JPH02138986A - 脂肪酸エステルの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は脂肪酸とアルコール残基を与える反応物をリパ
ーゼの触媒作用のもとに反応させてエステルを製造する
方法に関する。本発明の一つの適用方法はりパーぜの転
位触媒作用による脂肪及び植物油の転位である。

脂肪及び植物油の転位においては、脂肪及び油の大部分
を構成Ｊるトリグリセリドの脂肪酸成分がその反応用に
選択された触媒に基いて人なり小なり１〜リグリセリド
上で転位を起す。アルカリ金属、それらの水酸化物、及
びアル−ｌキシドの作用下では転位は常にランダムに行
われる。

つい最近開発された方法であって、米国特許第４２７５
０８１号に開示されでいるリパーゼ触媒を用いた方法で
は選択したリパーゼ、及び反応組成物中に遊離酸又はア
ルキルエステルとして存在するその他の脂肪酸基に関連
して転位はランダム又は選択的となる。この方法及び他
の文献に記載されているように、酵素が無機及び／又は
有機の不活性な担持体物買上に固定されるのが好ましい
。又、反応は、反応物に対する溶媒の有無に関係なく、
各種の温度で、そして反応物が水−不混和性の均一液相
にあり、触媒が活性であるという条件のもとで、回分式
又は連続式に行われる。

アルカリ金属触媒の作用を受ける転位操作は石けんの生
成を伴う副反応及び触媒活性の損失を避けるために水を
厳密に除外した状態で行われなければならないが、酵素
触媒は反応の間活性を保つために少量の水を必要とする
。酵素が層内の触媒担持体上に固定されており、供給原
料がその層を通過する連続反応の場合には供給原料中に
存在する水で十分であり得る。そして、その水のけは、
通常、供給原料の１重量％未満であり、０．１重量％程
度であることもある。これより相当大量の水が存在する
時、触媒は活性なままであるが反応は加水分解生成物の
生成の方法を示し、トリグリセリドの損失を伴う。一方
において、存在する水の量をできるだけ少なくしようと
すると触媒活性が低下する。

リパーゼ酵素の触媒作用のもとに行われるエステル化反
応（アルコール分解反応を含む）においても、許容され
る水の量に制限があることに関して同様な考慮が必要で
ある。そしてこの反応においてはエステルのアルコール
残基−このエステルは勿論トリグリセリドのようなグリ
セリドエステルであってもよい−が他のアルコール残基
と置き変えられる。これらの反応は、不要な加水分解生
成物の生成を避けるために転位操作同様、反応系内の水
を極微量に保つことを必要どする。

担持された酵素リパーゼの触媒作用のもとて極微量の水
の存在のもとに行われる前述の転位操作又はそれと関連
する操作においては、酵素を大きな表面積を持つ担持体
物買上に沈積させる。この担持体物質は無機質、例えば
シリカ及びその誘導体、特にセライト（Ｃｅｌｉｔｅ）
　（ケンソウ土の商品名）、又は有機質、例えば酵素が
収容される孔がマク［１孔質構造になっているイオン交
換樹脂、である。従来、これらの反応において、酵素を
担持体物質に付着さ仕るのは次の方法によって行われて
いる。すなわち、酵素を親水性の担持体表面に沈澱させ
ることによる物理的な方法、又は欧州特許公開第１４７
９１４号に開示されているように有機金属の結合化合物
（ＣｏｕｐｌｉｎｇＣｏｍｐｏｕｎｄ）を用いて酵素を
、疎水性の環境を作りながら担体に科学的に結合させる
方法、又は欧州特許公開第１４０５４２号に開示されて
いるようにイオン交換物質にイオン的に付着させる方法
などである。米国特許第４５５１４８２号には改質ポリ
スヂレンボリマーへのＩＩ木のイオン的付着が開示され
ている。酵素の固定以前に、もともと疎水性であったポ
リマー表面を長い連鎖のカチオン性表面活性剤の稀薄溶
液に浸漬して調整することが米国特許第４５３９２９４
号に開示されている。

本発明の目的は脂肪酸エステルの改良された［ｉ方法を
提供ＪることＣある。

本発明により、担持された活性リパーゼ触媒の作用のも
とで、変質的に非水均一反応系にお（プるトリグリ廿リ
ドの転位及びニスデル製造のための他の反応の改良され
た方法が見出された。この方法においては酵素の担持体
物質への付着は好ましくは溶液からの吸着にＪｚって当
該担持体物質の疎水性多孔性表面に対して行われる。

本発明の反応は実質的に非水液相で行なわれるが若干の
水が酵素に結合していることが必要である。

この水の量はほとんど測定できない程微量である。

例えば非水液相を水ぐ飽和させるだ（プで十分であり、
事実５０％以上の飽和で十分である。水溶液相は存在し
ない。

本発明において使用するのに適切な担持体物質にはポリ
エチレン及びポリプロピレンなどのマクロ孔質のポリオ
レフィンが含まれる。それらは一般に単一ポリマー及び
共重合体であってそのポリマー単位はビニル及びビニリ
デン単位などのエチレン系のもの、例えばポリビニル、
及びポリビニリデン、へログン化物、ポリウレタン及び
ポリカーボネートである。他の合成担持体物質にはブタ
ジェン及びイソプレンの重合体又は共重合体、ポリニス
゛ｊル、ポリｊ７ミド例えばナイロンなどが含まれる。

本発明において用いるのに適切な天然のポリマーには天
然ゴム及びグツタペルカが含まれる。これらの物質は多
孔性に作られねばならず、これは重合の時に発泡剤を用
いることによって行われる。ガラス及び耐熱性物質、例
えばシリカのような無機多孔性物質であって、−ぞの表
面が例えばシラン処理によって疎水性にされたものも又
適切である。酵素の固定を良好にザるため担持体物質の
平均の細孔の大きさは５０％ｍ以上、好ましくは０．０
５乃至５μである。平均の細孔の人ぎさとは水銀ボロシ
メ］〜リ−の標準的な技術によ−）で測定されＩＣ平均
細孔直径である。適切な物質の粒子の大きさはポリオレ
フィンの場合は０．０１乃至５ｍｍｚ特に０１乃至１．
５＃、シリカのような耐熱性物質の場合は０．５乃至３
ｎａである。

疎水性物質に担持された酵素は米国特許第４６２９７４
２号に開示されでおり、この場合、これらの酵素は脂肪
の加水分解に用いられる。本発明において特に有益な合
成ポリマーは欧州特許公開第６０１３８号に開示されて
いる高分散相エマルジョン法（ｈｉｇｈｎｔＯｒｎａｌ
　ｐｈａｓｅ　ｅｎｌｔｌｌｓｉｏｎ　ｔｅｃｈｎｉｑ
ｕｅ）によって製造される合成ポリマーである。これら
は、ポリビニル系のポリマー物質、例えばボリスヂレン
である。

担持体物質は、全細孔容積が５０％以」−であり、過半
数が穴によって相位に連絡している気孔を含み、その気
孔の平均直径が１乃至１５０μｍの範囲内にある多孔性
ポリマー物質から成るのが好ましい。全細孔容積が７５
％以上、例えば９０％又はそれ以上であるのが一層好ま
しい。

本発明において使用するのに適切な多孔性物質に関して
さらに詳細な事項は−Ｌ述の欧州特許公開第６０１３８
号に記載されているがその他欧州特許公開第１０５６３
４号、欧州特許公開第１５６５４１＋″ｉ、欧州特許公
開第１５７５０４号、英国特拾第２１５５４８１号、欧
州特許公開第２００５２８号、欧州特許公開第２２３５
７４号、欧州特許公開第２３９３６０号、欧州特許公開
第２４０３４２号、欧州特許公開第２６４２６８　Ｓ号
、欧州特泊公間第２８９２３８号、欧州性許公開第２８
８３１０号及び、欧州特許出願８８３０６４４７．９（
１９８８年１月１５日出願の米国特許出願第２１９２３
１号に対応する）などにも見出される。これらの特許明
細書の各々は本発明の多孔性に対する要件を満たず多孔
性物質を開示している。づべての場合において、物質は
出発物質を高分散相しマルジョン（ｈｉｇｈｎｔｅｒｎ
ａｌ　ｐｈａｓｅ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ）の形で重合させ
て製造りることができる。そしてこのエマルシコンは油
中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン又は二つの
実質的に混和しない溶液間に形成されるエマルジョンの
いづれかであってもよい。［−水１は水溶液系を意味し
、「油」は水溶液と混和しない系を意味Ｊる。

それぞれの明細書に開示されている物質は出発物質及び
／又は仕上がりの性質が異なる。今述べた特許明細書は
すべて、参考として本明細権中に採用する。

日本国特許出願公告第５９−９１８８３号は酵素溶液を
スチレン又はメタクリル酸エステルと接触させることに
よる担持された酵素の製造を開示している。スヂレンボ
リマーはソ連特許第８０４６４７８明細内においで酵素
担持体物質として提案されている。ホックＣｌｌ０Ｑ）
他（ＪＡＯＣ８す、（４）　１９８４年４月、１）１１
．７７６−８１　）は疎水性の多孔性支持体物質、例え
ばポリプロピレン、上に固定されたリパーゼの触媒作用
のもとに、混和しない水相と非水液相を含む不均一系反
応集団内で行われるグリセリド合成を開示している。

本発明において有益なその他の相持体は無機質の耐熱性
物質例えばシリカ又はガラスである。このような物質は
疎水性の有機シリカ重合体被膜を有し得る。

本発明において使用するのに適切な酵素にはム］（Ｐｅ
ｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属のリパーゼ種からのリパーゼが
含まれる。

本発明において用いられる脂肪酸及びアルコール残基を
与えるための反応物はグリセリドエステル、例えば１種
類以上の脂肪酸及び油から成るのが好ましい。

好ましい１つの反応物系はグリセリドエステルと共に１
種類以上の遊離酸又はそのアルキルエステルを含む。

例 本発明を説明するため以下に多くの例を示す。言うまで
もなく、本発明はこれらの例に限定されるものではない
。

これらの例において、リパーゼ用に各種の相持体が用い
られる。それらの特性は次のとおりである：ＥＰ−１０
０　　ＥＰ−４００ＥＰ−９００オランダのエンカ社（
Ｅｎｋａ）から入手できる。

種類：ポリプロピレン（ＥＰ−１００，ＩＰ−４００）
又はポリアミド（ＥＰ−９００）のマクロ孔質粒子であ
って穴で相互に連絡された大きな隔室 （気孔）を持つ。

商品名：アキュレル（Ａｃｃｕｒｅｌ）ＥＰ−１００Ｅ
Ｐ−４００ Ｐ−９００ 粒子の大きさ （ｍ）　　　　　　０．２−０．４　　０．２−０．４
０．２−０．４ 孔容積（ｄ／（１）　　　３．２　　　０．６表面積（
ＴＩｌ、１０）　　９２　　　　２０．８ かざ密度 （Ｑ／１ｔｄｌ　＞　　　　　０．１５　　　０．２０
０．２１ 穴の大きさ （μｍ＞　　　　０．０！］−０，５０，１−０，５気
孔率（％）　　　７５　　　　７５ ９８０Ｇ シェル社（Ｓｈｅｌｌ）より入手できる。

種類：多孔性シリカ球形粒子 粒子の大きさ　１．５＃ ■孔容積　　　１．２ｄ／ｌｊ 表面積　　　　６３Ｔｄ、７ｇ かさ密度　　　０．４ｏ／Ｉｌｄ！ 平均細孔直径　６０ｎｍ ０．０５−０．３ ５６９３−９３．７８−７３００ 英国、ナショナルスターヂ・アンド・ケミカル社（Ｎａ
ｔｉｏｎａｌ　５ｔａｒｃｈ　＆　Ｃｈｅｉｉｃａｌ　
Ｌｔｄ、）から入手できる。

種類：穴によって相互に連絡した大きな隔室（気孔）を
持ってマクロ孔質ののポリスチレン粒子であって、連続
相（ｅＸｔｅｒｎａｌｐｈａＳｅ）に七ツマ−１そして
大きな分散相（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｐｈａｓｅ）容積の
乳化重合によって製造されたもの。全細孔容積は９０％
より大である。

表面積（ＢＥＴ）　　　　１１．３Ｔｄ１０　　６．３
麓／ｇ細孔の大きさ分布　５００−７０００ｎｍ　　１
１０００−６０００ｎ平均細孔直径　　　１６８６ｎｍ
　　　　３３６０ｎｍ全細孔容積　　　　４．７１ｄＩ
Ｑ　　　５．１ａｔｅ　／（］アンバーライト（ＡＨＢ
ＥＲＬＩＴＥ）　ＸＥ−３０５０−ム寺アンド・ハース
社（Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ）より入手できる。

種類：マクロ孔質のポリスチレン粒子 表面積（ＢＦＴｌ　　　　４３．７Ｔｄ、／（］孔の大
きさ分布　　３３０−２００ｎ 平均細孔直径　　　５５ｎｍ ＰＧ−２０００−１２０ ジグＶ−ケミカル１：（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ
　Ｃｏ、　Ｌｔｄ、）から入手できる。

種類：ｍ孔−制御のガラスピーズ 表面積　　　　　　１１．１７に／９ 平均細孔白径　　　２０５．９ｎｍ 実施例１ ）固定化 ８ｇのＥＰ−１００を１００戒のエタノールに加えて、
すべての粉末が確実に湿潤するように激しく撹拌した。

６０ｉｄの過剰のエタノールをデカンデージョンで除き
、０．１Ｈリン酸緩衝液ｐＨ７，０を２００ｄ加えて撹
拌し完全に混合させた。過剰の緩衝液をガラス濾過器上
で穏やかに吸引して除いた。湿潤粉末にムコール・ミニ
ヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）の１．３選択的リパー
ゼ粉末（デンマーク、ノボ社（Ｎｏｖｏ）から入手可能
）　１０．０ｇを含む０、１８リン酸緩衝液ｐＨ７、ｏ
を１００ｄ加えてゆっくりと撹拌した。ポリマーによる
リバーげの吸着は溶液からのリパーゼ活性の損失によっ
て評価した。２８時間後に担持体はリパーゼ活性の９３
％を吸着し、１６，０ＯＯＬＵ／　ｇ（リバーぜ　ユニ
ット／ｑ）の理論上の吸着量を与えた。この触媒を濾過
によって取り出し、０．１Ｍリン酸緩衝液１）Ｈ７，Ｏ
で２回洗浄して、室温で真空乾燥した。

道）エステル交換反応 ２、Ｏｑの触媒をプレカラム（ｐｒｅ−ｃｏｌｕｍｎ）
どして用いる３、２ｇの水を含む４ｇの湿潤ＩＩ）シリ
カゲル（英国クロスフィールズ社（Ｃｒｏｓｔ’１ｅｌ
ｄｓ）から入手可能）と共に、直径１５１１１１１１の
カラムに充填した。オレイン酸エステル含量の高いひま
わり油１重量部、ラウリンＭＯ１７重量部、石油Ｉ　−
チル（沸点１００−　１２０℃）４重量部を含み、水で
飽和した供給原料を流速２５．０ｄ　／時でカラムに通
した。この時カラムは水ジャケットを用いて５０℃に維
持し・ていた。トリグリセリド中に組込まれたラウリン
酸の姐はＦＡＭＥ／　ＧＣ分析（脂肪Ｇ 酸メチルエステル／ガスクロマトグラフィー分析）で決
定した。

対照実験を同様の条件下、（親水性の）イオン交換樹脂
上のムコール・ミニヘイのリパーゼを基体とする触媒、
登録商標［リボザイム（ＬｉｐｏｚｙｍｅＮ　　（ノボ
社）を用いで行った。結果を供した原料油のトリグリセ
リド分析、及び生成物について表わした表１で比較した
。

表　　１ Ｃ１０：ＯＯ０ Ｃ１２：Ｏｏ、。

Ｃ１４：Ｏｏ、。

Ｃ１６：Ｏ３，７ Ｃ１８：Ｏ４，７ Ｃ１８：１　　　　　　８４．９ Ｃ１８：２　　　　　　　６．３ Ｃ２０：０　　　　　　　０．４ ０．０　　　　０．３ ２６．２　　　１７．２ ０．０　　　　０．６ １．６　　　　２．６ ２．２　　　　３，６ ６５．５　　　　６９．３ ４．５　　　　６．０ ０．０　　　　０．４ 実施例２ 担持体物質としてそれぞれ、ＥＰ−１００、Ｅｌ）−４
００，及びＥＰ−９００粉末を用い、別のリパーゼを用
いて、実施例１の操作を３回繰返した。用いたリパーゼ
はリゾプス・ニベウス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ　ｎ１ｖｅｕ
ｓ）由来のもの（アマノＮ１日本、アマノ■、より入手
可能）であった。

操作は実施例１で述べたように行なったが、理論上のリ
パーゼ吸＠量が１０，０ＯＯＬＵ／　ｇのものが得られ
た。

結果を表２に示す。

表　　２ Ｃ１０：Ｏｏ、。

Ｃ１２：Ｏｏ、。

Ｃ１４：Ｏｏ、。

Ｃ１６：Ｏ３，７ Ｃ１８：Ｏ４，７ Ｃ１８：１　　　　８４．９ Ｃ１８：２　　　　　６．３ Ｃ２０：ＯＯ，４ ｏ、ｏ　　　　　ｏ。

２８．５　　　２９．０ ０．９　　　　０．５ １．６　　　　１．６ ２．２　　　　２．０ ６２．３　　　６１．６ ４．５　　　　４．４ ｏ、ｏ　　　　　ｏ、。

１．６ ２．１ ６２．２ ０．０ 表１から明らかなように、ラウリン酸による置換は、親
水性物質の効果に比べて、疎水性触媒担体を用いた場合
の方がかなり大きい。又表２から、別の担体と別の酵素
を用いた場合にも良好な効果が得られることがわかる。

実施例３ １）担体の調製と酵素の固定化 ５ｇのシリカ球状粒子３．９８０Ｇを、１０ｇのジメチ
ルジクロロシランを含む１００ｄの１．１．１−ｔ−リ
クロロエタン中で３０分間振盪することによって疎水性
にする。球状粒子を濾過して、１００＃ｌｌ！のトリク
ロロエタンで２回洗浄した後、室温で脱気して乾燥させ
た。シラン化した球状粒子は５゜−のエタノール中で穏
やかに振盪して完全に湿潤させた。そして　１００Ｉｄ
の０．１Ｈリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７を加え、穏や
かに振盪して完全に混合させた。過剰の緩衝液をデカン
テーションで除き、５０−のリパーゼ水溶液（ムコール
・ミニヘイ由来、１，０００１１１　／ｌｉｄ！の活性
を有する）を加えて、球状粒子と１６時間振盪した。球
状粒子を濾過し、緩衝液で２回洗浄して前回と同様に乾
燥させた。

ｉ）エステル交換反応 得られた触媒を実施例１で述べた転位法に使用した。供
給原料としてひまわり油１部当りラウリン酸０．５３部
及びミリスヂン酸０．２７部を含むものを用いた。トリ
グリセリド分析の結果を表３に示す。

ＣＩＯ：０　　　　　　　　０．Ｏｏ、１Ｃ１２：Ｏｏ
、ｏ　　　　　　１４．６Ｃ１４：Ｏｏ、ｏ　　　　　
　　６．６Ｃ１６コ０　　　　　　　　　　　　３．７
　　　　　　　　　２３Ｃ１８：０　　　　　　　　４
．７　　　　　　３．１Ｃ１８：１　　　　　　　８４
．９　　　　　６８．４Ｃ１８：２　　　　　　　　６
．３　　　　　　４９Ｃ２０：ＯＯ，４０，０ 表３の結果は担持酵素の影響でひまわり油中の不飽和脂
肪酸がラウリン酸及びミリスチン酸によって非常によく
置換されたことを示している。

実施例４ １）多孔性担体の調製 油相がスヂレン、ジビニルベンピン、及び界面活性剤ス
パン８０　（５ｐａｎ　８０）をそれぞれ４．４２醇、
０．４４に９．０．８８Ｋｇ、含み、水相が水、過硫酸
ナトリウム、及び塩化カルシウムをそれぞれ４４．２５
　Ｋ９．０．０９７／（ｇ、９．０Ｋｙ含む、高分散相
である油中水型■マルジ」ンを形成させた。スパン８０
はソルビタンモノオレイン酸エステルである。■マルジ
ョンは３０分間８５　ｒｐＩＩｌで後形成剪断を施した
。続いて６０℃で４０時間かけて重合を行った。得られ
たポリマーは粉砕し、所望の粒子大にふるい分け、イソ
プロパツールでソックスレー抽出してスパン８０を除い
た。続いて脱イオン水で洗浄し、最終的に乾燥させた。

顕微鏡検査によると、このポリスチレン物質は９０％の
多孔度を有し、隔室（気孔）の大きさは３０μｍ以上、
連続穴の大きさは１０μｍｒＬ以上であり、粒度は０．
１乃至２．０Ｍであった。

ｎ）固定化 ２．０ｇのポリマーを１３５ｄの無水エタノール中に入
れ、ポリマーを完全に湿潤させた。過剰のエタノール１
２０Ｉｄをデカンテーションで除ぎ、２００ｄの０．１
Ｈリン酸ナトリウム緩衝液を加えて２時間穏やかに撹拌
し、完全に混合させた。

過剰の液体１９５ｄをデカンデージョンで除き、続いて
２００Ｉｄ！の緩ｉｌｌを加えて１０分間撹拌した。

過剰の液体２００−を再びデカンテーションで除いた。

１．４ｇのリゾプス・ニベウス由来リパーゼ（アマノ）
を含む０．　ＩＮリン酸ナトリウムｐＨ７のリパーゼ溶
液１００ｍｍ！を加えて穏ヤかに撹拌した。リパーゼの
吸着は溶液からの酵素活性の損失を測定してモニターし
た。２４時間後にポリマーは９２．１％のリパーゼ活性
を吸着し、理論上の吸着量は９，２７０ＬＵ／　ｇパリ
マーであった。ポリマーを濾過によって取り出し、２０
０＃Ｉｉ！のリン酸緩衝液で２回洗浄し、室温で真空乾
燥した。

１１ｉ）土ステル交換反応 上述の触媒のエステル交換反応活性を以１・のようにし
て評価した。１００１１１ｇの試料を反応用バイアルに
入れ、０．５９のオリーブ油、０．１２１のミリスチン
酸、及び１０．０ｄの石油エーテル（沸点１００．、−
、２００°Ｃ）から成る溶液を加えた。

バイアルを密封し、振揺器付の４０℃の水浴に入れた１
、１時間後に試料を取り出し、１−リグリヤリド中に組
込まれたミリスチン酸量をｒＡＨ４／　ＧＣ分析で決定
した。

得られた結果を、リポザイム触ｖ！１．＜ノボ社、イオ
ン交換樹脂上のム」−ル・ミニヘイ由来リパーゼ）の結
果と併せて表４に承り。ノボＬｕアッセイ（Ｎｏｖｏ　
Ｌｕ　Ａｓ５ａｙ）は酵素活性を決定する簡便な標準検
定法である。

表　　４ ポリスチレン　　　７．９　　　　　　２２３８リボザ
イム　　　　１０．６　　　　　　５５７実施例５ ）固定化 ２．０ｇの疎水性のマク１］孔質ポリスチレン粒子５６
９３−９３を３０−のエタノールに撹拌しながら加え、
すべてのポリマー粒子を湿潤さけた。これに２００ｄの
０．１８リン酸す１〜リウム緩衝液ｐｌ＋７を撹拌しな
がら加え、完全に混合した。過剰の溶液をデカンテーシ
ョンで除き、続いて４１．５ｄのムコール・ミニヘイの
リパーゼ溶液（リボザイム、ノボ社）を含む２００ｄの
緩衝液を加えＩＣ６溶液を穏やかに撹拌した。多孔性ポ
リマーによるリパーゼの吸着は溶液からの活性の損失に
よってモニターした。１６７時間後に担体は６７％のリ
パーゼ活性を吸着し、理論上の吸着量は１７３、１００
１．Ｕ／　９であった。触媒を濾過で取り出し、２００
ｍの０．１８リン酸緩衝液で２回洗浄し、室温で真空乾
燥した。

■）ニスデル交換反応 ０．２５５７の触媒及びリバーＵを担持していない同一
の担体０．７５　’ｊの混合物を、３．２ｇの水を含み
、プレカラム（Ｄｒｅ−ＣＯＩＵｍｎ）として用いる４
グの湿潤ＩＤシリカゲル（クロスフィールド社）と共に
、直径１５ｍｍのカラムに充填した。オレイン酸エステ
ル含量の高いひまわり油１重量部、ラウリン酸０．７重
量部、及び石油エーテル（沸点１００−２００℃）４串
間部を含み、水で飽和した供給原料を水ジャケットを用
いて５０℃に維持されたカラムに通した。トリグリセリ
ド中に組込まれたラウリン酸の量はＦＩＶ［：／ＧＣ分
析で決定した。初期活性を流速と転化率から計算したと
ころ、８．５ｇトリグリゼリド／時／９触媒であった１
、（本割算法は本明細書の最後で説明する。） 実施例６ １）固体化 ２、Ｏｇの疎水性のマクロ孔質ボリスヂレン粒子７８−
７３００を３５ｍのエタノールに撹拌しながら加え、す
べてのポリマー粒子を湿潤させた。これに２００ｄの０
．１８リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７を撹拌しながら加
え、完全に混合させた。過剰の溶液をデカンテーション
で除き、続いて２０ｄのムコール・ミニヘイのリバーげ
溶液（リポザイム、ノボ社）を含む２００ｄの緩衝液を
加えた。溶液は穏やかに撹拌した。多孔性ポリマーによ
るリパーゼの吸着は溶液からの活性の損失によってモニ
ターした。４７時間後に担体は８５％のリパーゼ活性を
吸着し、理論上の吸着量は９２６００１０／　ｇであっ
た。触媒を濾過して取り出し、２００ｍｆ！の０，１Ｈ
リン酸緩衝液で２回洗浄して、室温で真空乾燥した。

ｎ）エステル交換反応 ０．２！］　（ｊの触媒及びリバー１を担持していない
同一の担体０．６９９の混合物を、３．２ｇの水を含み
、プレカラムとして用いる４Ｓｊの湿潤ＩＤシリカゲル
（り［ｌスフゴール１社）と共に、直径１５＃ｌ＃Ｉの
カラムに充填した。オレイン酸ニスアル含量の高いひま
わり油１重量部、ラウリン酸０．７重量部、及び石油エ
ーテル（沸点１０〇−１２０℃）４重量部を含み、水で
飽和した供給原料を、水ジャケットで５０℃に維持され
たカラムに通した。トリグリセリド中に組込まれたラウ
リン酸の量は、ＧＡＭＥ／　ＧＣ分析で決定した。流速
及び転化率から初期活性を標準化したところ、７．５ｃ
ｉ’ｒ−リグリセリド／時／ｇ触媒であった。

実施例７ １）固定化 ２．０ｇの疎水性のマクロ孔質ポリプロピレン粒子ＥＰ
−１００を２０−のエタノールに撹拌しながら加え、す
べてのポリマー粒子を湿潤させた。これに２００−の０
．１Ｎリン酸す］・リウム緩衝液ｐＨ７を撹拌しながら
加え、完全に混合させた。過剰の溶液をデカンテーシヨ
ンで除き、ムコール・ミニヘイのリパーゼ溶液（リボザ
イム、ノボ社）を含む５００ｄの緩衝液を加えて、溶液
を穏やかに撹拌した。この操作を三つの異なる量のリパ
ーゼ溶液に対して行なった。加えた酸素量と理論上の吸
着量を表５に示す。触媒は濾過して取り出し、２００ｍ
１！の０．１Ｈリン酸緩衝液で２回洗浄し、室温で真空
乾燥した。

Ｉｔ）エステル交換反応 触媒及びリパーゼを担持していない同一の担体の混合物
（担持酸素の活性によって、その混合比を変えた、族５
参照）を、３．２ｇの水を含み、プレカラムとして用い
る４ｇの湿潤１０シリカゲル（クロスフィールズ社）と
共に、直径１５闇のカラムに充填した。オレイン酸含量
の高いひまわり油１重量部、ラウリン９０．７重量部、
及び石油エーテル（沸点１００−１２０℃）４重量部を
含み、水で飽和した供給原料を、水ジャケットで５０℃
に維持した功ラムに通した。トリグリセリド中に組込ま
れたラウリン酸の量は、ＦＡＭＥ／　ＧＣ分析で決定し
た。流速及び転化率から初期活性を標準化した。その結
果を表５（活性Ａの欄）に示す。

ｍ〉エステル化反応 ５ＯｒｔｒＨの触媒をバイアルに入れ、５．８８ｇのオ
レイン酸（９２％英国Ｂ１社製）、及び２．７０ｏのオ
クタン−１−オール（ＧＰＲ級、Ｂ叶社）を含み、水で
飽和した混合物を加えた。バイアルを密封し、５０℃の
水浴に入れ、毎分２００ストロークで絶えず振盪させな
がら１時間放置した。０．２０　ａｅの試料を取り出し
て直ちに、内部標準物質として５■のステアリン酸メチ
ルを含む０．２０　ｄの石油エーテル（沸点６０−８０
℃）溶液と共に、ジエチルエーテルで小さなアルミナカ
ラム（塩基性、活性度２）中を溶出した。ジエチルエー
テルを蒸発によって除き、６＃ｌＩ！の石油エーテル（
沸点６０−８０℃）に置き変えた。オレイン酸オクチル
とステアリン酸メチルの比を気液クロマトグラフィー（
ＧＬＣ）で決定した。この比からエステル形成速度を計
算し、その結果を表５　（活性Ｂの欄）に示した。

表　　５ ６．６　　　　９８．５　　　　３５，７００　　２．
３　　　６６４８．０　　　　９２．２　　　２４４，
８００　３４．０　　３３０３０８．０　　　　８０．
０　　１，１８８，０００　６３．６　　　！＋４６八
−エステル交換反応活性、 ９トリグリセリド／時／ｇ触媒、 Ｂ−エステル交換反応活性、 μｉｏｌエステル／時／Ｉ１ｇ触媒 実施例８ １）固体化 ２．０ｇの疎水性のマクロ孔質ポリマー粒子アンバーラ
イトＸＥ−３０５を２０蔵のエタノールに撹拌しながら
加え、すべてのポリマー粒子を湿潤させた。これに２０
０ＩＩ１１！の０．１Ｎリン酸ナトリウム緩衝液Ｅ）１
１７を撹拌しながら加え、完全に混合させた。過剰の溶
液をデカンテーシヨンで除き、続いて５．５ａｄ！のム
コール・ミニヘイのリパーゼ溶液（リボザイム、ノボ社
）を含む１００ｄの緩衝液を加え、穏やかに撹拌した。

多孔性ポリマーによるリパーゼの吸着は溶液からの活性
の損失でモニターした。２時間後に担体はリパーゼ活性
の７５．７％を吸着し、理論上の吸着量は２１．６００
１１／　ｇであった。触媒を濾過して取り出し、２００
ｄの０．１Ｈリン酸緩衝液で２回洗浄して、室温で真空
乾燥した。

■）ニスアル交換反応 １、Ｏｑの触媒及びリパーゼを担持していない同一の担
体１．Ｏｇの混合物を、３．２ｇの水を含み、プレカラ
ムとして用いる４ｇの湿潤ＩＯシリカゲル（り１」スフ
ィールズ社）と共に、直径１５姻のカラムに充填した。

オレイン酸エステル含量の高いひまわり油１重吋部、ラ
ウリン酸０．７重量部、及び石油エーテル（沸点１００
−１２０℃）４重量部を含み、水で飽和した供給原料を
、水ジ１ノクットで５０°Ｃに耗持したカラムに通した
。

トリグリセリド中に組込まれたラウリン酸の量は、ＦＡ
Ｈ［／　ＧＣ分析で決定した。流速及び転化率から標準
化した初期活性は２．０ｇｔ−リグリセリド／時／Ｊ触
媒であった。

実施例９ １）固定化 ２、Ｏｇの疎水性のマクロ孔質ポリマー粒子［Ｐ−１０
０を２０ｄのエタノールに撹拌しながら加え、づべての
ポリマー粒子を湿潤させた。これに２００７の０，１Ｈ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７を撹拌しながら加え、完
全に混合ざした。過剰の溶液をデカンテーションで除き
、３７ｊ７のリゾプス・ニベウスのリパーゼ溶液（リパ
ーゼＮ１アマノ■）を含む２００ｄの緩衝液を加えた。

溶液を穏やかに撹拌した。多孔性ポリマーによるリパー
ゼの吸着は溶液からの活性の損失でモニターした。２２
時間後に担体はリパーゼ活性の９０％を吸着し、理論上
の吸着量は３８．４００ＬＵ／　ｇであった。触媒を濾
過して取り出し、２００ｄの０．ＩＨリン酸緩衝液で２
回洗浄しで、室温で真空乾燥した。

れ）エステル交換反応 ０．２５　ｆｌの触媒及びリパーゼを担持してぃない同
一の担体０．３６　（ｊの混合物を、３．２ｇの水を含
み、プレカラムとして用いる４ｇの湿潤１０シリカゲル
（クロスフィールズ社）と共に、直径１５履のカラムに
充填した。オレイン酸エステル含量の高いひまわり油１
重量部、ラウリン酸０．７重量部、及び石油エーテル（
沸点１００１２０℃）４重量部を含み、水で飽和した供
給原料を、水ジャケットで５０℃に維持したカラムに通
した。トリグリセリド中に組込まれたラウリン酸の量は
、「八ＨＥ／　ＧＣ分析で決定した。流速及び転化率か
ら標準化した初期活性は３５．０ｇトリグリセリド／時
／ｇ触媒であった。

実施例１０ １）固定化 ２、Ｏｑの疎水性のマクロ孔質ポリマー粒子［Ｐ−１０
０を２０ｍのエタノールに撹拌しながら加え、すべての
ポリマー粒子を湿潤させた。これに２００ｄの０．１Ｍ
リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７を撹拌しながら加えて完
全に混合させた。過剰の溶液をデカンテーションで除き
、２ｄのフミコ一う属の一種（ｔｌｕｍｉｃｏｌａ　ｓ
ｐ、　）のリパーゼ溶液（ＳＰ　３９８／ＰＰＷ　２５
４２、ノボ社）を含む２００−の緩衝液を加えた。溶液
を穏やかに撹拌した。多孔性ポリマーによるリバーげの
吸着は溶液からの活性の損失でモニターした。２時間後
に担体はリパーゼ活性の９７％を吸着し、理論上の吸着
量は６１．７００Ｌｔｌ／　ｇであった。触媒を濾過し
て取り出し、２００＃ｌｉ！の０．１Ｈリン酸緩衝液で
２回洗浄して、室温で真空乾燥した。

ｎ）エステル交換反応 ０．５ｇの触媒及びリパーゼを担持していない同一の担
体０．４６５　ｆｊの混合物を直径１５顯のカラムに充
填してプレカラムとした。オレイン酸エステル含量の高
いひまわり油１重量部、ラウリン酸０．１重量部、及び
石油エーテル（沸点１ｏ。

１２０℃）４重量部を含み、水で飽和した供給原料を、
水ジャケットで５０℃に維持したカラムに通し１ｃ０ト
リグリゼリド中に組込まれたラウリン酸の量をＦＡＭＥ
／　ＧＣ分析ぐ決定した。流速及び転化率から標準化し
た初期活性は５．８ｊＪｌ−リグリセリド／時／ｇ触媒
であった。

ｍ）ニスデル化反応 同−の触媒５０Ｒｇをバイアルに入れ、５．８８ｇのオ
レイン酸（９２％、８叶社）、及び２．７００のオクタ
ン−１−オール（ＧＰＲ級、８０１１社）を含み、水で
飽和した混合物を加えた。バイアルを密封し、５０℃の
水浴に入れ、毎分２００ストロークで絶えず振盪させな
がら１時間放置した。０．２０　ｄの試料を取り出して
直ちに、内部標準物質として５■のステアリン酸メチル
を含む０．２０　ｍの石油エーテル（沸点６０−８０℃
）溶液と共に、ジエチルエーテルで小さなアルミナカラ
ム（塩基性、活性疫２）中を溶出させた。ジエチルエー
テルを蒸発によって除き、６ｄの石油エーテル（沸点６
０−８０℃）に置き変えに０オレイン酸オクチルとステ
アリン酸メチルの比を気液クロマトグラフィーで決定し
た。この比からエステル形成速度を計算したところ、２
０μｍ０１／時／■であった。

実施例１１ １）シラン化 ３．０９の細孔−制御ガラスビーズＰＧ−１２００１２
０を１０５℃のオーブン中で１５分間乾燥させた。。

冷えたところへ、６．７ｍｌ！のジメヂルジク［１［１
シランを含む２７ｄの１．１．１−トリクロロエタンを
加えて、ビーズを撹拌した。１時間１５分後にビーズを
濾過し、１，１．１−ｔ−リクロロエタンで洗浄し、室
温で真空乾燥した。

ｂ）固定化 ３、Ｏｑのシラン化したビーズを１００ｄのエタノール
中に１６時間放置し、担体を湿潤させた。

５０ｄのエタノールを除き、５０ｄの０，１Ｈリン酸ナ
トリウム緩衝液ｐＨ７で置き換えた。数分間撹拌した後
、５０ｄの緩衝液／エタノール溶液を取り除き、５０ｄ
のリン酸緩衝液をさらに加えた。

数分間撹拌を続けた後、担体の気孔中の過剰な気体を、
液体表面を真空にさらすことによって除いた。そして５
０ｍの緩衝液／１タノール溶液を取り除き、３．５Ｉｄ
のムコート・ミニヘイのリパーゼ溶液（リポザイム、ノ
ボ社）を含む２５０艷の緩衝液を加えた。溶液を穏やか
に撹拌した。

多孔性ガラスピーズによるリパーゼの吸着は溶液からの
活性の損失でモニターした。２５時間４５分後にビーズ
はリパーゼ活性の９１．７％を吸着し、酵素の理論上の
吸着量は１１．７７４Ｌｌｌ／　ｇであった。

触媒を濾過によって単離し、４００威の０．１Ｈリン酸
ナトリウム緩衝液で洗浄し、室温で真空乾燥した。

１ｉ１）エステル交換反応 ３．０ｇ触媒を、３．２ｇの水を含み、プレカラムとし
て用いる４ＳＪの湿潤ＩＯシリカゲル（クロスフィール
ド社）と共に直径１５ｍのカラムに充填した。オレイン
酸エステル含量の高いひまわり油１重量部、ラウリン酸
０．７重量部、及び石油エーテル（沸点１００−１２０
℃）４重量部を含み、水で飽和した供給原料を、水ジャ
ケットで５０℃に維持されたカラムに通した。トリグリ
セリド中に組込まれたラウリン酸の量は、ＦＡＭＥ／Ｇ
Ｃ分析で決定した。流速及び転化率から初期活性を標準
化したところ、 １．３ｇトリグリセリド／時／ｇ触媒であった。

触媒重量（ｇ） 流速−グトリグリセリド／時（カラム中）平衡含量％−
初期含量％ 本実施例においては、初期ラウリン酸含帛−０平衡含量
−３１，３％ 特許出願代理人 弁理士　　山　　崎　　行　　造

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. （１）脂肪酸エステルを製造する方法であつて、触媒と
   して作用するリパーゼ酵素の存在下、かつ実質的非水均
   一液相中で前記脂肪酸エステルを生成するように、脂肪
   酸とアルコール残基を与える反応物を反応させる工程を
   含む方法において、該リパーゼが平均の細孔の大きさ５
   ０ｎｍ以上の疎水性多孔質固体担持体物質に吸着によっ
   て物理的に付着していることを特徴とする方法。
2. （２）前記反応物がグリセリドエステルを含む請求項１
   記載の方法。
3. （３）前記グリセリドエステルが１種以上の油脂を含む
   請求項２記載の方法。
4. （４）反応物が１種以上の遊離の脂肪酸又は１種以上の
   遊離脂肪酸のアルキルエステルを含有する請求項２又は
   請求項３記載の方法。
5. （５）担持体物質が、１乃至１５０μｍの範囲内の平均
   直径の、過半数が穴によって相互に連絡している気孔を
   含み、かつ５０％以上の全細孔容積を有する多孔性ポリ
   マー物質を含む請求項１乃至請求項３のいずれか１項記
   載の方法。
6. （６）多孔性高分子物質が９０％以上の全細孔容積を有
   する請求項５記載の方法。
7. （７）担持体物質が天然又は合成の多孔性ポリオレフィ
   ンを含む請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方
   法。
8. （８）担持体物質がビニル又はビニリデンポリマーを含
   む請求項１乃至請求項７のいずれか１項記載の方法。
9. （９）担持体物質がポリアミド又はポリエステルを含む
   請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法。
10. （１０）担持体物質の平均の細孔の大きさが０．０５乃
    至５μである請求項１乃至請求項９のいずれか１項記載
    の方法。
11. （１１）担持体物質が耐熱性物質を含む請求項１乃至請
    求項４のいずれか１項記載の方法。
12. （１２）担持体物質がシリカを含む請求項１１記載の方
    法。
13. （１３）担持体物質の表面が疎水性の有機シリカ重合体
    被膜を有する請求項１１又は請求項１２記載の方法。
14. （１４）担持体物質がガラスを含む請求項１乃至請求項
    ４のいずれか１項記載の方法。