JPH0213381A - 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 - Google Patents
複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法Info
- Publication number
- JPH0213381A JPH0213381A JP16470688A JP16470688A JPH0213381A JP H0213381 A JPH0213381 A JP H0213381A JP 16470688 A JP16470688 A JP 16470688A JP 16470688 A JP16470688 A JP 16470688A JP H0213381 A JPH0213381 A JP H0213381A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- vector
- proteins
- structural gene
- codon
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 62
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 37
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims abstract description 18
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 claims description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 abstract description 9
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 abstract 3
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 10
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 5
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 5
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 5
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000006747 Transforming Growth Factor alpha Human genes 0.000 description 2
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 2
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 238000007500 overflow downdraw method Methods 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 101001091385 Homo sapiens Kallikrein-6 Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 102100034866 Kallikrein-6 Human genes 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規ベクターおよびこれを含む形質転検体なら
びにこれらを用いる複数の所望タンパク質の製造法に関
するものである。
びにこれらを用いる複数の所望タンパク質の製造法に関
するものである。
友■及亙
ここ数年、遺伝子工学的手法により微生物にペプチドな
いしタンパク質（以下タンパク質等という）を生産させ
る技術が一般化されつつある。
いしタンパク質（以下タンパク質等という）を生産させ
る技術が一般化されつつある。
そして現在、この技術を駆使してタンパク質等を生産す
るにあたり、その生産効率を向上させるべく種々の改良
がなされているところである。
るにあたり、その生産効率を向上させるべく種々の改良
がなされているところである。
遺伝子工学的手法によるタンパク質等の生産とは、所望
タンパク質等に対応するＤＮＡ遺伝子をベクターに組込
み、組替えＤＮＡとし、ついでこれを宿主微生物に組込
んで宿主の形質転換を行なって、形質転換体を得る。次
いで、これを適当な条件で培養することによって所望タ
ンパク質を生産させ、次いで、この所望タンパク質等を
回収する工程よりなるのが普通である。
タンパク質等に対応するＤＮＡ遺伝子をベクターに組込
み、組替えＤＮＡとし、ついでこれを宿主微生物に組込
んで宿主の形質転換を行なって、形質転換体を得る。次
いで、これを適当な条件で培養することによって所望タ
ンパク質を生産させ、次いで、この所望タンパク質等を
回収する工程よりなるのが普通である。
そしてこのような工程において、生産効率の向上を図る
改良とは、例えば、宿主菌、ベクターの改良、タンパク
質等の回収・精製法の改良等である。
改良とは、例えば、宿主菌、ベクターの改良、タンパク
質等の回収・精製法の改良等である。
このうちベクターについて種々の改良の提案がなされて
いる。ここでいうベクターとは、目的とするタンパク質
等の遺伝子（以下「外来性遺伝子」ということもある）
を宿主菌に導入し、増殖、発現させるための機能を有す
る運搬体ＤＮＡのことである。 そして、ベクター中に
はこの機能を担うべくプロモータ、オペレータ、転写開
始領域、リポソーム結合領域（ＲＢＳ）等ｔ−具備する
のが普通である。
いる。ここでいうベクターとは、目的とするタンパク質
等の遺伝子（以下「外来性遺伝子」ということもある）
を宿主菌に導入し、増殖、発現させるための機能を有す
る運搬体ＤＮＡのことである。 そして、ベクター中に
はこの機能を担うべくプロモータ、オペレータ、転写開
始領域、リポソーム結合領域（ＲＢＳ）等ｔ−具備する
のが普通である。
ところ受、ベクターの改良としては、プロモータ活性が
強いもの（トリプトファンプロモータ、ＰＬプロモータ
等）と置換したり、従来よりタンパク質等の高発現に関
与しているＤＮＡ領域を有するもの（例えばリボプロテ
ィン由来のもの［ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、３．２４３
７−２４４２（１９８４）］）の転転写開始域またはＲ
ＢＳ等を利用しようとしたり、これらと由来の異なる他
のプロモータ、オペレータやＲＢＳと適宜組合せ、また
３°側非翻訳領域の改良あるいはランナウェー タイプ
（ＲＵＮ ＡＷＡＹ ＴＹＰＥ）のプラスミドの導入な
どにより、高発現のベクターを造成しようという試みが
なされているところである。
強いもの（トリプトファンプロモータ、ＰＬプロモータ
等）と置換したり、従来よりタンパク質等の高発現に関
与しているＤＮＡ領域を有するもの（例えばリボプロテ
ィン由来のもの［ＥＭＢＯＪｏｕｒｎａｌ、３．２４３
７−２４４２（１９８４）］）の転転写開始域またはＲ
ＢＳ等を利用しようとしたり、これらと由来の異なる他
のプロモータ、オペレータやＲＢＳと適宜組合せ、また
３°側非翻訳領域の改良あるいはランナウェー タイプ
（ＲＵＮ ＡＷＡＹ ＴＹＰＥ）のプラスミドの導入な
どにより、高発現のベクターを造成しようという試みが
なされているところである。
しかしながら、現時点では、各領域の組合せがうまくい
かなっかたり、リボプロティン由来のＤＮＡ領域のよう
に、明確なオペレータを持たず、そのため遺伝子発現を
任意に調節、制御することが困難であるため、このまま
では遺伝子組換え技術の観点から使用しにくい等の問題
を有していた。
かなっかたり、リボプロティン由来のＤＮＡ領域のよう
に、明確なオペレータを持たず、そのため遺伝子発現を
任意に調節、制御することが困難であるため、このまま
では遺伝子組換え技術の観点から使用しにくい等の問題
を有していた。
従って、種々の外来性遺伝子の高発現および回収を常に
達成できるようなベクターは、あまり得られてないのが
現状である。
達成できるようなベクターは、あまり得られてないのが
現状である。
本発明は、遺伝子工学的手法によりタンパク質等を生産
するに際し有用なベクターを開発すべく鋭意研究を行な
ったところ、１つのプロモータ制御下に、あるいは個別
のプロモータ制御下に複数の翻訳ユニットを有するもの
であって、一方が、所望タンパク質を菌体外および／ま
たはべりブラズム中に分泌させ得るものであり、他方が
、異なる他の所望タンパク質を菌体内で発現、回収させ
得るものを用いれば、互いに異なる所望タンパク質を同
時に発現させかつ別々に回収できることを見出し、この
新知見をもとになされたものである。
するに際し有用なベクターを開発すべく鋭意研究を行な
ったところ、１つのプロモータ制御下に、あるいは個別
のプロモータ制御下に複数の翻訳ユニットを有するもの
であって、一方が、所望タンパク質を菌体外および／ま
たはべりブラズム中に分泌させ得るものであり、他方が
、異なる他の所望タンパク質を菌体内で発現、回収させ
得るものを用いれば、互いに異なる所望タンパク質を同
時に発現させかつ別々に回収できることを見出し、この
新知見をもとになされたものである。
従って、本発明におけるベクターは、予定した宿主内で
増殖可能であり、かつ一つのプロモータ制御下に、ある
いは個別のプロモータ制御下に少なくとも下記の翻訳ユ
ニット（１）および（２）を有すること、を特徴とする
ものである。
増殖可能であり、かつ一つのプロモータ制御下に、ある
いは個別のプロモータ制御下に少なくとも下記の翻訳ユ
ニット（１）および（２）を有すること、を特徴とする
ものである。
（１）イ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、二）構造遺伝子、ホ）終止コドン また、本発明におけるタンパク質の製造は、下記の工程
イ）〜ハ）からなること、を特徴とするもの受ある。
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、二）構造遺伝子、ホ）終止コドン また、本発明におけるタンパク質の製造は、下記の工程
イ）〜ハ）からなること、を特徴とするもの受ある。
イ）予定した宿主内で増殖可能であり、かつ一つのプロ
モータ制御下に、あるいは個別のプロモータ制御下に少
なくとも下記の翻訳ユニット（１）および（２）を有す
るベクターを用意すること。
モータ制御下に、あるいは個別のプロモータ制御下に少
なくとも下記の翻訳ユニット（１）および（２）を有す
るベクターを用意すること。
（１）イ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）Ｉ！訳開始コドン、ハ）シグ
ナルペプチド、二）構造遺伝子、幻終止コドン ロ）このベクターを用いて宿主細胞の形質転換を行なっ
て、形質転換体を調製すること。
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）Ｉ！訳開始コドン、ハ）シグ
ナルペプチド、二）構造遺伝子、幻終止コドン ロ）このベクターを用いて宿主細胞の形質転換を行なっ
て、形質転換体を調製すること。
ハ）この形質転換体を培養して、生産された所望のタン
パク質を回収すること。
パク質を回収すること。
ガ求
本発明のベクターは、−度に複数個の所望タンパク質を
発現でき、かつこれらを菌体内および菌体外および／ま
たはペリプラズム中から別々に回収できることより効率
よい物質生産が可能である。
発現でき、かつこれらを菌体内および菌体外および／ま
たはペリプラズム中から別々に回収できることより効率
よい物質生産が可能である。
ベクター
本発明でいうベクターとは、予定した宿主内で増殖可能
であり、かつ一つのプロモータ制御下に、あるいは個別
のプロモータ制御下に少なくとも下記の翻訳ユニット（
１）および（２）を有するものである。
であり、かつ一つのプロモータ制御下に、あるいは個別
のプロモータ制御下に少なくとも下記の翻訳ユニット（
１）および（２）を有するものである。
（１）イ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）Ｂ訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、二）構造遺伝子、幻終止コドン そして必要に応じて、遺伝子の転写効率の増大に関与す
る領域、構造遺伝子の翻訳開始効率を上昇させる領域ま
たは塩基配列、ｍＲＮＡの安定化に寄与する８゛側非翻
訳領域、プラスミドのコピー数に関与する領域などを具
備し、あるいは欠失してもよい。このようなベクターは
、通常の遺伝子工学手法に基づき調製可能であって、例
えば公知のベクターを基にして、これに必要な領域を化
学的に合成するか、他のベクターより得るかして該領域
を適宜当該ベクター組込むことにより容易におこなうこ
とができる。
伝子、二）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、口）Ｂ訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、二）構造遺伝子、幻終止コドン そして必要に応じて、遺伝子の転写効率の増大に関与す
る領域、構造遺伝子の翻訳開始効率を上昇させる領域ま
たは塩基配列、ｍＲＮＡの安定化に寄与する８゛側非翻
訳領域、プラスミドのコピー数に関与する領域などを具
備し、あるいは欠失してもよい。このようなベクターは
、通常の遺伝子工学手法に基づき調製可能であって、例
えば公知のベクターを基にして、これに必要な領域を化
学的に合成するか、他のベクターより得るかして該領域
を適宜当該ベクター組込むことにより容易におこなうこ
とができる。
例えば、Ｔｒｐ・プロモータ遺伝子は、大腸菌の染色体
上に存在しており、したがって大腸菌の染色体ＤＮＡよ
り、上記プロモータを常法に従ってクローニングするこ
とにより容易に得ることができる。ここでプロモータ領
域とは、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報を転写する酵素
ＲＮＡポリメラーゼが最初に結合する領域をいう。菌体
外および／またはべりブラズムへ分泌機能を有する領域
はイ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）シグナルペ
プチド、二）構造遺伝子、ホ）終止コドンからなる翻訳
ユニットを有するものである。特にシグナルペプチドは
、これをコードする遺伝子の下流側末端直後に所望タン
パク質の構造遺伝子を結合させ得るものを含むものであ
り、これらの詳細は、特開昭６１−３７０９９号公報参
照のこと。
上に存在しており、したがって大腸菌の染色体ＤＮＡよ
り、上記プロモータを常法に従ってクローニングするこ
とにより容易に得ることができる。ここでプロモータ領
域とは、ＤＮＡからＲＮＡへの遺伝情報を転写する酵素
ＲＮＡポリメラーゼが最初に結合する領域をいう。菌体
外および／またはべりブラズムへ分泌機能を有する領域
はイ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）シグナルペ
プチド、二）構造遺伝子、ホ）終止コドンからなる翻訳
ユニットを有するものである。特にシグナルペプチドは
、これをコードする遺伝子の下流側末端直後に所望タン
パク質の構造遺伝子を結合させ得るものを含むものであ
り、これらの詳細は、特開昭６１−３７０９９号公報参
照のこと。
一方、所望タンパク質を宿主細胞内で発現、回収可能な
領域はイ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、二）終止コドンからなる翻訳ユニットを有するも
のである。前記分泌機能を有する翻訳ユニットと異なる
ことはシグナルペプチドがないことである。すなわち、
翻訳開始コドン下流に切断可能なアミノ酸配列からなる
連結部を介して直接他の所望タンパク質の構造遺伝子を
結合させ、いわゆる融合法か、翻訳開始コドン下流に所
望の構造遺伝子を結合させる直結法であり、これらはい
ずれも公知の手法である。
領域はイ）ＳＤ配列、口）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、二）終止コドンからなる翻訳ユニットを有するも
のである。前記分泌機能を有する翻訳ユニットと異なる
ことはシグナルペプチドがないことである。すなわち、
翻訳開始コドン下流に切断可能なアミノ酸配列からなる
連結部を介して直接他の所望タンパク質の構造遺伝子を
結合させ、いわゆる融合法か、翻訳開始コドン下流に所
望の構造遺伝子を結合させる直結法であり、これらはい
ずれも公知の手法である。
えベクターの１
上記組換えベクターは、目的とする一種または二種以上
のタンパク質等の構造遺伝子を特定の位置に組み込んだ
後、所与の遺伝子工学的手法に従って、目的物質の生産
工程に使用することができる（詳細は後記実施例を参照
のこと）。具体的には、インシュリン、インターフェロ
ン（α、β）、インターロイキン（Ｉ〜ＩＶ ）、カル
ストニン、ＥＧＦ％ＧＨ，ＮＧＦ、ＴＧＦ（α、β）、
ＥＰＯおよびＩＧＦ（１、■）等、任意の物質を発現さ
せることができる。
のタンパク質等の構造遺伝子を特定の位置に組み込んだ
後、所与の遺伝子工学的手法に従って、目的物質の生産
工程に使用することができる（詳細は後記実施例を参照
のこと）。具体的には、インシュリン、インターフェロ
ン（α、β）、インターロイキン（Ｉ〜ＩＶ ）、カル
ストニン、ＥＧＦ％ＧＨ，ＮＧＦ、ＴＧＦ（α、β）、
ＥＰＯおよびＩＧＦ（１、■）等、任意の物質を発現さ
せることができる。
発現された所望タンパク質は、菌体内または菌体外およ
び／またはべりブラズム中から、公知の手法により別々
に回収することができる。
び／またはべりブラズム中から、公知の手法により別々
に回収することができる。
詳細な回収法に関しては、１）直接発現法の場合：特開
昭り８−１３４９９８号、特開昭６０−２８９９４号公
報、２）融合法：特願昭６２−３０４９３７号、特願昭
６３−４１６１５号明細書、３）分泌法：特開昭６１−
１５２２９７号、特開昭６１−１り２２７８号、特開昭
６１−１５２２７９号、特開昭６１−１８１３９６号、
特開昭６１−２５４１９６号、特開昭６１−２８０２９
２号、特開昭６２−１５８４９１号、特開昭６３−３７
９９号、特開昭６３−３８００号、特開昭６３−７４４
８５号および特願昭６２−４４５８５号、特願昭６１−
３０９８５８号明細書等を参照されたい。
昭り８−１３４９９８号、特開昭６０−２８９９４号公
報、２）融合法：特願昭６２−３０４９３７号、特願昭
６３−４１６１５号明細書、３）分泌法：特開昭６１−
１５２２９７号、特開昭６１−１り２２７８号、特開昭
６１−１５２２７９号、特開昭６１−１８１３９６号、
特開昭６１−２５４１９６号、特開昭６１−２８０２９
２号、特開昭６２−１５８４９１号、特開昭６３−３７
９９号、特開昭６３−３８００号、特開昭６３−７４４
８５号および特願昭６２−４４５８５号、特願昭６１−
３０９８５８号明細書等を参照されたい。
ヌ」１外
１）ｈＢＧＦおよびｈＴＧＦ／ＴＧＦαの調製１、ｐＴ
Ａ２６３２Ｒの作成 ｐＴＡ２６２２Ｒ（特願昭６２−４４５８５号明細書参
照）１０Ｒｇを６ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，
９）１５０ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭＭｇＣ１□溶液
５０Ｒｇ中３ｕｎｉｔの５ａｌｌで８７℃、２時間反応
し直鎖状とした。
Ａ２６３２Ｒの作成 ｐＴＡ２６２２Ｒ（特願昭６２−４４５８５号明細書参
照）１０Ｒｇを６ｍＭ Ｔｒｌｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，
９）１５０ｍＭ ＮａＣ１、６ｍＭＭｇＣ１□溶液
５０Ｒｇ中３ｕｎｉｔの５ａｌｌで８７℃、２時間反応
し直鎖状とした。
フェノール処理、エタノール沈澱後、５０μンの上記溶
液に溶かし１ｕｎｌｔのＥｃｏＲＩで部分切断を行なっ
た。
液に溶かし１ｕｎｌｔのＥｃｏＲＩで部分切断を行なっ
た。
その後、アガロース電気泳動によって、Ｔｒｐプロモー
タ、Ｋｍ（カナマイシン）耐性遺伝子を含む（１）のフ
ラグメントを得た。
タ、Ｋｍ（カナマイシン）耐性遺伝子を含む（１）のフ
ラグメントを得た。
ｐＴＡ１６３２（特開昭６１−１４９０８７号公報参照
のこと）５μｇを５０μｅの上記溶液中、８ｕｎｉｔの
ＢｃｏＲＩ、５ａｌｌで切断しｂｌａシグナル−ｈＥＧ
Ｆ遺伝子を含む約２２０ｂｐの（ＩＩ ）のフラグメン
トをアガロースゲルから回収した。（１）および（ＩＩ
）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて
閉環し、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体
からプラスミドを調製し ｐＴＡ２６３２Ｒを得た（第
１図参照）。
のこと）５μｇを５０μｅの上記溶液中、８ｕｎｉｔの
ＢｃｏＲＩ、５ａｌｌで切断しｂｌａシグナル−ｈＥＧ
Ｆ遺伝子を含む約２２０ｂｐの（ＩＩ ）のフラグメン
トをアガロースゲルから回収した。（１）および（ＩＩ
）をＤＮＡライゲーションキット（宝酒造）を用いて
閉環し、大腸菌ＨＢＩＯＩを形質転換した。形質転換体
からプラスミドを調製し ｐＴＡ２６３２Ｒを得た（第
１図参照）。
２、ｐＴＡ２６ ０１７ ３２Ｒの作成ｐＦＭ−ＴＧＦ
１０Ｒｇを（３ｍＭＴｒ ｌ ５−ＨＣｌ （ｐＨ
８，０）、２０ｍＭＫＣｌおよび６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｃｌ ２ 溶液中、３７℃で２時間、８ｕｎ ｌ
ｔのＳ ｍ ａ ＩおよびＨｐａｌと反応を行なった。
１０Ｒｇを（３ｍＭＴｒ ｌ ５−ＨＣｌ （ｐＨ
８，０）、２０ｍＭＫＣｌおよび６ ｍ Ｍ Ｍ ｇ
Ｃｌ ２ 溶液中、３７℃で２時間、８ｕｎ ｌ
ｔのＳ ｍ ａ ＩおよびＨｐａｌと反応を行なった。
その後、アガロースゲル電気泳動によって、ｈ Ｅ Ｇ
Ｆ ／ Ｔ Ｇ Ｆ ａ遺伝子を含む（ＩＩ ）のフ
ラグメントを得た（第２図参照）。
Ｆ ／ Ｔ Ｇ Ｆ ａ遺伝子を含む（ＩＩ ）のフ
ラグメントを得た（第２図参照）。
ｐＴＡ２６３２Ｒ５μｇを上記組成溶液中８ｕｎｉｔの
Ｈｐａｌで切断後、フェノール抽出、エタノール沈澱後
、５０μεのＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）に
溶かし、１ｕｎｉｔのバクチリアル アルカリン ホス
ファターゼ［Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｆｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）］で６６０℃１時間
アガロースゲル電気泳動によって精製し、１のフラグメ
ントを得た（第２図参照）。
Ｈｐａｌで切断後、フェノール抽出、エタノール沈澱後
、５０μεのＩＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ８，０）に
溶かし、１ｕｎｉｔのバクチリアル アルカリン ホス
ファターゼ［Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ａｌｋａｌｆｎｅ
Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）］で６６０℃１時間
アガロースゲル電気泳動によって精製し、１のフラグメ
ントを得た（第２図参照）。
（１）および（ＩＩ ）をＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造）を用いて閉環し、大腸菌ＨＢＩＯＩを・形質
転換した。形質転換体からプラスミドを調製しｐＴＡ２
６−０１７−３２Ｒを得た（第２図参照）。このベクタ
ーはｔｒｐプロモータの支配下でｈＥＧＦ／ＴＧＦαの
後に、ストップ配列を持ち、更にその下流にＳＤ配列を
介してｂｌａシグナル−ｈＥＧＦ通伝子を持つ。
（宝酒造）を用いて閉環し、大腸菌ＨＢＩＯＩを・形質
転換した。形質転換体からプラスミドを調製しｐＴＡ２
６−０１７−３２Ｒを得た（第２図参照）。このベクタ
ーはｔｒｐプロモータの支配下でｈＥＧＦ／ＴＧＦαの
後に、ストップ配列を持ち、更にその下流にＳＤ配列を
介してｂｌａシグナル−ｈＥＧＦ通伝子を持つ。
３．３ｓ伝子の発現および回収
ｐＴＡ２６−０１７−３２Ｒを含む
Ｂ、ｃｏｌｉ ８８１０１株を５０ ｔｔ ｇ ／
ｍ ｅのカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｕｔｈ ５ｍ
ｅに接種し、３７℃で一晩培養した。このうちの５０μ
ンを、５０Ｒｇ ／ ｍ Ｊ！のカナマイシン、０．２
％のカザミノ酸を含むＭ−９培地５１！、に接種し、３
７℃で振どう培養をおこなった。
ｍ ｅのカナマイシンを含むＬ−ｂｒｏｕｔｈ ５ｍ
ｅに接種し、３７℃で一晩培養した。このうちの５０μ
ンを、５０Ｒｇ ／ ｍ Ｊ！のカナマイシン、０．２
％のカザミノ酸を含むＭ−９培地５１！、に接種し、３
７℃で振どう培養をおこなった。
２４時間後、菌体を遠心分離により回収し、５ＤＳ−ポ
リアクリルアミドゲル電機泳動によって第３図に示す通
りｈＥＧＦ／ｈＴＧＦαの融合タンパクの生産（第３図
中ａ）を確認した。
リアクリルアミドゲル電機泳動によって第３図に示す通
りｈＥＧＦ／ｈＴＧＦαの融合タンパクの生産（第３図
中ａ）を確認した。
なお、第３図中すはカナマイシン耐性遺伝子産物のバン
ドであるためｐＦＭ−ＴＧＦでは見られなかった。
ドであるためｐＦＭ−ＴＧＦでは見られなかった。
一方、培養上清に分泌されたｈＥＧＦをＩＥＩＡ（Ｅｎ
ｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ５ａｙ）によて定量
した。なお、対象として ｐＦＭ−ＴＧＦを同様の条件で培養した結果も下表に示
す（ｐ ＦＭ−ＴＧ Ｆ／ＨＢ １０１の培養時には、
カナマイシンの代りにアンピシリン５０μｇ／ｍｅを加
えて行なった）。
ｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏ Ａｓ５ａｙ）によて定量
した。なお、対象として ｐＦＭ−ＴＧＦを同様の条件で培養した結果も下表に示
す（ｐ ＦＭ−ＴＧ Ｆ／ＨＢ １０１の培養時には、
カナマイシンの代りにアンピシリン５０μｇ／ｍｅを加
えて行なった）。
培地中に分泌されたｈＥＣＦの定量
Ｎ、Ｄ：検出不可能
その結果、培養開始後、２４時間の菌体では、ｈＢＧＦ
／ｈＴＧＦαの融合タンパクのバンドが顕著に認められ
る。
／ｈＴＧＦαの融合タンパクのバンドが顕著に認められ
る。
一方、ｈＥＧＦは２４時間後に５３０μｇ／ンｃｕｌｔ
ｕｒｅの分泌量を示した。
ｕｒｅの分泌量を示した。
培養開始後２４時間の培養液上清からｈＥＧＦを回収、
精製した。また、同時に菌体がらｈＥＧＦ／ｈＴＧＦα
の融合タンパクを回収することができたくなお、ｈＥＧ
Ｆ／ｈＴＧＦαの融合タンパクからｈＴＧＦαを回収す
る方法は特願昭６１−１２８５４９明細書参照のこと）
。
精製した。また、同時に菌体がらｈＥＧＦ／ｈＴＧＦα
の融合タンパクを回収することができたくなお、ｈＥＧ
Ｆ／ｈＴＧＦαの融合タンパクからｈＴＧＦαを回収す
る方法は特願昭６１−１２８５４９明細書参照のこと）
。
第１図は、ｐＴＡ２６３２Ｆｔの作製法を示したもので
ある。 第２図は、ｈＧＨ／ｈＴＧＦの融合タンパクとｈＥＧＦ
！同時に発現しつるベクターｐＴＡ２６−０１７−３２
Ｒの作製法を示したものである。 第３図は、ｈＧＨ／ｈＴＧＦの融合タンパクの発現を５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電機泳動で確認した図で
ある。
ある。 第２図は、ｈＧＨ／ｈＴＧＦの融合タンパクとｈＥＧＦ
！同時に発現しつるベクターｐＴＡ２６−０１７−３２
Ｒの作製法を示したものである。 第３図は、ｈＧＨ／ｈＴＧＦの融合タンパクの発現を５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電機泳動で確認した図で
ある。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、予定した宿主内で増殖可能であり、かつ一つのプロ
モータ制御下に、あるいは個別のプロモータ制御下に少
なくとも下記の翻訳ユニット（１）および（２）を有す
るベクター。 （１）イ）ＳＤ配列、ロ）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、ニ）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、ロ）翻訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、ニ）構造遺伝子、 ホ）終止コドン ２、下記の工程イ）〜ハ）からなることを特徴とするタ
ンパク質の製造法。 イ）予定した宿主内で増殖可能であり、かつ一つのプロ
モータ制御下に、あるいは個別のプロモータ制御下に少
なくとも下記の翻訳ユニット（１）および（２）を有す
るベクターを用意すること。 （１）イ）ＳＤ配列、ロ）翻訳開始コドン、ハ）構造遺
伝子、ニ）終止コドン （２）イ）ＳＤ配列、ロ）翻訳開始コドン、ハ）シグナ
ルペプチド、ニ）構造遺伝子、 ホ）終止コドン ロ）このベクターを用いて宿主細胞の形質転換を行なつ
て、形質転換体を調製すること。ハ）この形質転換体を
培養して、生産された所望のタンパク質を回収すること
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16470688A JPH0213381A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP16470688A JPH0213381A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0213381A true JPH0213381A (ja) | 1990-01-17 |
Family
ID=15798332
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP16470688A Pending JPH0213381A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0213381A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991005863A1 (en) * | 1989-10-11 | 1991-05-02 | Pitman-Moore Australia Limited | Recombinant growth factors |
| WO2002090554A1 (fr) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Gencom Corporation | Vecteur de clonage |
| JP2005034025A (ja) * | 2003-07-18 | 2005-02-10 | Mitsubishi Pharma Corp | 大腸菌での異種遺伝子発現を促進させるプラスミドベクター、組換え大腸菌、該組換え大腸菌を用いた化学物質製造法及び組換えタンパク質の製造法 |
-
1988
- 1988-06-30 JP JP16470688A patent/JPH0213381A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1991005863A1 (en) * | 1989-10-11 | 1991-05-02 | Pitman-Moore Australia Limited | Recombinant growth factors |
| WO2002090554A1 (fr) * | 2001-05-09 | 2002-11-14 | Gencom Corporation | Vecteur de clonage |
| JP2005034025A (ja) * | 2003-07-18 | 2005-02-10 | Mitsubishi Pharma Corp | 大腸菌での異種遺伝子発現を促進させるプラスミドベクター、組換え大腸菌、該組換え大腸菌を用いた化学物質製造法及び組換えタンパク質の製造法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4711845A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette | |
| AU679427B2 (en) | DNA sequences encoding gelonin polypeptide | |
| JP3837154B2 (ja) | 遺伝子発現用プロモーター | |
| JP4510884B2 (ja) | 原核細胞で活性型の可溶性タンパク質を製造する方法及びそのためのポリシストロンベクター | |
| US7264946B2 (en) | Thermoanaerobacter brockii alcohol dehydrogenase promoter for expression of heterologous proteins | |
| CA1327329C (en) | Recombinant diphtheria toxin fragments | |
| US20080233614A1 (en) | Production of recombinant collagenases colg and colh in escherichia coli | |
| US4921699A (en) | Polypeptides having interferon activity | |
| JP3366339B2 (ja) | 高効率発現ベクターを用いてサッカロミセスセレビジエから再組合蛋白質を製造する方法 | |
| US4795706A (en) | Novel expression control sequences | |
| JP5673986B1 (ja) | タンパク質の沈殿による製造方法 | |
| CA2159079C (en) | Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells | |
| US7070989B2 (en) | Escherichia coli strain secreting human granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) | |
| AU647025B2 (en) | Fusion proteins having an in vivo post-translational modification site and methods of manufacture and purification | |
| JPH0213381A (ja) | 複数発現ベクターおよびこれを用いたタンパク質の製造法 | |
| US8003348B2 (en) | Method for the mass expression of an antimicrobial peptide by co-expression of a basic antimicrobial peptide and an acidic peptide using a translational coupling system | |
| HRP940770A2 (en) | Process for the production of stranger protein in streptomycetes | |
| KR102142255B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| KR102099342B1 (ko) | Crm197 단백질 발현 방법 | |
| CA1242981A (en) | Portable temperature-sensitive control cassette | |
| JP2524695B2 (ja) | 蛋白質の製造法 | |
| JPS61502655A (ja) | 酵母クロ−ニングビヒクル | |
| JPH04295499A (ja) | 抗ウイルス性タンパク質 | |
| KR20200082618A (ko) | 인슐린 과발현용 램프 태그 및 이를 이용한 인슐린의 제조방법 | |
| JPH01160488A (ja) | ポリペプチド類を生産するための新規ベクターおよび発現配列 |