　（実施例３　Ｂ　）の構築法
に従い、プラスミドｐＧＣＨＡＫ（Ｅ−）を構築した。

プラスミドｐＧｃＨＡＧｌ（Ｅ−）は、プラスミドｐＳ
　Ｖ　２　ｇｐｔの代わりにプラスミドｐＳ　Ｖ　２ｇ
ｐｔ（Ｅ　−）を使用する以外は、実質上、プラスミド
ｐＧＣ）（ＡＧＩ（実施例３Ａ）の構築法に従って構築
した。

Ｆ、プラスミドｐＮＣＥＭＫＧ　１（Ｅ−）の構プラス
ミドｐＮＣＥＭＫＧ　１（Ｅ−）は、プラスミドｐＮｃ
ＥＭＧｌの代わりにプラスミドｐＮＯＥＭＣＩ（Ｅ−）
を使用する以外は、実質上、プラスミドｐＮＣＥＭＫＧ
　ｌ　（実施例３Ｑ）の構築法に従って構築し、た。

Ｇ、プラスミドｐＧｃＨＡＫＧ　１（Ｅ−）の構築プラ
スミドｐＧＣＨＡＫＧ　１（Ｅ−）は、プラスミドｐＧ
ｃＨＡＧｌの代わりにプラスミドｐｃｃｉ−ｔＡＧＩ（
Ｅ−）を使用する以外は、実質上、プラスミドｐＧｃＨ
ＡＫＧ１（実施例３Ｃ）の構築法に従って構築した。

Ｈ，プラスミドｐＧＣ）ＩＡＫＧ　１（Ｅ−）およびｐ
ＮＣＥＭＫＧ　１（Ｅ−）によるＳ　Ｐ　２１０細胞の
トランスフェクシヨン 実施例４に記載の方法に実質上従い、プラスミドｐＧＣ
ＨＡＫＧ　１（Ｅ−）をまず、５Ｐ２１０細胞にトラン
スフェクトした。５ｐ２１０細胞をトランスフェクトし
た後、活性ＣＨＡキメラ抗体を発現するＳ　Ｐ　２１０
細胞を実施例５Ｂに記載の方法によって同定し、これら
のクローンをプラスミドｐＮＣＥＭＫＧ　１（Ｅ−）で
トランスフェクトすることによって、高レベルで２機能
性キメラ抗体ＣＥＭ／ＣＨＡの発現を示す細胞を生産し
た。

まず始めに、式： で示されるＤＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドポリ
リンカーを製造することにより、中間体プラスミドｐ１
９ＨＡＮＣＨを構築した。このリンカ−は、当業界周知
の方法で１本領デオ牛シオリコヌクレオチドから合成し
た。１本鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、バイオサー
チ（Ｂ　１ｏｓｅａｒｃｈ）８７００　　ＤＮＡ合成装
置［Ｂ　１ｏｓｅａｒｃｈ社供給、Ｓａｎ　Ｒａｐｈａ
ｅｌ　ＣＡ、］のような、ホスホル７ミダイ）　（ｐｈ
ｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の化学を利用する市販の
装置を用いて合成することができる。ＤＮＡ合成の他の
方法も当業者には既知である。１本鎖ＤＮＡ合成のため
の、伝統的な改良ホスホトリエステル法は、イタクラら
（Ｉ　ｔａｋｕｒａ）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）
、１９８：１０５６（１９７７）およびフレアら（Ｃｒ
ｅａ）、プロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンシイズＵＳＡ。

７５：５７６５（１９７８）により示されている。

加えて、特に好ましいＤＮＡ合成法は、ヒスイングら（
Ｈｓｉｕｎｇ）、ニュクレイック・アシッズ・リサーチ
、ｌ　ｌ：３２２７（１９８３）およびナランら（Ｎ　
ｒａｎｇ）、メソソズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ＥｎｚｙＨｌｏｌｏｇｙ）、６８：
９０（１９８０）により開示されている。

約２．５μｇの２つのオリゴヌクレオチド鎖を２ｘ７＝
−リング緩衝Ｗｌ　（０，２Ｍ　ＮａＣｌ２．２０μｅ
ＭトリスーＨ（Ｊｌ　（ｐＨ７，８）および２ｍＭＥＤ
ＴＡ）５０μｅおよび水５０μｇと混合した。この反応
混合物を７０℃で５分間加熱したのち、２本の一本鎖が
アニーリングして一本のリンカ−セグメントとなるよう
、室温まで徐々に放冷した。

プラスミドｐＵｃ１９（二ニー・イングランド・バイオ
ラボ）約ｌμｇを、実質上、既述の方法に従い、制限酵
素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌＨで消化した。約２．６
ｋｂのベクターフラグメントを精製した後、Ｅ　ｃｏＲ
１／　Ｈ１ｎｄＩ！ｌ消化プラスミドｐｔＪｃ１９に、
合成したポリリンカーをライゲートさせた。

Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉを形質転換し、再度、プラスミドＤ
ＮＡを単離し、リンカ−領域内に適切なＨｉｎｄｏｌ、
５ｓｐ１、Ｐｓｔｌ、５ｓｔＨおよびＥｃｏＲ１部位を
有するプラスミドをプラスミドｐｉ　９ＨＡＮと命名し
た。

プラスミド５（−）ＣＨＡＶＬは、最初にＢｌｕｅｓｃ
ｒｉｐｔベクター、Ｍ１３（−）ＳＫ　（ストラックジ
−ン）を制限酵素ＢａａＨＩおよび５ｓｔｌで消化し、
実質上、既述の方法に従い、大きいベクターフラグメン
トを単離することによって構築した。次いで、プラスミ
ドｐＭＬＣＨ−１を制限酵素Ｂａ５ｌ（Ｉおよび５ｓｔ
ｌで消化し、ネズＣＨＡ可変領域をコードしている遺伝
子を含有する約１１００ｂｐのフラグメントを単離した
。プラスミドｐＭｔ、Ｃｌ−Ｈは、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　
Ｒｅｇｉｏｎａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、　ｌ　８１５　　Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓ
ｉｔｙ　５ｔｒｅｅｔ。

Ｐｅｏｒｉａ、　Ｉ　Ｌ　６１６０４に寄託され、その
パーマネント・ストック・カルチャー・コレクションの
一部を構成するＥ、ｃｏｌｉ　Ｋ　１２　　ＨＢ　Ｉ　
Ｏ１／ｐＭＬＣＨ−１から好都合に単離することができ
る。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　　ＨＢＩＯＩ／ＰＭＬＣＦ（−
１は受託番号ＮＲＲＬ　Ｂ−１８４３２の下で入手可能
である。プラスミドｐＭＬＣＨ−１の約１１００ｂｐ　
ＢａａＨＩ／５ｓｔｌ制限フラグメントをＢａｍＨＩ／
５ｓＬ１消化ベクターＭ１３（−）ＳＫとライゲートさ
せ、得られたプラスミドで実質上、上の実施例記載の方
法に従い、Ｅ　、　ｃｏｌ　ｉを形質転換した。

再単離および制限マツピングの後、適正な約１１００ｂ
ｐのＢａｍＨＩ／５ｓｔｌフラグメントを含有するプラ
スミドをプラスミドＳ　（−）ＣＩ（Ａ　Ｖ　Ｌと命名
した。

実質上、既述の方法に従い、プラスミド５（−）ＣＨＡ
ＶＬ約ｌμｇを制限酵素Ｐｓｔｌで消化した。

ネズミＣＩＡ可変領域コードしている遺伝子を含有する
約９００ｂｐＰｓｔｌ制限フラグメントを単離し、制限
酵素Ｐｓｔｌでポリリンカー領域に切断を施しておいた
プラスミドり１９ＨＡＮとライゲートさせた。形質転換
、再単離および制限マツピングを行った後、ポリリンカ
ーのＨｉｎｄＩ［［部位と最も近接してＣＨＡ遺伝子の
Ｊ領域を含有しているプラスミドをプラスミドｐｌ　９
ＨＡＮＣＨと命名した。

実質上、既述の方法に従い、プラスミドｐＧＣＥＭＫ　
（実施例１で構築）約５μｇを制限酵素Ｃ１ｍ１および
５ｓｐｌで消化し、ＯＥＭカッパプロモーターを含有す
る約２．２ｋｂ　Ｃ１ａｌ　／５ｓｐｌ制限フラグメン
トを精製した。別の反応で、プラスミドｐＧＣＥＭＫを
制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｔｆｌで消化し、約９．４
ｋｂベクターフラグメントを単離した。さらに、プラス
ミドｐ１９ＨＡＮｃＨを制限酵素Ｓ　ｓｐ　Ｉおよび５
ｓｔＩ！で消化し、ネズミカッパＣＨＡ可変領域をコー
ドする遺伝子を含有している約９３１ｂｐの制限フラグ
メントを単離した。

３成分ライゲーンシタン反応により、プラスミドｐＧＣ
ＥＭＫの約９．４ｋｂ　Ｃ１ａｌ／５ｓｔｌＩベクター
フラグメント、プラスミドｐＧＣＥＭＫのＯＥＭプロモ
ーター含有約２．２ｋｂ　Ｃ１ａｌ／５ｓｐＩ制限フラ
グメント、およびネズミカッパＣＨＡ可変領域をコード
する遺伝子を含有しているプラスミドｐ　１９　ＨＡ　
Ｎ　ＣＨの約９３１ｂｐ　５ｓｐｌ／５ｓＬＵ制限フラ
グメントのすべてを一緒に、同時にライケートさせ、実
質上、既述の実施例の方法に従い、Ｅ、ｃｏｌｉを形質
転換した。プラスミドを単離し、制限マツピングに付し
た後、制限フラグメントのサイズが適正であるプラスミ
ドをプラスミドｐＧＣＨＡＫ−２と命名した。

同様の方法でプラスミドｐＧＣＥＭＫ（Ｅ−）＜実施例
６Ｃで構築）を制限酵素Ｃ１ａｌおよび５ｓｔＩ［で消
化し、約９．２ｋｂ制限フラグメント（ＳＶ４０エンハ
ンサ−不含）を単離した。次いで、このフラグメントを
プラスミドｐＧＣＥＭＫのＣＥＭカッパプロモーターを
含有する約２．２ｋｂＣ１ａｌ／５ｓｐｆ制限フラグメ
ントおよびプラスミドｐ１９ＨＡＮＣＨの約９３１ｂｐ
　５ｓｐｌ／５ｓｔｌＩ制限フラグメントとライゲート
させ、プラスミドｐＧＣＨＡＫ−３を構築した。プラス
ミドｐｃ　ＣＨＡＫ−３とプラスミドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋ
　−２とは、プラスミドｐｃ　ＣＦ（Ａ　Ｋ　−３がＳ
Ｖ４０エンハンサ−を欠如している点でのみ異なる。

プラスミドｐＧｃＨＡＫＧ１−２は、プラスミドｐＧＣ
）ＩＡＫの代わりにプラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ２を使
用する以外はプラスミドｐＧ　ＣＨＡ　Ｋ　Ｇｌの構築
法（実施例３Ｃ）に従って構築した。同様に、プラスミ
ドｐＧＣＨＡＫＧ１−３は、プラスミドｐＧｃＨＡＫの
代わりにプラスミドｐＧＣＨＡＫ−２を使用し、プラス
ミドｐＧｃＨＡＧｌの代わりにプラスミドｐＧＣＨΔＧ
ｌ（Ｅ−）を使用する以外はプラスミドｐｃ　ＣＨＡ　
Ｋの構築法（実施例３Ｃ）に従って構築した。プラスミ
ドｐＧＣＨΔＫＧｌ−２は、ＣＥＭカッパプロモーター
から誘導されるＣＨＡキメラＬ鎖をコードしている遺伝
子、およびキメラＨ鎖ＣＨＡ−特異的遺伝子を含有して
いる。プラスミドｐＧＣＨＡＫＧｌ−３は、ＯＥＭカッ
パプロモーターから誘導されるＣＨＡキメラし鎖をコー
ドしている遺伝子、およびキメラＨ鎖ＣＨＡ−特異的遺
伝子をＳＶ４０エンハンサー不含ベクター上に含有して
いる。プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１−２およびｐＮＣＥ
ＭＫＧｌで５Ｐ２１０細胞をトランスフェクトすると、
２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡの発現レベルが増加され
ることが示され、プラスミドｐｃ　ＣＨＡ　ＫＧｌ−３
およびｐＮｃＥＭＫＧｌで５Ｐ２１０細胞をトランスフ
ェクトすると、これもまた２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨ
Ａの発現レベルが増加されることが示された。

【図面の簡単な説明】

第１図はプラスミドｐＭＬＣＥ−１０およびプラスミド
ｐＨＦＫ−１の制限部位および機能地図、第２図はプラ
スミドｐＨＫＣＥ−１０およびプラスミドｐＧＣＥＭＫ
の制限部位および機能地図、第３図はプラスミドｐＭＨ
ＣＥ−３ＱおよびプラスミドｐＨＧＩＺの制限部位およ
び機能地図、第４図はプラスミドｐＨＧＣＥＭ−３０お
工びプラスミドｐＮｃＥＭＧｌの制限部位および機能地
図、第５図はプラスミドｐＮＯＥＭＫＧｌの制限部位お
よび機能地図、第６図はプラスミドｐＭ　Ｌ　ＣＨｌお
よびｐＭＬｃ８１ｄＢの制限部位および機能地図、第７
図はプラスミドｐｃ　ＣＨＡ　Ｋの制限部位および機能
地図、第８図はプラスミドｐｕ　ＣＶ　ＨＩ　ｎｃ　−
Ｉ　ＡおよびｐＨＧｌ−ＣＨＡの制限部位および機能地
図、第９図はプラスミドｐＧＣＨＡＧｌの制限部位およ
び機能地図、ならびに第１０図はプラスミドｐＧＣＦ（
ＡＫＧＩの制限部位および機能地図をそれぞれ示す模式
図である。 第２図 ネス゛ミ　ＣＥＭ２３１　− ド 代　理　人　弁理士　青白　葆　（外１名）第３１ 仁、− 第４図 第５図 第６図 第８図 第９図

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、キメラモノクローナル抗体のヒト癌胎児性抗原に特
   異的なＬ鎖可変領域をコードしている第１のＤＮＡ配列
   、およびキメラモノクローナル抗体のヒト癌胎児性抗原
   に特異的なＨ鎖可変領域をコードしている第２のＤＮＡ
   配列を含有する組換えＤＮＡ化合物であって、該抗体Ｌ
   鎖可変領域アミノ酸配列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を含有し、該抗体Ｈ鎖可変領域
   アミノ酸配列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を含有するものである組換えＤ
   ＮＡ化合物。 ２、第１のＤＮＡ鎖暗号配列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列を含有し、第２のＤＮＡ鎖暗号配
   列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列を含有する請求項１に記載の組換
   えＤＮＡ化合物。 ３、キメラモノクローナル抗体のＬ鎖定常領域をコード
   している第３のＤＮＡ鎖配列、およびキメラモノクロー
   ナル抗体のＨ鎖定常領域をコードしている第４のＤＮＡ
   鎖配列をさらに含有する請求項１または請求項２に記載
   の組換えＤＮＡ化合物。 ４、第１および第２のＤＮＡ鎖暗号配列がネズミハイブ
   リドーマから誘導されたものである請求項１、請求項２
   または請求項３のいずれかに記載の組換えＤＮＡ化合物
   。 ５、ネズミハイブリドーマがＣＥＭ２３１．６．７であ
   る請求項４に記載の組換えＤＮＡ化合物。 ６、第３および第４のＤＮＡ鎖暗号配列がヒトリンパ球
   から誘導されたものである請求項３に記載の組換えＤＮ
   Ａ化合物。 ７、第５図に示されるプラスミドｐＮＣＥＭＫＧ１であ
   る請求項６に記載の組換えＤＮＡ化合物。 ８、プラスミドｐＮＣＥＭＫＧ１（Ｅ−）である請求項
   ６に記載の組換えＤＮＡ化合物。 ９、キメラモノクローナル抗体のキレート特異的Ｌ鎖可
   変領域をコードしている第１のＤＮＡ配列、およびキメ
   ラモノクローナル抗体のキレート特異的Ｈ鎖可変領域を
   コードしている第２のＤＮＡ配列を含有する組換えＤＮ
   Ａ化合物であって、該抗体Ｌ鎖可変領域アミノ酸配列が
   、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を含有し、該抗体Ｈ鎖可変領域
   アミノ酸配列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるアミノ酸配列を含有するものである組換えＤ
   ＮＡ化合物。 １０、第１のＤＮＡ鎖暗号配列が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列を含有し、第２のＤＮＡ暗号配列
   が、式： 【遺伝子配列があります】 で示されるＤＮＡ配列を含有する請求項９に記載の組換
   えＤＮＡ化合物。 １１、キメラモノクローナル抗体のＬ鎖定常領域をコー
   ドしている第３のＤＮＡ鎖配列、およびキメラモノクロ
   ーナル抗体のＨ鎖定常領域をコードしている第４のＤＮ
   Ａ鎖配列をさらに含有する請求項９または請求項１０に
   記載の組換えＤＮＡ化合物。 １２、第１および第２のＤＮＡ鎖暗号配列がネズミハイ
   ブリドーマから誘導されたものである請求項９、請求項
   １０または請求項１１のいずれかに記載の組換えＤＮＡ
   化合物。 １３、ネズミハイブリドーマがＣＨＡ２５５．５である
   請求項１２に記載の組換えＤＮＡ化合物。 １４、第３および第４のＤＮＡ鎖暗号配列がヒトリンパ
   球から誘導されたものである請求項１１に記載の組換え
   ＤＮＡ化合物。 １５、第１０図に示されるプラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１
   である請求項１４に記載の組換えＤＮＡ化合物。 １６、プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１（Ｅ−）である請求
   項１４に記載の組換えＤＮＡ化合物。 １７、プラスミドｐＧＣＨＡＫＧ１−２である請求項１
   ４に記載の組換えＤＮＡ化合物。 １８、プラスミドｐＧＣＨＡにＧ１−３である請求項１
   ４に記載の組換えＤＮＡ化合物。 １９、２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡを分泌する形質転
   換された宿主細胞。 ２０、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１／ｐＧＣＨＡＫＧ
   １である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２１、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１／ｐＧＣＨＡＫＧ
   １（Ｅ−）である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２２、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１／ｐＧＣＨＡＫＧ
   １−２である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２３、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１／ｐＧＣＨＡＫＧ
   １−３である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２４、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１（Ｅ−）／ｐＧＣ
   ＨＡＫＧ１である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２５、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１（Ｅ−）／ｐＧＣ
   ＨＡＫＧ１（Ｅ−）である請求項１９に記載の宿主細胞
   。 ２６、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１（Ｅ−）／ｐＧＣ
   ＨＡＫＧ１−２である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２７、ＳＰ２／０／ｐＮＣＥＭＫＧ１（Ｅ−）／ｐＧＣ
   ＨＡＫＧ１−３である請求項１９に記載の宿主細胞。 ２８、ある１つのＬ鎖可変領域および対応するある１つ
   のＨ鎖可変領域が第１の抗原を特異的に認識するＬ鎖お
   よびＨ鎖可変領域を含有し、別のＬ鎖可変領域および対
   応する別のＨ鎖可変領域が第２の異なる抗原を特異的に
   認識するＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含有し、さらに、す
   べてのＬ鎖およびＨ鎖定常領域がヒト抗体定常領域を含
   有している２機能性キメラモノクローナル抗体。 ２９、ある１つのＬ鎖可変領域および対応するある１つ
   のＨ鎖可変領域がヒト癌胎児性抗原を特異的に認識する
   Ｌ鎖およびＨ鎖可変領域を含有し、別のＬ鎖可変領域お
   よび対応する別のＨ鎖可変領域が金属キレートを特異的
   に認識するＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含有し、さらに、
   すべてのＬ鎖およびＨ鎖定常領域がヒト抗体定常領域を
   含有している請求項２８に記載の２機能性キメラモノク
   ローナル抗体。 ３０、ヒト癌胎児性抗原を認識するＬ鎖可変領域がアミ
   ノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含有し、ヒト癌胎児性抗原を認識するＨ鎖可変領域が
   アミノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含有し、金属キレートを認識するＬ鎖可変領域がアミ
   ノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含有し、金属キレートを認識するＨ鎖可変領域がアミ
   ノ酸配列： 【遺伝子配列があります】 を含有する請求項２９に記載の２機能性キメラモノクロ
   ーナル抗体。 ３１、２機能性キメラＣＥＭ／ＣＨＡである請求項３０
   に記載の２機能性キメラモノクローナル抗体。