JPH02131569A - マイクロチャンバープレート、これを利用した細胞検出方法、処理方法および装置ならびに細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は細胞融合装置に係わり、特に異種の細胞を１対
１に融合させるのに好適な細胞融合のためのマイクロチ
ャンバプレートおよび粒子判別方法ならびに粒子処理装
置および細胞処理装置に関する。

〔従来の技術〕

従来の装置は文献（昭和６２年度精密工学会春季大会学
術講演会論文集ｐ．８４５〜８４６）に記載のように格
子状に配列した隔室に異種細胞を１対ずつ供給して、吸
引ノズルで隔室の小さな開口部に吸引固定して、同一融
合条件下で一括して融合を行っていた。

〔発明が解決しようとする課題〕

上記従来技術では、多量の細胞の融合を一括して行うた
め、大きさや細胞膜の厚さや活性度のばらつき等の個体
差のある細胞を全て確実に融合させることが困難であり
、未融合細胞と融合細胞とを選別するための労力を必要
とする問題があった。

本発明の目的は、個体差の大きい細胞の状態をそれぞれ
独立に把握し、最適な条件で融合条件を与え、多量の細
胞を確実に融合することにあり、さらに独立に状態を把
握した細胞に遺伝子を導入することにあり、また，さら
に、血液を用いてその形状等の情報から、血液の状態を
把握するなどｆ・Ｒ々の細胞を個々に処理することを可
能とすることにある。

［課題を解決するための手段］ 上記目的を達成するために、それぞれの隔室に独立な電
極を設けて、各電極に独立に電圧等を印加したり、電極
間の抵抗等を測定可能な構造の、粒子や細胞を位置決め
保持するための多数の隔室を有するマイクロチャンバプ
レートを用いた。また，隔室内の粒子や細胞の挙動をそ
れらを挟んでいる電極間の電位として測定することによ
り、粒子や細胞を判別することを可能とした。また、粒
子や細胞を挟んだ電極間に電圧を印加することにより個
々に処理や融合を可能とする装置や細胞融合装置を得た
。

〔作用〕

マイクロチャンバプレート上の隔室に設けた一対の電極
は電圧を印加することにより，電極間に存在する一対の
細胞を互いに接触させたり、互いに接触した細胞膜を介
して融合したり、さらには、電極間の電位の変化から融
合した細胞の形状の変化を知り、融合のパルス電圧を強
めたり，弱めたり調整することができる．隔室を多数、
格子上に配列したマイクロチャンバ上で、隔室からのＮ
　＋Ｘを独立な構造にすることにより、それぞれの隔室
に存在する、細胞の個体差に依存する′雀気融合条件を
微妙に制御することが可能となるので、多数の細胞を効
率良く融合させることができる。さらに、それぞれの隔
室に存在する細胞の状態を独立に把握できるため、労力
を要する目視＠測等の手段なしに、所望の細胞の配：ｎ
場所を把握して抽出することが可能となるので、所望の
細胞のみを確実に，しかも効！ｒ良く生成することが可
能となる。

また、隔室に存在する細胞の挙動を把握しながら、レー
ザ光線やＸ線を用いて細胞に加工を施せるので遺伝子導
入等の細胞処理を容易にかつ確実に行える。さらに、液
体中で、細胞等を位置決めするマイクロチャンバの隔室
に、細胞を位Ｉｎ決め保持する際に障害となる気泡の付
着の有無を判定できるので、気泡の事前除去が可能とな
り、細胞等の微小な粒子を信頼性の高く取扱えるマイク
ロチャンバを提供することができる。

〔実施例〕

以下、本発明の一実施例を第１冫１〜第３２１により説
明する。第１図は本望明のマイクロチャンバプレート，
第２図はマイクロチャンハプレートを用いた細胞融合装
置、第３図はマイクロチャンバプレートの電極の配線パ
ターン９′ｊである。第１，［コづ〜第３図において、
共通部分の番号は同一とした。

粒子として、大きさが２　０　〜１　０　０　Ａｔｍの
，＋ｉｔｌ　＋Ｊを取扱う場合のマイクロチャンバプレ
ートの拡大した断面の鳥撤図を第１図に示す。マイクロ
チャンバプレート９０１は、厚さ４００μｍのＳｉウノ
エハに異方性エッチング処理によりピッチ７７０μｍの
格子状の配列で形成さた隔室１０１〜１０３，２０１〜
２０３を有している。隔室１０１〜１０３には一対の細
胞を電気的に融合するため、異種細胞が２個ずつ吸引保
持されている。

なお、隔室２０１〜２０３には細胞が入っていない状態
を示してある。全ての隔室には、隔室１０３の吸引孔６
０３と同一の構造の吸引孔が形成されている。吸引孔の
下側より図示していない吸引手段を用いて吸引すること
により、細胞を位置決め保持できる構造となっている。

これらの細胞は、図示していない容器（第２図９０６）
に満たされた等張液中で、図示していない搬送手段（第
２図９０２，９０３）によりそれぞれの隔室に所定の数
だけ移し替えられる。隔室１０３には一組みの電極８０
２，８０３が形成され、配線１０．１３を経て図示して
いない制御系（第２図９０５）につながっている。他の
隔室１０１，電極と配線１１．１２および２０〜２３が
制御系に接続している。

第２図は第１図に示したマイクロチャンバプレート９０
１を用いた細胞融合装置９０４の外観図である。浸透圧
を揃えて細胞の活性を保つための、等張液として０．５
ｍｏｌのソルビトール液を容器９０６の中に入れる。異
種細胞をＡ，Ｂとすると、細胞Ａを搬送する手段９０２
、細胞Ｂを搬送する手段９０３を有している。搬送手段
は、マイクロチャンバプレート９０１の隔室に細胞Ａと
Ｂをそれぞれ１個ずつ移し替えるため、それぞれ隔室に
対応した位置に細胞をそれぞれ１個だけ吸引する吸引座
を有した構造となっている。搬送手段９０２，９０３は
それぞれｘ，ｚ軸方向に移動でき、マイクロチャンバプ
レートの隔室に細胞を移し替えることにより、一対の細
胞Ａ，Ｂが位置決め保持される。各隔室に独立に設けら
れた電極からの配線は制御系９０５に接続されている。

制御ｊ’Ｊ９０５は、マイクロチャンバプレートの隔室
内の細胞を電気的に融合させるための電源や、細胞の状
態を）Ｉｌｌ胞を挟んだ電極間の電位変化として把握し
て、細胞の状態に応じて印加電圧を調整したり開閉する
等の処理を行う処理回路、搬送手段９０２，９０３ｋ駆
動してマイクロチャンバプレートに細胞を移し替える操
作等を制御する回路等から構成されている。

第３図はマイクロチャンバプレートの隔室にそれぞれ独
立に設けられた？Ｉ！極１０１〜１０４，２０１〜２０
４，３０１〜３０４，４０１〜４０４と、これらの電極
からの配線１０〜１４，２０〜２４．３０〜３４．４０
〜４４を平面状にパターン化した例である。

次に第１図に隔室１０３内の細胞を例にして、電気的な
細胞融合の過程を述へる。搬送手段により移し替えら１
ｆＬ、位置決めされた細胞８００，８０１は吸引孔６０
３からの吸引圧によって、吸引孔直上で互いに接触する
。一対の細胞は電極間に長手方向を成した吸引孔６０３
によって、互いに接触し８の字状を成し、その長手方向
が電界方向と一致するように位置決めされる。接触を保
った状態で、電極間にパルス状の電圧を印加すると、電
極に挟まれた一対の細胞が接触した細胞膜の部分から融
合し始める。融合の進行に伴って接触していた細胞は、
だるま状から楕円体状を経て球状体となる。一組みの電
極間の抵抗や静電容量や電荷量は、細胞の形状変化に伴
って変わる。

半径ｒｌｌ　ｒ２の細胞が融合して半径ｒ，の大きさに
変化するものと仮定すると、細胞の総容積が一定である
ので、次式が成立する。

ｒエ’＋ｒ２’＝ｒ， 接触した細胞の最大長は ２・（ｒエ＋ｒｚ） で、融合後の細胞の最大径は ２　・　ｒ，＝２　・（ｒよ’＋ｒ２’）である。例え
ば，等しい半径Ｒの２個の細胞が接触している時の最長
距離は４Ｒである。融合後の最長距射は２．５２・Ｒと
２個のｍ胞が接触していた時に比べて６３％と小さくな
る。従って、電極間の電位変化として検出できる。

融合のためパルス状の電圧を印加した後、電極間の電位
変化が始まれば、その時細胞融合が始まったことになる
。細胞融合が進行して一つの球体となると、電極間の電
位変化が小さくなる。従って、一対の細胞に融合用のパ
ルス状電圧を印加した直後に、電極間の電位を測定し、
その変化率を求めることにより、融合の開始点を把握す
ることができる。細胞融合が始まるまでは、適当な周期
でパルス状電圧を加え続け、さらに、融合が始まらない
時には印加するパルス状電圧を漸次昇圧して印加条件を
変えることにより、細胞を融合させることができる。電
位変化が現われて融合の開始が検出された後には、融合
を進展させるためにパルス状電圧の印加を停止する。ま
た、細胞の活性か弱い場合等には、パルス状電圧の印加
により細胞が破損することがあるが、この時の電位変化
のモードは急峻な変化の後に一定となるモードを示す。

従って、融合の進展に伴なってリ２われる緩やかな電位
変化のモートと区別することができるので、細胞の破損
時点を把握することができる。

隔室内で１個の細胞の破損が判明した場合には、残りの
細胞が未融合のまま残って、培養時に増夕１６すること
が防ぐために、残りの細胞を破壊処理させるための高い
電圧を印加する。残存細胞の有無や破壊状況も電位変化
から検知できる。以Ｌの方法により、所望の融合細胞の
みを確実に残すことが可能である。なお、電極間距離を
２００μｍとし、０　．　５　ｍｏｌのソルビトール液
を用いて、サラダ菜の細胞を融合させる場合には、約２
５Ｖ，１５０μｓのパルス状電圧を１〜数回程印加する
だけで細胞融合が始まり、８の字状の接触状態から、だ
るま状、楕円体状を経て、約２〜３分で球体状に融合が
進む。

第１図，第３図における電極からの配線パターンは互い
に交差しないので、パターニングは簡単であるが、チャ
ンバプレート上に形成可能な隔室の数に限度がある。第
４図は配線パターンを立体的に交差する構造にすること
によって、隔室の数に制限なしにチャンバプレート上に
形成可能な場合の一実施例である。ｙ方向の配線１０．
６０とＸ方向の配線１〜７の交差点に対応して一組みの
電極１１〜６７がパターニングされている。それぞれの
電極に電圧を印加したり、電極間の電位を測定するため
の接続方法は、公知の２次元液晶デバイスや２次元Ｍ　
Ｏ　Ｓイメージセンサ等を恥動する方法の応用で可能で
ある。

第５図は第４図に示した配線方法を用いたＳｉ製のマイ
クロチャンバプレートを拡大した断面の鳥徹図である。

細胞を吸引位置決めする吸引孔（寸法１０μｍ×８０μ
ｍ）を有する細胞保持溝プレート２００と、吸引孔の位
置に対応して隔室を構成している側壁プレート２０１と
の二枚重ね構造である。重ね合わせる部分に形成した電
極類を示すため、細胞保持溝プレートと側壁プレートと
を分離した状態を示してある。Ａｕ製の厚さ３００ｎｍ
の配線６，７および１０−３０は、第４図の配線パター
ンと同一番号の部分に対応する。

交差する配線の交差部分はＳｉｎ２製の絶縁層で電気的
にｌｍされている。次に、隔室３７を用いて説明する。

隔室３７の吸引孔３００の長手方向に配線６からの電極
３０１と配線３０からの電極３０２が形成されている。

吸引孔３００の横方向にはＳ　ｉｏ２製の絶縁体の凸部
３０３，３０４が形成されている。絶紳体の凸部３０３
，３０４は吸引孔を挟んで配百されており、電極３０１
と３０２との間に電圧を印加した時に生しる電気力線を
吸引孔の中央で収束させる機能がある。従って、吸引孔
上に接触位置決めされた一対の細胞に対して効率の良い
電圧印加やａｌｌ＋定を可能としている。

次に、一対の電極間に存在する細胞の状態や挙動を電気
的に検出した実施例を第６〜８図を用いて述へる。第６
図は、本発明の実施例のｆ１極部拡犬図で、電極６０１
，６０２との間に異種細胞６０３，６０４が互いに接触
し位置決めされている状態を示している。これらの電極
や細胞は等張′／Ｆ！ｉ６０５に浸ッテイる。文献（細
胞工学Ｖｏｌ．３，ＮＯ．６，１９８８，ｐ．４９７−
５０５のｐ．５００，ｐ．５０２）　に示さｈているよ
うに、０　．　５　ｍｏｌのソルビトールの等張液の比
抵抗は約１ｋΩ・ｍｍで、細胞膜の比抵抗は約１００，
＆Ω・ｍｍである。通常、細胞膜の厚さは約１０ｎｍで
あるのでその厚さ方向の抵抗は約１ｋΩである。本発明
の電極６０１と６０２の間隔は２００μｍで、その抵抗
は約０．２ｋΩである。従って、対向する電極の幅を細
胞の直径より小さくするか、締林体（第５図の３０３，
３０４に相当）を設けて世界が細胞に集中する構造にす
ることによって、電極間に存在する細胞の形状に存在す
る抵抗を測定することが可能である。電極６０１と６０
２間に電源６０６から定電圧をパルス状に印加して、検
出処理回路６０７から細胞の膜の厚さに存在する抵抗を
求め図示していない制御系（第２図９０５に相当）に出
力する。なお、低電圧をパルス状に印加するのけ等張液
の電気分解を防ぐためである。

測定処理後に得られる細胞の形状に存在する抵抗値の時
間的変化の例として第７，８図に示す。第７図は融合過
程の抵抗特性を示す。また第８図は細胞の破壊過程を示
す。両図とも横軸は時間し，縦軸は抵抗値ｒを表わして
いる。

第７Ｍにおいて、細胞が？１！極間に存在しない時間ｔ
，には等張液のみの抵抗値ｒ，　（約０．２ｋΩ）、細
胞が１個だけ位置決めされている時間し２には細胞１個
分の膜厚に依存した抵抗値ｒｚ（約２ｋΩ）、細胞が２
個だけ位置決めされている時間し，には細胞２個分の膜
厚に依存した抵抗値ｒ３（約４ｋΩ）、細胞融合が始ま
り細胞の融合が進行している時間ｔ４には、互いに接触
していた部位の膜が薄くなり融合が進むに連れて抵抗値
が減少しｒ４となり、その結果、雑種細胞が形成される
。

時間ｔ，には雑種細胞として存在している時の抵抗値ｒ
４を示す。

第８図は細胞の数と破損の有無を示す特性の一例である
。時間ｔ１〜ｔ，までは第７図と同じである。２個存在
していた細胞のうち１個が破損すると時間し，とし４と
の間の変化のように抵抗値の変化は急峻となる。従って
、細胞融合が進行中の緩やかな抵抗値の変化（第７図し
．に相当）と比へて識別して処理することが可能である
。時間ｔ６の抵抗値ｒ，　（ほぼｒ２に等しい）は一対
の細胞のうち１個だけ破損して、残り１個となった時の
細胞の抵抗値である。さらに、残りの１個の細胞も破損
すると、時間ｔ７に示すような抵抗値ｒｔ　（ほぼｒ１
に等しい）となる。なお、それぞれの物質の抵抗値は電
極の形状や等張液の濃度，−１解質の濃度，細胞の種類
等により左右されることは明らかであるが、一度条件を
求めれば、大きなばらつきはない。また、静電容量や誘
電率などの電気的特性も検出処理回路の応用として考え
ることは容易である。

以上述へた実施例は、２０〜１００μｍの細胞を取扱う
場合であるが、この寸法以外の細胞や″位子に対しても
、マイクロチャンバプレートの隔室や吸引孔を適切に設
計することにより容易に応用できることは明らかである
。なお、吸引孔のμｍオーダの加工は半導体プロセスで
用いられているパターニング技術やエッチング技術を応
用することで実現できる。また、マイクロチャンバプレ
ートの材料等は加工寸法や精度に応じて、Ｓｉ以外の硝
子や樹脂やセラミクス等を用いることも可能である。

さらに、本発明で示した細胞融合装置以外に、所定数の
細胞を隔室に入れてその状態を把握しながら薬品処理を
行ったり、培養処理を行う等の細胞処理装置として用い
ることも可能である。

また、所定の遺伝子を懸濁した液の中に細胞の位置決め
されたマイクロチャンバプレートを入れ、細く絞ったレ
ーザ光線やＸ線を細胞壁に照射して微細孔を開け、遺伝
子を細胞内に入れる遺伝子導入装置として用いることも
可能である。

さらに、粒子として血液を用いれば、隔室に位置決めさ
れる血球の数を計数することにより、単位流量当たりの
血球の数を計測して、血球濃度を求めることができる。

また、隔室に位置決めした血球に電圧を印加して，その
電圧による形状の変形具合から、血球の変形能を求めて
診断に供することのできる血球処理装置として用いるこ
とも可能である。

なお、粒子を液体中で位置決めして扱うマイクロチャン
バプレートにとって、隔室や吸引孔に気泡が付着するこ
とは粒子を操作する上で好ましくない。それぞれの隔室
の電極間の電位を予め測定することにより気泡の有無を
検知し、気泡を除去したり、データ処理上の配慮をする
ことが可能となるので、信頼性の極めて高いマイクロチ
ャンバを提供することができる。

〔発明の効果〕

本発明によれば、細胞や粒子の状態を個々に、独立に把
握することができるので、従来、細胞の個体差が大きい
ため人手に頼らざるを得ず自動化することが困難であっ
た細胞融合を、自動的に大量に行えるシステムとするこ
とが可能となったので、細胞工学の大きな発展に寄与で
きる。また、マイクロチャンバプレート上の隔室の配列
は既知であるので、隔室内の粒子や、細胞を番地付け管
理することが容易にでき、種々の処理を施した後の粒子
や、細胞の挙動を個々にコンピュータに取り込み処理す
るなどして、従来、不可能とされていた細胞や遺伝子工
学上の追跡研究等に貢献できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の第１の実施例の拡大断面の鳥撤図、第
２図は第１の実施例の装置の外観図、第３図は第１の実
施例の配線パターン図、第４図は第２の実施例の配線パ
ターン図、第５図は第２の実施例の拡大断面の鳥馳図、
第６図は本発明の実施例の電極部拡大図、第７図は融合
過程の抵抗特性を示す図、第８図は細胞の破損過程を示
す図である。 符号の説明 １０〜２１・・配線、１０１〜２０３・・隔室、６０３
　　・吸引孔、８００，８０１・・・細胞、８０２，８
０３・・・電極、９０１・・・マイクロチャンバプレー
ト 爾／困 序２ワ ２ρ／′・一岳田脂 ２・３一一丸社 ／らダ 〆θ．．｛−，％ｌｌ御々、 第５悶 ｊｌＪ，メＤグ 寒寧ト凸ぢｐ 第４虐 ／ρ ２ρ ．？ク ４ρ タρ ｚ０ 第２目 ｂｙ　　　乙１　　乙Ｉ　　　乙◆　　　　　ｔｆ陸中
叫ムμムト慰

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、内部に一対の電極を有した複数の隔室と該隔室毎に
   独立に前記一対の電極間へ電圧を印加する手段とを有す
   ることを特徴とするマイクロチャンバプレート。 ２、請求項１記載のマイクロチャンバプレートにおいて
   、上記一対の電極間の電気抵抗や静電容量や蓄積を検知
   する手段を付加してなることを特徴とするマイクロチャ
   ンバプレート。 ３、請求項２記載のマイクロチャンバプレートを用いて
   検出された上記一対の電極間の電気抵抗や静電容量や電
   荷から、上記隔室内の粒子の有無または形状を特定する
   ことを特徴とする粒子判別方法。 ４、請求項２記載のマイクロチャンバプレートに、上記
   一対の電極間に粒子を位置決めする手段を付加してなる
   ことを特徴とする粒子処理装置。 ５、請求項４記載の粒子処理装置において、上記粒子を
   細胞としたことを特徴とする細胞処理装置。 ６、請求項５記載のマイクロチャンバプレートに、上記
   一対の電極間に位置決めされた細胞融合手段を付加して
   なることを特徴とする細胞融合装置。 ７、請求項６記載の細胞融合装置を用いて融合し培養し
   たことを特徴とする細胞。 ８、請求項２記載のマイクロチャンバプレートに、上記
   隔室内に存在する細胞に微小孔を開ける手段を付加して
   なることを特徴とする細胞への遺伝子導入装置。 ９、請求項８記載の細胞への遺伝子導入装置において、
   上記微小孔を開ける手段としてレーザ光線を用いること
   を特徴とする細胞への遺伝子導入装置。 １０、請求項８記載の細胞への遺伝子導入装置において
   、上記微小孔を開ける手段としてＸ線を用いることを特
   徴とする遺伝子導入装置。 １１、請求項５記載の細胞処理装置における細胞を血球
   とし、該血球の活性度や変形能を判別する手段を付加し
   てなることを特徴とする血球処理装置。