JPH02124092A - Production of batroxobin by genetic recombination - Google Patents
Production of batroxobin by genetic recombinationInfo
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Landscapes
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Abstract
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、遺伝子組換え技術により製造されたバトロキ
ソビ／に関するものである。さらに詳しクハ、バトロキ
ソビンをコードするＤＮＡを単独で、または他のポリペ
プチドをコードするＤＮＡと共に含有する発現ベクター
、該発現ベクターを保持する形質転換体、該形質転換体
を用いてバトロキソビンを製造する方法、および該方法
によって得られる遺伝子組換え、バトロキソビンに関ス
るものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION Field of Industrial Application The present invention relates to batroxovi/ produced by genetic recombination technology. Further details: Expression vector containing DNA encoding batroxobin alone or together with DNA encoding other polypeptides, transformant carrying the expression vector, method for producing batroxobin using the transformant , and the genetically recombinant batroxobin obtained by the method.
従来技術および発明か解決すべき課題
天然バトロキソビンは、南米産ガラガラ蛇が産生ずるト
ロンビン様酵素タンパク質である。この物質は、フィブ
リノーゲンＡ鎖を特異的に切断して可溶性のフィブリン
を生成する作用を有することから、循環器系疾患、例え
ば、心機能低下による血行障害、特に末梢血流の阻害等
種々の疾患の予防および治療に有用である。PRIOR ART AND PROBLEMS TO BE SOLVED BY THE INVENTION Natural batroxobin is a thrombin-like enzyme protein produced by South American rattlesnakes. Since this substance has the effect of specifically cleaving fibrinogen A chain to produce soluble fibrin, it can be used for various diseases such as circulatory system diseases, such as blood circulation disorders due to decreased cardiac function, especially inhibition of peripheral blood flow. useful for the prevention and treatment of
従来、天然バトロキソビンは、上記毒蛇の毒液から単離
、精製して得る以外に人手法が知られていなかったため
に、安定的な供給に不安があり、また、高価であるとい
う問題点を有していた。Conventionally, natural batroxobin has been obtained by isolation and purification from the venom of the above-mentioned viper, as there was no known human method to obtain it, and there were concerns about stable supply, and the problem was that it was expensive. was.
課題を解決するための手段
本発明者らは、バトロキソビンを安定かつ安価に供給す
るために、遺伝子組換え技術による該物質の製造を実用
化することを目的として研究を重ねてきた。即ち、バト
ロキソビンをコードするＤＮＡを適当な発現ベクターに
組み込んでバトロキソビン発現ベクターを構築し、該発
現ベクターによって宿主細胞を形質転換し、得られた形
質転換体を培地に培養してその培養物から、バトロキソ
ビンを単離することを試みた。Means for Solving the Problems In order to stably and inexpensively supply batroxobin, the present inventors have conducted extensive research with the aim of commercializing the production of this substance using genetic recombination technology. That is, a batroxobin expression vector is constructed by inserting DNA encoding batroxobin into an appropriate expression vector, a host cell is transformed with the expression vector, the obtained transformant is cultured in a medium, and from the culture, An attempt was made to isolate batroxobin.
ところで、天然バトロキソビンをコードするＤＮＡ配列
は、既に公知であり、例えば特開昭６３−４９０８４号
公報にその推定アミノ酸配列とともに開示されており、
該ＤＮＡは、寄託番号ＦＥＲＭＰ−８９１３の下、工業
技術院微生物工業技術研究所に寄託されている、エッシ
エリヒア・コリ（Ｅ ５ｃｈｅｒｉｈｉａ ｃｏｌｉ）
Ｄ Ｈ１（ｐＢ ａｔ −２）から常法通り単離される
プラスミドｐＢａｔ−２を制限酵素処理することにより
得ることができる。天然バトロキソビンをコードするＤ
ＮＡ配列およヒ推定のアミノ酸配列を第１０図に示す。By the way, the DNA sequence encoding natural batroxobin is already known, and has been disclosed, for example, in JP-A-63-49084 together with its deduced amino acid sequence.
The DNA is derived from Escherichia coli, which has been deposited at the National Institute of Microbiology, Agency of Industrial Science and Technology under deposit number FERMP-8913.
It can be obtained by treating plasmid pBat-2, which is isolated from D H1 (pBat-2) in a conventional manner, with a restriction enzyme. D encoding natural batroxobin
The NA sequence and the deduced amino acid sequence are shown in FIG.
図中、アミノ酸番号−２４〜−１はプレプロ配列を、１
〜２３１は天然バトロキソビンのアミノ酸量列ヲ表ス。In the figure, amino acid numbers -24 to -1 represent the prepro sequence, 1
~231 shows the amino acid content sequence of natural batroxobin.
バトロキソビンを遺伝子組換え技術によって製造するに
際しては、種々の宿主−ベクター系を利用することがで
きる。大腸菌（エノシェリヒア・コリ）や枯草菌（バチ
ルス・サブチリス）等の原核生物、または酵母や吐乳動
物のごとき真核生物由来の宿主、並びにそれらに適した
発現ベクターは当業者に多数知られており、それらを適
宜選択し、上記バトロキソビン遺伝子の発現に適するよ
う改良して用いることができる。When producing batroxobin by genetic recombination technology, various host-vector systems can be used. Many hosts derived from prokaryotes, such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, or eukaryotes, such as yeast and mammalian emitters, as well as expression vectors suitable therefor, are known to those skilled in the art. They can be appropriately selected, modified and used to suit expression of the batroxobin gene.
しかしながら、本発明者らは、バトロキソビン遺伝子が
効率良く発現される宿主−ベクター系の開発を目的とし
て研究を重ねてきた結果、微生物宿主、特に大腸菌宿主
の場合、直接発現法ではバトロキソビンは確認されなか
ったが、他のポリペプチドとの融合タンパク質としてな
らば発現されることを見出した。即ち、、バトロキソビ
ンと池のポリペプチドとの融合タンパク質をコードする
ＤＮＡを大腸菌宿主内で機能的な発現ベクターに組み込
み、得られたバトロキソビン発現ベクターによって大腸
菌宿主を形質転換し、所望の形質転換体を選択して培地
に培養することにより、バトロキソビン含有融合タンパ
ク質を発現させることに成功した。次いで、発現された
融合タンパク質を精製及切断し、所望のバトロキソビン
を他のポリペプチドから分離した。さらに、分離したタ
ンパク質をリホールディングして生物学的に活性なバト
ロキソビンを得た。However, as a result of repeated research aimed at developing a host-vector system in which the batroxobin gene is efficiently expressed, the present inventors have found that batroxobin was not detected by direct expression in microbial hosts, especially E. coli hosts. However, we found that it can be expressed as a fusion protein with other polypeptides. That is, a DNA encoding a fusion protein of batroxobin and Ike's polypeptide is inserted into a functional expression vector in an E. coli host, and the E. coli host is transformed with the obtained batroxobin expression vector to produce a desired transformant. By selectively culturing in a medium, we succeeded in expressing a batroxobin-containing fusion protein. The expressed fusion protein was then purified and cleaved to separate the desired batroxobin from other polypeptides. Furthermore, the isolated protein was refolded to obtain biologically active batroxobin.
一方、酵母やより高等な真核細胞、例えばマウス上９２
９細胞に適合する発現ベクターを構築し、該ベクターを
用いて適当な宿主を形質転換し、得られた形質転換体を
培養してバトロキソビンを直接発現させることにも成功
した。この場合には、リホールディングを行わなくとも
、生物学的に活性なバトロキソビンが得られる。On the other hand, yeast and higher eukaryotic cells, such as mice92
We also succeeded in directly expressing batroxobin by constructing an expression vector compatible with 9 cells, transforming an appropriate host using the vector, and culturing the obtained transformant. In this case, biologically active batroxobin can be obtained without refolding.
本発明の“遺伝子組換えバトロキソビン”とは遺伝子組
換え法により製造された天然のバトロキソビンおよびそ
の誘導体を含む。ここで言う天然のバトロキソビンの誘
導体とは、遺伝子組換え手法において、天然バトロキソ
ビンをコードするＤＮＡをＤＮＡの付加、削除および置
換により改変することにより、あるいはバトロキソビン
をコードするＤＮＡを発現させるに際し、宿主細胞を選
択してグリフシル化の種類および程度を天然バトロキソ
ビンと変えることにより製造可能な天然バトロキンピン
の酵素活性を有する酵素を意味する。The term "genetically recombinant batroxobin" of the present invention includes natural batroxobin produced by genetic recombination methods and derivatives thereof. The derivatives of natural batroxobin referred to herein are those obtained by modifying the DNA encoding natural batroxobin by addition, deletion, and substitution of DNA in genetic recombination techniques, or by modifying the DNA encoding natural batroxobin in host cells when expressing the DNA encoding batroxobin. means an enzyme having the enzymatic activity of natural batroquinpine, which can be produced by selecting and changing the type and degree of glyfusylation from natural batroxobin.
そのような例としては、天然バトロキソビンのＮ末端に
オリゴペプチド（例えば、ＧｌｙＴｈｒＧｌｕＰｈｅＭ
ｅｔ−１ＳｅｒＧｌｕＰｈｅＭｅｔ−等）が付加したバ
トロキソビン、天然のグリフシル化を伴わないバトロキ
ソビン［例えば、グリフシル化されていない（糖鎖のな
い）天然バトロキソビン等］などが挙げられる。さらに
、その誘導体には、下記の融合タンパク質のうち、バト
ロキソビン活性を有するものも含まれる。Such examples include oligopeptides (e.g., GlyThrGluPheM) at the N-terminus of native batroxobin.
et-1SerGluPheMet-, etc.), batroxobin without natural glyphsylation [for example, natural batroxobin without glyphsylation (no sugar chain), etc.]. Further, the derivatives include those having batroxobin activity among the following fusion proteins.
また、原核細胞を宿主として用いて、バトロキソビンを
融合タンパク質として発現させる場合のバトロキソビン
に融合させるべき他のポリペプチドの好ましい例として
は保護ペプチドが挙げられる。ここで、保護ペプチドと
は、バトロキソビンを遺伝子組換え手法で製造する際に
バトロキソビンの発現を妨げるような作用（例えば、翻
訳阻害作用）または発現されたバトロキソビンを分解す
るような作用（例えば、菌体内プロテアーセによる分解
作用）などの、バトロキソビンの製造に悪Ｈを与える作
用から、バトロキソビンを保護することができ、必要に
応じて、例えば適当な酵素処理により、融合タンパク貫
から容易に脱離しうるポリペプチドを意味し、さらに、
バトロキソビンに融合することにより融合タンパク質を
大腸菌体内で不溶化せしめる能力を有することが望まし
い。Further, when batroxobin is expressed as a fusion protein using a prokaryotic cell as a host, a protective peptide is a preferable example of another polypeptide to be fused to batroxobin. Here, the protective peptide refers to an effect that inhibits the expression of batroxobin (e.g., translation inhibition effect) or an effect that degrades the expressed batroxobin (e.g., intracellular A polypeptide that can protect batroxobin from harmful effects on the production of batroxobin, such as degradative action by protease, and can be easily detached from the fusion protein by, for example, appropriate enzymatic treatment, if necessary. means, and furthermore,
It is desirable that the protein has the ability to insolubilize the fusion protein in E. coli by fusing it to batroxobin.
そのような保護ペプチドの好ましい例としては、ソマト
メジンのＣ−ドメインを構成するペプチド（ペプチドＣ
ｄ）、γ−インターフェロンのレフト・ハーフ部分（γ
−インターフェロンのアミノ酸配列１〜５９番目に相当
）を構成するペプチド（ＬＨ蛋白）またはペプチドＣｄ
およびＬＨ蛋白からなる融合ペプチド（特開昭６２−６
６８９号公報参照）のそれぞれＣ−末端に血液凝固第χ
ｍ因子様ペプチドを付加したポリペプチドが挙げられる
。これらの保護ペプチドは、トロンビンをこの融合タン
パク質に作用させることにより、容易に脱離し、バトロ
キソビンを与える。Preferred examples of such protected peptides include peptides constituting the C-domain of somatomedin (peptide C
d), left half part of γ-interferon (γ
- Peptide (LH protein) or peptide Cd constituting the amino acid sequence 1 to 59 of interferon
and a fusion peptide consisting of LH protein (JP-A-62-6
Blood coagulation number χ is present at the C-terminus of each
Examples include polypeptides to which m-factor-like peptides have been added. These protected peptides are easily removed by allowing thrombin to act on this fusion protein, yielding batroxobin.
即ち、本発明の製造法に従い、バトロキソビンのアミノ
酸配列をコードするＤＮＡを含んでいる発現ベクターを
構築し、該発現ベクターで形質転換した宿主細胞を培地
に培養し、培養物からバトロキソビンを採取することに
より、遺伝子組換えバトロキソビンを製造することがで
きる。That is, according to the production method of the present invention, an expression vector containing DNA encoding the amino acid sequence of batroxobin is constructed, host cells transformed with the expression vector are cultured in a medium, and batroxobin is collected from the culture. Accordingly, recombinant batroxobin can be produced.
以下に、本発明の製造方法を詳細に説明する。The manufacturing method of the present invention will be explained in detail below.
本発明方法に用いる宿主細胞には、細菌（例えば、大腸
菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ ５ｕｂｔｉｌｉｓ）等）、酵母（例え
ばパン酵母＋１（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅ
ｖｉｓｉａｅ）等の微生物由来の細胞、並びに培養ヒト
細胞および培養動物細胞（例えばＣＨ○細胞、Ｌ９２９
細胞等）および培養植物細１包か包含されうる。微生物
の好ましい例は細菌、特にエシェリヒア属に属する細菌
（例えばＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩ ＡＴＣＣ３３６９
４，Ｅ、ｃｏｌｉ ＨＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ ＢＰ−
１３７２、Ｅｃｏｌｉ ＭＭ２９４ ＡＴＣＣ３１４
４６、Ｅ 、 ｃｏｌ １Ｄ）ｉｌ ＡＴＣＣ３３８
４９等）およびパン酵母（例えばＳ、ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ ＡＨ２２ＡＴＣＣ３８６２６等）であり、動物細
胞の好ましい例はマウスＬ９２９細胞およびチャイニー
ズ・ハムスター・オバリー（ＣＨＯ）細胞等である。Host cells used in the method of the present invention include bacteria (e.g. Escherichia coli, Bacillus subtilis).
acillus 5ubtilis), yeast (e.g. baker's yeast +1 (Saccharomyces cere)
visiae), as well as cultured human cells and cultured animal cells (e.g. CH○ cells, L929
cells, etc.) and cultured plant cells. Preferred examples of microorganisms are bacteria, in particular bacteria belonging to the genus Escherichia (e.g. E. coliHBIOI ATCC 3369).
4, E, coli HBIOI-16FERM BP-
1372, Ecoli MM294 ATCC314
46, E, col 1D) il ATCC338
49) and baker's yeast (e.g. S. cerevisi
ae AH22ATCC38626, etc.), and preferred examples of animal cells include mouse L929 cells and Chinese hamster overly (CHO) cells.
通常、発現ベクターは、原核生物である細菌、特に大腸
菌を宿主細胞として用いる場合には、少なくともプロモ
ーター、開始コドン、、バトロキソビンと他のポリペプ
チドとの融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤ
ＮＡ、終止コドン、ターミネータ−領域および自己複製
可能ユニット（単位）から構成される。他方、真核生物
、即ち酵母や動物細胞を宿主細胞として用いる場合には
、発現ベクターは、少なくともプロモーター、開始コド
ン、ングナル・ペプチド、バトロキソビンのアミノ酸配
列をコードするＤＮＡおよび終止コドンから構成される
のが好ましい。さらにエンハンサ−配列、バトロ牛ソビ
ンの５″−およヒ３’−非コード領域、スプライシング
・ジャンクション、ポリアデニル化部位および自己複製
可能単位を挿入することもできる。Usually, when a prokaryotic bacterium, especially Escherichia coli, is used as a host cell, the expression vector includes at least a promoter, an initiation codon, and a D encoding the amino acid sequence of a fusion protein of batroxobin and another polypeptide.
It is composed of NA, a stop codon, a terminator region, and a self-replicatable unit. On the other hand, when eukaryotes, such as yeast or animal cells, are used as host cells, the expression vector is composed of at least a promoter, an initiation codon, a peptide, a DNA encoding the amino acid sequence of batroxobin, and a stop codon. is preferred. Additionally, enhancer sequences, 5''- and 3'-non-coding regions of the Baturosobin, splicing junctions, polyadenylation sites and self-replicating units can also be inserted.
上記の発現ベクターの構成要素について説明すると、ま
ず、自己複製可能単位には、形質転換体の選択マーカー
（たとえば、アンピシリン耐性）が含有されていること
が好ましい。To explain the components of the above expression vector, first, the self-replicable unit preferably contains a selectable marker for transformants (for example, ampicillin resistance).
細菌を宿主として用いる場合、プロモーターという語句
は、プロモーター、オペレーターおよびシャインータル
ガーノ（ＳＤ）配列（たとえばＡＡＧＧ等）からなるプ
ロモーター・オペレーター領域を意味する。そのような
プロモーターの例としては、慣用のプロモーター・オペ
レーター領域（たとえば、ラクトースオペロン、ＰＬ−
プロモータ、ｔｒｐ−プロモーター等）が挙げられる。When using bacteria as a host, the term promoter refers to a promoter-operator region consisting of a promoter, an operator, and a Shine-Talgarno (SD) sequence (eg, AAGG, etc.). Examples of such promoters include conventional promoter-operator regions (e.g., lactose operon, PL-
promoter, trp-promoter, etc.).
酵母を宿主とする場合に用いられるプロモーターの例と
しては触５プロモーターが挙げられる。哺乳動物細胞に
おける発現のため用いられるプロモーターの例としては
、ＨＴＬＶ−ＬＴＲプロモーターＳＶ４０初期および後
期プロモーター、マウス・メタロチオネインＩ（ＭＴ）
−プロモーター等が挙げられる。An example of a promoter used when yeast is used as a host is the 5 promoter. Examples of promoters used for expression in mammalian cells include the HTLV-LTR promoter SV40 early and late promoter, mouse metallothionein I (MT)
- promoters, etc.
好ましい開始コドンとしてはメチオニンコドン（ＡＴＧ
）が挙げられる。A preferred start codon is the methionine codon (ATG
).
シグナル・ペプチドをコードするＤＮＡとしてはｐｈｏ
５、ｔ−ＰＡおよびバトロキソビンのシグナル・ペプチ
ドをコードするＤＮＡが挙げられる。The DNA encoding the signal peptide is pho.
5, t-PA and batroxobin signal peptide encoding DNA.
バトロキソビン、バトロ牛ソピンと池のポリペプチドと
の融合タンパク質またはシグナル・ペプチドのアミノ酸
配列をコードするＤＮＡは、たとえば、ＤＮＡ合成装置
を用いて、部分または全ＤＮＡを合成するか、あるいは
形質転換体［たとえばＥ、ｃｏｌｉ ＤＨ−１（ｐＢａ
ｔ ２）ＦＥＲＭ Ｐ−８９１３等］から得られるベ
クター［例えば、ｐＢａｔ＝２等１に挿入されている天
然バトロキソビンのＣＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡを常
法通り処理する（たとえば、制限酵素による消化、細菌
アルカリホスファターゼによる脱燐酸化、Ｔ４ポリヌク
レオチドキナーゼによる燐酸化、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを
用いたライゲーション）ことによって調ラフすることが
できる。DNA encoding the amino acid sequence of batroxobin, a fusion protein of batroxobin and Ike's polypeptide, or a signal peptide can be obtained by, for example, synthesizing partial or total DNA using a DNA synthesizer, or by using a transformant [ For example, E. coli DH-1 (pBa
t2) FERM P-8913, etc.], the natural batroxobin cDNA or genomic DNA inserted into a vector [e.g., pBat=2, etc. 1] is treated in a conventional manner (e.g., restriction enzyme digestion, bacterial alkali The DNA can be roughened by dephosphorylation using phosphatase, phosphorylation using T4 polynucleotide kinase, and ligation using T4 DNA ligase.
終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばＴＡＧ、ＴＧＡ、等）か挙げられる。Examples of the stop codon include commonly used stop codons (eg, TAG, TGA, etc.).
ターミネータ−領域としては、天然または合成のターミ
ネータ−（たとえば、合成ｒｄファージターミネーター
１等）が挙げられる。Terminator regions include natural or synthetic terminators (eg, synthetic rd phage terminator 1, etc.).
自己複製可能ユニットとは、それを占有する発現ベクタ
ーの全ＤＮＡを宿主細胞中で自己複製しうるＤＮＡ配列
であって、天然のプラスミド、人工的に修飾したプラス
ミド（たとえば、天然プラスミドから調製したＤＮＡ断
片）および合成プラスミドが挙げられる。そのようなプ
ラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とす
る場合、例えばプラスミドｐＢ Ｒ３２２またはその人
工修飾体（ｐＢＲ３２２の適当な制限酵素処理によって
得られたＤＮＡ断片）が挙げられ、酵母を宿主細胞とす
る場合、例えば、ｐＪＤＢ２１９、ｐＪＤＢ２０７、ｐ
ＭＭＩＯ２が挙げられ、さらに、動物細胞を宿主細胞と
する場合、例えばプラスミドｐＳ Ｖ ２ｄｈｆｒ Ａ
ＴＣＣ３７１４５、プラスミドｐｄＢＰＶ−ＭＭＴｎｅ
ｏ ＡＴＣＣ３７２２４、プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏ
ＡＴＣＣ３７１４９が挙げられる。A self-replicable unit is a DNA sequence that is capable of autonomously replicating the entire DNA of the expression vector it occupies in a host cell, including natural plasmids, artificially modified plasmids (e.g., DNA prepared from natural plasmids). fragments) and synthetic plasmids. Preferred examples of such plasmids include plasmid pB R322 or an artificially modified version thereof (a DNA fragment obtained by treating pBR322 with an appropriate restriction enzyme) when using Escherichia coli as a host cell. For example, pJDB219, pJDB207, p
MMIO2 is mentioned, and when animal cells are used as host cells, for example, plasmid pS V 2dhfr A
TCC37145, plasmid pdBPV-MMTne
o ATCC37224, plasmid pSV2neo
ATCC37149 is mentioned.
エンハンサ−配列としては、例えば５Ｖ４Ｑのエンハン
サ−配列が挙げられる。Examples of the enhancer sequence include the 5V4Q enhancer sequence.
ポリアデニル化部位としては、例えば５Ｖ４Ｑのポリア
デニル化部位が挙げられる。Examples of the polyadenylation site include the 5V4Q polyadenylation site.
スプライシング・ジャンクションとしては、例えばＳＶ
４０のスプライシング・ジャンクションが挙げられる。As a splicing junction, for example, SV
There are 40 splicing junctions.
細菌を宿主として用いる場合、本発明のバトロキソビン
発現ベクターは、プロモーター、開始コドン、、バトロ
キソビンと他のポリペプチドとの融合タンパク質のアミ
ノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドンおよびターミ
ネータ−領域を、適当な自己複製可能ユニットと共に、
上流から下）点に向けて連続的に、所望により適当なり
ＮＡ断片（例えば、制限酵素認識配列を持つリンカ−等
）を用いて、常法（例えば、制限酵素による消化、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼを用いた燐酸化、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを用いたライゲーション）通り環状に連結する
ことにより調製される。動物細胞、特に哺乳動物細胞を
宿主として用いる場合、本発明の発現ベクターは、エン
ハンサ−配列、プロモーター領域、５”−非コード領域
、開始コドン、シグナル・ペプチドおよびバトロキソビ
ンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ、終止コドン、３
−非コード領域、スプライシング・ンヤンクンコンおよ
びポリアデニル化部位を上記慣用の手法により、適当な
自己複製可能ユニットに、上流から下流に向けて連続的
かつ環状に連結して調製することができる。When a bacterium is used as a host, the batroxobin expression vector of the present invention contains a promoter, an initiation codon, a DNA encoding the amino acid sequence of a fusion protein of batroxobin and another polypeptide, a stop codon, and a terminator region. With a replicable unit,
If necessary, use an appropriate NA fragment (e.g., a linker with a restriction enzyme recognition sequence, etc.) sequentially from the upstream to the lower point, using a conventional method (e.g., restriction enzyme digestion, T4
Phosphorylation using polynucleotide kinase, T4 DNA
ligation using ligase). When animal cells, particularly mammalian cells, are used as hosts, the expression vector of the present invention contains DNA encoding the enhancer sequence, promoter region, 5''-noncoding region, start codon, signal peptide and amino acid sequence of batroxobin, stop codon, 3
- The non-coding region, the splicing site and the polyadenylation site can be prepared by sequentially and circularly linking from upstream to downstream into a suitable self-replicable unit by the conventional techniques described above.
次に、本発明の発現ベクターを選択した宿主細胞に導入
する。当業者既知の常法（たとえば、大腸菌の場合、り
７ユナー（Ｋ ｕｓｈｎｅｒ）法、酵母の場合、タレ（
ＫＵＲ）法、動物細胞の場合、リン酸・カルンウム法、
マイクロインジェクション法等）によって導入すること
により、形質転換体が得られる。Next, the expression vector of the present invention is introduced into the selected host cell. Conventional methods known to those skilled in the art (for example, in the case of E. coli, the Kushner method; in the case of yeast, the sauce (
KUR) method, in the case of animal cells, phosphoric acid/carunium method,
A transformant can be obtained by introducing the vector by microinjection method, etc.).
次いで本発明の遺伝子組換えバトロキソビンを製造する
ために、得られた発現ヘクター含有形質転換体を培地に
培養する。Next, in order to produce the recombinant batroxobin of the present invention, the obtained transformant containing the expression hector is cultured in a medium.
通常、培地は、炭素源（例えば、グルコース、グリセリ
ン、マンニトール、フルクトース、ラクトース、等）お
よび無機または有機の窒素源（例えば、硫酸アンモニウ
ム、塩化アンモニウム、カセイン加水分解物、酵母エキ
ス、ポリペプトン、バタトトリブトン、牛肉エキス、ア
ミノ酸等）を含有する。所望により、他の成分、例えば
、無機塩類（例えば、燐酸二水素ナトリウムまたはカリ
ウム、燐酸水素二カリウム、塩化マグネ／ラム、硫酸マ
グネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（例えば、
ビタミンＢ、）、抗生物質（例えば、アンピシリン）等
を培地に加えてもよい。Typically, the medium contains a carbon source (e.g., glucose, glycerin, mannitol, fructose, lactose, etc.) and an inorganic or organic nitrogen source (e.g., ammonium sulfate, ammonium chloride, casein hydrolyzate, yeast extract, polypeptone, batatotributon, beef extracts, amino acids, etc.). Optionally, other ingredients such as inorganic salts (e.g. sodium or potassium dihydrogen phosphate, dipotassium hydrogen phosphate, magne/rum chloride, magnesium sulfate, calcium chloride), vitamins (e.g.
Vitamin B, ), antibiotics (eg, ampicillin), etc. may be added to the medium.
動物細胞用の培地としては、任意に成長促進物質及び／
又は吐乳動物血清を補給された市販の培地を用いること
ができる。The medium for animal cells may optionally contain growth promoting substances and/or
Alternatively, commercially available media supplemented with mammalian serum can be used.
本発明の形質転換体の培養は、一般に、ｐＨ５゜５〜８
．５（好ましくはｐＨ７〜７．５）、１８〜４０’Ｃ（
好ましくは２５〜３８°Ｃ）において、５〜５０時間に
わたって行えばよい。The transformant of the present invention is generally cultured at a pH of 5.5 to 8.
．． 5 (preferably pH 7-7.5), 18-40'C (
Preferably at 25 to 38°C), it may be carried out for 5 to 50 hours.
次いで、形質転換体により発現されたバトロキソビンを
分離する。大腸菌のような細菌を宿主細胞として用いる
場合は、発現された、バトロキソビンと他のポリペプチ
ドとの融合タンパク質は、通常、培養形質転換体細胞中
に存在しているので、まず、細胞を濾過または遠心分離
によって集め、細胞壁および／または細胞膜を常法（例
えば、リゾチームおよび／または超音波による処理等）
により破壊し、デブリスとする。このデブリスからの融
合タンパク質の単離、精製は、天然または合成の蛋白質
の精製、単離における一般的手法［例えば、適当な溶媒
（例えば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグアニジウム塩水溶液
等）による蛋白質の溶解、透析、ゲル濾過、カラムクロ
マトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、および
抗バトロキソビン抗体を用いるアフィニティクロマトグ
ラフィー等］を用いて行うことができる。酵母、動物細
胞を宿主細胞として用いる場合には、製造されたバトロ
キソビンは分ｉ・され、通常、培養液中に活性体として
存在するので、培養物を濾過（または遠心分離）するこ
とにより培養濾液（上澄液）を得、この１１、！液（上
澄液）を上述した通常の方法で精製することができる。The batroxobin expressed by the transformant is then isolated. When using bacteria such as Escherichia coli as host cells, the cells are first filtered or Collected by centrifugation, cell walls and/or cell membranes were removed using conventional methods (e.g., treatment with lysozyme and/or ultrasound).
Destroy it and turn it into debris. Isolation and purification of the fusion protein from this debris can be carried out using general techniques for the purification and isolation of natural or synthetic proteins [e.g., dissolving the protein in an appropriate solvent (e.g., 8M urea aqueous solution, 6M guanidium salt aqueous solution, etc.). , dialysis, gel filtration, column chromatography, high performance liquid chromatography, affinity chromatography using an anti-batroxobin antibody, etc.]. When yeast or animal cells are used as host cells, the produced batroxobin is separated and usually exists as an active form in the culture solution, so the culture filtrate can be extracted by filtering (or centrifuging) the culture. (supernatant liquid) was obtained, and this 11,! The liquid (supernatant liquid) can be purified by the usual method described above.
上記において、大腸菌のような細菌が宿主細胞の場合、
単離、精製した融合タンパク質を適当な酵素処理（例え
ば、血液凝固第ＸＩＩＩＩＪ囚子様ペプチドかバトロキ
ソビンのＮ−末端に付加されている場合にはトロンビン
による処理）に付すことにより、保護ペプチドを脱離さ
せ、目的物であるバトロキソビンを得る。In the above, if the host cell is a bacterium such as E. coli,
The protected peptide is removed by subjecting the isolated and purified fusion protein to a suitable enzymatic treatment (e.g., treatment with thrombin if blood coagulation factor XIIIJ prisoner-like peptide or batroxobin is attached to the N-terminus). The target product, batroxobin, is obtained.
このようにして分離されたバトロキソビンをリホールデ
ィングすることにより、生物学的に活性なバトロキソビ
ンが得られる。本発明者らはグリセリンの存在下、還元
剤の非存在下でリホールディングすると、還元剤の存在
下におけるよりもはるかに効率よくリホールディングさ
れるという驚くへき事実を見出した。By refolding the thus separated batroxobin, biologically active batroxobin can be obtained. The present inventors have surprisingly discovered that refolding in the presence of glycerin and in the absence of a reducing agent results in much more efficient refolding than in the presence of a reducing agent.
上記製造法により得られた遺伝子組換えバトロキソビン
は、循環器系疾患、例えば心臓病等の末梢廂流の障害に
起因する疾患の治療のための薬剤として有用である。本
発明の遺伝子組換えバトロキソビンを治療に用いるため
には、医薬として許容しうる担体と混合し、注射剤また
は注入剤のごとき適当な投与剤形に製剤化し、ヒトを含
めた哺乳動物に非経口的に投与する。The recombinant batroxobin obtained by the above production method is useful as a drug for treating diseases of the circulatory system, such as diseases caused by disorders of peripheral circulation such as heart disease. In order to use the recombinant batroxobin of the present invention for treatment, it is mixed with a pharmaceutically acceptable carrier, formulated into an appropriate dosage form such as an injection or infusion, and administered parenterally to mammals including humans. Administer directly.
本発明のバトロキソビン製剤のための医薬上許容し得る
担体には、ペプチドまたは蛋白質（たとえば、血清アル
ブミン等）を含有する医薬組成物の調製に慣用されてい
る種々の有機または無機の担体材料が包含される。Pharmaceutically acceptable carriers for batroxobin formulations of the present invention include various organic or inorganic carrier materials commonly used in preparing pharmaceutical compositions containing peptides or proteins (e.g., serum albumin, etc.). be done.
本発明の遺伝子組換えバトロキソビンの投与方法および
投与量は、既に市販されている天然ノ・トロキソビンに
準じて定めることかできる。The administration method and dosage of the recombinant batroxobin of the present invention can be determined in accordance with the already commercially available natural batroxobin.
本明細書においては、必要に応じて文献名を括弧内に数
字で記し、その詳細を明細書末尾の一覧表にまとめて示
した。In this specification, literature names are written with numbers in parentheses as necessary, and the details are summarized in a list at the end of the specification.
本発明のバトロキソビン発現ベクターの構築および形質
転換に用いた大腸菌、酵母および動物細胞を以下に説明
する。E. coli, yeast, and animal cells used for construction and transformation of the batroxobin expression vector of the present invention are explained below.
大腸菌ＪＭ８３（１）は、ｐＵｃ１８（ファルマシアよ
り市販）を用いて合成オリゴマーをクローニングする際
の形質転換実験における受容菌として用いられた。大腸
菌である菌株ＤＩ（ｌ（２）およびＭＭ２９４（３）は
その他のプラスミドを構築する際の形質転換実験におけ
る受容菌として用いられた。ＨＢＩＯＩ−１６ＦＥＲＭ
ＢＰ−１８７２は、ＨＢｌｏｌにＭＣ４１００（町Ｒ
１６）由来のｈｔｐＲ１６変異（４）を形質転換された
菌株であり、異種遺伝子の発現実験の宿主として用いら
れた。Escherichia coli JM83 (1) was used as a recipient bacterium in a transformation experiment when cloning synthetic oligomers using pUc18 (commercially available from Pharmacia). E. coli strains DI(l(2) and MM294(3) were used as recipient bacteria in transformation experiments when constructing other plasmids. HBIOI-16FERM
BP-1872 is MC4100 (Town R
This strain was transformed with the htpR16 mutation (4) derived from 16) and was used as a host for a heterologous gene expression experiment.
パン酵母（Ｓ ａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖ
ｉｓｉａｅ）Ａ Ｈ２２ＡＴＣＣ３８６２６（５）は、
異種遺伝子の発現実験の宿主として用いられた。Baker's yeast (Saccharomyces cerev)
isiae)A H22ATCC38626(5) is
It was used as a host for heterologous gene expression experiments.
培養動物細胞を用いた発現実験の宿主には、マウスＬ９
２９（犬日本製薬より市販）が用いられた。The host for expression experiments using cultured animal cells is mouse L9.
No. 29 (commercially available from Inu Nippon Pharmaceutical) was used.
本発明のハ゛トロキソビン遺伝子の発現ベクターの構築
に用いられた酵素は市販されており、それらの主な供給
源を以下に示す。The enzymes used for constructing the expression vector for the hydroxobin gene of the present invention are commercially available, and their main sources are listed below.
発現プラスミドの構築に際して用いられた制限酵素の内
、Ｃ１ａｌはベーリンガー、ＮｄｅｌはＢＲＬからそれ
ぞれ購入した。それ以外の制限酵素類は東洋紡から購入
した。切断における反応条件は、添付の使用方法に従っ
た。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（］ｉｇａｓｅ）、およびＴ４
ポリヌクレオチドキナーゼ（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉ
ｄｅ ｋｉｎａｓｅ）は、宝酒造から購入した。Among the restriction enzymes used in constructing the expression plasmid, C1al was purchased from Boehringer and Ndel was purchased from BRL. Other restriction enzymes were purchased from Toyobo. The reaction conditions for cleavage were in accordance with the attached directions for use. T4 DNA ligase (]igase), and T4
polynucleotide kinase (polynucleotide kinase)
de kinase) was purchased from Takara Shuzo.
ＤＮＡポリメラーセ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ） ｌ ［
フレノウ断片（Ｋ ｌｅｎｏｗ ｆｒａｇｍｅｎｔ）］
は、Ｂ ＲＬから購入した。DNA polymerase l [
K lenow fragment]
was purchased from BRL.
トロンビンは持出製薬社製のものを用いた。これらの酵
素も全て、添付の使用法に従って用いられた。As thrombin, one manufactured by Kakashi Seiyaku Co., Ltd. was used. All these enzymes were also used according to the attached instructions.
以下の実施例および添付の図面で用いる略語は次の意味
を有する：Ａｍｐ、アンピシリン；Ｔｃ、テトラサイク
リン；Ｒ，ｔｊ性； Ｂ ａｔ、 、バトロキソビンＳ
ＭＣ，ソマトメジン−Ｃ；α−ｈＡＮＰ、ヒト心房性ナ
トリウム***性利尿ホルモン；ｐｒｏ、、フロモーター
；ｔｅｒ、、ターミネータ−；１すｐｒｏ、、トリプト
ファン・プロモーター；ｆｄ ｔｅｒ、、ｆｄファージ
・ターミネータ−；融５ ｐｒｏ、、■５プロモーター
；ＭＴ ｐｒｏ−、マウスメタロチオネイン・プロモー
ター、ＬＨ，γ−インターフェロン・レフトハーフ；Ｃ
ｄ、ソマトメジン−ＣのＣドメインｔＰＡ、ヒト組織プ
ラスミノーゲン活性化因子。Abbreviations used in the following examples and the accompanying drawings have the following meanings: Amp, ampicillin; Tc, tetracycline; R, tj; Bat, , batroxobin S
MC, somatomedin-C; α-hANP, human atrial natriuretic diuretic hormone; pro, fromomotor; ter, terminator; 1 pro, tryptophan promoter; fd ter, fd phage terminator; fusion5 pro, ■5 promoter; MT pro-, mouse metallothionein promoter, LH, γ-interferon left half; C
d, C domain of somatomedin-C tPA, human tissue plasminogen activator.
なお、アミノ酸およびヌクレオチド類の略語は、当該技
術分野で通常の方法に従った。In addition, the abbreviations of amino acids and nucleotides were determined according to the usual method in the technical field.
本発明の発現ベクターの構築にかかわるプラスミドは以
下の通りである。ｐＢａｔ−２（第１図）は、ｐＵｃ１
３のポリクローニング部位にあるＥｃｏＲ１部位にＢａ
ｔｃＤＮＡのＥｃｏＲＩ断片か挿入されているプラスミ
ドである（６）。このプラスミドは形質転換体Ｅ、ｃｏ
ｌｉ ＤＨｌ（ｐＢａｔ−２）ＦＥＲＭＰ−８９１３か
ら常法により単離できる。ｐＬＳＤｉ（第１図）は、ト
リプトファン・プロモーター （Ｔ ｒｐ ｐｒｏ、
）の下流にＬＨ−３ＭＣの構造遺伝子及びｒｄ ｔｅｒ
、をクローニングした発現プラスミドである（７）。ｐ
ＬＳ−Ｔ２（第６図）は、Ｔｒｐｐｒｏ。The plasmids involved in the construction of the expression vector of the present invention are as follows. pBat-2 (Figure 1) is pUc1
Ba is added to the EcoR1 site in the polycloning site of 3.
This is a plasmid into which an EcoRI fragment of tcDNA has been inserted (6). This plasmid was used in transformants E, co
liDHl(pBat-2) can be isolated from FERMP-8913 by a conventional method. pLSDi (Figure 1) is a tryptophan promoter (Trp pro,
) downstream of LH-3MC structural gene and rd ter
(7). p
LS-T2 (Figure 6) is Trppro.
の下流にＳＤ配列を含有すると共に、ＬＨ−３ＭＣ遺伝
子がポリジストロニックにクローニングされたプラスミ
ドである（８）。ｐＣＬ ａＨｔｒｐ３ ｔ（第４図）
は、Ｔｒｐｐｒｏ、の下流にＣｄ・ＬＨの遺伝子・α−
ｈＡＮＰの構造遺（云子及びｆｄ ｔｅｒ、をクローニ
ングした発現プラスミドである（９）。ｐＢ Ｒ−ＰＨ
Ｏ／ ｌａｃ Ｚ （第７図）はｐＢＲ３２２に酵母の
ｐｈ。This plasmid contains an SD sequence downstream of the LH-3MC gene, and the LH-3MC gene is polydystrically cloned (8). pCL aHtrp3 t (Figure 4)
is a Cd/LH gene/α- downstream of Trppro.
This is an expression plasmid in which the structural genes of hANP (Yuko and fd ter) were cloned (9). pB R-PH
O/lac Z (Fig. 7) is the pH of yeast in pBR322.
５遺伝子（発現制御・調節領域とシグナル配列を含む）
と大腸菌のＩａｃＺ遺伝子をクローニングしたプラスミ
ドである。ｐＭＭ１０２（第７図）はｐＢＲ３２２のＥ
ｃｏＲ１部位に酵母由来の２μｍプラスミドをクローニ
ングした大腸菌と酵母のンヤトルベクターである。ｐｓ
Ｔ１１２（第８図）は、マウスのメタロチオネイン遺伝
子のプロモーターの下流にヒト組織プラスミノーゲン活
性化因子のｃＤＮＡがクローニングされた動物細胞での
発現プラスミドである。このプラスミドは形質転換体Ｅ
ｃｏｌｉ ＤＨ−１（ｐｓＴｌ １２）ＦＥＲＭ ＢＰ
−１９６６から常法により単離できる。5 genes (including expression control/regulatory regions and signal sequences)
This is a plasmid in which the E. coli IacZ gene is cloned. pMM102 (Figure 7) is the E of pBR322.
This is a vector for E. coli and yeast in which a 2 μm plasmid derived from yeast is cloned into the coR1 site. ps
T112 (FIG. 8) is an expression plasmid for animal cells in which the cDNA of human tissue plasminogen activator is cloned downstream of the mouse metallothionein gene promoter. This plasmid is used for transformants E
coli DH-1 (psTl 12) FERM BP
-1966 by conventional methods.
本発明のバトロキソビン発現ベクターは全てプラスミド
である。その内、プラスミドｐＢａｔ−９Ｓ４９、ｐＢ
ａｔ−３Ｓ５０、ｐＢａｔ−３Ｓ５１は原核生物、特に
大腸菌属、好ましくは旦、９其ＨＢ＋０１ｉ６を宿主と
して融合タンノＮ＋り質を発現させるのに適し、プラス
ミドｐＭＭｌ ０７およびｐＭＭ］ ０５は真核生物、
特に前者は酵母、後者はマウス上９２９細胞を宿主とし
てノ＜トロキソビンまたは融合タンパク質を発現させる
のに適している。All batroxobin expression vectors of the present invention are plasmids. Among them, plasmids pBat-9S49, pB
at-3S50, pBat-3S51 are suitable for expressing the fusion tanno-N+ plasmids in prokaryotes, especially Escherichia coli, preferably E. coli, and plasmids pMM107 and pMM]05 are eukaryotes,
In particular, the former is suitable for expressing notroxobin or a fusion protein using yeast and mouse 929 cells as hosts.
これらの発現ベクターは適当な大腸菌に挿入されて、そ
れぞれ下記の寄託番号の下、工業技術院微生物工業技術
研究所に寄託されている。These expression vectors have been inserted into appropriate Escherichia coli and deposited at the Institute of Microbial Technology, Agency of Industrial Science and Technology under the following deposit numbers.
形質転換体 寄託番号Ｅｓｃｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＨＢＩＯ１−１６／ｐＢａｔ−３
Ｓ４９ ＦＥＲＭＰ−＋０３２４Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ
ｉａｃｏｌｉｔ（ＢＩＯＩ−１６／ｐＢａｔ−３Ｓ５０
ＦＥＲＭＰ−１０３２５Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃ
ｏｌｉＨＢ１０１−１６／ｐＢａＬ−３Ｓ５１ ＦＥ
ＲＭＰ−１０３２６Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
ＨＢ １０１−１６／ｐＭＭ １０５ Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｐ−＋０３２７Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏ
ｌｉ ＭＭ２９４／ｐＭＭ １０７ Ｆ Ｅ
ＲＭ Ｐ−１０３２８以下に実施例を挙げ、本発明の詳
細な説明する。Transformant Deposit number Esche
richiacoliHBIO1-16/pBat-3
S49 FERMP-+0324Escherich
iacolit (BIOI-16/pBat-3S50
FERMP-10325Escherichiac
oliHB101-16/pBaL-3S51 FE
RMP-10326 Escherichia coli
HB 101-16/pMM 105 F E
RM P-+0327Escherichia co
li MM294/pMM 107 F E
RM P-10328 The present invention will be described in detail with reference to Examples below.
実施例１ 大腸菌の形質転換
本発明における大腸菌の形質転換は、特に明記しない限
り、以下の条件および方法に従って行ねれた。Example 1 Transformation of Escherichia coli The transformation of Escherichia coli in the present invention was carried out according to the following conditions and methods unless otherwise specified.
形質転換に用いる受容菌を滅菌ψａ培地［バクトトリプ
ト７ （Ｂ ａｃｔｏ Ｔ ｒｙｐｔｏｎｅ） ２０
ｇ、バクト酵母エキス（Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘ
ｔｒａｃｔ）、Ｍ、Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，０５ｇ、寒天（
Ａｇａｒ） １５９、Ｈ，Ｏｌ（、ＩＮ ＫＯＨでｐ
Ｈ７，６に調整した）上で、３０°Ｃあるいは３７°Ｃ
で一晩培養した。上記プレート上で増殖したコロニーの
うち単一のもの１個あるいは２個を５１の滅菌ψｂ培地
（ψａ培地から寒天を除いたもの）に植菌した。３０’
Ｃあるいは３７°Ｃて約２時間培養後（０，Ｄ、、、、
＝０．３）、５Ｒρの菌液を１００１１ＩＱの滅菌ψｂ
培地に植え継ぎ、更に同温で培養した。Ｏ，Ｄ、ｅｏｏ
”ｏ、４８になった時点で培養液を水冷下で５分間静置
後、４０００Ｘ９．４°Ｃで５分間遠心した。沈澱物を
４０ｔ（ｌのトランスフォメーション・バッファーｒ
（Ｔｒｂｌ ）（３０ｍＭ ＫＯＡｃ、１００ｍＭ Ｒ
ｂＣＱ、１０ｍＭ ＣａＣＱ、、５ Ｑ ｍＭ ＭｎＣ
Ｑ、、１５％（ｖ／ｖ）グリセロール、０．２ＭＡｃＯ
Ｈでｐ）（５，８に調整後、濾過滅菌した）に穏やかに
懸濁した。水冷下で５分間静置して、４０００ｘ９．４
°Ｃで５分間遠心後、沈澱物を４Ｎ＆のトランスフォメ
ーション・バッファー１１（ＴｆｂＩＩ）（１０ｍＭ
Ｐ Ｉ ＦＥＳ（あるいはＭＯＰＳ）、７５ｍＭ Ｃ
ａＣＱｔ、ｌｏｍＭＲｂｃ４．１５％（Ｖ／／Ｖ）グリ
セロール、ＩＮ ＫＯＨてｐＨ６，５に調整後、濾過滅
菌した）に穏やかに懸濁して水冷下で静置した。１５分
後、０．２ｍＱずつ分注したものを急速凍結して一８０
°Ｃにて保存した。必要時に１０分から１５分間水冷下
で融解して以下のように用いた。１０〜２０μＣのＤＮ
Ａ溶液を加え、更に３０分から４５分間水冷下で静置後
３７°Ｃで３分間（受容菌がｈｔｐＲの場合）あるいは
４２°Ｃで９０秒間静置してヒート ／コックを行った
。The recipient bacteria used for transformation were placed in sterile ψa medium [Bacto Tryptone 20
g, Bacto yeast extract (Bacto yeast ex
tract), M, Mg5O, 7H, 05g, agar (
Agar) 159, H, Ol (, p in KOH
(adjusted to H7,6) at 30°C or 37°C.
Cultured overnight. One or two single colonies grown on the above plate were inoculated into 51 sterile ψb medium (ψa medium without agar). 30'
After incubation at 37°C or 37°C for about 2 hours (0, D,...
= 0.3), 5Rρ bacterial solution was sterilized with 10011IQ ψb
The cells were subcultured into a medium and further cultured at the same temperature. O, D, eoo
When the temperature reached 48°C, the culture solution was allowed to stand still under water cooling for 5 minutes, and then centrifuged at 4000 x 9.4°C for 5 minutes.
(Trbl) (30mM KOAc, 100mM R
bCQ, 10mM CaCQ, 5QmM MnC
Q., 15% (v/v) glycerol, 0.2 MAcO
The mixture was gently suspended in p) with H (adjusted to 5,8 and sterilized by filtration). 4000x9.4
After centrifugation for 5 min at °C, the precipitate was washed with 4N transformation buffer 11 (TfbII) (10mM
P I FES (or MOPS), 75mM C
aCQt, lomMRbc4.15% (V//V) glycerol, adjusted to pH 6.5 with IN KOH, filter sterilized) and allowed to stand still under water cooling. After 15 minutes, the aliquots of 0.2 mQ were quickly frozen and
Stored at °C. When necessary, it was melted under water cooling for 10 to 15 minutes and used as follows. DN of 10-20μC
Solution A was added, and the mixture was allowed to stand still under water cooling for 30 to 45 minutes, and then heated/cocked at 37°C for 3 minutes (if the recipient bacteria was htpR) or at 42°C for 90 seconds.
水冷下で約９０秒間静置後、０．８ｉ（！のψｂ培地を
加え３０°Ｃあるいは３７°Ｃで１時間培養した後、選
択培地［アンピシリン耐性株（ＡｍｐＩｌ）あるいはテ
トラサイクリン耐性株（Ｔ ｃＲ）を選択する場合、そ
れぞれＡｍｐ１００γあるいはＴｅ１２．５７を含んだ
滅菌り一寒天培地（バタトトリプトン １０ｇ、ハクト
酵母エキス ５ｇ、ＮａＣＱ５９、寒天 １５ｇ、８２
０ Ｎ！、ｌＮＮａＯＨでｐＨ７，４に調整した）］
に塗布した。３０’Ｃあるいは３７°Ｃで一晩培養した
。形質転換体からのプラスミドＤＮ７〜の調製は、バー
ンボイム（Ｂ ｉｒｎｂｏｉｍ）らのアルカリ抽出法（
１０）に従って行った。After leaving to stand for about 90 seconds under water cooling, add 0.8i (!) of ψb medium and incubate at 30°C or 37°C for 1 hour. ), use sterile Riichi agar medium containing Amp100γ or Te12.57 (Batato tryptone 10g, Hakuto yeast extract 5g, NaCQ59, agar 15g, 82
0 N! , adjusted to pH 7.4 with IN NaOH)]
It was applied to. Cultured overnight at 30'C or 37°C. Plasmid DN7~ was prepared from the transformant using the alkaline extraction method of Birnboim et al.
10).
実施例２ 中間体プラスミドｐＢａｔ−３ＳＩの構築
夫々の制限酵素を、指示通りに使用してｐＢａｔ２［こ
のプラスミドは旦ｃｏｌｉ Ｄ ｆ（−１（ｐＢａｔ
２）ＦＥＲＭ Ｐ−８９１３より常法により単離でき
る］のＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅｌ断片（バトロキソビンの構
造遺伝子を含む約１．６に塩基対（以下ｂｐと略す））
を調製した。Example 2 Construction of Intermediate Plasmid pBat-3SI The respective restriction enzymes were used as directed to create pBat2 [this plasmid was first transformed into coli D f (-1 (pBat
2) EcoRI-Ndel fragment (can be isolated from FERM P-8913 by a conventional method) (approximately 1.6 base pairs (hereinafter abbreviated as bp) containing the structural gene of batroxobin)
was prepared.
同様に、プラスミドｐＬＳ−ＤＩ（欧州特許出願公開公
報第０２１９８１４号公報参照）のＥｃｏＲｌ −Ｎｄ
ｅｌ断片（大腸菌の複製開始点を含む約２２Ｋｂｐ）を
調製した。Similarly, EcoRl -Nd of plasmid pLS-DI (see European Patent Application Publication No. 0219814)
An el fragment (approximately 22 Kbp containing the E. coli origin of replication) was prepared.
上記で得た２つのＥ ｃｏＲＩ −Ｎｄｅ Ｉ断片をＴ
４ＤＮＡリガーゼにより、ライゲートした。なお、以下
の実施例でのＤＮＡ断片のライゲーションはすべてＴ４
ＤＮＡリガーゼの存在下常法により行った。The two EcoRI-Nde I fragments obtained above were
4 DNA ligase. In addition, all ligations of DNA fragments in the following examples were performed using T4.
This was carried out by a conventional method in the presence of DNA ligase.
次いで、実施例１記載の方法に従い、ライゲーション反
応混合物で大腸菌ＭＭ２９４を形質転換し、アンピシリ
ン耐性の形質転換体よりプラスミドｐＢａｔ−３ＳＩを
分離して、ＥｃｏＲＩ（１箇所切断）、ＥｃｏＲＩ −
ＢａｍＨＩ （２箇所切断）、ＲｓａＩ（３箇所切断）
消化で目的のプラスミドか得られていることを確認した
。Next, according to the method described in Example 1, Escherichia coli MM294 was transformed with the ligation reaction mixture, plasmid pBat-3SI was isolated from ampicillin-resistant transformants, and EcoRI (cleaved at one site), EcoRI -
BamHI (cutting at 2 places), RsaI (cutting at 3 places)
It was confirmed that the desired plasmid was obtained by digestion.
プラスミドｐＢａｔ−３ＳＩの構築模式図を第１図に示
す。A schematic diagram of the construction of plasmid pBat-3SI is shown in FIG.
実施例３ 中間体プラスミドｐＢａｔ−５Ｓ２の構築
１）オリゴヌクレオチドの合成
本実施例および以後の実施例で用いるオリゴヌクレオチ
ド■〜■を、全自動Ｄ Ｎ Ａ合成ｎ （Ｍ ｏｄｅ１
３８１ Ａ、 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製）を用い、その指示通りに合成した。Example 3 Construction of intermediate plasmid pBat-5S2 1) Synthesis of oligonucleotides Oligonucleotides ■ to ■ used in this example and subsequent examples were subjected to fully automatic DNA synthesis n (Mode 1
381 A, Applied B iosystem
(manufactured by S Company) according to the instructions.
合成されたＤＮΔ部分の塩基配列を、マキサムギルバー
ト法（１１）により確認した。The base sequence of the synthesized DNAΔ portion was confirmed by the Maxam-Gilbert method (11).
これらのオリゴマーを以下の表１に示す。These oligomers are shown in Table 1 below.
表 １ 合成オリゴヌクレオチド
■ＡＡＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡ
■ＴＴＧＧＡＧＧＴ
■ＧＡＴＧＡＡＴＧＴＧＡＣＡＴＡＡ
■ 八ＴＧＡＡＣＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴ■ＴＧＣＡＴＴ
ＣＡＴＧＴＡＣ
■ＡＴＧＡＡＴＧＣＡＡＧＧＡＡＡＧ
■ＧＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＡＴＧＴＣ
■ＡＣＡＴＴＣＡＴＣＡＣＣＴ
■ＣＣＡＡＴＧＡＣＣＡＴＧ
［株］、Ａ ＡＴＴＣＡ ＴＧＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＣ
Ｇ Ａ ＣＴＧＴＡＧ Ａ ＡＣＴＧ ＣＡＡＧ ＴＧ
ＧＴＡ ＣＣＴＣＧＡＧＴＧＡ
■ＣＣＡＡＴＣＡＣＴＣＧ ＡＧＧＴＡ ＣＣＡ ＣＴ
ＴＧＣＡＧＴＴＣＴ、’１ＣＡＧＴＣＧＧＣＡＧ ＡＴ
ＣＡＴＣＣＡＴＧ
次いで、このオリゴヌクレオチドを用いて、ＳＤ配列と
メチオニン開始コドンとの距離か適当な中間体プラスミ
ドを構築した。Table 1 Synthetic oligonucleotides AATTCATGGTCA TTGGAGGT GATGAATGTGACATAA Eight TGAACATCCTTTCCT TGCATT
CATGTAC ■ATGAATGCAAGGAAAG ■GATGTTCATTTATGTC ■ACATTCATCACCT ■CCAATGACCATG [Stock], A ATTCA TGGATGATCTGCC
G A CTGTAG A ACTG CAAG TG
GTA CCTCGAGTGA ■CCAATCACTCG AGGTA CCA CT
TGCAGTTCT,'1CAGTCGGCAG AT
CATCCATG This oligonucleotide was then used to construct an intermediate plasmid with an appropriate distance between the SD sequence and the methionine initiation codon.
２）プラスミドｐＵＣ−ＢａｔＬ１の構築（１）オリゴ
ヌクレオチドのライゲーションＪＡ］オリゴヌクレオチ
ド■、■、■、■を夫々０．８ｎｍｏｌづつ混合し、エ
タノール沈殿に付した。2) Construction of plasmid pUC-BatL1 (1) Ligation of oligonucleotides JA] Oligonucleotides (1), (2), (2), and (2) were mixed in an amount of 0.8 nmol each, and subjected to ethanol precipitation.
乾燥ｉＬ Ｔ ４ポリヌクレオチドキナーゼにより各オ
リゴヌクレオチドの５°末端をりん酸化（以下、キナー
ゼ処理とｆ／Ｆする）した後、ライゲーションさせた。The 5° end of each oligonucleotide was phosphorylated using dry iL T 4 polynucleotide kinase (hereinafter referred to as "kinase treatment"), followed by ligation.
［Ｂ］オリコヌクレオチド■、■、■、■、■各Ｑ 、
８ｎｍｏｌを混合してエタノール沈殿に付し、乾燥
後、キナーゼ処理およびライゲーション反応を行った。[B] Oliconucleotide ■, ■, ■, ■, ■Each Q,
8 nmol was mixed and subjected to ethanol precipitation, and after drying, kinase treatment and ligation reaction were performed.
［Ｃ］上記［Ａ］および［Ｂ］の反応溶液を混合して更
に１時間ライゲーションさせた後、ＥｃｏＲＩ消化を行
い、得られた混合物をポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけて所望の６５ｂｐ断片を得た。[C] The reaction solutions of [A] and [B] above were mixed and ligated for an additional hour, followed by EcoRI digestion, and the resulting mixture was subjected to polyacrylamide gel electrophoresis to obtain the desired 65 bp fragment.
（２）プラスミドｐＵＣ−ＢａｔＬ１の構築プラスミド
ｐＵｃ１８をＥｃｏＲＩおよびＫｐｎＩ消化して得たＤ
ＮＡ断片と１）で得た６５ｂｐ断片とをライゲーション
反応に付し、得られたライゲーション反応混合物で大腸
菌ＪＭ８３を形質転換した。アンピシリン耐性を示す形
質転換体を選択し、その形質転換体からプラスミドｐＵ
Ｃ−Ｂ ａｔＬｌを分離し、ＥｃｏＲＩ −ＰｖｕＩ
Ｉ、ＥｃｏＲＩ＼弁■、１並Ｒ１−影肪Ｉ、腹梗Ｉ−旦
μ■、Ｒｓａｌ−ＰｖｕＨ？ｌ’ｌ化により、所望のプ
ラスミドであることを確認した。(2) Construction of plasmid pUC-BatL1 D obtained by digesting plasmid pUc18 with EcoRI and KpnI
The NA fragment and the 65 bp fragment obtained in 1) were subjected to a ligation reaction, and the resulting ligation reaction mixture was used to transform Escherichia coli JM83. A transformant exhibiting ampicillin resistance was selected, and plasmid pU was extracted from the transformant.
C-B atLl was isolated and EcoRI-PvuI
I, EcoRI＼valve■, 1 normal R1-shadow fat I, abdominal infarction I-dan μ■, Rsal-PvuH? It was confirmed that the plasmid was the desired plasmid by ligation.
３）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ２の構築プラスミドｐＢ
ａｔ−５ＳＩをＲｓａ１部分消化（１箇所切断、反応条
件ニブラスミドＤＮＡ２００１ｉρ（約４５μｇ）に５
倍濃度のＲｓａｌｉ衝液［５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＣ（
ｐ［（８，０）、３５ｍＭ ＭｇＣ（！ｚ、２５Ｑ１Ｍ
ＮａＣＱ、３５ｘＭ ２−メルカプトエタノール、５
００μｇ／πＱウシ血清アルブミン］６０μＱと酵素３
μＱ（１５ユニツト）および蒸留水３９μＱを加えて３
７°Ｃで１時間保温）シ、次いで、ＥｃｏＲＩ７ｔ’！
化して得られた断片と、上記２）で得たプラスミドｐＵ
Ｃ−ＢａｊＬ２のＲｓａｌ −ＥｃｏＲＩ断片（６３ｂ
ｐ）とをライゲーション反応に付した。3) Construction of plasmid pBat-3S2 Plasmid pB
at-5SI was partially digested with Rsa1 (cleaved at one site, reaction conditions were added to Niblasmid DNA2001iρ (approximately 45 μg).
Double concentration Rsali buffer [50mM Tris-HCC (
p[(8,0), 35mM MgC(!z, 25Q1M
NaCQ, 35xM 2-mercaptoethanol, 5
00μg/πQ bovine serum albumin] 60μQ and enzyme 3
Add μQ (15 units) and 39 μQ of distilled water to
Incubate at 7°C for 1 hour), then EcoRI7t'!
The resulting fragment and the plasmid pU obtained in 2) above
Rsal-EcoRI fragment of C-BajL2 (63b
p) was subjected to a ligation reaction.
得られたライゲーション反応混合物で大腸菌ＭＭ２９４
を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体からプラ
スミドｐＢａｔ−３Ｓ２を分離した。The resulting ligation reaction mixture was used to incubate E. coli MM294.
was transformed, and plasmid pBat-3S2 was isolated from the ampicillin-resistant transformant.
より、目的のプラスミドであることを確認した。It was confirmed that the plasmid was the desired plasmid.
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ２の構築模式図を第２図にボ
す。A schematic diagram of the construction of plasmid pBat-3S2 is shown in FIG.
実施例４ 中間体プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３の構築
プラスミドｐＬＳ−ＤＩをＢａｍＨＩ消化した後、ＤＮ
ＡポリメラーセＩ（フレノウ断片）で平滑末端化処理し
た。ざらにＰｓｔＩ消化を行い、約１６Ｋｂｐの断片を
得た。Example 4 Construction of intermediate plasmid pBat-3S3 After plasmid pLS-DI was digested with BamHI, DN
The ends were blunt-ended with A polymerase I (Flenow fragment). Rough PstI digestion was performed to obtain a fragment of approximately 16 Kbp.
プラスミドｐＢａＬ−３Ｓ２をＰｓｔＩｉ肖化した後、
）Ｉｐａ１部分消化（１箇所切断、反応条件ニブラスミ
ドＤ Ｎ Ａ ２００μＱ（約１８μｇ）に５倍濃度の
几ハＩ緩衝１夜（：５Ｑ、ｖＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ！
（１）８７．５）、 ３５次Ｍ きメ７ｇｃ ρ２、５
Ｑ ＱｚＭ Ｋ ＣＱ、 ３５ｙＭ ２−メルカ
プトエタノール、５００μ９／ｍ（ｌウシ廂清アルブミ
ン］５０μＱと酵素５μＱ（１５ユニツト）を加えて３
７°Ｃで１．５時間保温）し、約１．５Ｋｂｐの断片を
得た。After transforming plasmid pBaL-3S2 into PstIi,
) Ipa1 partial digestion (one site cleavage, reaction conditions Niblasmid DNA 200μQ (about 18μg) and 5x concentration of HCl buffer overnight (:5Q, vM Tris-HCI!)
(1)87.5), 35th order M texture 7gc ρ2,5
Q
(Incubated at 7°C for 1.5 hours) to obtain a fragment of approximately 1.5 Kbp.
」二記で調製した約１．６Ｋｂｐおよび約１．５Ｋｂｐ
のＤＮＡ断片をライゲーションし、得られたライゲーシ
ョン反応混合物で大腸菌ＤＨＩを形質転換した。アンピ
シリン耐性の形質転換体からプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ
３を分離し、ＢａｍＨＩ（１箇所切断）、ＢａｍＨｌ
−ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＩ −３ａｌ Ｉ消化で目
的のプラスミドであることを確認した。About 1.6 Kbp and about 1.5 Kbp prepared in ``2.
The DNA fragments were ligated, and E. coli DHI was transformed with the resulting ligation reaction mixture. Plasmid pBat-3S from ampicillin-resistant transformants
Separate 3, BamHI (cut at one place), BamHI
-EcoRI and EcoRI -3al I digestion confirmed that the plasmid was the desired plasmid.
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３の構築模式図を第３図に示
す。A schematic diagram of the construction of plasmid pBat-3S3 is shown in FIG.
実施例５ ペプチドＣｄとバトロキソビンとの融合タン
パク質をコードする中間体プラスミドｐＢａｔ−３ＳＩ
Ｏの構築
１）プラスミドｐＣＬ ａＨｔｒｐ３ ｔのＥｃｏＲＩ
−Ｐｓｔ Ｉ断片の調製
ＥｃｏＲＩ −Ｐｓｔ Ｉ消化を行いペプチドＣｄをコ
ードする約０．８５Ｋｂｐをコードする断片を調製した
。Example 5 Intermediate plasmid pBat-3SI encoding a fusion protein of peptide Cd and batroxobin
Construction of O 1) EcoRI of plasmid pCL aHtrp3 t
- Preparation of Pst I fragment A fragment encoding approximately 0.85 Kbp encoding peptide Cd was prepared by EcoRI-Pst I digestion.
２）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３のＥｃｏＲＩ −Ｐｓ
ｔ １断片の調製
同様にしてプラスミドｐＢａｔ−８Ｓ３の約２．３５Ｋ
ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｐｓｔ Ｉ断片を調製した。2) EcoRI-Ps of plasmid pBat-3S3
Approximately 2.35K of plasmid pBat-8S3 was prepared in the same manner as the preparation of the t1 fragment.
A bp EcoRI-Pst I fragment was prepared.
３）ライゲーション
実質上、実施例２の方法に従って１）で調製した約０．
８５ＫｂｐのＤＮＡ断片を、２）で得た杓２゜３５Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片とライゲーシヨンし、得られたライゲー
ション溶液で大腸菌ＤＨＩを形質転換した。アンピシリ
ン耐性の形質転換体より、プラスミドｐＢａｔ−３ＳＩ
Ｏを分離して、ＥｃｏＲＩＰｓｔｌ、Ｃ１ａＩ−Ｐｓｔ
ｌ及びＨｉｎｄｌＩＩ−ＰｓｔＩｉ肖化により、目的の
プラスミドであることを確認した。3) Ligation substantially according to the method of Example 2 to about 0.0.
The 85 Kbp DNA fragment was 2.35 Kb obtained in 2).
The resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli DHI. From the ampicillin-resistant transformant, plasmid pBat-3SI
EcoRIPstl, C1aI-Pst
It was confirmed that the plasmid was the desired plasmid by transfection with PstI and HindlII-PstIi.
プラスミドｐＢａｔ−ｓｓ１０の構築模式図を第４図に
示す。A schematic diagram of the construction of plasmid pBat-ss10 is shown in FIG.
実施例６ 融合タンパク質発現プラスミド、ｐＢａｔ−
３ＳＩＯを保持する形質転換体による融合タンパク質の
発現
実施例５で調製したプラスミドｐＢａｔ−３ＳＩＯにて
、実施例１の方法に従って、Ｅ、ｃｏｌｉ ）（Ｂｌｏ
ｔ−１６ＦＥＲＭ ＢＰ−１８７２を形質転換し、ｐＢ
ａｔ−３ＳＩＯを保持する形質転換菌を以下の発現実験
に用いた。滅菌Ｌ −Ａ ｍｐ（アンピシリンを５０７
含むし一ブロス：Ｌ−寒天培地から寒天を除いたもの）
Ｍ！に植菌後、３０°Ｃで一晩培養し、菌液０．１ｓｆ
ｆを新しい滅菌Ｌ−Ａｍｐ３ｉりに値え継ぎ、３０°Ｃ
で培養した（前々培養）。約８時間後、０．５１Ｑの前
々培養液を５０１１！１２Ｌ−Ａｍｐに植え継ぎ、更に
一晩３０’Ｃで培養した（前培養）。Example 6 Fusion protein expression plasmid, pBat-
Expression of fusion protein by transformant carrying 3SIO Using the plasmid pBat-3SIO prepared in Example 5, E. coli ) (Blo
Transform t-16FERM BP-1872 and transform pB
A transformed bacterium harboring at-3SIO was used in the following expression experiment. Sterile L-A mp (ampicillin 507
Shiichi broth: L-agar medium with agar removed)
M! After inoculation, culture at 30°C overnight, and make 0.1sf of bacterial solution.
Transfer f to a new sterile L-Amp3i and heat at 30°C.
(previous culture). After about 8 hours, the 0.51Q pre-preculture was subcultured into 5011!12L-Amp, and further cultured overnight at 30'C (preculture).
前培養液２０吋を４００．ｍＣの滅菌本培養液［■１０
（＠濃度のＭ９保存液（ＮａｔＨＰＯ４・ｌ ２Ｈ−０
１５２９、ＫＨ，Ｐｏ、３０９、ＮａＣＱ ５９、ＮＨ
。20 inches of pre-culture solution to 400. Sterilized main culture solution of mC [■10
(@concentration M9 storage solution (NatHPO4・l 2H-0
1529, KH, Po, 309, NaCQ 59, NH
.
ＣＩ：ｌｌ０ｇ、Ｈ，Ｏｌｆ２、ＩＯＮ ＮａＯＨで
ｐＨ７４に調整）、■４０％グルコース、■０．５％カ
ザミノ酸、■塩酸チアミン１０ｘｙ／ｍｃ、０２００１
１１ＭＭｇＳＯ４、ｌ ＱｘＭ ＣａＣＬ、■Ａ ｍｐ
５１９／ ＭＱ ；■〜■を別々に滅菌した後、■の
溶液に、■をｌ／１０遣、■を１／８０量、■を１／２
００量、■を１／１００量、■を１／２００量加えて調
製］に植菌し３０’Ｃで培養した。約３時間培養後（０
゜Ｄ、、ｏ、＃０．６）、３−インドールアクリル酸（
ＩＡＡ）を最終ｌ農度１０γになるように本培養液に加
えた。１時間から３時間の間で菌液を採取した。CI:ll0g, H,Olf2, ION Adjusted to pH 74 with NaOH), ■40% glucose, ■0.5% casamino acid, ■thiamine hydrochloride 10xy/mc, 02001
11MMgSO4, l QxM CaCL, ■A mp
519/MQ; After sterilizing ■～■ separately, add ■ to the solution of ■, add 1/10 of ■, 1/80 amount of ■, and 1/2 amount of ■.
00 amount, 1/100 amount of ■, and 1/200 amount of ■] were inoculated and cultured at 30'C. After culturing for about 3 hours (0
゜D,, o, #0.6), 3-indole acrylic acid (
IAA) was added to the main culture solution to give a final yield of 10γ. Bacterial fluid was collected between 1 and 3 hours.
２０〜４０！（！の培養液を遠心分離にかけて、集菌し
た。集菌した菌体を光学顕微鏡で観察した結果、菌体内
に不溶化したタンパク塊（ｌ ｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏ
ｄｙ）が認められた。沈澱物に１／１０量のｌ Ｑ ｒ
ｌＭ ＰＢＳ ２５ｚＭ ＥＤＴＡ（ＮａＣｆ２８．
ＯＩＦ、ＫＣａＯ９２９、Ｎａ、ＨＰＯ，・１２Ｈ，０
２，９９、Ｋ Ｈ。20-40! The culture solution (!) was centrifuged to collect bacteria. As a result of observing the collected bacteria with an optical microscope, it was found that there were insoluble protein lumps (l nclusion bo
dy) was observed. Add 1/10 amount of l Q r to the precipitate
1M PBS 25zM EDTA (NaCf28.
OIF, KCaO929, Na, HPO, 12H, 0
2,99, K.H.
Ｐｏ、０．２９、ＥＤＴＡ（２Ｎａ）３．７３９、Ｎａ
ＯＨＯ，４５９、Ｈ，Ｏｌ（、ＩＯＮ ＮａＯＨでｐＨ
８，０に調整）を加えた。水冷下で懸濁後、１分間の超
音波処理を２回行った。３００００ｘｙて３０分間、４
°Ｃにおいて遠心分離した後、上清をＰＢＳ可溶性画分
として保４ｊシた。沈澱物については更に８Ｍ尿素、ｌ
００１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ２（ｐＨ８，０）２５肩
Ｍ ＥＤＴＡを培養液の１／１０ｆｆｉ加えて懸濁した
後、上記と同様の超音波処理を２回行った。３００００
Ｘ９．３０分間、４°Ｃて遠心分離した後、上清をＰ
ＢＳ不溶性画分として保存した。発現されたタンパク質
の発現効率及び分子量の測定は、レムリ（Ｌａｅｍｍｌ
ｉ）の方法（１２）に従って５ＤＳ−ＰＡＧＥで行った
。１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥの結果、ＰＢＳ不溶性画分に
ペプチドＣｄとバトロキソビンとの融合タンパク質が高
発現されていることが分かった。Po, 0.29, EDTA (2Na) 3.739, Na
OHO,459,H,Ol(,ION pH with NaOH
(adjusted to 8.0) was added. After suspending under water cooling, ultrasonication was performed twice for 1 minute. 30000xy for 30 minutes, 4
After centrifugation at °C, the supernatant was kept as the PBS soluble fraction. For the precipitate, add 8M urea, l
001M Tris-HCi2 (pH 8,0) 25M EDTA was added to 1/10ffi of the culture solution and suspended, and then the same ultrasonic treatment as above was performed twice. 30000
After centrifugation for 30 minutes at 4°C, the supernatant was
It was saved as a BS-insoluble fraction. Determination of expression efficiency and molecular weight of expressed proteins was performed using Laemmli
5DS-PAGE was performed according to method (12) of i). As a result of 15% 5DS-PAGE, it was found that the fusion protein of peptide Cd and batroxobin was highly expressed in the PBS-insoluble fraction.
またｐＢａｔ−３ＳＩＯを保持する形質転換体から発現
された融合タンパク質の量は約４０ｚｙ／（１培養液で
あることか高速液体クロマトグラフィーから明らかとな
った。Furthermore, it was revealed by high performance liquid chromatography that the amount of the fusion protein expressed from the transformant carrying pBat-3SIO was approximately 40zy/(1 culture solution).
実施例７ トロンビン切断部位を有し、ペプチドＣｄと
バトロキソビンとの融合タンパク質をコードしている発
現プラスミド、ｐＢａｔ−３Ｓ４９の構築
１）プラスミドｐＵＣ−ＢａｔＬ２の構築（１）オリゴ
ヌクレオチドのライゲーション実施例３、表１に記載の
オリゴヌクレオチド■〜■、［相］、■を用い、第Ｘ■
因子様アミノ酸配列（トロンビン切断部位）をコードす
るＤＮＡを調製した。Example 7 Construction of pBat-3S49, an expression plasmid having a thrombin cleavage site and encoding a fusion protein of peptide Cd and batroxobin 1) Construction of plasmid pUC-BatL2 (1) Oligonucleotide ligation Example 3, Using oligonucleotides ■ to ■, [phase], and ■ listed in Table 1,
DNA encoding a factor-like amino acid sequence (thrombin cleavage site) was prepared.
以下のようにして合成オリゴマーのライゲーションを行
った。Ligation of synthetic oligomers was performed as follows.
［Ａ］・オリコマ−■、■、■、■、■、■、■をそれ
ぞれＱ、５ｒ＋ｍｏｌ混合し、エタノール沈澱を行った
。乾燥後、キナーゼ処理に付し、更にライケー７：Ｉン
処理を行った。[A] Oricomer - Q, 5r+mol of each of ■, ■, ■, ■, ■, ■, and ■ were mixed, and ethanol precipitation was performed. After drying, it was subjected to kinase treatment and further treated with Lyke 7:I.
［Ｂ］：オリゴマ−［相］、■をそれぞれＱ、５ｎｍｏ
ｌ混合してエタノール沈澱に付し、乾爆後、キナーゼ処
理を行った。[B]: Oligomer [phase], ■ is Q and 5nmo, respectively.
The mixture was mixed with ethanol, subjected to ethanol precipitation, and after dry bombing, was subjected to kinase treatment.
［Ｃ］：ＣＡＩの溶液と［Ｂ］の溶液を混合し、更に１
時間ライゲージクン処理を行った後、ＥｃｏＲＩ消化に
付した。その反応溶液を１７．５％のポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動にかけ所望の、１０４ｂｐの断片を精製
した。[C]: Mix the CAI solution and [B] solution, and then add 1
After ligature treatment for an hour, the mixture was subjected to EcoRI digestion. The reaction solution was subjected to 17.5% polyacrylamide gel electrophoresis to purify the desired 104 bp fragment.
（２）オリゴマーとプラスミドのライゲーションｐＵｃ
１８を制限酵素１並ＲＩおよびＫ ｐｎ Ｉ消化に付し
、ＥｃｏＲＩ ７Ｋｐｎｌ断片を得た。この断片と、１
）、［Ｃ］で調製した１０４ｂｐ断片とをライゲーショ
ンした。ライゲーション溶液で大腸菌ＪＭ８３を形質転
換し、アンピンリン耐性の形質転換体からプラスミドｐ
ＵＣ−ＢａｔＬ２を分離しプラスミドが得られているこ
とを確認した。(2) Ligation of oligomer and plasmid pUc
18 was subjected to restriction enzyme 1 RI and K pn I digestion to obtain an Eco RI 7Kpnl fragment. This fragment and 1
) and the 104bp fragment prepared in [C] were ligated. E. coli JM83 was transformed with the ligation solution, and plasmid p was extracted from the ampinrin-resistant transformant.
It was confirmed that UC-BatL2 was isolated and a plasmid was obtained.
２）プラスミドｐＵＣ−Ｂａｔｌの構築実施例４で得た
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３のＲｓａｌ −ＢａｍＨＩ
断片（約０．６Ｋｂｐ）と、上記１）で得たｐＵＣ−Ｂ
ａｔＬ２のＲｓａ１部分消化（１箇所切断、反応条件ニ
ブラスミドＤＮＡ７５μＱ（約９０１１ｇ）にＩＯ（＠
濃度のＲ３ａｌｔｌ衝液［１００＋ｎＭＴｒｉｓ−ＨＣ
Ｃ（ｐＨ８，０）、７０ｍ〜ｉ ＭｇＣＬ、５００ｍＭ
ＮａＣＣ１７０ｍＭ２−メルカプトエタノール、Ｉｍｇ
／ｍＱウシ血清アルブミン］１５μυとＲｓａ１２μｃ
（１０ユニツト）および蒸留水５８μＣを加えて３７°
Ｃで４０分間保、晶）シ、得られた断片をＢａｍＨ１消
化して得た断片（約２．７Ｋｂｐ）とライゲーションし
た。ライゲー／ヨン反応の反応混合物で大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換し、アンピシリン耐性の形質転換体からプ
ラスミドｐＵＣＢａｔｌを分離し、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ。2) Construction of plasmid pUC-Batl Rsal-BamHI of plasmid pBat-3S3 obtained in Example 4
Fragment (approximately 0.6 Kbp) and pUC-B obtained in 1) above
Rsa1 partial digestion of atL2 (one site cleavage, reaction conditions Niblasmid DNA 75 μQ (approximately 9011 g) and IO (@
Concentration of R3altl solution [100+nM Tris-HC
C (pH 8,0), 70m~i MgCL, 500mM
NaCC 170mM 2-mercaptoethanol, Img
/mQ bovine serum albumin] 15μυ and Rsa12μc
(10 units) and 58 μC of distilled water to 37°
The resulting fragment was incubated at C for 40 minutes and ligated with a fragment (approximately 2.7 Kbp) obtained by BamH1 digestion. E. coli MM29 in the reaction mixture of Ligey/Yon reaction
4 was transformed, plasmid pUCBatl was isolated from the ampicillin-resistant transformant, and HindIII, H
indIII-BamHI.
ヒＸｈｏ［−Ｐｖｕｌｌｔ肖化で目的のプラスミドであ
ることを確認した。The desired plasmid was confirmed by incubation with human Xho[-Pvullt.
３）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ４９の構築プラスミドｐ
Ｂａｔ−３ＳＩＯのＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨＩ断片（約
２．４Ｋｂｐ）とプラスミドｐＵ Ｃ−Ｂ ａｔ １の
１並Ｒ［−堕Ｈｌ断片（約６５０ ｂｐ）をそれぞれ別
個に１し、ライゲーションした。ライゲーションした溶
液で大腸菌ＭＭ２９４を形質転換し、アンピシリン耐性
の形質転換体よりプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ４９を分離
して、ＥｃｏＲＩ −ＢａｍＨミドが得られていること
を確認した。3) Construction of plasmid pBat-3S49 Plasmid p
The EcoRI-BamHI fragment (approximately 2.4 Kbp) of Bat-3SIO and the 1-parallel R[-degraded Hl fragment (approximately 650 bp) of plasmid pUC-Bat 1] were each separately combined and ligated. Escherichia coli MM294 was transformed with the ligated solution, and plasmid pBat-3S49 was isolated from the ampicillin-resistant transformant, and it was confirmed that EcoRI-BamH mido was obtained.
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ４９の構築模式図を第５図に
示す。A schematic diagram of the construction of plasmid pBat-3S49 is shown in FIG.
実施例８ トロンビン切断部位を有するＬＨ蛋白とバト
ロキソビンとの融合タンパク質をコードする発現プラス
ミドｐＢａｔ−３Ｓ ５０、並びに、トロンビン切断部
位を有する、ＬＨ蛋白、ペプチドＣｄおよびバトロキソ
ビンの融合タンパク質をコードする発現プラスミドｐＢ
ａｔ−３Ｓ５１の構築
１）プラスミドｐＢａｔ−ＳＳ４９のＥｃｏＲＩ −Ｐ
ｓｔ ｌ断片の調製
ｐＢａｔ−３Ｓ４９のＥｃｏＲＩ −Ｐｓｔ ｌ断片（
約２３Ｋｂｐ）を調製した。Example 8 Expression plasmid pBat-3S 50 encoding a fusion protein of LH protein and batroxobin having a thrombin cleavage site, and expression plasmid pB encoding a fusion protein of LH protein, peptide Cd, and batroxobin having a thrombin cleavage site
Construction of at-3S51 1) EcoRI-P of plasmid pBat-SS49
Preparation of stl fragment EcoRI-Pstl fragment of pBat-3S49 (
Approximately 23 Kbp) was prepared.
２）プラスミドｐＬＳ−Ｔ２及びｐＣＬ ａＨｔｒｐ３
ｔのＥｃｏＲｌ −Ｐｓｔ Ｔ断片の調製
１）ＬＳ−Ｔ２をＥｃｏＲＩで部分消化（１箇所切断、
反応条件ニブラスミドＤＮＡ４０μｇ（約４０μｇ）に
５倍を農度のＥｃｏＲＩ緩術液（前述）４０μρと酵素
２μ１２（５０ユニツト）および蒸留水１１８μρを加
えて３７°Ｃで１０分間保温）した後、Ｐｓｔｌ消化を
行い、所望の断片（約１．０６Ｋｂｐ）を調製した。2) Plasmids pLS-T2 and pCL aHtrp3
Preparation of EcoRl-Pst T fragment of t 1) Partial digestion of LS-T2 with EcoRI (one site cut,
Reaction conditions 40 μg of Niblasmid DNA (approximately 40 μg) was mixed with 40 μρ of EcoRI relaxation solution (described above), 2 μ12 of enzyme (50 units), and 118 μρ of distilled water and kept at 37°C for 10 minutes), followed by Pstl digestion. The desired fragment (approximately 1.06 Kbp) was prepared.
他方、プラスミドｐＣＬ ａＨｔｒｐ３ ｔ（欧州特許
出願公開公報第０２０６７６９号公報参照）をＥｃ。On the other hand, plasmid pCL aHtrp3 t (see European Patent Application Publication No. 0206769) was converted to Ec.
Ｒ１部分消化〔１箇所切断、反応条件・プラスミドＤ
Ｎ Ａ ４０ ｕ Ｃ（約８μ９）に５倍濃度のＥｃｏ
ＲＴ緩衝液［５０ａＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（１）Ｈ７，
５）、３５ｊ１ＭＭ ｇ ＣＱ ｔ、２５０１Ｍ Ｎａ
ＣＱ、３５ｚＭ２−メルカプトエタノール、５００μ２
／、１ρウン血清アルフミン１４０μρと酵素２μρ（
５０ユニツト）および蒸留水１１８μＱを加えて３７°
Ｃて１分間保温〕した後、Ｐｓｔｌｉｆｌ化を行いＣｄ
−ＬＨをコートする約１．０５ Ｋｂｐ ＥｃｏＲＩ
−Ｐｓｔ ｌ断片を調製した。R1 partial digestion [1 site cleavage, reaction conditions/Plasmid D
5x concentration of Eco in N A 40 uC (approximately 8μ9)
RT buffer [50aM Tris-HCC(1)H7,
5), 35j1MM g CQ t, 2501M Na
CQ, 35zM2-mercaptoethanol, 500μ2
/, 1ρun serum albumin 140μρ and enzyme 2μρ(
50 units) and 118 μQ of distilled water and boil at 37°.
After incubating for 1 minute at C, Pstliflization was performed and Cd
- Approximately 1.05 Kbp EcoRI coats LH
-Pstl fragment was prepared.
３）ライゲーション
１）で得た約２．３ＫｂｐのＥｃｏＲＩ −Ｐｓ口断片
と、２）で得た１、０６Ｋｂｐの断片をライゲーション
し、ライゲーション溶液で大腸菌ＭＭ２９４を形質転換
し、プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ５０を構築した。他方、
１）で得た約２．３Ｋｂｐ断片と２）で得た約１．０５
Ｋｂｐ断片をライゲーションし、同様に大腸菌ＭＭ２９
４を形質転換することにより、プラスミドｐＢａｔ−３
Ｓ５１を構築した。それぞれのアンピシリン耐性の形質
転換体よりプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ５０およびｐＢａ
ｔ−３Ｓ５１を分離して、Ｘｈｏｌ、ＥｃｏＲ１−Ｐｓ
目、Ｈｉｎｄ［−Ｐ ｓｔＩ及びＣ１ａｒ−Ｐｓｔｌｉ
Ｍ化に付し、目的のプラスミドであることを確認した。3) Ligation The approximately 2.3 Kbp EcoRI-Ps fragment obtained in 1) and the 1.06 Kbp fragment obtained in 2) were ligated, and E. coli MM294 was transformed with the ligation solution to construct plasmid pBat-3S50. did. On the other hand,
The approximately 2.3 Kbp fragment obtained in 1) and the approximately 1.05 Kbp fragment obtained in 2)
Kbp fragment was ligated and E. coli MM29
Plasmid pBat-3 by transforming 4
S51 was constructed. Plasmids pBat-3S50 and pBa were obtained from each ampicillin-resistant transformant.
Separate t-3S51 and extract Xhol, EcoR1-Ps
eyes, Hind[-P stI and C1ar-Pstli
It was confirmed that the plasmid was the desired plasmid.
プラスミドｐＢａｔＳＳ５０およびｐＢａｔ−ＳＳ５１
の構築模式図を第６図に示す。Plasmids pBatSS50 and pBat-SS51
A schematic diagram of the construction is shown in Figure 6.
塞旌ＦＩ９ トロンビン切断部位を有する融合タンパ
ク質発現プラスミド、ｐＢａｔ−３Ｓ４９、ｐＢａｔ−
３Ｓ５０およびｐＢａｔ−３Ｓ５１を保持する大ｇ！ｊ
ｊ菌からのバトロキソビンの発現ｌ）形質転換および発
現
実施例１記戦の方法に従って標題の各プラスミドで大腸
菌ＨＢＩＯＩ〜１６を形質転換し、得られた各形質転換
体を実施例６と同様にして培養し、実施例６記載のごと
く処理してＰＢＳ可溶性画分とＰＢＳ不溶性画分を得た
。１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥを行い、タンパク質の発現効
率及び分子量の１則定を行った。その結果、ｐＢａＬ−
３Ｓ４９、ｐＢａｔ−３Ｓ５０またはｐＢａｔ−３Ｓ５
１を保持する大腸菌のＰＢＳ不溶性画分に、バトロキソ
ビンの融合タンパク質が高発現されていることを認めた
。A fusion protein expression plasmid with a thrombin cleavage site, pBat-3S49, pBat-
Large g holding 3S50 and pBat-3S51! j
Expression of batroxobin from J bacterium l) Transformation and expression E. coli HBIOI-16 was transformed with each of the titled plasmids according to the method described in Example 1, and each of the obtained transformants was transformed in the same manner as in Example 6. The cells were cultured and treated as described in Example 6 to obtain a PBS-soluble fraction and a PBS-insoluble fraction. 15% 5DS-PAGE was performed to determine the protein expression efficiency and molecular weight. As a result, pBaL-
3S49, pBat-3S50 or pBat-3S5
It was observed that the batroxobin fusion protein was highly expressed in the PBS-insoluble fraction of E. coli harboring 1.
また、それらの発現量はｐＢａｔ−３ＳＩＯの時と同様
なレベル（約４０ｏ／（培養液）であった。Moreover, their expression levels were at the same level as in pBat-3SIO (approximately 40o/(culture solution)).
２）形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉ）Ｉ Ｂ １０１ １６／
ｐＢａｔＳＳ４９、Ｅ、ｃｏｌｉＨＢ １０１−１６／
ｐＢａｔ −３Ｓ５ＱまたはＥ、ｃｏｌｉＨＢｌｏｌ
１６／ｐＢａｔＳＳ５１から発現された融合タンパク
質の粗精製実施例６と同様に各形質転換体をそれぞれ別
個３に培養（本培養液４０（ＭりＬ、３−インドールア
クリル酸を添加した後、２．５時間で全菌液を１２００
０Ｘｉ＋、１０分間、４°Ｃの遠心分離にかけて集菌し
た。集菌した菌体を光学顕微鏡で観察した結果、菌体内
に不溶化したタンパク塊（Ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｂｏｄ
のか認められた。沈澱物にｌｏｍＭＰＢＳ−２５ｍＭＥ
ＤＴＡ（ｐＨ８，０）を８ｘＣ加え、水冷下で懸濁後、
１分間の超音波処理を２回行った。2) Transformant E, coli) I B 101 16/
pBatSS49, E, coliHB 101-16/
pBat-3S5Q or E, coliHBlol
16/Rough purification of fusion protein expressed from pBatSS51 In the same manner as in Example 6, each transformant was cultured separately (main culture solution 40 (ML), after adding 3-indole acrylic acid, 2. Total bacterial solution 1200 in 5 hours
Bacteria were collected by centrifugation at 0Xi+ for 10 minutes at 4°C. As a result of observing the collected bacterial cells with an optical microscope, it was found that there were insoluble protein lumps inside the bacterial cells.
was recognized. LomMPBS-25mME to the precipitate
Add DTA (pH 8,0) at 8xC and suspend under water cooling.
Ultrasonication was performed twice for 1 minute.
３００００ Ｘ９．２０分間、４°Ｃの遠心後、沈澱物
に５０％（ｖ／ｖ）グリセリン水溶液をｌ０ＩＱ加えて
上記と同様に超音波処理した。２００００Ｘｙ、２０分
間、４°Ｃの遠心の後、沈澱物に上記のグリセリン水溶
液を加え、同様に洗浄した。２００００×９．２０分間
、４°Ｃの遠心分離の後、沈澱物に８Ｍ尿素−１００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣＣ（ｐＨ８，０）２５ｍＭ ＥＤＴ
Ａ（ｐＨ８，０）Ｕ液４ｍ（ｌを加えて上記と同様に超
音波処理し、３００００Ｘｙ、２０分間、４°Ｃの遠心
分離により、上清を得た。この上清を、融合タンパク質
の粗精製品として保存した。After centrifugation at 30,000×9.20 minutes at 4°C, 10IQ of 50% (v/v) aqueous glycerin solution was added to the precipitate and sonicated in the same manner as above. After centrifugation at 20,000Xy for 20 minutes at 4°C, the above glycerin aqueous solution was added to the precipitate and washed in the same manner. After centrifugation at 20,000
M Tris-HCC (pH 8,0) 25mM EDT
Add 4 ml (l) of A (pH 8,0) U solution, perform sonication in the same manner as above, and centrifuge at 30,000Xy for 20 minutes at 4°C to obtain a supernatant. It was stored as a crude product.
実施例１０ トロンビンによる融合タンパク質の消化
によるバトロキソビンの分離
ｌ）方法
実施例９．２）で調製した融合タンパク質の粗精製品５
μｇに、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−１１（１！ （ｐＨ８０
）中トロンビン５〜８μρ（ｌユニ、ｌ−／μｅ）と精
製水２７〜３０μｇを加え、全量を４０μＱとした。大
量に融合タンパク質を処理するときは、同じ割合で粗精
製品、トロンビン及び精製水を混ぜ合わせればよい。３
７°Ｃて杓６時間反応させた後、５ＤＳ−ＰＡＧＥによ
ってトロンビンによる融合タンパク質の消化の有無を調
べた。Example 10 Separation of batroxobin by digestion of the fusion protein with thrombin l) Crude purified product of the fusion protein prepared in Method Example 9.2) 5
μg, 10mM Tris-11 (1! (pH 80
) 5 to 8 μρ (l uni, l−/μe) of thrombin and 27 to 30 μg of purified water were added to make the total amount 40 μQ. When processing a large amount of fusion protein, it is sufficient to mix the crude product, thrombin, and purified water in the same proportions. 3
After reacting at 7°C for 6 hours, the presence or absence of digestion of the fusion protein by thrombin was examined by 5DS-PAGE.
２）トロンビンの使用量および尿素濃度の影響プラスミ
ドｐＢａｔ−３Ｓ４９を用いて発現させた粗精製融合タ
ンパク質を、種々の濃度の頗素の存在下で上記ｌ）の方
法に従ってトロンビン消化し、トロンビンの量および尿
素、８度の両者か消化効果に及ぼす影響を検討した。尿
素濃度は８Ｍ、４Ｍ、２ＭおよびＩＭである。2) Influence of the amount of thrombin used and urea concentration The crudely purified fusion protein expressed using plasmid pBat-3S49 was digested with thrombin according to the method of 1) above in the presence of various concentrations of The influence of both urea and 8 degrees on the digestive effect was investigated. Urea concentrations are 8M, 4M, 2M and IM.
その結果、２Ｍ尿素の存在下では、トロンビンを１０ユ
ニ、ト用いた場合に融合タンパク質の消化が認められた
。As a result, in the presence of 2M urea, digestion of the fusion protein was observed when 10 units of thrombin was used.
１Ｍ１ｉ素の存在下では、トロンビンを１ユニ。In the presence of 1M1i element, 1 unit of thrombin.
ト用いるだけて融合タンパク質の消化が認められ、１０
ユニツト用いると融合タンパク質は完全に切断された。Digestion of the fusion protein was observed just by using
When using Unit, the fusion protein was completely cleaved.
この結果に基き、以後のトロンビンによる消化反応は実
施例１Ｏ記載の融合タンパク質粗精製品５μＱ、トロン
ビン５〜８μ１２（１ユニツト／μのおよび精製水２７
〜３０μｇの割合で行った。ｐＢａｔＳＳ１００ロンビ
ン消化部位を持たない融合ポリペプチドを含有するプラ
スミド）、ｐＢａｔＳＳ４９およびｐＢａｔ−３Ｓ５１
を含有する形質転換体から得られた融合タンパク質を、
それぞれトロンビンて処理した結果、血液凝固第Ｘ■因
子由来のアミノ酸配列を含むｐＢａｔ−３Ｓ４９または
５１を含有する形質転換体から得られた融合タンパク質
のみに、トロンビンで消化された断片か観察された。Based on this result, the subsequent digestion reaction with thrombin was performed using 5μQ of the crude fusion protein product described in Example 1O, thrombin 5-8μ12 (1 unit/μ), and purified water 27μQ.
~30 μg was used. pBatSS100 (a plasmid containing a fusion polypeptide without a rhombin digestion site), pBatSS49 and pBat-3S51
The fusion protein obtained from the transformant containing
As a result of treatment with thrombin, thrombin-digested fragments were observed only in the fusion proteins obtained from transformants containing pBat-3S49 or 51, which contain the amino acid sequence derived from blood coagulation factor XI.
３）トロンビン消化により生成したタンパク質のアミノ
酸配列の決定
実施例９．２）に記載した方法によって大腸菌て発現さ
れた融合タンパク質（ｐＢａｔ −Ｓ Ｓ ４９て形質
転換された形質転換体により発現されたちの）を上記１
）のごとくにしてトロンビンによる切断反応に付し、得
られた反応ｌ昆合物を１５％５ＤＳＰＡＧＥにかけた。3) Determination of the amino acid sequence of the protein produced by thrombin digestion. ) as above 1
), and the resulting reaction mixture was subjected to 15% 5DSPAGE.
目的のタンパク質を含有するケル部分を切り出し、マッ
クスイールド（〜１ａｘＹ １ｅｌｄ）（Ａ Ｔ Ｔ
Ｏ？ｆ製）を用いてケルからタンパク質を溶出させた。Cut out the Kel part containing the protein of interest and extract it from Max Yield (~1axY 1eld) (A T T
O? The protein was eluted from the cell using a gel solution (manufactured by F.F.).
溶出液を濃縮した後、高速液体クロマトグラフィ（ＹＭ
ＣＡＰ−３０２カラム、検出条件は２１０ｎｍ、流速１
、０７ｒＱ／ ｍｉｎ、溶出液０１％トリフルオロ酢
酸（ＴＦＡ）を含む１０６０％アセトニトリル）を行い
、メインピークを分取した。約２０μ９／ｒ！Ｑの溶出
成約２ｍＱをＮ末端アミノ酸配列の決定に用いた。試料
全量をシークエンサー（Ａ ｐｐｌ ｉｅｄ Ｂ ｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ社製 気相シークエンサー）の反応フィ
ルター上で乾固し、エドマン反応（１３）を行った。シ
ークエンサーから得られたＰＴＨ（フェニルチオヒダン
トイン）−アミノ酸溶液を乾燥後、アセトニトリル溶液
中した。液体クロマトグラフ法を用いてアセトニトリル
溶液中のＰ Ｔ Ｈ−アミノ酸を同定した。その結果、
Ｎ末端からバリンーイソロイシンーグリシンーグリンン
ーアスパラギン酸と並んでいることが明らかとなった。After concentrating the eluate, high performance liquid chromatography (YM
CAP-302 column, detection conditions are 210 nm, flow rate 1
The main peak was fractionated. Approximately 20μ9/r! Approximately 2 mQ of the eluted Q was used to determine the N-terminal amino acid sequence. The entire sample was transferred to a sequencer (A pplied bio
The mixture was dried on a reaction filter of Systems (vapor phase sequencer) and subjected to Edman reaction (13). The PTH (phenylthiohydantoin)-amino acid solution obtained from the sequencer was dried and then poured into an acetonitrile solution. PTH-amino acids were identified in acetonitrile solution using liquid chromatography. the result,
It was revealed that the sequence is valine-isoleucine-glycine-glycine-aspartic acid from the N-terminus.
この配列は、天然に存在する成熟、バトロキソビンと同
一である。即ち、トロンビンにより特異的に血液凝固筒
ＸＩ因子由来のアミノ酸配列が認識されて、消化された
ことを意味する。このようにして決定された発現タンパ
ク質のバトロキソビンのＮ末端付近のアミノ酸およびＤ
ＮＡ配列を第９図に示す。This sequence is identical to naturally occurring mature batroxobin. This means that the amino acid sequence derived from blood coagulation factor XI was specifically recognized and digested by thrombin. Amino acids and D near the N-terminus of batroxobin in the expressed protein determined in this way
The NA sequence is shown in FIG.
実施例１１ 大腸菌宿主により発現されたタンパク質の
りホールディングによる活性化上記実施例１０で消化し
て得た、バトロキソビンをリホールディングした。Example 11 Activation by Paste Folding of a Protein Expressed by an E. coli Host Batroxobin obtained by digestion in Example 10 above was refolded.
１）リホールディング用タンパク質の調製トロンビンに
よる切断反応に付した融合タンパク質溶液０．８ｊ！ｆ
２を１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（
２ｍｍ厚）にかけてタンパク質を分離した。目的のタン
パク質を含有するゲル部分を切り出し、約２ｍｍ角に切
り刻み、マックス・イールドを用いて電気泳動的にゲル
からタンパク質を溶出させた。回収した溶出液に４倍量
の冷アセトンを加えて一８０°Ｃで３０分間静置した。1) Preparation of protein for refolding 0.8j of fusion protein solution subjected to cleavage reaction with thrombin! f
2 on 15% 5DS-polyacrylamide gel electrophoresis (
2 mm thick) to separate proteins. The gel portion containing the protein of interest was cut out, cut into pieces of about 2 mm square, and the protein was electrophoretically eluted from the gel using Max Yield. Four times the volume of cold acetone was added to the collected eluate, and the mixture was allowed to stand at -80°C for 30 minutes.
２００００ｘ９．２０分間、−１０°Ｃで遠心分離した
後、沈澱物を８０％アセトンで洗浄し、真空乾燥した後
、８Ｍ尿素−１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ２２５ｍＭ
ＥＤＴＡ（ｐ）１８．０）混液に溶解してリホールディ
ング用タンパク質とした。After centrifugation at -10 °C for 20,000 x 9.20 min, the precipitate was washed with 80% acetone, vacuum dried, and then mixed with 8M urea-100mM Tris-HCf225mM
It was dissolved in a mixture of EDTA (p) 18.0) to obtain a protein for refolding.
２）リホールディング 以下のＡ−Ｅの各方法でリホールディングを行つた。2) Reholding Refolding was performed using each of the following methods A to E.
方法−Ａ
上記リホールディング用タンパク質をＡ ２ Ｂ ６０
１になるよう、アルカリｙｔ液（５０ｍＭＫＨ。Method-A The above refolding protein is A 2 B 60
1, add alkaline YT solution (50mMKH.
１）Ｏ，，５０ｍＭ ＮａＣｆｆ、１ｍＭＥＤＴΔ、
ｐＨｌ０７、尿素を約０．８Ｍ含有）に加えた。室温で
１時間静置後、ＩＮ ＨＣρを加えてｐＨ７とした。1) O,, 50mM NaCff, 1mM EDTA,
pH 107, containing about 0.8M urea). After standing at room temperature for 1 hour, IN HCρ was added to adjust the pH to 7.
更に室温で１時間静置後、ウシ血清アルブミンを最終濃
度０１％になるように加え、得られた混合物を１０ｍＭ
ＰＢＳ−２５ｍＭ ＥＤＴＡ（＋）Ｈ７）に対して透
析した。４°Ｃで一晩透析を行った後、透析内液のバト
ロキソビンを下記４）の方法によりう／オイムノアッセ
イ（ＲＩ Ａ）で測定した。After further standing at room temperature for 1 hour, bovine serum albumin was added to a final concentration of 01%, and the resulting mixture was diluted to 10mM.
Dialyzed against PBS-25mM EDTA(+)H7). After performing dialysis overnight at 4°C, batroxobin in the dialyzed fluid was measured by immunoassay (RIA) according to method 4) below.
方法−Ｂ（混合ジスルフィド法） 上記リホールディング用タンパク質をＡ ｔｓ。Method-B (mixed disulfide method) The above refolding protein is Ats.
０．０２になるように緩衝液（５０ｍＭ Ｔ ｒｉｓＨ
ＣＱ、５０ｍＭ ＣａＣＱｘ、ｐＨ９，０、使用前に真
空下で１５分間脱気した後、窒素を数分間吹き込んだち
の）に加えた。更にシスティン（Ｃｙｓ）を最終濃度３
ｍＭになるように加えた後、室温で２０時間静置した。Add buffer (50mM TrisH) to 0.02
CQ, 50 mM CaCQx, pH 9,0, was degassed under vacuum for 15 minutes before use, followed by a few minutes of nitrogen bubbling). Furthermore, cysteine (Cys) was added to the final concentration of 3.
After adding the solution to a concentration of mM, it was allowed to stand at room temperature for 20 hours.
氷酢酸を加えてｐＨを４に調整し、室温で３時間静置し
た。ウシ血清アルブミンを最終濃度０川％になるように
加え、１０ｍＭＰＢＳ２５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）
に対して透析した。The pH was adjusted to 4 by adding glacial acetic acid, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours. Bovine serum albumin was added to a final concentration of 0% and mixed with 10mM PBS 25mM EDTA (pH 7).
Dialyzed against.
・１°Ｃで一晩透析を行った後、透析内液のバトロキソ
ビンを下記４）の方法によりＲＩＡで測定した。- After performing dialysis overnight at 1°C, batroxobin in the dialyzed fluid was measured by RIA according to method 4) below.
方法−〇
上記リホールディング用タンパク質をＡ ｔｅｏ−〇、
２になるように緩衝液（ｌｏｏｍＭ Ｔｒｉｓ、 ２
Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ還元型グルタチオン、１ｍ
Ｍ酸化型グルタチオン、ｐＨ８，５）に加えた後、室温
で２０時間静置した。氷酢酸を加えてｐＨ６に調整し、
室温で３時間静置した。ウシ血清アルブミンを最終濃度
０．１％になるように加えて１０ｍＭ ＰＢＳ−２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ７）に対して透析した。４°Ｃて一
晩透析した後、透析内液のハトロキソビンを下記４）の
方法によりＲＩＡで１制定した。Method-〇The above protein for refolding is Ateo-〇,
Buffer solution (roomM Tris, 2
M guanidine hydrochloride, 10mM reduced glutathione, 1m
After adding M oxidized glutathione (pH 8.5), the mixture was left standing at room temperature for 20 hours. Add glacial acetic acid to adjust pH to 6,
The mixture was allowed to stand at room temperature for 3 hours. Bovine serum albumin was added to a final concentration of 0.1% in 10mM PBS-25m.
Dialyzed against MEDTA (pH 7). After overnight dialysis at 4°C, hatroxobin in the dialysis solution was determined using RIA using the method described in 4) below.
方法−Ｄ（Ｓ−スルホン化法）
上記リホールディング用タンパク質をＡ、８ｏ−０．０
５から０．２になるように緩衝液（２５ｍＭホウ酸ナト
リウム、２Ｍ尿素、５ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ還元型グ
ルタチオン、１ｍＭ酸化型グルタチオン、ｐＨ８，５）
に加えた後、室温で約２０時間静置した。ウシ血清アル
ブミンを最終濃度Ｏ８１％になるように加えて５０ｍＭ
ＮＨ３ＨＣＯバｐＨ７゜８）に対して透析した。４°
Ｃで一晩透析を行った後、透析内液のバトロキソビンを
下記４）の方法によりＲＩＡで測定した。Method-D (S-sulfonation method) The above refolding protein is A, 8o-0.0
Buffer (25mM sodium borate, 2M urea, 5mM EDTA, 2mM reduced glutathione, 1mM oxidized glutathione, pH 8.5)
After adding it to the solution, it was left to stand at room temperature for about 20 hours. Bovine serum albumin was added to a final concentration of 81% O to 50mM.
Dialysis was performed against NH3HCO (pH 7.8). 4°
After performing dialysis overnight with C, batroxobin in the dialyzed fluid was measured by RIA according to method 4) below.
方法−Ｅ（希釈法）
上肥りホールディング用タンパク質を０．５〜２５ｕ９
／ｘ（ｌになるように希釈緩衝液（５０ｍＭＴｒｉｓ
ｐＨ８，０１２０％グリセロール、１５０ｍＭＮａＣｆ
ｆ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴ、Ｏｌ ｍ
ｇ／ ｍ（ｌウシ血清アルブミン）に加えた後、室温で
２０時間静置した。次いで、緩衝液のバトロキソビンを
下記４）の方法によりＲＩＡで測定した。Method-E (dilution method) 0.5 to 25u9 of protein for upper fat holding
/x (l) of dilution buffer (50mM Tris
pH 8,0120% glycerol, 150mM NaCf
f, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, Ol m
g/m (l bovine serum albumin) and then allowed to stand at room temperature for 20 hours. Next, batroxobin in the buffer solution was measured by RIA according to method 4) below.
上記Ａ−Ｅの各方法によるリホールディングの結果を表
２に示す。Table 2 shows the results of refolding by each method of A to E above.
表 ２ リホールディング方法にょろりホールディング
効率の比較
Ａ ６．２８９
０．０１３Ｂ １．６
０．０１６Ｃ４１，８０，０４２
Ｄ １．５８
０．００１６Ｅ Ｏ，９２０，０３
表２から蛋白質のりホールディング法としては、各種文
献既知の方法にてリホールディングを行った場合におい
ては、最高で約０．０４％の効率でバトロキソビンか得
られた。更に大量のバトロキソビンを得るために以下の
様な方法でリホールディングの条件を検討した。Table 2 Comparison of refolding method Nyorori holding efficiency A 6.289
0.013B 1.6
0.016C41,80,042D 1.58
0.0016E O,920,03 As shown in Table 2, when refolding was carried out using methods known in various literature as a protein paste folding method, batroxobin was obtained with a maximum efficiency of about 0.04%. In order to obtain a larger amount of batroxobin, refolding conditions were investigated using the following method.
３）リホールディング条件の検討
２）で示したりホールディング方法Ｅの条件で新たなり
ホールディング方法を検討した。3) Examination of reholding conditions A new holding method was examined under the conditions of holding method E as shown in 2).
−船釣にリホールディング効率に影響を与える要因とし
ては、ａ）異種タンパク質の純度及び濃度、ｂ）ｐＨ，
ｃ）溶液のイオン成分、ｄ）チオール化合物の存在の有
無などが挙げられる。- Factors that affect refolding efficiency in boat fishing include a) purity and concentration of foreign protein, b) pH,
Examples include c) ionic components of the solution, and d) presence or absence of thiol compounds.
まず、ｄ）のチオール化合物の検討を種々行ったところ
、Ｅ法にてチオール化合物（還元剤）を除くことにより
、リホールディング効率は約２３倍上昇した（０．７０
％）。First, we investigated various thiol compounds in d) and found that by removing the thiol compound (reducing agent) using method E, the refolding efficiency increased approximately 23 times (0.70
%).
さらに上記のａ）〜Ｃ）について検討した。Furthermore, the above a) to C) were studied.
まず、タンパク質量をＩＡｔａ。＝５００μｙ／、ｗ（
１として計算し、異種タンパク質濃度を変えて、ＤＴＴ
を含まない緩衝液を用いてリホールディングを行った結
果、至適濃度は２．５μ９／屑ρであった。First, the protein amount is IAta. =500μy/,w(
1 and varying the heterologous protein concentration, DTT
As a result of refolding using a buffer solution containing no ., the optimum concentration was 2.5 μ9/waste ρ.
さらに、緩衝液のｐＨを変えてリホールディングを行っ
た実験において、最も高いリホールディング効果はｐＨ
７付近で得られた。Furthermore, in experiments in which refolding was performed by changing the pH of the buffer solution, the highest refolding effect was found at pH
It was obtained around 7.
最後に、タンパク質濃度を２．５μ９／ｍＱとしてｐＨ
７で含まれるＮａＣ１２の濃度を変えてリホールディン
グを行った。その結果、ＮａＣｌ２の濃度をＯＭから０
．６Ｍと変化させるとりホールディング効果が約１０倍
上昇し、Ｒ［Ａで約３％の効率が得られた。Finally, the protein concentration was set to 2.5μ9/mQ and the pH
Refolding was performed by changing the concentration of NaC12 contained in Step 7. As a result, the concentration of NaCl2 was changed from OM to 0.
．． When changing to 6M, the holding effect increased by about 10 times, and an efficiency of about 3% was obtained with R[A.
以上の結果から従来蛋白質のりホールディング法として
知られている方法に比較して約１００倍の効率でリホー
ルディングか成功し、その好ましい条件は、蛋白濃度１
〜５μｑ／ｌ（１，ｐＨ６，５〜８．５、ＮａＣＱ濃度
０．４−１．３Ｍであることか分かる。From the above results, refolding was successful with approximately 100 times the efficiency compared to the conventional protein glue folding method, and the preferred conditions are that the protein concentration is 1
~5μq/l (1, pH 6.5-8.5, NaCQ concentration 0.4-1.3M).
１１）リホールディングされたタンパク質の定量次いで
、上記のりホールディングされたバトロキソビンをラジ
オイムノアッセイ（ＲＩＡ）で調へた。11) Quantification of refolded protein Next, the refolded batroxobin was determined by radioimmunoassay (RIA).
リホールディングしたバトロキソビン試料、および様々
な濃度のバトロキソビン標品（０，３１，０，６３，１
，２５，２，５，５，１０，２Ｏｎ’ｉ／ 、＝、の各
１００μ１２と、アッセイ緩衝液（ＰＢＳ−２５ｍＭ
ＥＤＴＡ−０，５％ウシ血清アルブミン）４００μＱお
よびバトロキソビン抗血清（Ｉ Ｏ５倍ｍＲ１ｆｆ１）
ｔｏｏμｅの混合物に１１５Ｉ−バトロキソビン（１０
５ｃｐｍ／ ｘＱ、ヨードケン（Ｉ ｏｄｏｇｅｎ）法
（１４）を用いて調製）１００μＱを加えて混合した後
、４°Ｃで一晩静置した。正常ウサギ血清（ｎｏｒｍａ
ｌ ｒａｂｂｉｔｓｅｒｕｍ） ｌ ＯＯμｇ１ウサギ
γ−グロブリン抗血清１００μＱおよび５％ポリエチレ
ングリコール６０００（９００μのを加えて混合した後
、さらに４°Ｃて静置した。約２５時間後、３０００
Ｘ９．４°Ｃ１３０分間の遠心分離を行って上清を除去
し、バ、カードＡｕｔｏ ＧＡＭＭＡ Ｃｏｕｎｔｅｒ
を用いて沈澱物の放射活性を測定し、バトロキソビンを
定量した。Refolded batroxobin samples and batroxobin preparations at various concentrations (0, 31, 0, 63, 1
, 25, 2, 5, 5, 10, 2 On'i/ , =, and assay buffer (PBS-25mM
EDTA-0.5% bovine serum albumin) 400μQ and batroxobin antiserum (IO5x mR1ff1)
115I-batroxobin (10
After adding 100 μQ of 5 cpm/xQ (prepared using the Iodogen method (14)) and mixing, the mixture was allowed to stand overnight at 4°C. Normal rabbit serum (norma
After adding and mixing 100 μQ of rabbit γ-globulin antiserum and 900 μ of 5% polyethylene glycol 6000, the mixture was further left to stand at 4°C. After about 25 hours, 3000
Centrifuge at 9.4°C for 130 minutes, remove the supernatant, and transfer to a card Auto GAMMA Counter.
The radioactivity of the precipitate was measured using a method to quantify batroxobin.
実施例１２ リホールディングしたバトロキソビンタン
パク質のトロンビン様活性
実施例１１て調製した、バトロキソビンタンパク質を用
い、そのトロンビン様活性をフィブリノーゲン・アガー
・プレートにより測定した。Example 12 Thrombin-like activity of refolded batroxobin protein Using the batroxobin protein prepared in Example 11, its thrombin-like activity was measured using a fibrinogen agar plate.
アガー（ＰＢＳ中１０ ｍ９／ ｍＱ）５ 、ｍＱとウ
シフィブリノ−ケン溶液（マイルスサイエンティフィノ
ク（Ｍｉｌｅｓ ５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社製 プラス
ミノーゲン不含、ＰＢＳ中Ｏ６４％） ５ ｘＱを混合
し、素早くフレートを作成した。プレート上に試料ある
いはバトロキソビン漂品（０，３１，０，６３，１，２
５，２，５，５，１０，２０ｎ９／ｚ（りを各１０μａ
のせた後、３７°Ｃで一晩静置した。白濁した円の直径
を測定し、バトロキソビンを定量した。Quickly create a plate by mixing agar (10 m9/mQ in PBS)5, mQ and bovine fibrinogen solution (Miles Scientific, plasminogen free, O64% in PBS) 5xQ. did. Samples or batroxobin debris (0,31,0,63,1,2
5, 2, 5, 5, 10, 20n9/z (10μa each
After being placed on the plate, it was left to stand at 37°C overnight. The diameter of the cloudy circle was measured and batroxobin was quantified.
このようにして上記リホールディング用タンパク質を方
法−Ｅでリホールディングしたものは、トロンビン様活
性を回復していることが確認された。It was thus confirmed that the above-mentioned refolding protein refolded by Method-E had recovered its thrombin-like activity.
実施例１３ 酵母における発現プラスミドｐＭＭ１０７
の構築
ｌ）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１７の構築実施例４で調
製したプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３をＥｃｏＲＩ？ｔ’
ｌ化した後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ／つ断片）を
用いて平滑末端化を行った。得られたＤＮＡ断片とキナ
ーゼ処理を行ったＫｐｎＩリンカ−（ＣＧＧＴＡＣＣＧ
）とをライゲーションした。ライゲーション溶液で大腸
菌ＭＭ２９４を形質転換し、アンピンリン耐性の形質転
換体からプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１７を分離し、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＫｐｎｌ消化で目的のプラスミドが得られ
ていることを確認した。Example 13 Expression plasmid pMM107 in yeast
Construction l) Construction of plasmid pBat-3S17 Plasmid pBat-3S3 prepared in Example 4 was incubated with EcoRI? t'
After ligation, blunt ends were made using DNA polymerase I (Fre/T fragment). The obtained DNA fragment and kinase-treated KpnI linker (CGGTACCG
) was ligated with. E. coli MM294 was transformed with the ligation solution, plasmid pBat-3S17 was isolated from the ampinrin-resistant transformant, and Ec
It was confirmed that the desired plasmid was obtained by oRI and Kpnl digestion.
２）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１９の構築（１）プラス
ミドｐＢａｔ−３Ｓ１７のＫｐｎｌ −ＰｓｔＩ断片の
調製
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１７をＫｐｎＴおよびＰｓｔ
Ｉ消化後、約２．３Ｋｂｐの断片を調製した。2) Construction of plasmid pBat-3S19 (1) Preparation of Kpnl-PstI fragment of plasmid pBat-3S17 Plasmid pBat-3S17 was transformed into KpnT and Pst
After I digestion, a fragment of approximately 2.3 Kbp was prepared.
（２）プラスミドｐＢ Ｒ−Ｐ ＨＯ／ １ａｃＺのＫ
ｐｎｌＰｓｌＩ断片の調製
プラスミドｐＢ Ｒ−Ｐ ＨＯ／ １ａｃＺをＫｐｎｌ
て部分消化〔１箇所切断、反応条件プラスミドＤ Ｎ
Ａ溶液４０μρ（約２０μｇ）に５倍濃度の現ｐｎ＋緩
衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ（Ｊ！（ｐＨ７，５）、
３５ｘＭＭｇＣジ７．５Ｑ、ｘＭ ＫＣρ、３５ＭＭ
２−メルカブトエタ／−ル、５００μｇ／ ｙ＆ウシ
血清アルブミン１２０μりと酵素５μ（（５０ユニツト
）および蒸留水３５μσを加え、３７℃で３０分間保温
する〕後、Ｐｓｔｌで消化を行い、約３．５Ｋｂｐの断
片を調製した。(2) K of plasmid pB R-P HO/1acZ
Preparation of pnlPslI fragment Plasmid pB R-P HO/1acZ was converted into Kpnl
Partial digestion [1 site cut, reaction conditions plasmid DN
Add 40 μρ (about 20 μg) of A solution to 5 times the current pn+ buffer [50 mM Tris-H (J! (pH 7,5),
35xMMgC di7.5Q, xM KCρ, 35MM
Add 2-mercabutene, 500μg/y, 120μ of bovine serum albumin, 5μ of enzyme (50 units) and 35μσ of distilled water, and incubate at 37°C for 30 minutes], then digest with Pstl to obtain approximately 3.5Kbp. fragments were prepared.
（３）ライゲーション
上記（１）および（２）で調製したＤＮＡ断片をライゲ
ーション反応に付し、ライゲーション溶液で大腸菌ＭＭ
２９４を形質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体
からプラスミドｐＢａｔ−ＳＳＩ９を分離し、Ｅ ｃｏ
ＲＩ −Ｈ１ｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩ、 Ｋｐｎ■消化
で目的のプラスミドであることを確認した。(3) Ligation The DNA fragments prepared in (1) and (2) above were subjected to a ligation reaction, and E. coli MM was added to the ligation solution.
294 was transformed. Plasmid pBat-SSI9 was isolated from ampicillin-resistant transformants and transformed into Eco
The desired plasmid was confirmed by digestion with RI-H1ndll, BamHI, and Kpn■.
３）発現プラスミドｐＭＭ１０７の構築（１）プラスミ
ドｐＢａｔ−３Ｓ１９のＰｓｔ Ｉ −Ｂｇｌ■断片の
調製
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１９をＰｓｔｌおよびＢｇｌ
■て消化に付し、約４．２Ｋｂｐの断片を調製した。3) Construction of expression plasmid pMM107 (1) Preparation of PstI-Bgl fragment of plasmid pBat-3S19
A fragment of approximately 4.2 Kbp was prepared by digestion.
（２）プラスミドｐＭＭ Ｉ Ｏ２のＰｓｔ Ｉ −Ｂ
ａｍＨＩ断片の調製
プラスミドｐＭＭ １０２をＢａｍＨＩおよびＰｓｔｌ
で消化に付し、約８．６Ｋｂｐの断片を調製した。(2) Pst I-B of plasmid pMM I O2
Preparation of amHI fragment Plasmid pMM 102 was isolated from BamHI and Pstl.
A fragment of approximately 8.6 Kbp was prepared.
（３）ライゲーション
上記（１）および（２）で調製したＤＮＡ断片をライゲ
ーション反応に付し、得られたライゲーション溶液で大
腸菌ＭＭ２９４を形質転換した。アンピシリン耐性の形
質転換体からプラスミドｐＭＭ１０７を分離し、Ｅｃｏ
ＲＩ、 Ｈｉｎｄｌｌｌ、ＢａｍＨＩ消化で目的のプラ
スミドであることを確認した。(3) Ligation The DNA fragments prepared in (1) and (2) above were subjected to a ligation reaction, and the resulting ligation solution was used to transform Escherichia coli MM294. Plasmid pMM107 was isolated from ampicillin-resistant transformants and
The desired plasmid was confirmed by digestion with RI, Hindll, and BamHI.
プラスミドｐＭＭ １０７の構築模式図を第７図に示す
。A schematic diagram of the construction of plasmid pMM 107 is shown in FIG.
酵母におけるこの発現プラスミドｐＭＭ １０７を用い
て酵母ＡＨ２２を形質転換し、得られた酵母形質転換体
により発現されたタンパク質のバトロキソビンＮ末端付
近の推定されるアミノ酸配列およびそれから推定される
プロセッシング部位を第９図に示す。This expression plasmid pMM 107 in yeast was used to transform yeast AH22, and the deduced amino acid sequence near the batroxobin N-terminus of the protein expressed by the resulting yeast transformant and the processing site deduced therefrom were converted to As shown in the figure.
実施例１４ 発現プラスミドｐＭＭＩ Ｏ７による酵母
の形質転換
１）形質転換
上記実施例１３で得た発現プラスミドｐＭＭＩＯ７を用
い、木材らのＫＵＲ法（１６）に従ってパン酵母ＡＨ２
２を形質転換した。Example 14 Transformation of yeast with expression plasmid pMMI O7 1) Transformation Using the expression plasmid pMMIO7 obtained in Example 13 above, baker's yeast AH2 was transformed according to the KUR method of Wooden et al. (16).
2 was transformed.
ロイシンを含まない滅菌最少培地［Ｙ ＭＭ（−Ｌ ｅ
ｕ）培地、■アミノ酸を含まないジフコ酵母窒素ベース
（Ｄｉｆｃｏ Ｙｅａｓｔ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ｂａｓ
ｅ） ７ｙ、寒天末２０９／蒸留水８８０ｊｌ＆、■
４０％グルコース、０１Ｍ Ｋ２ＨＰＯ４ＫＨｔＰ０４
バッフ７−ｐＨ７，５、■Ｈ混合液（ウラシル０．４
９、ＴｒｐＯ１４ｇ、Ｈｉｓｏ、４９、Ａｒｇｏ、４９
、Ｍｅｔｏ、４９、Ｔｙｒ Ｏ，６９、Ｌｅｕｏ、６ｇ
、ｌ１ｅ０．６？、Ｌｙｓ Ｏ，６ｇ、Ｖａｌ ３．Ｏ
ｇおよびＰｈｅｌ、２９を蒸留水ＩＱに溶解した混合液
）、■５％Ａｓｐ溶を夜、■５％Ｔｈｒ溶液、これら■
〜■を別々に滅菌した後、■の溶液に、■を５０ｒｔｔ
（１、■を１０村、■を５０屑り、■を５ＩＩ！７！、
モして■を５ｘＣ加えて調製］でコロニーを形成した形
質転換体を以後の発現実験に用いた。Sterile minimal medium without leucine [Y MM (-L e
u) Medium, ■ Difco Yeast nitrogen base without amino acids.
e) 7y, agar powder 209/distilled water 880jl &, ■
40% glucose, 01M K2HPO4KHtP04
Buff 7 - pH 7.5, ■H mixed solution (uracil 0.4
9, TrpO14g, Hiso, 49, Argo, 49
, Meto, 49, Tyr O, 69, Leuo, 6g
, l1e0.6? , Lys O, 6g, Val 3. O
A mixed solution of g and Phel, 29 dissolved in distilled water IQ), ■ 5% Asp solution overnight, ■ 5% Thr solution, these ■
~ After sterilizing ■ separately, add 50 rtt of ■ to the solution of ■.
(1, 10 villages for ■, 50 scraps for ■, 5II for ■! 7!,
The transformants that formed colonies were used in subsequent expression experiments.
２）プラスミドｐＭＭ１０７を保持するパン酵母ＡＨ２
２からのバトロキソビンの発現、並びに活性の測定
以下の方法で形質転換体を培養した。2) Baker's yeast AH2 carrying plasmid pMM107
Expression of batroxobin from 2 and measurement of activity Transformants were cultured in the following manner.
ロイシン非要求性の形質転換菌を１０ｆｆｉρ滅菌Ｙ
Ｍ Ｍ （−Ｌ ｅｕ）液体培地［Ｙ Ｍ Ｍ （−Ｌ
ｅｕ）培地から寒天末を除いたもの］に植菌後、３０
’Ｃて一晩培養した。菌液１０ズＱを新しい滅菌Ｙ Ｍ
Ｍ （−Ｌ ｅｕ）液体培地２００ｊ！夕に植え継ぎ
、３０’Ｃで２日から３日間培養した（前培養）。組換
え酵母を十分増殖させた後、前培養２００ｍＣを４００
０ Ｘ９５分間の遠心分離で集菌した。菌体を４０Ｉ７
ｆ！の滅菌本培養液［０Ｍｇ５０．０．５９、ＮａＣ１
！ Ｏ，Ｉ９、ＣａＣ（！２０．１ｇ、ＫＣＱ １．０
ｇ、Ｈｉｓｏ、０２ｇ、Ａｓｎ２．０ｇ、アデニン０．
４ｇ、蒸留水９３４スＱ、■４０％グルコース、■５％
Ａｓｐ溶液、■５％Ｔｈｒ溶液、■ビタミン保存液（チ
アミン２０ｍｇ、ピリドキノン２０ｙ９、ニコチン酸２
０ｒｘ９、パントテン酸２０１１ｇ、ピオチン０．２＋
９およびイノシトール１ｇを蒸留水ＩＱに溶かしたもの
）、■微量元素保存液（Ｈ３ＢＯ４６０ＪＩｇ、ＭｎＳ
○ｔ３０ｉｙ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ，０３００ｍｇ、 Ｃ
ｕ Ｓ Ｏ４・ ５１（２０４０ｍ９、ＦｅＣＱ３・６
Ｈ２０２５０ｚｙ、Ｎ ａ ２ Ｍ ｏ○４−２Ｈ７０
２５ｍｇを蒸留水ＩＱに溶かしたもの）、■〜■を別々
に滅菌した後、■の溶液に、■を５０＋（、■を５Ｍ（
１、■を５ＪＩＩ２、■を５肩Ｑ、■を１肩Ｑそれぞれ
加えて調製］で洗浄した後、２０ＩＩＩＱの滅菌本培養
液に懸濁した。懸濁液全量を３００Ｊ１１２の滅菌本培
養液に植菌し、３０°Ｃで培養を続行した。６時間から
１２時間の間で菌液を採取した。２０．Ｗ１２の培養液
を１０００ Ｘ９．１０分間、４°Ｃの遠心分離にかけ
て集菌した。沈澱物に８ズＱの１０＋ｎＭＰＢＳ−２５
ｍＭ ＥＤＴＡ（前述）を加えて洗浄した後、１１１Ｑ
の１０ｍＭ ＰＢＳ−２５ｍＭ ＥＤＴＡ−ＩｎＭ
ＰＭＳＦを加え、水冷下で懸濁した後、ガラスピーズ（
直径０．４５ｍｍ）１９を加えた。ミキサーを用いて２
分間激しく撹拌を行った。２回撹拌を行った後に１００
００ｘ９１０分間４°Ｃの遠心分離を行い、上清を試料
として保存した。Sterilize the non-leucine auxotrophic transformed bacteria at 10ffiρ.
M M (-L eu) liquid medium [Y M M (-L
eu) culture medium with agar powder removed] after inoculation, 30
'C and cultured overnight. New sterilization of bacteria solution 10sQ
M (-L eu) Liquid medium 200j! The seeds were subcultured in the evening and cultured at 30'C for 2 to 3 days (preculture). After sufficiently growing the recombinant yeast, incubate the preculture at 200 mC with 400 mC.
Bacteria were harvested by centrifugation at 0×95 minutes. 40I7 bacterial cells
f! Sterilized main culture solution [0Mg50.0.59, NaCl
! O, I9, CaC (!20.1g, KCQ 1.0
g, Hiso, 02g, Asn2.0g, adenine 0.
4g, distilled water 934Q, ■40% glucose, ■5%
Asp solution, ■ 5% Thr solution, ■ Vitamin preservation solution (thiamine 20mg, pyridoquinone 20y9, nicotinic acid 2
0rx9, pantothenic acid 2011g, piotin 0.2+
9 and 1 g of inositol dissolved in distilled water IQ), ■ Trace element preservation solution (H3BO460JIg, MnS
○t30iy, ZnSO4・7H, 0300mg, C
u SO4・51 (2040m9, FeCQ3・6
H20250zy, Na2Mo○4-2H70
25mg dissolved in distilled water IQ), ■~■ were sterilized separately, and then 50+ (■) and 5M (■) were added to the solution (■).
1, ■ by adding 5 JII and 2, ■ by adding 5 shoulder Q, and ■ by 1 shoulder Q] and then suspended in sterilized main culture solution of 20 IIIQ. The entire suspension was inoculated into 300J112 sterilized main culture, and culture was continued at 30°C. Bacterial fluid was collected between 6 and 12 hours. 20. The W12 culture solution was centrifuged at 1000×9.10 minutes at 4°C to collect bacteria. 10+nMPBS-25 of 8sQ to the precipitate
After adding and washing with mM EDTA (described above), 111Q
10mM PBS-25mM EDTA-InM
After adding PMSF and suspending under water cooling, glass beads (
19 (diameter 0.45 mm) was added. 2 using a mixer
Vigorous stirring was performed for a minute. 100 after stirring twice
Centrifugation was performed at 4°C for 00x910 min, and the supernatant was saved as a sample.
ハトロキソビンが発現されていることを実泡例ＩＩ、４
）記載の方法に従い、ＲＩＡにより確認した（１．３μ
ｇ／Ｑ培養液）。また実施例１２記載の方法に従い、フ
ィブリノーゲン・アカ−・プレートを用いた測定結果か
ら、酵母から発現されたハトロキソビンの生物学的活性
はＲＩＡ値とほぼ同等であることが示された。Example II, 4 shows that hatroxobin is expressed.
) Confirmed by RIA according to the method described (1.3μ
g/Q culture solution). Furthermore, the results of measurements using fibrinogen acid plates according to the method described in Example 12 showed that the biological activity of hatroxobin expressed from yeast was approximately equivalent to the RIA value.
３）分子量の測定
酵母から発現されたバトロキソビンの分子量を以下の方
法で推定した。3) Measurement of molecular weight The molecular weight of batroxobin expressed from yeast was estimated by the following method.
上記２）記載の発現実験において、本培養を１０時間行
った試料を用い、以下のようにサイモグラフィ（Ｚ ｙ
ｍｏｇｒａｐｈｙ）を行って、酵母から発現されたバト
ロキソビンの分子量を推定した。In the expression experiment described in 2) above, samples cultured for 10 hours were used, and thymography (Z y
mography) was performed to estimate the molecular weight of batroxobin expressed from yeast.
試料を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにかけて分離した後、ゲ
ルを２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ −１００水溶液（２００
ｘ（Ｄに浸した。室温で約３時間、穏やかに撹拌した後
、蒸留水で洗浄し、次いで、濾紙上で乾かしてフィブリ
ノ−ケン・アガー・プレート（前述）上にのせ、３７°
Ｃて一晩保温した。天然のバトロキソビンを比較試料と
して用い、同様に処理した。その結果、酵母から発現さ
れたバトロキソビンの場合には、３０． ＯＯＯ±２０
００の分子量の位置に活性が検出された。After the samples were separated by 15% 5DS-PAGE, the gel was washed with 25% Triton X-100 aqueous solution (200
x (D). After gentle stirring at room temperature for about 3 hours, it was washed with distilled water, then dried on a filter paper and placed on a fibrinogen agar plate (described above) at 37 °C.
C and kept warm overnight. Natural batroxobin was used as a comparison sample and treated similarly. As a result, in the case of batroxobin expressed from yeast, 30. OOO±20
Activity was detected at the molecular weight position of 00.
実施例１５ 動物細胞での発現プラスミドｐＭＭＩ０５
の構築
■）プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１８の溝築実施例４で調
製したプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ３をＩＥｃｏＲｌて（
肖化し１こ後、ＤＮＡポリメラーゼＩ（フレ／つ断片）
を用いて平滑末端化した。得られたプラスミドと、キナ
ーゼ処理を行ったＢｇｌｌｌＪンカー（ＣＡＧＡＴＣＴ
Ｇ）とをライゲー７ヨンした。ライゲーション溶液で大
腸ＩＭＭ２９４を形質転換した。アンピンリン耐性の形
質転換体からプラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１８を分離し、
Ｂｇｌｌｌ消化で目的のプラスミドであることを確認し
た。Example 15 Expression plasmid pMMI05 in animal cells
Construction of plasmid pBat-3S18 Plasmid pBat-3S3 prepared in Example 4 was constructed using IEcoRl (
After 1 year of development, DNA polymerase I (fragment)
The ends were made blunt using The obtained plasmid and the kinase-treated BglllJ linker (CAGATCT
G) was played as a ligame. Colon IMM294 was transformed with the ligation solution. Isolate plasmid pBat-3S18 from anpinlin-resistant transformant,
The desired plasmid was confirmed by Bglll digestion.
２）プラスミドｐＳＴ−Ｘｈｏ［の構築プラスミドｐｓ
Ｔｌ１２［プラスミドｐｓＴ１１２を含む形質転換体Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＤＨｌ （ｐｓＴ１
１２）は微工研条寄第１９６６号として寄託されている
］をＳ ｍａ ｌ Ｉｉ！ｌ化して得た断片と、キナー
ゼ処理を行ったＸｈｏｌリンカ−ＣＣＣＴ ＣＧＡＧＧ
）とをライゲー７ヨンした。ライゲーション溶液で大腸
菌ＭＭ２９４を形質転換した。アンピンリン耐性の形質
転換体から所望のプラスミドｐＳＴ−Ｘｂｏｌを分離し
、Ｘｈｏｌ消化により、目的のプラスミドであることを
確認した。2) Construction of plasmid pST-Xho [Plasmid ps
Tl12 [Transformant E containing plasmid psT112
scherichia coli DHL (psT1
12) has been deposited as Microtechnology Research Institute No. 1966] is S ma l Ii! Fragment obtained by ligation and Xhol linker-CCCT CGAGG subjected to kinase treatment
) and played a live game. E. coli MM294 was transformed with the ligation solution. The desired plasmid pST-Xbol was isolated from the ampinrin-resistant transformant and confirmed to be the desired plasmid by Xhol digestion.
３）動物細胞における発現プラスミＦｐＭＭ １０５の
構築
（１）プラスミドｐＢａｔ−ＳＳ］８のＢｇｌｔＪ−Ｘ
ｈ。3) Construction of expression plasmid FpMM 105 in animal cells (1) Plasmid pBat-SS]8 BgltJ-X
h.
Ｉ断片の調製
プラスミドｐＢａｔ−３Ｓ１８をＢｇｌｌｌおよびＸｈ
。Preparation of I fragment Plasmid pBat-3S18 was transformed into Bgll and Xh
.
Ｉで消化した後、約０．７Ｋｂｐの断片を調製した。After digestion with I, an approximately 0.7 Kbp fragment was prepared.
（２）プラスミドｐｓＴ−ＸｈｏｌのＢｇｌＩＩ−Ｘｈ
ｏｌ断片の調製
プラスミドｐＳＴ−ＸｈｏｌをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏ
ｌて消化し、約５．８Ｋｂｐの断片を調装した。(2) BglII-Xh of plasmid psT-Xhol
Preparation of ol fragment Plasmid pST-Xhol was transformed with BglII and Xho
A fragment of approximately 5.8 Kbp was prepared.
（３）ライケーンヨン
上記（１）および（２）で得たＤＮＡ断片をライゲー／
コン反応に付し、その反応溶液で大腸菌ＭＭ２９４を形
質転換した。アンピシリン耐性の形質転換体からプラス
ミドｐＭＭ１０Ｄを分離し、Ｅｃ。(3) DNA fragments obtained in (1) and (2) above are ligated/
E. coli MM294 was transformed with the reaction solution. Plasmid pMM10D was isolated from ampicillin-resistant transformants and transformed into Ec.
ＲＩ 、 Ｈｉｎｄ［Ｈ２ＣｃｏＲＩ −Ｈ１ｎｄｌＩ
Ｉｆ肖化によって目的のプラスミドであることを確認し
た。RI, Hind[H2CcoRI-H1ndlI
It was confirmed that the plasmid was the desired plasmid by If culture.
プラスミドｐＭＭ １００の構築模式図を第８図に示す
。A schematic diagram of the construction of plasmid pMM100 is shown in FIG.
取得した目的のプラスミドｐＭＭ］ ０５で培養動物細
胞マウスＬ９２９を形質転換し、得られた形質転換体に
より発現されたタンパク質のバトロキソビンＮ末瑞付近
の推定アミノ酸配列および推定されるプロセノ／ング部
位を第９図に示す。[obtained target plasmid pMM] 05 was used to transform cultured animal cell mouse L929, and the predicted amino acid sequence near the batroxobin N-terminus of the protein expressed by the obtained transformant and the predicted proseno/ing site were extracted. It is shown in Figure 9.
実施例１６ 発現プラスミドｐＭＭＩ０５による培養動
物細胞の形質転換と発現
■）形質転換
培養動物細胞の形質転換はグラハム（Ｇ ｒａｈａｍ。Example 16 Transformation of cultured animal cells with expression plasmid pMMI05 and expression ■) Transformation Transformation of cultured animal cells was carried out by Graham (Graham).
Ｆ、）らのリン酸カル７ウム共沈澱法ぐ１７）に従って
行なわれた。即ち、プラスミドｐＳ Ｖ ２ ｎｅｏ
ＡＴＣＣ３７１９８（０，１μ９）とプラスミドｐＭＭ
１０５（３０Ｉｚｙ）による同時形質転換を行った。This was carried out according to the calcium phosphate co-precipitation method of F. et al.17). That is, plasmid pSV 2 neo
ATCC37198 (0,1μ9) and plasmid pMM
Co-transformation with 105 (30Izy) was performed.
マウスＬ ９２９細胞を直径ＩＱｃｘの培養ディンユ中
ＩＱ％ウン胎児血清を含むタルへノコＭＥＭ培ｔｌ！！
（ＤＭＥ〜１）で培養したちのに、発現プラスミド（ｐ
ＭＭ１０５）とマーカープラスミド（ｐＳ ■２ｎｅｏ
）とをリン酸カルシウムにて共沈させたものを加えた。Mouse L 929 cells were cultured with a diameter of IQcx in MEM medium containing IQ% unborn fetal serum. !
(DME~1), the expression plasmid (p
MM105) and marker plasmid (pS ■2neo
) and co-precipitated with calcium phosphate were added.
ＣＯ２インキュヘーター中で一晩培養後、培養液を新し
い非選択培地（前出ＤＭＥＭ）に変えて更に一晩培養し
た。次に培養液を選択培地（Ｇ、４１８（ＧＩ［３ＣＯ
社製） ５００ ｔｔ ｓ／ 、ｑＱ、をＳむＤＭＥＭ
）に交換して２４〜４８時間培養した後、同選択培地で
９６ウエルのプレートに細胞を分割（１×１０゛細胞／
１００μＱ培地／ウエル）した。３日あるいは４日毎に
選択培地にて培地交換を行いながら培養を続けた。After culturing overnight in a CO2 incubator, the culture solution was changed to a new non-selective medium (DMEM as described above) and further cultured overnight. Next, the culture solution was mixed with selective medium (G, 418 (GI[3CO
DMEM containing 500 tt s/, qQ,
) and culture for 24 to 48 hours, then divide the cells into 96-well plates (1 x 10 cells/well) using the same selective medium.
100 μQ medium/well). Culture was continued while replacing the medium with a selective medium every 3 or 4 days.
２）プラスミドｐＭＭ１０５を保持する形質転換体から
のバトロキソビンの発現
上記１）において選択培地で増殖してきた細胞を用い、
バトロキソビンの発現状況を調べた。2) Expression of batroxobin from a transformant carrying plasmid pMM105 Using the cells grown in the selective medium in 1) above,
The expression status of batroxobin was investigated.
９６ウエルのプレート上で細胞増殖の観察されたウェル
中の培地をメタロチオネインプロモーターの誘導用培地
（２ｍＭ酪酸ナトリウム、４０μＭ Ｚｎ５Ｏ，，２
％ウン胎児血清を含むＤ〜ｉＥＭ）と交換し、２４時間
培養した。培養液中のバトロキソビン活性をＲＩＡによ
り測定し、最も高い産生量（約１０μ９／（ｌ培養液）
を示した細胞をハトロキソビン産生細胞として選択し、
ＭＭＩ ０５と名つけた。The medium in the well where cell proliferation was observed on a 96-well plate was mixed with metallothionein promoter induction medium (2mM sodium butyrate, 40μM ZnO, 2
The cells were replaced with D~iEM containing % fetal serum and cultured for 24 hours. Batroxobin activity in the culture solution was measured by RIA, and the highest production amount (approximately 10μ9/(l culture solution)
Cells showing this were selected as hatroxobin-producing cells,
It was named MMI 05.
３）培養動物細胞から発現された融合タンパク質の１且
精製
上記２）に記載のＭＭ１０５（バトロキソビン産生能を
有する、形質転換されたマウス上９２９細胞）をクロー
ニングすることによって更に高卒生体を所得した。約５
０〜１００μｙ／Ｑ培養液の産生能を有する形質転換株
を用いて、約４００ｙ（ｌの培養を行った。培養液を１
２０００ｘｙ、１０分間、４°Ｃの遠心分離にかけ、上
清をバトロキソビン抗体をカップリングさせたケルによ
るアフイニティクロマトグラフイーにかけて精製した。3) Purification of fusion protein expressed from cultured animal cells A high school graduate organism was further obtained by cloning MM105 (transformed mouse 929 cells capable of producing batroxobin) described in 2) above. Approximately 5
Approximately 400 y (l) of culture was carried out using a transformed strain capable of producing 0 to 100 μy/Q culture solution.
The mixture was centrifuged at 2000xy for 10 minutes at 4°C, and the supernatant was purified by affinity chromatography using KEL coupled with batroxobin antibody.
バトロキソビン約１３．８μ９を含有する培養上清から
溶出緩衝液（０，２Ｍ グリンンーＨＣＱ、Ｑ、５ＭＮ
ａＣ（！ ｐＨ２，０）により、約１２μ９のバトロキ
ソビンを精製・回収した。アフィニテイクロマトグラフ
ィーの溶出液を１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで調へたところ
、バトロキソビン標品と泳動度が一致するところにメイ
ンバンドか存在していた。From the culture supernatant containing about 13.8μ9 of batroxobin, elution buffer (0.2M green-HCQ, Q, 5MN
About 12μ9 of batroxobin was purified and recovered by aC (!pH 2,0). When the eluate from the affinity chromatography was analyzed on 15% 5DS-PAGE, a main band was present where the electrophoretic mobility matched that of the batroxobin sample.
上記に用いたアフィニティ・カラムは、以下のごとくに
して作成された
バトロキソビン抗血清（家兎を用いて１６Ｂ９．τＱに
ＰＢＳを等量加え、さらに飽和硫酸アンモニウム溶液を
９．−ＩＱ加えて４°Ｃで１時間撹拌した。４°Ｃて３
５時間静置した後、２００００：＜９で３０分間遠心し
、沈澱物を２０ ｍＭ ＋）ン酸緩衝液（ｐＨ８０）２
Ｑに対して一晩透析した。透析内液を２０ｍＭリン酸援
便１ｉ夜（ｐＨ８，０）で洗浄したＤＥＡＥセルロース
・カラムを用いて精製し、バトロキソビンの粗精製抗体
約３５．４ｚ９／ ３２＋Ｃを得た。The affinity column used above was prepared using batroxobin antiserum (using rabbit, 16B9.τQ, an equal volume of PBS was added, and then a saturated ammonium sulfate solution was added to 9.-IQ, and the mixture was heated at 4°C. Stir for 1 hour at 4°C.
After standing for 5 hours, centrifugation was carried out for 30 minutes at 20,000:<9, and the precipitate was diluted with 20 mM +) acid buffer (pH 80) 2.
Dialyzed overnight against Q. The dialysed fluid was purified using a DEAE cellulose column washed with 20mM phosphate-enriched 1iN (pH 8,0) to obtain a crudely purified batroxobin antibody of approximately 35.4z9/32+C.
その内２０７９分く１８ｍのをカップリングｖｉ由ｉ＆
（０，１ｆｖｌ Ｎａ）ｉｃ○３１）Ｈ８，Ｏ）に対
して透析した。Of that, 2079 minutes and 18m of coupling viyui &
Dialysis was performed against (0,1 fvl Na)ic○31)H8,O).
透析内液にあらかじめｌ ｍＭ ＨＣＱ ３００ＭＱて
膨潤、洗浄したＢｒＣＮ−活性化セファロース４Ｂ（フ
ァルマ／ア社）ソ）１．２１ｙ相当（約５−ＩＱケル）
加え、室７Ｕて２時間撹拌した。さらにケルをブロッキ
ング試Ｘ（０，２Ｍ グリシノｐＨ８，０）と共に２時
間撹拌後、カップリング緩衝液（前述）と０．１Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ４，０）で交互に洗浄し、ＰＢＳに懸濁し
て保存した。BrCN-activated Sepharose 4B (Pharma/A) 1.21y equivalent (approximately 5-IQ Kel) swelled and washed with lmM HCQ 300MQ in the dialysis solution
The mixture was stirred for 2 hours in a 7U chamber. Further, KEL was stirred for 2 hours with blocking reagent I saved it.
４）Ｌ９２９から発現されたタンパク質のウェスタン・
プロッティングによる確認
上記３）における５ＤＳ−ＰＡＧＥによって得られたメ
インバンドがバトロキソビンであることを確かめるため
に以下の方法でウェスタン・プロッティングを行った。4) Western analysis of the protein expressed from L929
Confirmation by Plotting In order to confirm that the main band obtained by 5DS-PAGE in 3) above is batroxobin, Western plotting was performed using the following method.
５ＤＳ−ＰＡＧＥをかけたケルに０．４５ μｍのメン
ブランフィルタ−［Ｓ ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆ Ｓ ｃ
ｈｕｌ１社製ＢＡ８５、フィルターをあらかじめトラン
スファー緩衝液（Ｔｒｉｓ ６，０６９、グリシノ ２
８゜８９、メタノール４００１Ｑ、水を加えて全量を２
夕とする）に浸し、完全に気泡を抜いておく１を重ね、
トランスプロッティング装置（バイオラッド社、ＴＲＡ
ＮＳ ＢＬＯＴ）を用い、６０ｍＡで１時間電気泳動
後、１２０ｍＡで一晩電気泳動を行った。A 0.45 μm membrane filter was applied to the gel subjected to 5DS-PAGE.
Transfer buffer (Tris 6,069, Glycino 2
8゜89, methanol 4001Q, add water and bring the total volume to 2
Soak in water) and remove air bubbles completely.
Transplotting device (Bio-Rad, TRA
NS BLOT), electrophoresis was performed at 60 mA for 1 hour, and then overnight at 120 mA.
フィルクーを３％ゼラチン溶液「Ｔ Ｂ Ｓ緩衝液（Ｔ
ｒｉｓ４，８４９、Ｎａ（Ｊ！ ５８．４８９．２（Ｈ
，０１ＩＮＨｃｃてｐＨ７，５に調整）を用いて調製コ
に１時間浸した後、バトロキソビン抗体を含む１％ゼラ
チン溶液に交換した。約１時間半後、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０溶液（Ｔ Ｂ Ｓ緩衝液を用いて作成）でフィ
ルターを洗浄した。５分間の洗浄を３回、１０分間の６
を浄を１回行った後、ＰＯＤ標識されたラビｙト［ｇＧ
を含む１％ゼラチン溶液に約１時間浸した。０．０５％
Ｔｗｅｅｎ２０溶液て５分間の洗浄を２回、１０分間の
洗浄を２回行った。Ａ液［５，１ρ冷メタ／−ルに発色
試薬（西洋ワサビのベルオキ／ラーゼ発色剤（Ｈｏｒｓ
ｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｃｏｌｏｒ ｄ
ｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）試薬）１５所を溶かしたもの］
とＢ液（２５祿ＴＢＳ緩衝液に１５μＣの３０％過酸化
水素水を加えたもの）をそれぞれ使用直前に調製して混
合した後、フィルターに加えて発色させた。その結果、
３）で得たけ品と同一の泳動度を示したメインバンドは
標品と同様に発色し、バトロキソビンであることが確か
められた。Filkoo was added to 3% gelatin solution "T B S buffer (T
ris4,849, Na(J! 58.489.2(H
, 01 INHcc (adjusted to pH 7.5) for 1 hour, and then replaced with a 1% gelatin solution containing batroxobin antibody. After about an hour and a half, 0.05% Twe
Filters were washed with en20 solution (made using TBS buffer). 3 washes of 5 minutes, 6 washes of 10 minutes
After one purification, POD-labeled rabbit [gG
It was soaked in a 1% gelatin solution for about 1 hour. 0.05%
Washing with Tween 20 solution was performed twice for 5 minutes and twice for 10 minutes. Solution A [5,1ρ Add coloring reagent (horseradish beluox/lase coloring agent) to cold methanol
eradish peroxidase color d
development) reagent) dissolved in 15 parts]
and B solution (25 μC of 30% hydrogen peroxide solution added to 25 μC of TBS buffer) were prepared and mixed immediately before use, and then added to the filter to develop color. the result,
The main band, which showed the same electrophoretic mobility as the product obtained in 3), developed the same color as the standard product, and was confirmed to be batroxobin.
本明細書で引用した文献を以下に示す。The documents cited in this specification are shown below.
参照文献
１、メノシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ、 Ｊ、 ）（１９７
９）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｉｃ
ａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ、 Ｎ Ｉ ＨＰｕｂｌｉｃａ
ｔｉｏｎ Ｎｏ、 ７９ ９９．２、ＮＯ，２，４３２
、ハナハン（）ｌａｎａｈａｎ、Ｄ、）（１９８３）
Ｊ、Ｍ。Reference 1, Messing, J. (197
9) Recombinant DNA Technic
al Bulletin, N I HPublica
tion No. 79 99.2, No. 2,432
, Lanahan, D. (1983)
J.M.
１、 Ｂ ｉｏｌ 七昼旦、５５７−５８０３、メセ
ルソン（Ｍｅｓｅｌｓｏｎ、 ｉ’ｉ４． ）およびユ
ン（Ｙｕａｎ、 Ｒ，）（１９６８） Ｎａｔｕｒｅ
２±７．１１１０４、トベ（Ｔ ｏｂｅ、 Ｔ 、
）、イトウ（Ｉ ｔｏ、 Ｋ、）およびニラ（Ｙｕｒ
ａ、Ｔ、）（１９８４） Ｍｏ１．Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅ
ｔ１９５．１０−１６
５ カーノ（Ｋ ｕｒｊａｎ、 Ｊ 、 ）およびヘル
スコウ゛イノツ（Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、 １．）（１
９８２） Ｃｅ１ｌ ３０．９６、イトウ（Ｉ ｔｏ
、 Ｎ、）、タナ力（Ｔ ａｎａｋａ、 Ｎ 、 ）、
ミハ／（Ｍ １ｈａｓｈｉ、 Ｓ 、 ）およびヤマシ
ナ（Ｙ ａｍａｓｈｉｎａ、１．Ｘ１９８７） Ｊ、
Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、２６２．３７ および８．欧州特
許出願公開公報第０２１９８１・１号公報
９、サイトウ（Ｓ ａｉｔｏ、 Ｙ、 ）、イシイ（Ｉ
５ｈｉｉ、 Ｙ、）、コヤ７ （Ｋ ｏｙａｍａ、
Ｓ 、 ）、ツジ（Ｔｓｕｊｉ、 Ｋ、）、ヤマタ（
Ｙ ａｍａｄａ、 Ｈ、）、テライ（Ｔ ｅｒａｉ、
Ｔ、 ）、コバヤ７（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、 Ｍ、 ）
、オノ（○ｎｏ、Ｔ、）、ニラ（Ｎ ｉｗａ、 Ｍ、
）、ウエタ（Ｕ ｅｄａ＋ ［、）およびキクチ（Ｋ
１ｋｕｃｈｉ、 Ｈ８）、（１９８７） Ｊ、Ｂｉｏ
ｃｈｅｍ ｔＵ２．１１１−１２２
１０、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、Ｈ，Ｃ，）お
よびドーリ−（Ｄｏｌｙ、 Ｊ 、）（１９７９）
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｃｓ、７．１５１３ １
５２３
１１ マキサム（Ｍ ａｘａｍ、 Ａ 、 ）および
ギルバー１−（Ｇ １ｌｂｅｒｔ、Ｗ、）（１９８０）
Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏ１６５．４９９−５
６０
１２ レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ、Ｕ、に、）（１９７０
） ＮａＬｕｒｅ ２２７ 、６８０ ６８５１３
、チセン（Ｃｈａｎｇ、 Ｊ、Ｙ、）、クレーイー（Ｃ
ｒｅａｓｅｒ、 Ｅ 、 ｔ（、）およびペントリイー
（Ｂｅｎｔｌｙ、 ＫＷ）（１９７６） Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ、Ｊ、１５３．（３Ｑ７１１１、サランンスキー
（Ｓ ａｌａｃｉｎｓｋｉ、 Ｐ、 Ｒ，）、マクリー
ン（Ｍｃ Ｌ ｅａｎ、 Ｃ、）、サイクス（Ｓ ｙｋ
ｅｓ、 Ｊ 、 ）クレメントージョーンズ（Ｃｌｅ
ｍｅｎｔ −Ｊ ｏｎｅｓ、 ＶＶ）およびローリ−（
Ｌｏｗｒｙ、 Ｐ、 Ｊ、）（１９８１）Ａｎａｌ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ、 ｌ Ｉ ７． Ｉ ３６−１４６
１５、バーガー（Ｈａｇｅｒ、 Ｄ、 Ａ、）およびバ
ージニス（Ｂｕｒｇｅｓｓ、Ｒ，Ｒ，）（１９８０）
Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ。1, Biol Seven Days, 557-5803, Meselson, i'i4. and Yuan, R. (1968) Nature
2±7.11104, Tobe (T,
), I to, K, and Yur
a, T.) (1984) Mo1. Gen, Gene
t195.10-16 5 Kurjan (J.) and Herskowitz (1.) (1
982) Ce1l 30.96, I to
, N,), Tanaka, N, ),
Miha/(M1hashi, S, ) and Yamashina (1.X1987) J.
Biol, Chem, 262.37 and 8. European Patent Application Publication No. 021981/1 Publication 9, Saito (Y, ), Ishii (I)
5hii, Y,), Koya7 (Koyama,
S, ), Tsuji (K,), Yamata (
Yamada, H.), Terai (Terai,
T, ), Kobayashi 7 (Kobayashi, M, )
, Ono (○no, T,), Chive (Niwa, M,
), Ueda+ [, ) and Kikuchi (K
1kuchi, H8), (1987) J, Bio
chem tU2.111-122 10, Birnboim, H.C. and Doly, J. (1979)
Nucleic Ac1dsRcs, 7.1513 1
523 11 Maxam, A. and Gilbert, W. (1980)
Methods Enzymo165.499-5
60 12 Laemmli (1970)
) NaLure 227, 680 68513
, Chang, J.Y., C.
Reaser, E. T. (, ) and Bently, K. W. (1976) Bioc.
hem, J, 153. (3Q7111, Salacinski, P, R, McLean, C, Sykes)
es, J.) Clemento Jones (Cle
ment-Jones, VV) and Laurie (
Lowry, P. J.) (1981) Anal.
Biochem, I 7. I 36-146
15, Hager, D.A. and Burgess, R.R. (1980)
Anal, Biochem.
１０９．７６−８６
１６、ハシモト（Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ、 Ｈ、）および
キムラ（Ｋｉｍｕｒａ、Ａ、）（１９８５） Ｈａｋ
ｋｏｕ−ｔｏ−Ｋｏｇｙｏ（ｉｎ Ｊ ａｐａｎｅｓｅ
） ４３、６３０−６３７１７、グラハム（Ｇ ｒａｈ
ａｍ、 Ｆ 、 Ｌ 、 ）およびファン・デア・イウ
゛（ｖａｎ ｄｅｒ Ｅｂ、Ａ、Ｊ、）（１９７３
）〜’ ｉｒｏｌｏｇｙ ５２．４５６−４６７109.76-86 16, Hashimoto, H. and Kimura, A. (1985) Hak
kou-to-Kogyo (in J apanese
) 43, 630-63717, Graham
am, F., L.) and van der Eb, A. J. (1973)
)～' irology 52.456-467
第１図は、ｐＢａｔ−３ＳＩの溝築模式図、第２１川は
ｐＢａｔ−３Ｓ２の構築模式図、第３図はｐＢａｔｓｓ
３の構築模式図、第４図はｐＢａＬ−３ＳＩＯの構築模
式図、第５図はｐＢａｔ−３Ｓ４９の構築模式図、第６
図はｐＢａｔ−３Ｓ５０およびｐＢａｔｓｓ５１の構築
模式図、第７図はｐＭＭ １０７の構築模式図、第８図
はｐＭＭ］ ０５の構築模式図、第９図は本発明の発現
プラスミドで形質転換された形質転換体により発現され
たタンパク質の、ハトロキソビンのＮ末端付近のＤＮＡ
配列およびそれから推定されるアミノ酸配列およびそれ
から（ＩＬ定されるプロセッシング部位を示す模式図、
第１０図は天然バトロキソビンをコードするＤＮＡの配
列式およびそれから推定されるアミノ酸配列を示す模式
図である。
特許出願人 藤ｔＲ薬品工業株式会社
代 理 人 弁理士 前出 葆 （外２名）−田
第
図
ｄｅＴ
Ｎ（ｌｅｔ
ｐＢａ↑
第
図
日ｇｌＩＩ
ｉ に
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図
第
図
ｐｅａ↑−５Ｓ３
ａｉｌ
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ＡＧＡＡＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＴＴＡＴＣＴＧＡ
ＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＡＡＣＡＧＣＴＴＧＣＣＡＣＧＣ
ＡＧＡＧＴＴＧＡＡＧＣＴＡＴ冨ｅ
ＴＴＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＣＴＣＣＣＣＧＧＴＡＴＴ
ＴＣＴＧＴＧＧＰ！１ｅＨｅヒＴｙｒＴ：／ｒＳｅｒＰ
ｒｏＡｒｇＴｙｒＰｈｅＣｙｓＧ １３８０
．４００ＴＡＣＣＣＡＡＡＧＧ
ＡＧＡＡＧＴＴＣＡＴτＴＧＴＣＣＣＡＡＴＡＡＴｙｒ
ＰｒｏＬｙｓＧＬｕＬｙｓＰｈｅＩｌｅｃｙｓＰｒｏＡ
ｓ＊Ｌｙ１０図（１）
ＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣ丁ＴＡＡ゛丁ＴＴＧＡＴＣＡＡＡ
ＴＡＡＡＧ 丁ＧＣＴＧＣＴＴＧＡＴＣＡ第１０図
ＡＡＧＣＴＴＴＴＴＴ丁ＡＧＡＣＴＣＡＡＡＴＡＧＧＡ
ＣＴＧＣＣＴＴＴＧＧＡノＣＣＴＧＴＴＴＴＡＴＧＧＴ
ＧＡＧＧＴＧＣＡＡＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴノＣ
ＴＴＣＴにＧＧＡＣＡＧＴＧＴＧＧＴＣＣＴＴＧＡＴＧ
ＣＴＣＴＣＴＧＡＧＣ”ＡＴＣＡＴＣＡＧＴＧＣＴＡＧ
ＡＡＴＡＴＴＣＴＣＴＴＣＴＡＴＧＴＴＡＧＴＴ−。Figure 1 is a schematic diagram of the construction of pBat-3SI, No. 21 is a schematic diagram of the construction of pBat-3S2, and Figure 3 is a schematic diagram of pBat-3S2 construction.
Figure 4 is a schematic diagram of the construction of pBaL-3SIO, Figure 5 is a schematic diagram of the construction of pBat-3S49, and Figure 6 is a schematic diagram of the construction of pBaL-3S49.
The figure shows a schematic diagram of the construction of pBat-3S50 and pBatss51, FIG. 7 shows a schematic diagram of the construction of pMM 107, FIG. 8 shows a schematic diagram of the construction of pMM]05, and FIG. DNA near the N-terminus of hatroxobin in the protein expressed by the transformant
a schematic diagram showing the sequence and the amino acid sequence deduced therefrom and the processing sites defined therefrom (IL;
FIG. 10 is a schematic diagram showing the sequence formula of DNA encoding natural batroxobin and the amino acid sequence deduced therefrom. Patent Applicant FujitR Yakuhin Kogyo Co., Ltd. Agent Patent Attorney Maeda Ao (2 others)-Ten-zu deT N CoreAGAAGTCTCCGCTTGGGTTATCTGA
TTAGGTTGCAAACAGCTTGCCACGC
AGAGTTGAAGCTATTomie TTCATGTACTACTCTCCCCGGTATT
TCTGTGGP! 1eHehiTyrT:/rSerP
roArgTyrPheCysG 1380
．． 400TACCCAAAGG
AGAAGTTCATτTGTCCCAATAATyr
ProLysGLuLysPheIlecysProA
s*Ly10 diagram (1) AACCAGCTGC dingTAA゛dingTTGATCAAA
TAAAG DingGCTGCTTGATCAFigure 10AAGCTTTTTTDingAGACTCAAATAGGA
CTGCCTTTGGANOCCTGTTTTATGGT
GAGGTGCAAAATTTTCTGACTCTNOC
TTCTGGACAGTGTGGTCCTTGATG
CTCTCTGAGC”ATCATCAGTGCTAG
AATATTCTCTTCTATGTTAGTT-.
Claims (1)
トロキソビン。 ３、グリコシル化されていない請求項１に記載のバトロ
キソビン。 ４、バトロキソビンのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ
を含有する発現ベクター。 ５、バトロキソビンと他のポリペプチドとの融合タンパ
ク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを含有する請求
項４に記載の発現ベクター。 ６、請求項４または５に記載の発現ベクターを保持する
形質転換体。 ７、請求項６に記載の形質転換体を培地に培養し、得ら
れる培養物からバトロキソビンを分離することからなる
バトロキソビンの製造方法。[Claims] 1. Genetically recombinant batroxobin. 2. Batroxobin according to claim 1, which is free from natural glycosylation. 3. The batroxobin according to claim 1, which is not glycosylated. 4. DNA encoding the amino acid sequence of batroxobin
An expression vector containing. 5. The expression vector according to claim 4, which contains DNA encoding the amino acid sequence of a fusion protein of batroxobin and another polypeptide. 6. A transformant carrying the expression vector according to claim 4 or 5. 7. A method for producing batroxobin, which comprises culturing the transformant according to claim 6 in a medium and separating batroxobin from the resulting culture.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63280045A JPH02124092A (en) | 1988-11-04 | 1988-11-04 | Production of batroxobin by genetic recombination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63280045A JPH02124092A (en) | 1988-11-04 | 1988-11-04 | Production of batroxobin by genetic recombination |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02124092A true JPH02124092A (en) | 1990-05-11 |
Family
ID=17619531
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63280045A Pending JPH02124092A (en) | 1988-11-04 | 1988-11-04 | Production of batroxobin by genetic recombination |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02124092A (en) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255082A (en) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Toray Ind Inc | Transformant having tryptophanase productivity and production of l-tryptophan |
| JPH08116980A (en) * | 1994-10-11 | 1996-05-14 | Mogam Biotechnol Res Inst | Gene carrying code for proteinases analogous to novel thrombin |
| WO2005045022A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-19 | Biobud Co., Ltd. | Thrombin-like recombinant batroxobin expressed by pichia sp.and production method thereof |
| WO2008119203A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Shanghai Wanxing Biopharmaceuticals, Co., Ltd. | A purified recombinant batroxobin with high specific activity |
| WO2009084841A3 (en) * | 2007-12-28 | 2009-09-17 | Biobud Co., Ltd. | Mutated nucleotide sequences of batroxobin, mutated alpha factor secretion signal sequence and processes for preparing batroxobin using the same |
-
1988
- 1988-11-04 JP JP63280045A patent/JPH02124092A/en active Pending
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02255082A (en) * | 1989-03-28 | 1990-10-15 | Toray Ind Inc | Transformant having tryptophanase productivity and production of l-tryptophan |
| JPH08116980A (en) * | 1994-10-11 | 1996-05-14 | Mogam Biotechnol Res Inst | Gene carrying code for proteinases analogous to novel thrombin |
| WO2005045022A1 (en) * | 2003-10-31 | 2005-05-19 | Biobud Co., Ltd. | Thrombin-like recombinant batroxobin expressed by pichia sp.and production method thereof |
| WO2008119203A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-09 | Shanghai Wanxing Biopharmaceuticals, Co., Ltd. | A purified recombinant batroxobin with high specific activity |
| US7939067B2 (en) | 2007-03-30 | 2011-05-10 | Shanghai Wanxing Biopharmaceuticals, Co., Ltd. | Purified recombinant batroxobin with high specific activity |
| WO2009084841A3 (en) * | 2007-12-28 | 2009-09-17 | Biobud Co., Ltd. | Mutated nucleotide sequences of batroxobin, mutated alpha factor secretion signal sequence and processes for preparing batroxobin using the same |
| US8377676B2 (en) | 2007-12-28 | 2013-02-19 | Biobud Co., Ltd | Mutated nucleotide sequences of batroxobin, mutated α factor secretion signal sequence and processes for preparing batroxobin using the same |
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