JPH0728746B2 - Novel plasmid, microbial cell, and method for producing human immunoglobulin G Fc region protein - Google Patents

Novel plasmid, microbial cell, and method for producing human immunoglobulin G Fc region protein

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JPH0728746B2
JPH0728746B2 JP61043531A JP4353186A JPH0728746B2 JP H0728746 B2 JPH0728746 B2 JP H0728746B2 JP 61043531 A JP61043531 A JP 61043531A JP 4353186 A JP4353186 A JP 4353186A JP H0728746 B2 JPH0728746 B2 JP H0728746B2
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Description

【発明の詳細な説明】 （１）技術分野 本発明はヒト免疫グロブリンＧ（以下“Ig G"と略すこ
ともある）Fc領域蛋白質コードするDNA断片を有する新
規組換えプラスミド、該プラスミドにより形質転換され
た新規組換え微生物細胞、及び該微生物を用いたヒトIg
G Fc領域蛋白質の菌体外分泌による製造方法に関す
る。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a novel recombinant plasmid having a DNA fragment encoding a human immunoglobulin G (hereinafter sometimes abbreviated as “Ig G”) Fc region protein, and transformation with the plasmid. Recombinant Microbial Cells Produced and Human Ig Using the Microorganisms
The present invention relates to a method for producing a G Fc region protein by extracellular secretion.

（２）発明の背景 すべての脊椎動物の体液中に存在し、抗原と特異的に結
合する能力を有する蛋白質が抗体であり、抗体蛋白質と
構造的、機能的関連をもつ蛋白質は総称して免疫グロブ
リンといわれている。免疫グロブリン（以下“Ig"と略
すことがある）は、物理化学的あるいは免疫学的な性状
から、IgG、IgA、IgM、IgE、IgDの５つのクラスに分類
される。(2) Background of the Invention Proteins that are present in the body fluids of all vertebrates and that have the ability to specifically bind to antigens are antibodies, and proteins that have a structural or functional relationship with antibody proteins are collectively referred to as immunity. It is called globulin. Immunoglobulins (hereinafter sometimes abbreviated as "Ig") are classified into five classes of IgG, IgA, IgM, IgE, and IgD based on their physicochemical or immunological properties.

なかでもIgGは細菌やウイルスに対する生体防御に重要
な役割を持っており、従来より、ヒトIgGを多量に含む
γ−グロブリン画分をヒトの血液より分離し、一部変性
することにより重症患者のための免疫製剤として用いら
れてきた。しかしながら、これは原料を人血に依存して
おり、その大量の安定した人手が困難であること、また
そのために均質で安全なものを常時得にくいという難点
があった。そこでヒト免疫グロブリンを遺伝子操作技術
によって産出することができれば、医薬品製造のために
極めて有利であることは論を待たない。Among them, IgG has an important role in the biological defense against bacteria and viruses, and conventionally, the γ-globulin fraction containing a large amount of human IgG was separated from human blood and partially denatured so that it can be used in severely ill patients. Has been used as an immunological agent for. However, this depends on human blood as a raw material, and it is difficult to obtain a large amount of stable human hands. Therefore, it is difficult to always obtain a homogeneous and safe product. Therefore, it is arguable that if human immunoglobulin could be produced by gene manipulation technology, it would be extremely advantageous for the production of pharmaceuticals.

さて、ヒトIgGは２本のＨ鎖（heavy chain）と２本のＬ
鎖（light chain）がジスルフィド結合で結ばれた形を
とる。ヒトIgG分子にパパインなどの蛋白質分解酵素を
作用させると分子中央で切断され、抗原結合活性のある
断片（Fab領域蛋白質）と、抗原結合活性はなく条件に
より結晶化しやすい断片（Fc領域蛋白質）とに分かれ
る。Fab領域蛋白質はＬ鎖全体とＨ鎖のアミノ末端側の
半分を含み、１分子のIgGから２分子のFab領域蛋白質が
生じる。一方、Ｈ鎖のカルボキシル末端側の半分である
Fc領域蛋白質は、ヒンジ（ｈ）、CH2、CH3の３つの部位
より成り、ヒンジ部位において２本の鎖がジスルフィド
結合によって結ばれた二量体構造をとっている。そし
て、Fc領域蛋白質はエフェクター（effector）機能を有
している。By the way, human IgG has two heavy chains and two L chains.
It takes the form of light chains linked by disulfide bonds. When a human IgG molecule is treated with a proteolytic enzyme such as papain, it is cleaved at the center of the molecule and has an antigen-binding activity (Fab region protein) and a fragment that has no antigen-binding activity and is easily crystallized under certain conditions (Fc region protein). Divided into The Fab region protein contains the entire L chain and the amino terminal half of the H chain, and one molecule of IgG produces two molecules of Fab region protein. On the other hand, it is the carboxyl terminal half of the H chain.
The Fc region protein is composed of three parts, hinge (h), C H 2, and C H 3, and has a dimer structure in which two chains are linked by a disulfide bond at the hinge part. The Fc region protein has an effector function.

従来、γ−グロブリン製剤は、無（低）γ−グロブリン
血症への補充、ウイルス感染症の予防と治療投与、等に
適用されてきた。近年、γ−グロブリン製剤が特発性血
小板減少性紫斑病（IT Ｐ）治療に有効であり〔P.Imba
chら,Lancet,１,1228（1981）〕、特にそのFc領域が重
要であることが示唆されている〔朴ら，臨床免疫、15
〔Supp1.7〕76（1983）〕。また、全身性エリテマトー
デス（SLE）等における腎糸球体沈着免疫複合体が、ヒ
トIgG Fc領域蛋白質の添加により融解したという報告
もある〔河往ら，臨床免疫，16,240（1984）〕。以上の
ように、Fc領域蛋白質は、ITPやSLEのような自己免疫疾
患の治療薬として用いることができる可能性があるが、
作用機序などを含めて不明な点が多い。十分な量のFc領
域蛋白質を供給できないことが、この理由の１つとなっ
ている。Conventionally, γ-globulin preparations are free (low) γ-globulin
For blood supplementation, prevention and treatment of viral infections, etc.
Has been applied. Recently, γ-globulin preparations
It is effective for the treatment of plaque reduction purpura (ITP) [P. Imba
ch et al, Lancet,1, 1228 (1981)], especially the Fc region
It has been suggested that it is important [Park et al., Clinical immunity,15
[Supp 1.7] 76 (1983)]. Also, systemic lupus erythematosus
The renal glomerular deposition immune complex in death (SLE) etc.
A report that it was thawed by the addition of IgG Fc region protein
There is also [Kawaoi et al., Clinical immunity,16, 240 (1984)]. More than
As such, Fc region proteins are associated with autoimmune diseases such as ITP and SLE.
Although it may be used as a remedy for the patient,
There are many unclear points including the mechanism of action. Sufficient Fc territory
One of the reasons for this is the inability to supply regional proteins
ing.

近年の遺伝子操作技術の発達により、種々の有用蛋白質
の微生物等を用いた生産が可能になった。しかしなが
ら、通常、有用蛋白質は主として菌体内に蓄積されるも
のであり、所望の有用蛋白質を菌体外に分泌する微生物
は限られたものしか知られていない。有用蛋白質を微生
物菌体内に産生させた場合には菌体体積を越える生産量
は期待できないが、菌体外に分泌させれば有用蛋白質
の、より多量の生産が可能になる。また、宿主微生物に
対してtoxicな有用蛋白質や、菌体内プロテアーゼに高
感受性な有用蛋白質の生産においても、菌体外分泌が有
利である。さらに、一般に分泌性蛋白質の種類はそれほ
ど多くないため、有用蛋白質を菌体外に分泌させればそ
の精製工程の簡略化が期待でき、工業的にみてコストダ
ウンがはかれる。以上の理由により、所望の有用蛋白質
を生産し、菌体外に分泌するような微生物を任意に創製
することができれば、その産業上の利用性は極めて大き
い。With the recent development of gene manipulation techniques, it has become possible to produce various useful proteins using microorganisms and the like. However, the useful protein is usually mainly accumulated in the microbial cells, and only a limited number of microorganisms secrete the desired useful protein outside the microbial cells. When the useful protein is produced in the microbial cells, the production amount exceeding the microbial cell volume cannot be expected, but if it is secreted outside the microbial cells, a larger amount of the useful protein can be produced. In addition, extracellular secretion is also advantageous in the production of useful proteins that are toxic to host microorganisms and useful proteins that are highly sensitive to intracellular proteases. Furthermore, since there are generally not many types of secretory proteins, if the useful protein is secreted outside the cells, the purification process can be expected to be simplified, and the cost can be reduced industrially. For the above reasons, if a microorganism capable of producing a desired useful protein and secreting it outside the microbial cell can be arbitrarily created, its industrial utility is extremely high.

一般に菌体外に分泌される蛋白質は、アミノ末端に20〜
40残基程度のアミノ酸からなるシグナルペプチドといわ
れるものが結合した状態で産生され、細胞膜を透過し分
泌されるときにシグナルペプチダーゼという酵素によっ
てシグナル領域が切断されて、蛋白質が外に分泌され
る。この機構は基本的に高等生物でも微生物でも同様に
考えられ、本来分泌されない蛋白質にシグナルペプチド
をつけてやることによって、細胞膜を透過させることも
可能なわけである。Generally, proteins secreted outside the cell are
It is produced in a state in which a so-called signal peptide consisting of about 40 amino acids is bound, and when it penetrates the cell membrane and is secreted, the signal region is cleaved by an enzyme called signal peptidase, and the protein is secreted to the outside. This mechanism is basically conceivable in higher organisms as well as in microorganisms, and it is possible to permeate cell membranes by attaching a signal peptide to a protein that is not originally secreted.

大腸菌〔エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）は、
その周囲を内膜・外膜という二つの膜で囲まれており、
内膜と外膜との間にはペルプラズムと呼ばれる空間が存
在する。従って、シグナルペプチドを用いることにより
内側を通過した蛋白質は、外膜を通過できないためペリ
プラズムに蓄積してしまうことになるため、大腸菌にお
ける本当の意味での菌体外分泌を考えた場合、シグナル
ペプチドのみでは不充分である。Escherichia coli (Escherichia coli)
Surrounded by two membranes, the intima and adventitia,
There is a space called the perplasm between the intima and the adventitia. Therefore, when the signal peptide is used, the protein that has passed inside cannot be passed through the outer membrane and accumulates in the periplasm. Therefore, in consideration of true extracellular secretion in E. coli, only the signal peptide is considered. Is not enough.

近年、本発明者らの一部は、プラスミドベクターpMB9
〔R.L.Rodriguezら,Molecular Mechanisms in the Cont
rol of Gene Expression,ICN−UCLA,symp.Mol.Cell.Bio
l（ed.D.P.Nierlichら），Ｖ,471,Academic Press In
c.,New York（1976）〕を用い、好アルカリ性バチルス
（Bacillus）No.170株（SERM BP−467）由来の染色体D
NAより、ペニシリナーゼ遺伝子の大腸菌によるクローン
化に成功した〔T.Kudoら,J.Bacteriol.,156,949（198
3）〕。Recently, some of the inventors have found that the plasmid vector pMB9
(RL Rodriguez et al., Molecular Mechanisms in the Cont
rol of Gene Expression, ICN-UCLA, symp.Mol.Cell.Bio
l (ed.DP Nierlich et al.), V , 471, Academic Press In
c., New York (1976)], and chromosome D derived from the alkalophilic Bacillus No. 170 strain (SERM BP-467).
From NA, we successfully cloned the penicillinase gene in E. coli [T. Kudo et al., J. Bacteriol., 156 , 949 (198
3)].

この際に、ペニシリナーゼ蛋白質の大腸菌菌体外への分
泌が見られ、pMB9プラスミド上に存在するプロモーター
を持たないKil遺伝子を、好アルカリ性バチルスNo.170
株由来のDNA断片中のペニシリナーゼ遺伝子近傍に存在
するプロモーター活性を有する領域（Exプロモーター）
により活性化させることにより、大腸菌外膜の透過性が
増大していることが明らかとなった〔堀越，現代化学、
176,56（1985）〕。At this time, secretion of the penicillinase protein outside the E. coli cells was observed, and the Kil gene having no promoter existing on the pMB9 plasmid was used as an alkaliphilic Bacillus No. 170
Region with promoter activity in the vicinity of the penicillinase gene in strain-derived DNA fragments (Ex promoter)
It was clarified that permeabilization of Escherichia coli outer membrane was increased by activation by [Horikoshi, Hyundai Kagaku,
176 , 56 (1985)].

そこで、本発明者らは、この菌体外分泌に関する研究を
更に進めた結果、ヒトIgG Fc領域蛋白質の菌体外分泌
発現に成功し、更にそのFc領域蛋白質の大部分はジスル
フィド結合を介した二量体構造を有していることを見出
し、本発明を完成するに至ったものである。Therefore, as a result of further research on the exocrine secretion of the bacterium, the present inventors succeeded in expressing the exocrine secretion of the human IgG Fc region protein, and most of the Fc region protein was dimerized via a disulfide bond. The inventors have found that they have a body structure and completed the present invention.

（３）発明の目的 本発明の目的は、ヒトIgG Fc領域蛋白質をコードするD
NAを含むDNA断片及びその断片が組み込まれた新規組換
えプラスミドを提供することにある。(3) Object of the Invention The object of the present invention is to encode human IgG Fc region protein D
It is intended to provide a DNA fragment containing NA and a novel recombinant plasmid into which the fragment is incorporated.

本発明の他の目的は、上記新規組換えプラスミドによっ
て形質転換され、目的とするヒトIgG Fc領域蛋白質
を、菌体外に産生し得る新規組換え微生物細胞を提供す
ることにある。本発明の更に他の目的は、該微生物細胞
を用いてヒトIgG Fe領域蛋白質を菌体外分泌生産させ
る方法を提供することにある。Another object of the present invention is to provide a novel recombinant microbial cell transformed with the above novel recombinant plasmid and capable of producing the target human IgG Fc region protein extracellularly. Still another object of the present invention is to provide a method for exocrine production of human IgG Fe region protein using the microbial cells.

本発明の更に他の目的は、以下の説明により一層明らか
になるであろう。Other objects of the present invention will become more apparent by the following description.

（４）発明の構成 本発明者の研究によれば、前記本発明の目的は、ｉ）ヒ
ト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質をコードするDNA領
域、該蛋白質の発現調節を行なうプロモーター機能を有
するDNA領域、及びシグナルペプチドをコードするDNA領
域を有するDNA断片、及び、 ii）実質的に菌体外分泌を促進する作用を宿主細胞に与
えるDNA領域、及び該DNA領域の発現調節を行なうプロモ
ーター機能を有するDNA領域、 を有するDNA断片を含むプラスミド、そのプラスミドに
よって形質転換された微生物細胞及びその微生物細胞を
用いてヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質を菌体外分
泌生産させる方法を提供することによって達成されるこ
とがわかった。(4) Structure of the invention According to the research conducted by the present inventor, the above-mentioned objects of the present invention include: i) a DNA region encoding a human immunoglobulin G Fc region protein, and a DNA region having a promoter function for regulating the expression of the protein. , And a DNA fragment having a DNA region encoding a signal peptide, and ii) a DNA region that provides a host cell with an action that substantially promotes extracellular secretion, and a DNA having a promoter function that regulates the expression of the DNA region. And a method for producing a human immunoglobulin G Fc region protein exocrine-secreted by using a plasmid containing a DNA fragment having a region, a microbial cell transformed with the plasmid, and the microbial cell. all right.

以下、本発明について更に詳細に説明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

《ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域遺伝子のクローン化》 ヒトIgGを産生する細胞、たとえばヒト骨髄腫細胞ARH77
株〔K.H.Burkら,J.Cancer Res.,38,2508（1978）〕を、
適当な条件下、たとえば37℃、炭酸ガス濃度５％で培養
増殖させ、得られた細胞を遠心分離によって集める。こ
の細胞を、たとえばラウリル硫酸ナトリウム（SDS）の
ような界面活性剤存在下で、たとえばプロテアーゼＫの
ような蛋白質分解酵素を用いて溶解させる。さらに、た
とえばフェノールによる抽出によって除蛋白質を行な
い、ヒト染色体DNAを得る。<< Cloning of Human Immunoglobulin G Fc Region Gene >> A cell producing human IgG, for example, human myeloma cell ARH77
The strain [KH Burk et al., J. Cancer Res., 38 , 2508 (1978)]
The cells are cultured and grown under appropriate conditions, for example, at 37 ° C. and a carbon dioxide concentration of 5%, and the obtained cells are collected by centrifugation. The cells are lysed using a proteolytic enzyme such as Protease K in the presence of a detergent such as sodium lauryl sulfate (SDS). Further, deproteinization is performed by extraction with, for example, phenol to obtain human chromosomal DNA.

こうして得られたDNAを、例えばEcoRIのような制限酵素
で切断し、適当なファージ・ベクター、たとえばシャロ
ン4Aベクター〔F.R.Blattnerら,Science,196,161（197
7）〕と連結した後、イン・ビトロ・パッケージング
（A.Beckerら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,72,581（197
5）〕を行ない、ヒトの遺伝子ライブラリーを得る。Eco
RI以外の制限酵素を用いる場合や、クローニングサイト
としてEcoRIをもたないような他のファージ・ベクター
を使用する場合には、適当なリンカーDNAを用いれば遺
伝子ライブラリーの作成が可能になる。The DNA thus obtained is cleaved with a restriction enzyme such as EcoRI, and an appropriate phage vector such as the Sharon 4A vector [FR Blattner et al., Science, 196 , 161, (197
7)], followed by in vitro packaging (A. Becker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72 , 581 (197
5)] is performed to obtain a human gene library. Eco
When a restriction enzyme other than RI is used or when another phage vector that does not have EcoRI as a cloning site is used, a gene library can be prepared by using an appropriate linker DNA.

この遺伝子ライブラリーのファージを、たとえばエシェ
リヒア・コリLE392株（ATCC33572）に感染、プラークを
形成させ、たとえばプラーク・ハイブリダイゼーション
法〔W.D.Bentonら,Science,196,180（1977）〕によって
目的クローンの選択を行なう。プローブとしては、たと
えばニックトランスレーション法〔P.W.J.Rigbyら,J.Mo
l.Biol.,113,237（1977）〕により32P標識を行なったヒ
ト免疫グロブリンＨ鎖Ｊ領域（Fab領域の中の一部であ
り、抗原結合活性を有する可変部とエフェクター機能を
有する定常部との境界に存在）遺伝子や、あるいはヒト
IgG Fc領域蛋白質のアミノ酸配列に対応すると考えら
れる塩基配列をもつオリゴヌクレオチドを化学合成した
後、これを32P標識したものを用いることができる。Escherichia coli LE392 strain (ATCC33572) was infected with the phages of this gene library to form plaques, and the target clones were selected by the plaque hybridization method (WD Benton et al., Science, 196 , 180 (1977)). To do. Examples of the probe include the nick translation method [PWJ Rigby et al., J. Mo.
l.Biol., 113 , 237 (1977)] labeled with 32 P by a human immunoglobulin H chain J region (a part of the Fab region, a variable region having an antigen-binding activity and a constant region having an effector function). Existing on the boundary with the part) gene or human
After chemically synthesizing an oligonucleotide having a nucleotide sequence considered to correspond to the amino acid sequence of IgG Fc region protein, 32 P-labeled oligonucleotide can be used.

このプラーク・ハイブリダイゼーションによって陽性を
示したクローンの制限酵素切断点地図を作成し、ヒト染
色体由来のDNA断片を、たとえばpBR322〔F.Bolivarら,G
ene,２,95（1977）〕のようなプラスミド・ベクターに
サブクローニングする。得られたサブクローンの挿入部
分のDNA塩基配列を、たとえばマキサム・ギルバート法
〔A.M.Maxamら,Methods Enzymol.,65,499（1980）〕あ
るいはM13ファージを用いたジデオキシ・チェーン・タ
ーミネーション法〔J.Messingら,Nucleic Acids Res.,
９,309（1981）〕の方法により決定し、ヒトIgG Fc領
域遺伝子の存在を確認する。第１図に、ヒトIgG Fc領
域蛋白質のアミノ酸配列及びそれをコードするDNA塩基
配列の一例を示す。A restriction enzyme cleavage point map of a clone showing a positive result by this plaque hybridization was prepared, and a DNA fragment derived from a human chromosome was isolated using, for example, pBR322 [F. Bolivar et al., G.
ene, 2 , 95 (1977)]. The DNA nucleotide sequence of the inserted portion of the obtained subclone is, for example, the Maxam-Gilbert method [AM Maxam et al., Methods Enzymol., 65 , 499 (1980)] or the dideoxy chain termination method [J.Messing] using M13 phage. Et al, Nucleic Acids Res.,
9 , 309 (1981)], and the presence of the human IgG Fc region gene is confirmed. FIG. 1 shows an example of the amino acid sequence of human IgG Fc region protein and the DNA base sequence encoding it.

こうして得られたヒトIgG Fc領域遺伝子は、ヒト染色
体のものであるから、実際にアミノ酸をコードしないイ
ントロン（intron）を含んでおり、このままでは微生物
中で発現させることはできない。そこでこのFc領域遺伝
子を適当な制限酵素で切断し、イントロンの部分を完全
に除去する。この制限酵素切断の際に、実際にアミノ酸
をコードするエクソン（exon）の部分も削られてしまう
ことがありうるが、その場合には化学合成したオリゴヌ
クレオチドのジョイントを用いて削られた部分を修復さ
せると共に、隣り合ったエクソン同志を連結させる。同
時に、合成オリゴヌクレオチドを用いた同様な手法によ
り、Fc領域遺伝子の３′末端に読みとりフレームを一致
させるように翻訳終止コドン（TGA,TAG,TAA）を２つ以
上タンデムに連結し、発現効率の向上をはかることもで
きる。ここで得られたイントロンのないFc領域遺伝子
は、やはり合成オリゴヌクレオチドを用いた手法を用
い、その上流に読みとりフレームを一致させるように翻
訳開始コドンを付与することができる。さらにこのFc領
域遺伝子は、適当なプロモーター、SD（シャイン・ダル
ガーノ）配列の下流につなぐことにより、菌体内発現型
遺伝子とすることができる。使用可能なプロモーターと
して、トリプトファン・オペロン・プロモーター（trp
プロモーター）、ラクトース・オペロン・プロモーター
（Iacプロモーター）、tacプロモーター、PLプロモータ
ー、IPPプロモーター等があげられるが、とりわけtrpプ
ロモーターやtacプロモーターが好適である。Fc領域遺
伝子を効率良く発現させるためには、プロモーター、SD
配列、翻訳開始コドン、翻訳終止コドンのすべてを連結
したものが好ましく、プロモーター、SD配列、翻訳開示
コドン、Fc領域遺伝子及び翻訳終止コドンが、この順序
で連結したものがとりわけ好ましい。Since the human IgG Fc region gene thus obtained is of the human chromosome, it actually contains an intron that does not code for an amino acid, and cannot be expressed in a microorganism as it is. Therefore, the Fc region gene is cleaved with an appropriate restriction enzyme to completely remove the intron portion. When cutting with this restriction enzyme, the part of the exon that actually encodes the amino acid may be deleted, but in that case, the part that was deleted using the joint of the chemically synthesized oligonucleotides should be removed. It repairs and connects adjacent exons. At the same time, two or more translation termination codons (TGA, TAG, TAA) were tandemly linked to the 3'end of the Fc region gene so as to match the reading frame by a similar method using a synthetic oligonucleotide to improve expression efficiency. It can also be improved. The Fc region gene without intron obtained here can also be provided with a translation initiation codon at the upstream so as to match the reading frames by using a method using a synthetic oligonucleotide. Furthermore, this Fc region gene can be made into an intracellular expression type gene by connecting it to the downstream of an appropriate promoter and SD (Shine-Dalgarno) sequence. As a usable promoter, tryptophan operon promoter (trp
Promoter), lactose operon promoter (Iac promoter), tac promoter, P L promoter, I PP promoter, and the like, are suitable, inter alia trp promoter and tac promoter. For efficient expression of Fc region gene, promoter, SD
Those in which all of the sequence, translation initiation codon and translation stop codon are linked are preferable, and those in which the promoter, SD sequence, translation disclosure codon, Fc region gene and translation stop codon are linked in this order are particularly preferable.

本発明の菌体内発現型ヒトIgG Fc領域遺伝子を、適当
なプラスミド・ベクター、たとえばpBR322に挿入するこ
とにより、発現型プラスミドが作成できる。菌体内発現
型プラスミドとして、好ましくは、pFC203、pFC211、pF
C361、pFC362が用いられる。An expression type plasmid can be prepared by inserting the intracellular expression type human IgG Fc region gene of the present invention into an appropriate plasmid vector, for example, pBR322. The intracellular expression type plasmid is preferably pFC203, pFC211 or pF.
C361 and pFC362 are used.

《好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ遺伝子
のクローン化》 ペニシリナーゼ生産能を有する好アルカリ性バチルスN
o.170株（FERM BP−467）を適当な条件下、たとえば30
℃で振とう培養し、得られた菌体を遠心分離によって集
める。この菌体から、公知の方法、たとえばフェノール
法によってDNAを抽出し、染色体DNAを得る。<< Cloning of Penicillinase Gene of Alkaliphilic Bacillus No.170 Strain >> Alkaliphilic Bacillus N capable of producing penicillinase
strain 170 (FERM BP-467) under suitable conditions, for example 30
The cells are shake-cultured at ℃, and the obtained cells are collected by centrifugation. DNA is extracted from this microbial cell by a known method such as the phenol method to obtain a chromosomal DNA.

こうして得られたDNAを、たとえばEcoRIのような制限酵
素で部分的に切断し、適当なプラスミドベクター、たと
えばpMB9プラスミドのEcoRIサイトへの挿入を行ない、
好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNAを組み込んだ
組換えプラスミドを得る。この組換えプラスミドを、た
とえばエシェリヒア・コリHB101株（ATCC33694）に公知
の方法、たとえばCaClz法〔M.V.Norgardら,Gene、３、2
79（1978）〕を用いて導入、アンピシリン及びテトラサ
イクリンに耐性の形質転換株をスクリーニングすること
により、好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ
遺伝子及びペニシリナーゼの菌体外分泌生産に関与する
情報を担うDNA領域を有する組換えプラスミド、たとえ
ばpEAP1を得る。The DNA thus obtained is partially cleaved with a restriction enzyme such as EcoRI, and inserted into an EcoRI site of a suitable plasmid vector, for example, pMB9 plasmid,
A recombinant plasmid incorporating the alkalophilic Bacillus No. 170 chromosomal DNA is obtained. This recombinant plasmid was prepared by a method known to, for example, the Escherichia coli HB101 strain (ATCC33694), for example, the CaClz method [MV Norgard et al., Gene, 3 , 2].
79 (1978)] and screened for transformants resistant to ampicillin and tetracycline, thereby identifying a DNA region that carries information related to extracellular secretion production of the alkalophilic Bacillus No. 170 strain penicillinase gene and penicillinase. A recombinant plasmid having, for example, pEAP1 is obtained.

得られた組換えプラスミドのDNA塩基配列を、たとえば
前記マキサム−ギルバード法あるいは前記M13ファージ
を用いたジデオキシ・チェーン・ターミネーション法に
より決定し、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域、
シグナルペプチド領域、成熟ペプチド領域の構造、さら
にペニシリナーゼの菌体外分泌に関与する好アルカリ性
バチルスNo.170株由来のExプロモーター領域及びpMB9プ
ラスミド由来のKil遺伝子の構造を明らかにする。第１
図に、好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ遺
伝子プロモーター領域・シグナルペプチド領域のDNA塩
基配列を示す。また、第２図にプラスミドpMB9由来のKi
l遺伝子のDNA塩基配列を、第３図に好アルカリ性バチル
スNo.170株由来のExプロモーター領域のDNA塩基配列
を、それぞれ示す。さらに、シグナルペプチド領域及び
Kil遺伝子については、対応するアミノ酸配列も合わせ
て示す。The DNA base sequence of the obtained recombinant plasmid is determined by, for example, the Maxam-Gilbird method or the dideoxy chain termination method using the M13 phage, and the penicillinase gene promoter region,
The structures of the signal peptide region, the mature peptide region, the Ex promoter region derived from the alkalophilic Bacillus No. 170 strain and the Kil gene derived from the pMB9 plasmid, which are involved in the extracellular secretion of penicillinase, will be elucidated. First
The figure shows the DNA base sequences of the alkaline region Bacillus No. 170 strain penicillinase gene promoter region / signal peptide region. The Ki derived from the plasmid pMB9 is shown in FIG.
The DNA base sequence of the l gene is shown in FIG. 3, and the DNA base sequence of the Ex promoter region derived from the alkalophilic Bacillus No. 170 strain is shown. Furthermore, the signal peptide region and
For the Kil gene, the corresponding amino acid sequence is also shown.

このペニシリナーゼ遺伝子及びペニシリナーゼの菌体外
分泌生産に関与する情報を担うDNA領域を有する組換え
プラスミドを出発材料として、自然欠失を利用した方
法、あるいはS1−ヌクレアーゼ、DNA−ポリメラーゼ等
の修飾酵素や合成オリゴヌクレオチドを用いる人為的方
法により、好アルカリ性バチルスNo.170株由来のExプロ
モーター領域とプラスミドpMB9由来のKil遺伝子から成
る菌体外分泌生産に関与する情報を担うDNA領域全域、
及びペニシリナーゼ遺伝子の全域あるいは一部を含む、
組換えプラスミドが得られる。このようなプラスミドと
して、好ましくはpEAP3、pEAP6、pEAP7、pEAP7ΔＨ、pE
AP7ΔCCH、pEAP7ΔCH、pHAP8、p329EXKが用いられる。Using a recombinant plasmid having a DNA region carrying the information relating to the extracellular secretion production of this penicillinase gene and penicillinase as a starting material, a method utilizing natural deletion, or a modification enzyme such as S1-nuclease, DNA-polymerase or synthesis By an artificial method using an oligonucleotide, the entire DNA region that carries information related to extracellular secretion production consisting of the Ex promoter region derived from the alkalophilic Bacillus No. 170 strain and the Kil gene derived from the plasmid pMB9,
And containing all or part of the penicillinase gene,
A recombinant plasmid is obtained. Such a plasmid is preferably pEAP3, pEAP6, pEAP7, pEAP7ΔH, pE.
AP7ΔCCH, pEAP7ΔCH, pHAP8 and p329EXK are used.

また、上述のペニシリナーゼ遺伝子及びペニシリナーゼ
の菌体外分泌生産に関与する情報を担うDNA領域を有す
る組換えプラスミドを、適当な制限酵素で切断し、ペニ
シリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナルペプチ
ド領域を含むDNA断片を得る。このDNA断片を、必要なら
適当な合成オリゴヌクレオチド・リンカーを介して、適
当なプラスミドベクター、たとえばpCM1（T.J.Closeと
R.Rodriguez,Gene,20,305（1982）〕とpCM7（T.J.Close
とR.Rodriguez,Gene,20,305（1982）〕とのハイブリッ
ド・プラスミドpCM71にクローン化し、ペニシリナーゼ
遺伝子プロモーター領域及びシグナルペプチド領域を有
するプラスミドが得られる。ペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域及びシグナルペプチド領域を有するプラス
ミドとして、好ましくはpPS1、pPS1ΔＨ、p329PSが用い
られる。Further, a recombinant plasmid having the above-mentioned penicillinase gene and a DNA region that carries information involved in extracellular secretion production of penicillinase is cleaved with an appropriate restriction enzyme to obtain a DNA fragment containing a penicillinase gene promoter region and a signal peptide region. . This DNA fragment is then transferred to a suitable plasmid vector, such as pCM1 (TJClose and TJClose), if necessary via a suitable synthetic oligonucleotide linker.
R. Rodriguez, Gene, 20 , 305 (1982)] and pCM7 (TJClose
And R. Rodriguez, Gene, 20 , 305 (1982)] to obtain a plasmid having a penicillinase gene promoter region and a signal peptide region. As a plasmid having a penicillinase gene promoter region and a signal peptide region, pPS1, pPS1ΔH and p329PS are preferably used.

《分泌型プラスミドの作成》 前に得られたヒトIgG Fc領域菌体内発現型プラスミ
ド、たとえばpFC362を、適当な制限酵素で切断すること
により、菌体内発現のためのプロモーター領域を削除
し、その部分に適当なプロモーター領域及びシグナルペ
プチド領域、たとえば好アルカリ性バチルスNo.170株ペ
ニシリナーゼ遺伝子シグナルペプチド領域との連結用の
合成オリゴヌクレオチド・ジョイントを挿入した形のプ
ラスミドを得る。このようなプラスミドとして、好まし
くはpSEC−FC、pSEC−FCCが用いられる。<< Preparation of secretory plasmid >> A human IgG Fc region intracellular expression plasmid obtained previously, for example, pFC362, is cleaved with an appropriate restriction enzyme to delete the promoter region for intracellular expression, To obtain a plasmid having a suitable promoter region and a signal peptide region, for example, a synthetic oligonucleotide joint for ligation with an alkaliphilic Bacillus No. 170 strain penicillinase gene signal peptide region. As such a plasmid, pSEC-FC and pSEC-FCC are preferably used.

次にこのプラスミドに、適当なプロモーター領域及びシ
グナルペプチド領域を有するプラスミドを適当な制限酵
素で切断することにより得られる適当なプロモーター領
域を有するDNA断片及びシグナルペプチド領域を有するD
NA断片を挿入し、適当なプロモーター領域及びシグナル
ペプチド領域下流にヒトIgG Fc領域遺伝子が連結した
形のプラスミドが得られる。このようなプロモーター領
域・シグナルペプチド領域を有する遺伝子としては、大
腸菌β−ラクタマーゼ遺伝子、大腸菌アルカリ性ホスフ
ァターゼ遺伝子、大腸菌リポプロテイン遺伝子、枯草菌
ペニシリナーゼ遺伝子、枯草菌プロテアーゼ遺伝子、酵
母α因子遺伝子、好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシ
リナーゼ遺伝子、好アルカリ性エアロモナス（Aeromona
s）No.212株キシラナーゼ遺伝子、好アルカリ性バチル
スNo.N−４株セルラーゼ遺伝子、好アルカリ性バチルス
No.1139株セルラーゼ遺伝子等があげられるが、好まし
くは好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ遺伝
子が用いられる。適当なプロモーター領域、適当なシグ
ナルペプチド領域及びヒトIgG Fc領域遺伝子が、この
順序に連結された形のプラスミドが最も好ましく、この
プラスミドを用いることにより、ヒトIgG Fc領域蛋白
質のペリプラズムまでの分泌が可能になる。このような
ペリプラリズム分泌発現型プラスミドとして、好ましく
はpPS−FCが用いられる。Next, a D fragment having a DNA fragment and a signal peptide region having an appropriate promoter region obtained by cleaving the plasmid having an appropriate promoter region and a signal peptide region with an appropriate restriction enzyme is added to this plasmid.
By inserting the NA fragment, a plasmid having a form in which a human IgG Fc region gene is linked downstream of an appropriate promoter region and signal peptide region can be obtained. Examples of genes having such promoter region / signal peptide region include Escherichia coli β-lactamase gene, Escherichia coli alkaline phosphatase gene, Escherichia coli lipoprotein gene, Bacillus subtilis penicillinase gene, Bacillus subtilis protease gene, yeast α factor gene, alkalophilic Bacillus No. .170 strain penicillinase gene, alkalophilic Aeromonas
s) No. 212 strain xylanase gene, alkalophilic Bacillus No. N-4 strain cellulase gene, alkalophilic Bacillus
The cellulase gene of No. 1139 strain and the like can be mentioned, but preferably the alkaliphilic Bacillus No. 170 strain penicillinase gene is used. A plasmid in which an appropriate promoter region, an appropriate signal peptide region, and a human IgG Fc region gene are linked in this order is most preferable. By using this plasmid, secretion of human IgG Fc region protein up to the periplasm is possible. become. As such a periplasmic secretory expression type plasmid, pPS-FC is preferably used.

さらに前記の各種プラスミドを組み合わせることによ
り、適当なプロモーター領域・シグナルペプチド領域下
流にヒトIgG Fc領域遺伝子を連結したDNA領域、及び好
アルカリ性バチルスNo.170株由来のExプロモーター領域
とpMB9プラスミド由来のKil遺伝子から成る菌体外分泌
生産に関与する情報を担うDNA領域とを合わせ持つよう
なプラスミドが得られる。このプラスミドを用いること
により、ヒトIgG Fc領域蛋白質の菌体外分泌が可能に
なる。このような菌体外分泌発現型プラスミドとして、
好ましくはpEXFC10、pEXFC100が用いられる。Furthermore, by combining the various plasmids described above, a DNA region in which a human IgG Fc region gene is ligated downstream of an appropriate promoter region / signal peptide region, and an Ex promoter region derived from the alkalophilic Bacillus No. 170 strain and a pMB9 plasmid derived Kil. It is possible to obtain a plasmid which has a DNA region which is composed of a gene and which carries information relating to extracellular secretion production. By using this plasmid, extracellular secretion of human IgG Fc region protein becomes possible. As such an extracellular secretion expression type plasmid,
Preferably, pEXFC10 and pEXFC100 are used.

なお、本発明において適当なプロモーター領域、シグナ
ルペプチド領域、ヒトIgG Fc領域遺伝子、Exプロモー
ター領域及びKil遺伝子は、これらと生物学的機能にお
いて同等なDNA領域、すなわち該DNA領域に対してヌクレ
オチドの置換、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの挿
入及びヌクレオチド配列の逆位その他の突然変異によっ
て関連づけられているDNA領域でもよいことはいうまで
もない。In the present invention, a suitable promoter region, signal peptide region, human IgG Fc region gene, Ex promoter region and Kil gene are DNA regions equivalent in biological function to those, that is, nucleotide substitution for the DNA region. It goes without saying that it may be a DNA region associated with a deletion of a nucleotide, an insertion of a nucleotide, an inversion of a nucleotide sequence or other mutation.

《ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質の生産》 かくして得られた、ヒトIgG Fc領域遺伝子菌体内発現
型プラスミド、ペリプラズム分泌発現型プラスミド及び
菌体外分泌型プラスミドを常法により適当な宿主に導入
して組換え微生物を得、これを培養することにより、ヒ
トIgG Fc領域蛋白質を生産させることができる。この
ような宿主としてはエシェリヒア（Escherichia）属に
属する微生物を有利に使用することができる。宿主とし
ては、前記のエシェリヒア・コリHB101株、同C600株、
同DP−supF株、同χ1776株、同LE392株等、通常のこの
種の技術分野で用いられる微生物が有利に用いられる。
なかでも、エシェリヒア・コリHB101株及び同C600株が
とりわけ好ましい。<< Production of Human Immunoglobulin G Fc Region Protein >> The thus obtained human IgG Fc region gene intracellular expression type plasmid, periplasmic secretion expression type plasmid and extracellular secretion type plasmid are introduced into a suitable host by a conventional method. A human IgG Fc region protein can be produced by obtaining a replacement microorganism and culturing it. As such a host, a microorganism belonging to the genus Escherichia can be advantageously used. As a host, the above Escherichia coli HB101 strain, the same C600 strain,
Microorganisms commonly used in this type of technical field, such as the DP-supF strain, the χ1776 strain, and the LE392 strain, are advantageously used.
Among them, Escherichia coli HB101 strain and C600 strain are particularly preferable.

このようにして得られた組換え微生物を、それ自体は公
知の方法で培養する。培地としては、ヒトIgG Fc領域
蛋白質の生産に適した培地であって、かつ宿主微生物の
生育に適した培地を用い得るが、たとえばM9培地〔T.Ma
niatisら編、Molecular Cloning P440（Cold Spring Ha
rbor Laboratory,New York 1982）〕、LB培地（T.Mania
tisら編,Molecular Cloning,P440（Cold Spring Harbor
Laboratory,Hew York 1982）〕、BPB培地（Difco
製）、Nutrient寒天培地等を基本培地として調製したも
のを用いればよい。その他、必要に応じて、炭素源、窒
素源の他にアミノ酸、ビタミン等の栄養素を添加しても
よいし、発現型プラスミドの宿主内安定化のために適当
量の抗生物質等を添加してもよい。The recombinant microorganism thus obtained is cultivated by a method known per se. As the medium, a medium suitable for the production of human IgG Fc region protein and a medium suitable for the growth of the host microorganism can be used, and for example, M9 medium [T.Ma.
Niatis et al., Molecular Cloning P440 (Cold Spring Ha
rbor Laboratory, New York 1982)], LB medium (T.Mania
tis et al., Molecular Cloning, P440 (Cold Spring Harbor
Laboratory, Hew York 1982)], BPB medium (Difco
Manufactured), Nutrient agar medium and the like prepared as a basic medium may be used. In addition, if necessary, in addition to carbon and nitrogen sources, amino acids, nutrients such as vitamins may be added, or an appropriate amount of antibiotics or the like may be added to stabilize the expression type plasmid in the host. Good.

培養は、pH、温度、酸素供給量を目的の組換え微生物に
適した条件で行なう。菌体内発現型プラスミドを有する
組換え微生物の培養においては、プロモーターを効率良
く機能させる目的で、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラ
クトシド等の薬剤を加えることもできる。菌体外分泌発
現型プラスミドを有する組換え微生物の培養において
は、該微生物が生育してその菌体量が最大に達したと
き、即ち対数増殖後期から培地中にFc領域蛋白質が生
成、蓄積するまでの時間中、同一培地で培養をそのまま
継続するのがよい。たとえばエシェリヒア属の微生物の
前記菌体量が最大に達したときから培地中にFc領域蛋白
質の生成、蓄積が停止すまでの時間は、ほぼ12〜48時間
の範囲である。なお、pH条件は特に影響されないが、pH
5〜８の範囲、特にpH7が適当である。また、ペリプラズ
ム分泌発現型プラスミドを有する組換え微生物の培養に
ついても、菌体外分泌型プラスミドを有する組換え微生
物と同様な方法で行なうことができる。The culture is carried out under conditions of pH, temperature and oxygen supply suitable for the target recombinant microorganism. In culturing a recombinant microorganism having an intracellular expression type plasmid, a drug such as isopropyl-β-D-thiogalactoside can be added for the purpose of allowing the promoter to function efficiently. In culturing a recombinant microorganism having an extracellular secretory expression type plasmid, when the microorganism grows and the amount of the bacterial cell reaches a maximum, that is, from the late logarithmic growth stage until the Fc region protein is produced and accumulated in the medium. During the period of time, it is preferable to continue the culture as it is in the same medium. For example, the time from when the amount of the Escherichia microorganisms reaches the maximum until the production and accumulation of the Fc region protein in the medium is stopped is in the range of about 12 to 48 hours. The pH conditions are not particularly affected, but the pH
A range of 5-8, especially pH 7, is suitable. Also, the cultivation of the recombinant microorganism having the periplasmic secretory expression type plasmid can be performed in the same manner as the recombinant microorganism having the extracellular secretory type plasmid.

培養後、たとえばオスモティック・ショック法〔C.Kato
ら、E.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.,18,339（198
3）〕を用いて、培養物を菌体内画分、ペリプラズム画
分及び菌体外画分に分画する。各画分におけるヒトIgC
Fc領域蛋白質の有無およびその会合の状態は、たとえ
ば市販のウサギ抗ヒトIgG−Fc成分抗血清及び酵素標識
抗ウサギIg抗体を用いたエンザイム・イムノアツセイ
（EIA）により確認できる。After culturing, for example, the osmotic shock method [C. Kato
EJ Appl. Microbiol. Biotechnol., 18 , 339 (198
3)] is used to fractionate the culture into an intracellular fraction, a periplasmic fraction and an extracellular fraction. Human IgC in each fraction
The presence or absence of the Fc region protein and its association state can be confirmed by, for example, an enzyme immunoassay (EIA) using a commercially available rabbit anti-human IgG-Fc component antiserum and an enzyme-labeled anti-rabbit Ig antibody.

各画分からのヒトIgG Fc領域蛋白質の精製は公知の通
常知られている蛋白質の分離、精製法に従えばよいが、
抗ヒトIgG−Fc成分抗体を用いたアフィニティーカラ
ム、クロマトグラフィーがとりわけ有利である。こうし
て得られたFc領域蛋白質精製品について、SDS−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動による分子量解析、アミノ酸
組成分析およびアミノ末端のアミノ酸配列解析を行なう
ことにより、シグナルペプチドが正しく切断されたFc領
域蛋白質の分泌が確認できる。Purification of the human IgG Fc region protein from each fraction may be carried out according to known and commonly known protein isolation and purification methods.
Affinity columns and chromatography using anti-human IgG-Fc component antibody are particularly advantageous. The Fc region protein purified product thus obtained was subjected to molecular weight analysis by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, amino acid composition analysis and amino terminal amino acid sequence analysis to confirm that the Fc region protein in which the signal peptide was correctly cleaved was secreted. I can confirm.

本発明において、アミノ酸、ペプチド、核酸、その他に
関し略号で表示する場合、それらはIUPAC−IUB生化学命
名委員会（CBN）により略号あるいは当該分野における
慣用略号に基づいて表示され、例えば下記の略号が使用
される。なお、アミノ酸などに関し光学異性体がある得
る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。In the present invention, when the abbreviations for amino acids, peptides, nucleic acids, etc. are indicated, they are indicated by the IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission (CBN) based on the abbreviations or conventional abbreviations in the art, such as used. When amino isomers may have optical isomers, L form is shown unless otherwise specified.

Cys:システイン Met:メチオニン Clu:グルタミン酸 Asp:アスパラギン酸 Lys:リジン Arg:アルギニン His:ヒスチジン Phe:フェニールアラニン Tyr:チロシン Trp:トリプトファン Pro:プロリン Asn:アスパラギン Gln:グルタミン Gly:グリシン Ala:アラニン Val:バリン Leu:ロイシン Ile:イソロイシン Ser:セリン Thr:スレオニン DNA:デオキシリボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS:ドデシル硫酸ナトリウム また、特に明示しなければ、微生物細胞が産生したヒト
免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質には、その単量体蛋白
質以外に、二量体等の多量体蛋白質も含まれるものとす
る。Cys: Cysteine Met: Methionine Clu: Glutamic acid Asp: Aspartic acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalalanine Tyr: Tyrosine Trp: Tryptophan Pro: Proline Asn: Asparagine Gln: Glutamine Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine DNA: Deoxyribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecylsulfate Also produced by microbial cells unless otherwise specified. In addition to the monomeric protein, the human immunoglobulin G Fc region protein described above also includes multimeric proteins such as dimers.

以下実施例を掲げて本発明について詳細に説明するが、
本発明は何らこれにより限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples.
The present invention is not limited to this.

実施例１（ヒト染色体DNAの単離） ヒト骨髄腫細胞ARH77株３×108個をガラス棒でつぶし、
２％ SDS存在下、プロテアーゼＫ（シグマ）で処理し
た後、TEバッファー〔10mM Tris−HCl（pH8.0）、1mM
EDTA〕で飽和したフェノールを加えた。遠心分離によ
り水相とフェノール相を分離し（フェノール抽出）、水
相をTEバッファー〔20mM Tris−HCl（pH7.5）、100mM
NaCl、5mM EDTA〕に対して透析した。リボヌクレア
ーゼＡ（シグマ）処理をし、再度フェノール抽出を行な
った後、TEバッファーに対して透析し、ヒト染色体DNA
約1.2mgを取得した。〔N.Blinら,Nucleic Acids Res.,
３,2303（1976）参照〕。Example 1 (isolation of human chromosomal DNA) 3 × 10 8 human myeloma cells ARH77 strain were crushed with a glass rod,
After treatment with protease K (Sigma) in the presence of 2% SDS, TE buffer [10 mM Tris-HCl (pH8.0), 1 mM
EDTA] saturated phenol was added. The aqueous phase and phenol phase are separated by centrifugation (phenol extraction), and the aqueous phase is TE buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM
NaCl, 5 mM EDTA]. After ribonuclease A (sigma) treatment and phenol extraction again, dialyzing against TE buffer, human chromosomal DNA
Obtained about 1.2 mg. (N. Blin et al., Nucleic Acids Res.,
3 , 2303 (1976)].

実施例２（ヒト遺伝子ライブラリーの作成） 実施例１で得られたヒト染色体DNA150μｇを後述する実
施例４に示した方法に準じて制限酵素EcoRI（宝酒造）
で部分分解した後、庶糖密度勾配遠心〔庶糖10〜40％
（wt/vol）、28000rpm×15時間、20℃〕を行ない、15Kb
p〜23Kbqに相当するDNA断片4.3μｇを得た。次にこのDN
A断片0.8μｇとシャロン4Aベクターとを連結を行ない、
シャロン4Aベクターの右のアームと左のアームの間にヒ
ト由来のDNAが挿入されたハイブリッドDNAを得た。連結
にはT4−DNAリガーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラト
リーズ）を用い、連結反応は66mM Tris−HCl（pH7.6）
−6.6mM MgCl2−10mM ジチオスレイトール−1mM ATP
水溶液中で、11℃、12時間行なった。得られたハイブリ
ッドDNAについて、イン・ヒドロ・パッケージングを行
ない、ヒト遺伝子ライブラリー（1.8×106PFU/μｇ、ヒ
ト染色体DNAの99％以上を含む）とした。Example 2 (Preparation of human gene library) 150 μg of human chromosomal DNA obtained in Example 1 was subjected to restriction enzyme EcoRI (Takara Shuzo) according to the method shown in Example 4 described later.
After partial decomposition with sucrose density gradient centrifugation [sucrose 10-40%
(Wt / vol), 28000 rpm x 15 hours, 20 ° C], 15 Kb
4.3 μg of a DNA fragment corresponding to p-23 Kbq was obtained. Then this DN
A fragment 0.8 μg and Sharon 4A vector were ligated,
A hybrid DNA in which human-derived DNA was inserted between the right arm and the left arm of the Sharon 4A vector was obtained. T4-DNA ligase (Bethesda Research Laboratories) was used for ligation, and 66mM Tris-HCl (pH7.6) was used for ligation reaction.
−6.6 mM MgCl 2 −10 mM Dithiothreitol −1 mM ATP
It was carried out at 11 ° C. for 12 hours in an aqueous solution. The obtained hybrid DNA was subjected to in-hydro packaging and used as a human gene library (1.8 × 10 6 PFU / μg, containing 99% or more of human chromosomal DNA).

実施例３（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子のスクリーニン
グ） 前記実施例２で得られたヒト由来のDNAを含むシャロン4
Aファージの集合（遺伝子ライブラリー）をエシェリヒ
ア・コリLE392株に感染させ、プラークを形成させた。
ヒト抗体遺伝子を含むクローンは、プラーク・ハイブリ
ダイゼーション法により、〔32P〕−標識ヒト免疫グロ
ブリンＧ Ｈ鎖Ｊ遺伝子で選択した。ヒトIgG遺伝子を
含むシャロン4AファージからのDNAの調製は、Thomasら
の方法〔M.Thomasら,J.Mol.Biol.,91,315（1974）参
照〕により行なった。Example 3 (Screening of human immunoglobulin G gene) Sharon 4 containing the human-derived DNA obtained in Example 2 above
A set of A phages (gene library) was infected with the Escherichia coli LE392 strain to form plaques.
The clone containing the human antibody gene was selected by [ 32 P] -labeled human immunoglobulin GH chain J gene by the plaque hybridization method. DNA was prepared from Sharon 4A phage containing human IgG gene by the method of Thomas et al. [See M. Thomas et al., J. Mol. Biol., 91 , 315 (1974)].

実施例４（制限酵素切断地図の作成） 実施例３で得られたヒトIgG遺伝子を含むシャロン4A D
NA1μｇを制限酵素切断用バッファー〔EcoRI、HpaI、Hi
nfI、TaqI、XbaI、XhoI切断では50mM Tris−HCl（pH7.
4）−100mM NaCl−10mM MgSO4水溶液を、Acc II、Bam
HI、ClaI、Hind III、PstI、RsaI、Sau3AI切断では10mM
Tris−HCl（pH7.5）−60mM NaCl−7mM MgCl2水溶液
を、BalI、BstNI、NaeI、Sst II切断では10mM、Tris−H
Cl（pH7.4）−10mM MgSO4−1mM ジチオスレイトール
水溶液を、そしてSmaI切断では10mM Tris−HCl（pH8.
0）−20mM KCl−7mM MgCl2−7mM ２−メルカプトエ
タノール水溶液を、それぞれ用いた。〕20μに溶解さ
せ、制限酵素（BstNI、ClaI、NaeIはニュー・イングラ
ンド・バイオラブズ製、Sst IIはペセスダ・リサーチ・
ラボラトリーズ製、RsaI、Sau3AI、TaqIはニッポン・ジ
ーン製、それ以外は宝酒造製を用いた。）２〜４ユニッ
トを添加して、37℃、１時間以上切断を行なった。制限
酵素BstNI及びTaqIによる切断は、60℃で１時間以上切
断を行なった。なお、二種類の制限酵素による切断を行
なう場合には、まず低塩濃度で作用する制限酵素で処理
し、次に所定濃度まで塩素度を上げてから、より高塩濃
度で作用する制限酵素で処理した。Example 4 (Creation of restriction enzyme cleavage map) Sharon 4A D containing the human IgG gene obtained in Example 3
1 μg NA for restriction enzyme digestion buffer [EcoRI, HpaI, Hi
For cleavage of nfI, TaqI, XbaI, and XhoI, 50 mM Tris-HCl (pH 7.
4) -100 mM NaCl-10 mM MgSO 4 aqueous solution, Acc II, Bam
10 mM for HI, ClaI, Hind III, PstI, RsaI, Sau3AI cleavage
Tris-HCl (pH 7.5) -60 mM NaCl-7 mM MgCl 2 aqueous solution was added to 10 mM Tris-H for cleavage with BalI, BstNI, NaeI and Sst II.
Cl (pH7.4) -10mM MgSO 4 -1mM dithiothreitol aqueous solution, and the SmaI cleavage 10mM Tris-HCl (pH8.
0) -20 mM KCl-7 mM MgCl 2 -7 mM 2 -mercaptoethanol aqueous solution was used, respectively. ] Dissolved in 20μ, restriction enzymes (BstNI, ClaI, NaeI made by New England Biolabs, Sst II made by Pethesda Research
Laboratories, RsaI, Sau3AI and TaqI were made by Nippon Gene, and the others were made by Takara Shuzo. ) 2 to 4 units were added and cut at 37 ° C for 1 hour or more. The restriction enzymes BstNI and TaqI were cleaved at 60 ° C. for 1 hour or longer. When cutting with two types of restriction enzymes, first treat with a restriction enzyme that acts at a low salt concentration, then raise the degree of chlorination to a predetermined concentration, then use a restriction enzyme that acts at a higher salt concentration. Processed.

制限酵素による切断後、４μの0.25％のブロモフェノ
ールブルー５％グリセロール水溶液を加え、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％〜2.5％）を行なった。ア
ガロースはシグマ社のタイプII電気泳動用を使用した。
電気泳動バッファーとして、40mM Tris−CH3COOH（pH
8.0）−1mM EDTA水溶液を用いた。厚さ2mmの垂直ゲル
にて、６〜9V/cmの電圧で1.5〜３時間電気泳動を行なっ
た。この電気泳動の際、DNA断片の分子量マーカーとし
て、λファージのDNAを制限酵素Hind IIIで切断したも
の（ベーリンガー・マンハイム）を用いた。電気泳動終
了後、アガロースゲル中のDNAを２μg/mlエチジウムブ
ロマイド水溶液で染色し、このゲルに対して長波長紫外
線を照射して、切断パターンの観察を行なった。各種制
限酵素単独による切断、及び二種の制限酵素の組合せに
よる切断、これらの切断パターンを解析することによ
り、第４図（Ａ）に示すような核制限酵素切断点の相対
位置関係を決定した。第４図（Ａ）はIgG遺伝子を含む
ヒト染色体DNAの制限酵素切断点地図を示す。After digestion with the restriction enzyme, 4 μm of 0.25% bromophenol blue 5% glycerol aqueous solution was added, and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8% to 2.5%) was performed. As the agarose, Sigma type II electrophoresis was used.
40 mM Tris-CH 3 COOH (pH
8.0) -1 mM EDTA aqueous solution was used. Electrophoresis was performed on a vertical gel having a thickness of 2 mm at a voltage of 6 to 9 V / cm for 1.5 to 3 hours. In this electrophoresis, as a molecular weight marker of the DNA fragment, a DNA of λ phage cleaved with a restriction enzyme Hind III (Boehringer Mannheim) was used. After the electrophoresis was completed, the DNA in the agarose gel was stained with an aqueous solution of 2 μg / ml ethidium bromide, and the gel was irradiated with long-wavelength ultraviolet light to observe the cleavage pattern. Cleavage with various restriction enzymes alone and with combination of two types of restriction enzymes, and by analyzing these cleavage patterns, the relative positional relationship of nuclear restriction enzyme cleavage points as shown in FIG. 4 (A) was determined. . FIG. 4 (A) shows a restriction enzyme cleavage point map of human chromosomal DNA containing IgG gene.

実施例５（ヒト免疫グロブリンＧ遺伝子断片のサブクロ
ーニング） ヒトIgG遺伝子を含むシャロン4A DNA3μｇを実施例４
の方法に準じて制限酵素Hind IIIで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）を行なった。ヒトIgG
Fc領域遺伝子を含む約8.2KbqのDNAの部分に相当するバ
ンドを切出し、そのアガロースゲル断片を３倍量（vol/
wt）の8M NaClO4水溶液に溶解させた。Chenらのグラス
フィルター法〔C.W.Chenら,Anal.Biochem.,101,339（19
80）〕により、約8.2KbqのDNA断片をアガロースゲルに
より回収した。一方、大腸菌用プラスミドpBR3221μｇ
を実施例４に準じて制限酵素Hind IIIで切断したものに
対して、アルカリ性ホスファターゼ（E.coliC75）（宝
酒造）を0.5ユニット加えて、37℃で１時間反応させ
た。反応終了後、反応液中のアルカル性ホスファターゼ
を失活・除去するために、フェノール抽出を３回繰返し
た。このようにして得られたbBR322のHind III−アルカ
リ性ホスファターゼ処理液を、ゲルより回収した約8.2K
bp Hind III断片水溶液と混ぜ、エタノール沈澱の後、
連結反応用バッファー（実施例２を参照）50μに溶解
させる。２ユニットのT4−DNAリガーゼを加え、11℃、1
2時間反応させて、連結反応を行なった。Example 5 (Subcloning of human immunoglobulin G gene fragment) 3 μg of Sharon 4A DNA containing human IgG gene was used in Example 4
Cleavage was carried out with the restriction enzyme Hind III according to the method of 1. above, and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) was performed. Human IgG
A band corresponding to a DNA portion of about 8.2 Kbq containing the Fc region gene was cut out, and the agarose gel fragment was cut in a 3-fold amount (vol /
wt) 8M NaClO 4 aqueous solution. Chen et al.'S glass filter method [CW Chen et al., Anal. Biochem., 101 , 339 (19
80)], a DNA fragment of about 8.2 Kbq was recovered by agarose gel. On the other hand, E. coli plasmid pBR3221 μg
According to Example 4, 0.5 unit of alkaline phosphatase (E.coli C75) (Takara Shuzo) was added to the digested product with the restriction enzyme Hind III, and the mixture was reacted at 37 ° C. for 1 hour. After completion of the reaction, phenol extraction was repeated 3 times in order to inactivate and remove the alcal phosphatase in the reaction solution. The thus-obtained HindIII-alkaline phosphatase-treated solution of bBR322 was recovered from the gel at about 8.2K.
After mixing with bp Hind III fragment aqueous solution and ethanol precipitation,
Dissolve in 50 μl of ligation reaction buffer (see Example 2). Add 2 units of T4-DNA ligase and add
After reacting for 2 hours, a ligation reaction was performed.

エシェリヒア・コリC600株（ATCC33525）の形質転換
は、通常のCaCl2法（M.V.Norgardらの方法，前記）の改
良法で行なった。すなわち、5mlのＬ培地（１％ トリ
プトン、0.5％ 酵母エキス,0.5％ NaCl,pH7.2）に大
腸菌C600株の18時間培養基を接種し、菌体を含む培養液
の600nmにおける濁度（OD600）0.3まで生育させる。菌
体を冷たいマグネシウム・バッファー〔0.1M NaCl、5m
M MgCl2、5mM Tris−HCl（pH7.6、０℃）〕中で２回
洗い、2mlの冷やしたカルシウム・バッファー〔100mM
CaCl2、250mM KCl、5mM MgCl2、5mM Tris−HCl（pH
7.6、０℃）〕中に再懸濁させ、０℃で25分間放置す
る。次に菌体をこの容量の1/10にカルシウム・バッファ
ーの中で濃縮し、連結後のDNU水溶液と2:1（vol.:vo
l.）混合する。この混合物を60分間、０℃で保った後、
1mlのLBG培地（１％ トリプトン、0.5％ 酵母エキ
ス、１％ NaCl、0.08％ グルコース、pH7.2）を添加
し、37℃で１時間振とう培養する。培養液を、選択培地
（アンピシリン30μg/mlを含むＬ培地プレート）に100
μ／プレートの割合で接種する。プレートを37℃で１
晩培養して、形質転換株を生育させる。得られたアンピ
シリン耐性のコロニーより、公知の方法を用いてDNAを
調製し、アガロースゲル電気泳動により、目的のサブク
ローンpTJ1B（約12.6Kbq）を確認した。Transformation of the Escherichia coli C600 strain (ATCC33525) was performed by an improved method of the ordinary CaCl 2 method (the method of MV Norgard et al., Supra). That is, 5 ml of L medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl, pH7.2) was inoculated with the culture medium of Escherichia coli C600 for 18 hours, and the turbidity (OD 600 ) Grow to 0.3. Bacteria are cold magnesium buffer [0.1M NaCl, 5m
M MgCl 2 , 5 mM Tris-HCl (pH 7.6, 0 ° C)] and washed twice, 2 ml of chilled calcium buffer [100 mM
CaCl 2 , 250 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , 5 mM Tris-HCl (pH
7.6, 0 ° C)] and left at 0 ° C for 25 minutes. Next, the cells were concentrated to 1/10 of this volume in calcium buffer, and after ligation, they were mixed with a 2: 1 (vol.
l.) Mix. After keeping the mixture at 0 ° C for 60 minutes,
Add 1 ml of LBG medium (1% tryptone, 0.5% yeast extract, 1% NaCl, 0.08% glucose, pH 7.2) and shake-culture at 37 ° C for 1 hour. Add 100 to 100 ml of culture medium (L medium plate containing 30 μg / ml ampicillin).
Inoculate at a ratio of μ / plate. Plate 1 at 37 ℃
After overnight culture, transformants are grown. DNA was prepared from the obtained ampicillin-resistant colonies by a known method, and the target subclone pTJ1B (about 12.6 Kbq) was confirmed by agarose gel electrophoresis.

前記実施例４の方法により作成した、このサブクローン
の制限酵素切断点地図を第４図（Ｂ）に示した。この第
４図（Ｂ）においてPstI−（３）からHind III−（３）
の間に、PstIサイトが３〜４個存在することは確認した
が、その位置についての確認は行なっていない。A restriction enzyme cleavage point map of this subclone prepared by the method of Example 4 is shown in FIG. 4 (B). In FIG. 4 (B), PstI- (3) to Hind III- (3)
It was confirmed that there were 3 to 4 PstI sites in between, but the position was not confirmed.

さらに、前記プラスミドpTJ1BのPstI−（２）PstI−
（３）のDNA断片（約1.7Kbp）を、pTJ1Bの場合とほぼ同
様の手法により、プラスミドpBR322のPstIサイトに挿入
し、プラスミドpTJ5（約6.1Kbq）を作成した。目的のク
ローンは、テトラサイクリン耐性の形質転換株の中から
選択した。得られたサブクローンの制限酵素切断点地図
を、第４図（Ｃ）に示した。Furthermore, PstI- (2) PstI-of the plasmid pTJ1B
The DNA fragment of (3) (about 1.7 Kbp) was inserted into the PstI site of the plasmid pBR322 by almost the same method as that for pTJ1B to prepare the plasmid pTJ5 (about 6.1 Kbq). The target clone was selected from the transformants resistant to tetracycline. The restriction enzyme cleavage point map of the obtained subclone is shown in FIG. 4 (C).

実施例６（ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域遺伝子DNA塩
基配列の決定） ヒトIgG Fc領域遺伝子のDNA塩基配列は、マキサム・ギ
ルバート法により決定した。Example 6 (Determination of human immunoglobulin G Fc region gene DNA base sequence) The DNA base sequence of the human IgG Fc region gene was determined by the Maxam-Gilbert method.

たとえば、前記実施例５において作成されたサブクロー
ンpTJ5 DNA約50μｇを実施例４の方法に準じてSmaIで
切断する。得られたDNA断片をアルカリ性ホスファター
ゼで脱ホスホリル化し、ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐ
−Ｌバイオケミカルズ）５ユニットを用いて〔γ−
32P〕−ATPで標識した。ポリヌクレオチドキナーゼ反応
は50mM Tris−HCl（pH9.5）−10mM MgCl2−5mM ジチ
オスレイトール水溶液中で行ない〔γ−32P〕−ATPはア
マーシャム製を100μCi分用いた。32P標識DNA断片をPst
Iで切断した後、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲ
ル濃度５％）により目的のDNA断片を分離し、後述の実
施例７の方法に従ってゲルからの抽出を行なった。得ら
れた32P標識−SmaIPstI断片について、各塩基特異的
な部分分解反応を行ない、7M尿素を含むポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ゲル濃度８％〜23％）で分離した。
２〜７日間、−80℃でオートラジオグラフィーを行なっ
た後、分解パターンの解析を行ない、Fc領域遺伝子の塩
基配列決定のための資料とした。For example, about 50 μg of the subclone pTJ5 DNA prepared in Example 5 is cleaved with SmaI according to the method of Example 4. The obtained DNA fragment is dephosphorylated with alkaline phosphatase to give a polynucleotide kinase (P
-L biochemicals) 5 units [γ-
It was labeled with 32 P] -ATP. The polynucleotide kinase reaction was carried out in an aqueous solution of 50 mM Tris-HCl (pH 9.5) -10 mM MgCl 2 -5 mM dithiothreitol, and [γ- 32 P] -ATP was manufactured by Amersham for 100 μCi. 32 P-labeled DNA fragment
After cutting with I, the target DNA fragment was separated by polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), and extracted from the gel according to the method of Example 7 described later. The resulting 32 P-labeled SmaIPstI fragment was subjected to partial base-specific partial decomposition reaction and separated by polyacrylamide gel electrophoresis containing 7 M urea (gel concentration 8% to 23%).
After performing autoradiography at −80 ° C. for 2 to 7 days, the decomposition pattern was analyzed and used as the data for determining the nucleotide sequence of the Fc region gene.

一方、pTJ5をPstIで切断した場合には、３′末端標識キ
ット（アマーシャム）を用いて、〔α−32P〕−ddATPに
よる標識を行なった。この32P標識DNA断片をSmaIで切断
した後、目的のDNA断片のポリアクリルアミドゲル電気
泳動（ゲル濃度５％）による分離・回収を行なった。得
られた32P標識−PstISmaI断片についても、上記手順
に従って解析を行ない、Fc領域遺伝子の塩基配列決定の
ための資料とした。On the other hand, when pTJ5 was cleaved with PstI, it was labeled with [α- 32 P] -ddATP using a 3'end labeling kit (Amersham). After the 32 P-labeled DNA fragment was cleaved with SmaI, the target DNA fragment was separated and collected by polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%). The obtained 32 P-labeled-PstISmaI fragment was also analyzed according to the above procedure, and used as the data for determining the nucleotide sequence of the Fc region gene.

実施例７（Fc領域CH3部位遺伝子のクローニング） 実施例５で得られたプラスミドpTJ5を、実施例４の方法
に準じて制限酵素PstIで切断した後、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度0.8％）を行ない、Fc領域遺伝子を含
む約1.7KbpのDNA断片を実施例５の方法でゲルより回収
した。得られたDNA断片を、実施例４の方法で制限酵素N
aeIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）を行なった。CH3部位遺伝子を含む約0.6Kbp
のDNAの部分に相当するバンドを切断し、そのポリアク
リルアミドゲル細片を細かく破砕した後、２〜5mlの溶
出用バッファー〔500mM NH4OAc,1mM EDTA,0.1％ SDS
（pH7.5）〕を加え、37℃で一晩振とうした。遠心分離
により、目的のDNAを含む水相の回収を行なった。さら
に得られたDNA断片を、実施例４の方法で制限酵素RsaI
で切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
５％）の後、CH3部位を含む約310bpのDNA断片を、上記
と同様な方法により、ポリアクリルアミドゲルから回収
した。Example 7 (Cloning of Fc region C H 3 site gene) The plasmid pTJ5 obtained in Example 5 was digested with the restriction enzyme PstI according to the method of Example 4, and then subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%). The DNA fragment of about 1.7 Kbp containing the Fc region gene was recovered from the gel by the method of Example 5. The obtained DNA fragment was treated with the restriction enzyme N by the method of Example 4.
It was cleaved with aeI and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%). About 0.6 Kbp including C H 3 site gene
After cutting the band corresponding to the DNA part of the DNA fragment and finely crushing the polyacrylamide gel fragment, 2 to 5 ml of elution buffer [500 mM NH 4 OAc, 1 mM EDTA, 0.1% SDS
(PH 7.5)] was added and the mixture was shaken overnight at 37 ° C. The aqueous phase containing the target DNA was recovered by centrifugation. The obtained DNA fragment was treated with the restriction enzyme RsaI by the method of Example 4.
After cleavage with polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), a DNA fragment of about 310 bp containing the C H 3 site was recovered from the polyacrylamide gel by the same method as described above.

こうして得られたCH3部位遺伝子を含む約310bpのRsaI
NaeIのDNA断片を、実施例５の方法に準じてプラスミドp
BR322のBaIIサイトに挿入し、CH3部位遺伝子の読みとり
方向がプラスミドpBR322中のテトラサイクリン耐性遺伝
子の読みとり方向と一致する方向（第５図において時計
まわりの方向）に挿入されたプラスミドpFC70（約4.7Kb
p）を作成した。pFC70作成の方法を第５図に示した。Approximately 310 bp RsaI containing the C H 3 site gene thus obtained
The DNA fragment of NaeI was treated with the plasmid p according to the method of Example 5.
Plasmid pFC70 (approx. 4.7) that was inserted into the BaII site of BR322 and inserted in the direction in which the reading direction of the C H 3 site gene coincided with the reading direction of the tetracycline resistance gene in plasmid pBR322 (clockwise direction in FIG. 5). Kb
p) was created. The method for preparing pFC70 is shown in FIG.

実施例８（Fc領域CH2部位遺伝子とCH3部位遺伝子の連
結） 実施例７で得られた、Fc領域遺伝子を含む約1.7KbpのDN
A断片を、実施例４の方法に準じて制限酵素Sau3AI及びT
aqIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）の後、CH2部位遺伝子を含む約240bpのDNA断
片約0.5μｇを、実施例７の方法に準じて、ポリアクリ
ルアミドゲルから回収した。Example 8 (ligation of Fc region C H 2 site gene and C H 3 site gene) About 1.7 Kbp DN containing the Fc region gene obtained in Example 7
The A fragment was treated with the restriction enzymes Sau3AI and T according to the method of Example 4.
After cutting with aqI and polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), about 0.5 μg of a DNA fragment of about 240 bp containing the C H 2 site gene was recovered from the polyacrylamide gel according to the method of Example 7. did.

CH2部位とCH3部位の連結部分に相当する、第６図記載の
塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチドを、上の鎖
と下の鎖とに分けて化学合成した。オリゴヌクレオチド
の合成は全自動DNA合成機（アプライド・バイオシステ
ムズ、モデル380A）を用いて、ホスフォアミダイト法に
より行なった。合成オリゴヌクレオチドの精製は、アプ
ライド・バイオシステムズ社のマニュアルに準じて行な
った。すなわち、合成オリゴヌクレオチドを含むアンモ
ニア水溶液を55℃で一晩保つことにより、DNA塩素の保
護基をはずし、セファデックスＧ−50ファイン・ゲル
（ファルマシア）を用いたゲル濾過によって、高分子量
の合成オリゴヌクレオチド画分の分取する。ついで、7M
尿素を含むポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度
20％）の後、紫外線シャドウイング法により泳動パター
ンの観察を行ない、目的とする大きさのバンド部分を切
出して、実施例７の方法に準じて合成オリゴヌクレオチ
ドをポリアクリルアミドゲルより回収した。最後に合成
オリゴヌクレオチドを含む溶液をゲル濾過カラム（セフ
ァデックスＧ−50）にかけることにより、合成オリゴヌ
クレオチドの精製品を得た。なお、必要に応じて、ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動を繰り返し、合成オリゴヌ
クレオチドの純度の向上をはかった。このようにして得
られた合成オリゴヌクレオチド精製物0.1〜1.0μｇの、
実施例６の方法に準じて、1mM ATP存在下でポリヌクレ
オチドキナーゼ反応を行ない、５′末端側をリン酸化す
る。５′末端をリン酸化した、上の鎖と下の鎖に相当す
る２本の合成オリゴヌクレオチドを混合し、その水溶液
温度を70℃から室温まで徐々に冷却することにより、ア
ニーリングを行なった。以上のようにして、CH2部位とC
H3部位との連結部分に相当するTaqISmaIのDNA断片
（約68bp）を取得した。A double-stranded oligonucleotide having a base sequence shown in FIG. 6, which corresponds to the connecting portion between the C H 2 site and the C H 3 site, was chemically synthesized by dividing it into an upper chain and a lower chain. Oligonucleotides were synthesized by the phosphoramidite method using a fully automatic DNA synthesizer (Applied Biosystems, model 380A). Purification of the synthetic oligonucleotide was performed according to the manual of Applied Biosystems. That is, by keeping an aqueous ammonia solution containing synthetic oligonucleotides at 55 ° C overnight, the protecting group of DNA chlorine was removed, and high molecular weight synthetic oligos were obtained by gel filtration using Sephadex G-50 Fine Gel (Pharmacia). Fractionate the nucleotide fractions. Then, 7M
Polyacrylamide gel electrophoresis containing urea (gel concentration
After 20%), the migration pattern was observed by the ultraviolet shadowing method, the band portion of the desired size was cut out, and the synthetic oligonucleotide was recovered from the polyacrylamide gel according to the method of Example 7. Finally, the solution containing the synthetic oligonucleotide was applied to a gel filtration column (Sephadex G-50) to obtain a purified product of the synthetic oligonucleotide. If necessary, polyacrylamide gel electrophoresis was repeated to improve the purity of the synthetic oligonucleotide. 0.1-1.0 μg of the purified synthetic oligonucleotide thus obtained,
According to the method of Example 6, a polynucleotide kinase reaction is carried out in the presence of 1 mM ATP to phosphorylate the 5'end side. Annealing was performed by mixing two synthetic oligonucleotides corresponding to the upper strand and the lower strand, which were phosphorylated at the 5'end, and gradually cooling the aqueous solution temperature from 70 ° C to room temperature. As described above, C H 2 site and C
A DNA fragment of TaqISmaI (about 68 bp) corresponding to the ligated portion with the H 3 site was obtained.

一方、前記実施例７で作成したプラスミドpFC70 DNA約
５μｇを、実施例４記載の制限酵素SmaI切断用バッファ
ーに溶解し、２〜５ユニットのSmaIを加えて20℃で15〜
45分反応させて部分分解を行なう。フェノール抽出によ
りSmaIを失活させた後、実施例４の方法に準じて、制限
酵素BamHIによる切断を行なう。アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度0.8％）の後、CH3部位遺伝子とベクターの
大部分を含む第６図記載のBamHISmaI−（１）のDNA断
片（約3.6Kbp）を、実施例５の方法に準じてアガロース
ゲルより回収した。On the other hand, about 5 μg of the plasmid pFC70 DNA prepared in Example 7 was dissolved in the restriction enzyme SmaI cleavage buffer described in Example 4, 2 to 5 units of SmaI was added, and the solution was added at 15 ° C. for 15 to 15 ° C.
Partially decompose by reacting for 45 minutes. After inactivating SmaI by phenol extraction, it is cleaved with the restriction enzyme BamHI according to the method of Example 4. After agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), the DNA fragment (about 3.6 Kbp) of BamHISmaI- (1) shown in FIG. 6 containing the C H 3 site gene and most of the vector was subjected to the method of Example 5. It was recovered from the agarose gel according to

以上のようにして得られた、CH2部位遺伝子を含むSau3A
ITaqIのDNA断片、CH2部位とCH3部位の連結部分に相当
するTaqISmaIのDNA断片、そしてCH3部位とベクター部
分を含むBamHI（Sau3AI）SmaI−（１）のDNA断片を混
合し、実施例５の方法に準じて、CH2部位遺伝子とCH3部
位遺伝子がイントロンを介さずに連結された遺伝子を含
むプラスミドpFC77（約3.9Kbp）を作成した。第６図にp
FC77の作成方法を示した。Sau3A containing the C H 2 site gene obtained as described above
Mix the ITaqI DNA fragment, the TaqISmaI DNA fragment corresponding to the junction between the C H 2 site and the C H 3 site, and the BamHI (Sau3AI) SmaI- (1) DNA fragment containing the C H 3 site and the vector site. According to the method of Example 5, a plasmid pFC77 (about 3.9 Kbp) containing a gene in which a C H 2 site gene and a C H 3 site gene were linked without an intron was prepared. P in Figure 6
The method of making FC77 was shown.

実施例９（Fc領域遺伝子とtrpプロモーターとの連結） 実施例８で得られたプラスミドpFC77を、実施例４の方
法に準じて制限酵素Sst II及びPstIで切断し、アガロー
スゲル電気泳動（ゲル濃度0.8.％）の後、CH2部位遺伝
子の後半部分、CH3部位遺伝子全域及びベクターの一部
を含む、第７図記載のSst IIPstIのDNA断片（約2.7Kb
p）を、実施例５の方法に準じてアガロースゲルより回
収した。Example 9 (ligation of Fc region gene and trp promoter) The plasmid pFC77 obtained in Example 8 was cleaved with restriction enzymes Sst II and Pst I according to the method of Example 4 and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration). 0.8 after.%), the latter part of the C H 2 region gene comprises a portion of the C H 3 region genes throughout and vectors, DNA fragments of Sst IIPstI in Figure 7, wherein (approximately 2.7Kb
p) was recovered from the agarose gel according to the method of Example 5.

次に、実施例７で得られたFc領域遺伝子を含む約1.7Kbp
のDNA断片を、実施例４の方法に準じて制限酵素BstNI及
びSst IIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ゲル濃度５％）の後、CH2部位遺伝子の前半部分を含
む約171bpのBstNI−（５）Sst IIIのDNA断片を、実施
例７の方法に準じて、ポリアクリルアミドゲルから回収
した。Next, about 1.7 Kbp containing the Fc region gene obtained in Example 7
Was cleaved with restriction enzymes BstNI and SstII according to the method of Example 4 and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), and then about 171 bp containing the first half of the C H 2 site gene was digested. The BstNI- (5) SstIII DNA fragment was recovered from the polyacrylamide gel according to the method of Example 7.

さらに、プロモーターとFc領域遺伝子との連結部分に相
当する、第７図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌ
クレオチド（約39bp）を、実施例８の方法に準じて作成
した。このClaIBstNI−（５）のDNA断片中には、trp
プロモーターとの連結のための制限酵素ClaIサイト、AT
Gという塩基配列で表わされる翻訳開始コドン、ｈ部位
遺伝子及びCH2部位遺伝子の一部が連続して含まれてお
り、このDNA断片を用いることにより、イントロンのな
いFc領域（ｈ−CH2−CH3部位）遺伝子をトリプトファン
・オペロン・SD配列下流に適当な距離をへだてて連結す
ることが可能になった。Furthermore, a double-stranded oligonucleotide (about 39 bp) having the nucleotide sequence shown in FIG. 7 corresponding to the connecting portion between the promoter and the Fc region gene was prepared according to the method of Example 8. In this ClaIBstNI- (5) DNA fragment, trp
Restriction enzyme ClaI site for ligation with promoter, AT
The translation initiation codon represented by the nucleotide sequence of G, the h site gene, and a part of the C H 2 site gene are continuously contained. By using this DNA fragment, the intron-free Fc region (h-C H The 2-C H 3 site) gene can be ligated to the downstream of the tryptophan / operon / SD sequence with an appropriate distance.

一方、trpプロモーターを含むプラスミドpYS31N（約4.7
Kbp）を、実施例４の方法に準じて制限酵素PstI及びCla
Iで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）
の後、trpプロモーター及びベクターの一部を含む、第
７図記載のPstIClaIのDNA断片（約1.1Kbp）を、実施
例５の方法によりアガロースゲルより回収した。On the other hand, plasmid pYS31N (about 4.7
Kbp) according to the method of Example 4 with the restriction enzymes PstI and Cla.
Cut with I and run agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%)
After that, the PstIClaI DNA fragment (about 1.1 Kbp) shown in FIG. 7 containing the trp promoter and a part of the vector was recovered from the agarose gel by the method of Example 5.

以上のようにして得られた、CH2部位後半とCH3部位遺伝
子とベクターの一部を含むSst IIPstIのDNA断片、CH2
部位遺伝子前半部分を含むBstNI−（５）Sst IIのDNA
断片、プロモーターとFc領域遺伝子との連結部分に相当
するClaIBstNI−（５）のDNA断片、そしてtrpプロモ
ーターとベクターの一部を含むPstIClaIのDNA断片を
混合し、実施例５の方法に準じて、Fc領域（ｈ−CH2−C
H3部位）遺伝子発現型プラスミドpFC203（約4.0Kbp）を
作成した。第７図にpFC203の作成方法を示した。The Sst II PstI DNA fragment containing the latter half of the C H 2 site and the C H 3 site gene and a part of the vector obtained as described above, C H 2
BstNI- (5) Sst II DNA containing the first half of the site gene
The fragment, the DNA fragment of ClaIBstNI- (5) corresponding to the connecting portion between the promoter and the Fc region gene, and the DNA fragment of PstIClaI containing a part of the trp promoter and the vector were mixed, and according to the method of Example 5, Fc region (h-C H2 -C
H3 site) Gene expression type plasmid pFC203 (about 4.0 Kbp) was prepared. FIG. 7 shows the method for preparing pFC203.

実施例10（Fc領域遺伝子翻訳終止コドンのタンデム化） 実施例９で得られたFc領域遺伝子発現型プラスミドpFC2
03を、実施例８に記載の方法に準じて、制限酵素SmaIで
部分分解した後、制限酵素PstIによる完全分解を行な
う。アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）の後、F
c領域遺伝子の大部分とベクターの一部を含む第８図記
載のSmaI−（２）PstIのDNA断片（約1.8Kbp）を、実
施例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した。Example 10 (tandemization of translation stop codon of Fc region gene) Fc region gene expression type plasmid pFC2 obtained in Example 9
According to the method described in Example 8, 03 is partially digested with the restriction enzyme SmaI and then completely digested with the restriction enzyme PstI. After agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), F
The SmaI- (2) PstI DNA fragment (about 1.8 Kbp) shown in FIG. 8 and containing most of the c region gene and part of the vector was recovered from the agarose gel according to the method of Example 5.

また、CH3部位遺伝子後部と翻訳終止コドンに相当す
る、第８図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレ
オチド（約17bp）を、実施例８の方法に準じて作成し
た。このSmaI−（２）BamHIのDNA断片には、CH3部位
遺伝子の一部、TAATAGという塩基配列で表わされるタン
デム化翻訳終止コドン及びベクターとの連結のための制
限酵素BamHIサイトが含まれており、このDNA断片を用い
ることによりFc領域遺伝子の翻訳終止コドンのタンデム
化が可能になった。Further, a double-stranded oligonucleotide (about 17 bp) having the nucleotide sequence shown in FIG. 8 corresponding to the rear part of the C H 3 site gene and the translation stop codon was prepared according to the method of Example 8. This SmaI- (2) BamHI DNA fragment contains a part of the C H 3 site gene, a tandem translation stop codon represented by the base sequence TAATAG, and a restriction enzyme BamHI site for ligation with a vector. However, the use of this DNA fragment enabled the tandemization of the translation stop codon of the Fc region gene.

一方、プラスミドpBR322を、実施例４の方法に準じて制
限酵素PstI及びBamHIで切断、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度0.8％）の後、ベクターの大部分を含む、第
８図記載のBamHIPstIのDNA断片（約3.2Kbp）を、実施
例５の方法に準じてアガロースゲルより回収した。On the other hand, the plasmid pBR322 was digested with the restriction enzymes PstI and BamHI according to the method of Example 4, subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), and then containing most of the vector, the DNA of BamHIPstI shown in FIG. The fragment (about 3.2 Kbp) was recovered from the agarose gel according to the method of Example 5.

以上のようにして得られた、Fc領域遺伝子の大部分とベ
クターの一部を含むSmaI−（２）PstIのDNA断片、CH3
部位遺伝子後部とタンデム化翻訳終止コドンを含むSmaI
−（２）BamHIのDNA断片、そしてベクターの大部分を
含むBamHIPstIのDNA断片を混合し、実施例５の方法に
準じて、タンデム化翻訳終止コドンを有するFc領域遺伝
子発現型プラスミドpFC211（約5.0Kbp）を作成した。第
８図にpFC211の作成方法を示した。The SmaI- (2) PstI DNA fragment containing most of the Fc region gene and part of the vector obtained as described above, C H 3
SmaI containing the site gene posterior and tandemized translation stop codon
-(2) The BamHI DNA fragment and the BamHIPstI DNA fragment containing most of the vector are mixed, and the Fc region gene-expressing plasmid pFC211 (about 5.0%) having a tandem translation termination codon is mixed according to the method of Example 5. Kbp). Figure 8 shows the method for making pFC211.

実施例11（Fc領域遺伝子とtacプロモーターとの連結） 実施例９で得られたFc領域遺伝子発現型プラスミドpFC2
03を、実施例４の方法に準じて制限酵素ClaIで切断し、
ポリメラーゼ用バッファー〔50mM Tris−HCl（pH7.
2）、10mM MgSO4、0.1mM ジチオスレイトール,50μg/
ml ウシ血清アルブミン〕40μに溶解し、0.25mMのdG
TP及び0.25mMのdCTP存在下で、２ユニットのDNAポリメ
ラーゼＩ・ラージ・フラグメント（ベセスダ・リサーチ
・ラボラトリーズ）を加える。37℃で30分間反応させ
て、末端の平滑化をはかる。次にこのDNA断片を、実施
例４の方法に準じて制限酵素PstIで切断し、アガロース
ゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）の後、Fc領域遺伝子全
域とベクターの大部分を含む、第９図記載の約2.8Kbpの
DNA断片を、アガロースゲルより回収した。Example 11 (ligation of Fc region gene and tac promoter) Fc region gene expression type plasmid pFC2 obtained in Example 9
03 was cleaved with the restriction enzyme ClaI according to the method of Example 4,
Polymerase buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7.
2), 10 mM MgSO 4 , 0.1 mM dithiothreitol, 50 μg /
ml bovine serum albumin] 40 μL, and add 0.25 mM dG
Two units of DNA Polymerase I Large Fragment (Bethesda Research Laboratories) are added in the presence of TP and 0.25 mM dCTP. Incubate at 37 ℃ for 30 minutes to smooth the ends. Next, this DNA fragment was digested with the restriction enzyme PstI according to the method of Example 4, and after agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), the entire Fc region gene and most of the vector were contained. About 2.8 Kbp described
The DNA fragment was recovered from the agarose gel.

次に、tacプロモーターを含むプラスミドpDR540（約4.0
Kbp,ファルマシア）DNAを、実施例４の方法に準じて制
限酵素BamHIで切断し、ついで上記の方法に準じて、dGT
P、dATP、dTTP、dCTP存在下、DNAポリメラーゼＩ・ラー
ジ・フラグメント処理により、末端の平滑化を行なう。
次にこのDNA断片を、実施例４の方法に準いて制限酵素P
stIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8
％）の後、tacプロモーターとベクターの一部を含む、
第９図記載の約1.1KbpのDNA断片を、アガロースゲルよ
り回収した。Next, plasmid pDR540 (about 4.0
Kbp, Pharmacia) DNA was cleaved with the restriction enzyme BamHI according to the method of Example 4, and then dGT was obtained according to the above method.
In the presence of P, dATP, dTTP and dCTP, the ends are blunted by treatment with DNA polymerase I large fragment.
Next, this DNA fragment was treated with the restriction enzyme P according to the method of Example 4.
Digest with stI and perform agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8
%) Followed by the tac promoter and part of the vector,
A DNA fragment of about 1.1 Kbp shown in FIG. 9 was recovered from an agarose gel.

以上のようにして得られた、Fc領域遺伝子全域とベクタ
ーの大部分を含む約2.8KbpのDNA断片と、tacプロモータ
ーとベクターの一部を含む約1.1KbpのDNAとを混合し、
実施例５の方法に準じて、tacプロモーターの下流にFc
領域遺伝子が連結した形の発現型プラスミドpFC361（約
3.9Kbp）を作成した。第９図にpFC361の作成方法を示し
た。Obtained as described above, a DNA fragment of about 2.8 Kbp containing the entire Fc region gene and most of the vector, and about 1.1 Kbp DNA containing part of the tac promoter and vector, mixed,
According to the method of Example 5, Fc was added downstream of the tac promoter.
Expression plasmid pFC361 (approx.
3.9 Kbp). Fig. 9 shows the method for preparing pFC361.

上記により得られたFc領域遺伝子発現型プラスミドpFC3
61DNAを、実施例４の方法に準じて制限酵素Sst II及びP
stIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8
％）の後、ベクターの一部、tacプロモーター及びFc領
域遺伝子前半部分を含む、第９図記載のSst IIPstIの
DNA断片（約1.3Kbp）を、実施例５の方法によりアガロ
ースゲルより回収した。Fc region gene expression type plasmid pFC3 obtained as described above
61 DNA was digested with the restriction enzymes Sst II and P according to the method of Example 4.
Digest with stI and perform agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8
%) Followed by a part of the vector, the tac promoter and the first half of the Fc region gene, the Sst II PstI of FIG.
The DNA fragment (about 1.3 Kbp) was recovered from the agarose gel by the method of Example 5.

また、実施例10により得られたタンデム化翻訳終止コド
ンを有するFc領域遺伝子発現型プラスミドpFC211DNA
を、実施例４の方法に準じて制限酵素Sst II及びPstIで
切断した後、上記と同じ手法により、Fc領域遺伝子後半
部分、タンデム化翻訳終止コドン及びベクターの大部分
を含む、第９図記載のPstISst IIのDNA断片（約3.6Kb
p）を得た。In addition, the Fc region gene expression type plasmid pFC211DNA having the tandemized translation stop codon obtained in Example 10
Is cleaved with restriction enzymes Sst II and Pst I according to the method of Example 4, and the latter half of the Fc region gene, the tandemized translation stop codon and most of the vector are contained by the same method as described above. DNA fragment of PstISst II (about 3.6 Kb
p) was obtained.

かくして得られた、ベクターの一部、tacプロモーター
及びFc領域遺伝子前半部分を含むSst IIPstIのDNA断
片と、Fc領域遺伝子後半部分、タンデム化翻訳終止コド
ン及びベクターの大部分を含むPstISst IIのDNA断片
とを混合し、実施例５の方法に準じて、tacプロモータ
ーの下流にFc領域遺伝子が連結され、なおかつタンデム
化翻訳終止コドンを有する形の発現型プラスミドpFC362
（約4.9Kbp）を作成した。第９図にpFC362の作成方法を
示した。Thus obtained, a part of the vector, a DNA fragment of Sst IIPstI containing the tac promoter and the first half of the Fc region gene, and a DNA fragment of PstISst II containing the second half of the Fc region gene, the tandem translation stop codon and the majority of the vector. According to the method of Example 5, the Fc region gene is ligated to the downstream of the tac promoter, and the expression plasmid pFC362 having a tandem translation stop codon is mixed.
(About 4.9 Kbp) was created. Fig. 9 shows the method for preparing pFC362.

実施例12（好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNAの
調製） ペニシリナーゼを菌体外に生成、蓄積する能力を有する
好アルカリ性のバチルスNo.170株（FERM BP−467）を
培地〔（g/）：グリセロール2.0、酵母エキス5.0、ポ
リペプトン5.0、K2HPO4 1.0、MgSO4・7H2O 0.2をNaHC
O3 10でpH9.0に調整したもの〕中、30℃で15時間振盪
培養を行ない、対数増殖後期の菌体を集菌後、フェノー
ル法によるDNA抽出法によって染色体DNAを抽出、精製
し、染色体DNA5mgを得た。Example 12 (Preparation of alkalophilic Bacillus No. 170 strain chromosomal DNA) An alkaliphilic Bacillus No. 170 strain (FERM BP-467) having the ability to generate and accumulate penicillinase extracellularly is added to a medium [(g /). : NaHC glycerol 2.0, yeast extract 5.0, polypeptone 5.0, K 2 HPO 4 1.0, MgSO 4 · 7H 2 O 0.2
In the one adjusted to pH 9.0 with O 3 10), shake culture is carried out at 30 ° C. for 15 hours, the bacterial cells in the late logarithmic growth phase are collected, and chromosomal DNA is extracted and purified by the DNA extraction method by the phenol method, 5 mg of chromosomal DNA was obtained.

実施例13（好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNA断
片のベクターへの挿入） 実施例12で得られた染色体DNA10μｇをとり、実施例４
の方法に準じて、制限酵素EcoRIを加え、37℃で反応さ
せて部分的に切断した。一方、ベクターとして用いるテ
トラサイクリン抵抗性（Tetr）のpMB9プラスミドDNA
（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ）を制限酵素Ec
oRIで完全に切断して65℃、５分の熱処理後、前者と混
合し、実施例２の方法に従ってT4−DNAリガーゼによっ
て10℃、24時間DNA鎖の連結反応を行ない、65℃、５分
の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを加えて染色
体DNAを組み込んだプラスミドDNAを沈澱、採取した。Example 13 (Insertion of alkalophilic Bacillus No. 170 strain chromosomal DNA fragment into vector) 10 μg of the chromosomal DNA obtained in Example 12 was taken, and Example 4
The restriction enzyme EcoRI was added according to the method described in 1. above, and the mixture was allowed to react at 37 ° C. to partially cut it. On the other hand, tetracycline-resistant (Tetr) pMB9 plasmid DNA used as a vector
(Bethesda Research Laboratories) restriction enzyme Ec
After complete digestion with oRI and heat treatment at 65 ° C for 5 minutes, the mixture is mixed with the former and the DNA chain ligation reaction is carried out by T4-DNA ligase according to the method of Example 2 at 10 ° C for 24 hours. After heat treatment, the reaction solution was mixed with 2 volumes of ethanol to precipitate and collect the plasmid DNA incorporating the chromosomal DNA.

実施例14（好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナー
ゼ遺伝子のクローン化） 実施例13で得られた好アルカリ性バチルスNo.170株染色
体DNAを有するプラスミドを、通常のCaCl2法（M.V.Norg
ardらの方法、前記）により、エシェリヒア・コリHB101
株に導入した。これらの形質転換株の中からアンピシリ
ン及びテトラサイクリンに耐性の株をスクリーニング
し、好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ遺伝
子を有するクローンを選択した。この菌体を培養した後
第10図のように処理することにより、ペニシリナーゼ遺
伝子を含む4.5Kbpの挿入を有する組換えプラスミドpEAP
1が得られた。さらに、実施例４の方法に準じて制限酵
素切断点地図を作成した。第11図にpEAP1の制限酵素切
断点地図を示す。Example 14 (Cloning of Alkaliphilic Bacillus No. 170 Strain Penicillinase Gene) A plasmid having the alkalophilic Bacillus No. 170 strain chromosomal DNA obtained in Example 13 was prepared by the usual CaCl 2 method (MVNorg
by the method of Ard et al., supra), Escherichia coli HB101.
Introduced into the stock. From these transformants, a strain resistant to ampicillin and tetracycline was screened, and a clone having the alkalophilic Bacillus No. 170 strain penicillinase gene was selected. After culturing the cells, the cells were treated as shown in Fig. 10 to give a recombinant plasmid pEAP having a 4.5 Kbp insertion containing the penicillinase gene.
1 was obtained. Further, a restriction enzyme cleavage point map was created according to the method of Example 4. Figure 11 shows the restriction enzyme map of pEAP1.

実施例15（好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNAを
有するプラスミドのDNA塩基配列の決定） 好アルカリ性バチルスNo.170株の染色体DNAを含むプラ
スミドのDNA塩基配列の決定は、M13シークエンシング・
キット（アマーシャム）を用い、M13ファージによるジ
デオキシ・チェーン・ターミネーション法により行なっ
た。第１図に好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナ
ーゼ遺伝子プラスミド領域・シグナル領域のDNA塩基配
列を、第２図にプラスミドpMB9由来のKi1遺伝子のDNA塩
基配列を、そして第３図に好アルカリ性バチルスNo.170
株染色体DNA由来のExプロモーターのDNA塩基配列を、そ
れぞれ示した。Example 15 (Determination of DNA base sequence of plasmid having alkalophilic Bacillus No. 170 strain chromosomal DNA) Determination of DNA base sequence of plasmid containing chromosomal DNA of alkalophilic Bacillus No. 170 strain was performed by M13 sequencing.
Using the kit (Amersham), the dideoxy chain termination method with M13 phage was performed. Figure 1 shows the DNA sequence of the plasmid region / signal region of the alkaline bacillus No. 170 strain penicillinase gene, Figure 2 shows the DNA sequence of the Ki1 gene derived from plasmid pMB9, and Figure 3 shows the alkalophilic Bacillus No. 170
The DNA base sequences of the Ex promoter derived from the strain chromosomal DNA are shown respectively.

実施例16（好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNAを
有する各種プラスミド誘導体の作成） 前記実施例14で得られたエシェリヒア・コリHB101（pEA
P1）株を継代していく中で、ペニシリナーゼ活性の増強
（pEAP1の約３倍）された変異体〔アンピシリン耐性（A
pr）、テトラサイクリン感受性（Tets）〕を得た。この
変異株から第10図の方法によりプラスミドを調製したと
ころ、ペニシリナーゼの構造遺伝子の上流約4Kbpが脱落
したプラスミドpEAP3（約5.8Kbp）が得られた。第12図
にpEAP3の制限酵素切断点地図を示す。Example 16 (Preparation of various plasmid derivatives having alkalophilic Bacillus No. 170 strain chromosomal DNA) Escherichia coli HB101 (pEA obtained in Example 14)
P1) strains were passaged, the penicillinase activity was enhanced (about 3 times that of pEAP1) mutant [ampicillin resistance (A
pr), tetracycline sensitivity (Tets)] was obtained. When a plasmid was prepared from this mutant strain by the method shown in FIG. 10, a plasmid pEAP3 (about 5.8 Kbp) in which about 4 Kbp upstream from the structural gene of penicillinase was lost was obtained. Figure 12 shows the restriction map of pEAP3.

こうして得られたpEAP3プラスミド１μｇを実施例４の
方法に準じて制限酵素EcoRIとHind IIIを加えて、37
℃、２時間反応させて切断した。次に実施例11の方法に
準じてDNAポリメラーゼＩラージ・フラグメントを加え
て、室温で30分間反応させ、DNA切断面を平滑末端と
し、ついで、実施例２の方法に準じてT4−DNAリガーゼ
によって、室温、24時間DNA鎖の連結反応を行ない、65
℃、５分間の熱処理後、反応液に２倍容のエタノールを
加えてプラスミドDNAを沈澱、採取した。得られたプラ
スミドDNAを実施例14と同様にエシェリヒア・コリHB101
株に導入形質転換し、アンピシリン耐性形質転換株から
第10図の方法によりプラスミドを分離精製し、約1.0Kbp
のEcoRIHind IIIDNA断片の脱落したプラスミドpEAP6
（約4.8Kbp）を得た。第12図にpEAP6の作成方法を示し
た。1 μg of the pEAP3 plasmid thus obtained was added with the restriction enzymes EcoRI and Hind III according to the method of Example 4 to give 37
The mixture was reacted at ℃ for 2 hours and cut. Next, DNA polymerase I large fragment was added according to the method of Example 11 and reacted at room temperature for 30 minutes to make the DNA cleavage surface a blunt end, and then with T4-DNA ligase according to the method of Example 2. Perform the DNA strand ligation reaction at room temperature for 24 hours.
After heat treatment at 5 ° C for 5 minutes, 2 volumes of ethanol was added to the reaction solution to precipitate and collect plasmid DNA. The obtained plasmid DNA was treated with Escherichia coli HB101 in the same manner as in Example 14.
The strain was introduced into the strain, and the plasmid was separated and purified from the ampicillin-resistant transformant by the method shown in Fig. 10.
Plasmid pEAP6 from which the EcoRI Hind III DNA fragment of Escherichia coli was removed
(About 4.8 Kbp) was obtained. Figure 12 shows how to create pEAP6.

次に、プラスミドpBR329（約4.15Kbp）〔L.Covarrubias
ら,Gene,17,79（1982）〕DNA10μｇを、実施例４の方法
に準じて制限酵素Acc IIで切断した後、アガロースゲル
電気泳動（ゲル濃度1.5％）を行ない、エレクトロエリ
ューション法〔P.J.Greeneら，“Methods in Molecular
Biology"vol.7,Marcell Dekker,1974,P.87〕を用い
て、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（CAT）遺伝子を含むAcc IIAcc IIのDNA断片（1.3Kb
p）を回収した。また、先に得られたプラスミドpEAP6を
実施例４の方法に準じて制限酵素SmaIで切断して後、上
記のAcc IIAcc IIのDNA断片と混合し、実施例２の方
法に準じてT4−DNAリガーゼを用いて連結した。上記と
同様にして、エシェリヒア・コリHB101株に導入形質転
換し、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性形質
転換株からプラスミドを分離精製し、プラスミドpEAP6
にCAT遺伝子が第12図において反時計まわりの向きに挿
入された形のプラスミドpEAP7（約6.1Kbp）を作成し
た。第12図にpEAP7の作成方法を示した。Next, plasmid pBR329 (about 4.15 Kbp) [L. Covarrubias
Et al., Gene, 17 , 79 (1982)] DNA (10 μg) was cleaved with the restriction enzyme Acc II according to the method of Example 4, and then agarose gel electrophoresis (gel concentration 1.5%) was performed to perform the electroelution method [PJGreene]. Et al., “Methods in Molecular
Biology "vol.7, Marcell Dekker, 1974, P.87], using a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) gene-containing Acc II Acc II DNA fragment (1.3 Kb
p) was recovered. Further, the plasmid pEAP6 obtained above was cleaved with the restriction enzyme SmaI according to the method of Example 4, and then mixed with the above-mentioned Acc IIAcc II DNA fragment, and T4-DNA was prepared according to the method of Example 2. Ligation was used to ligate. In the same manner as above, the Escherichia coli HB101 strain was introduced and transformed, and the plasmid was separated and purified from the chloramphenicol- and ampicillin-resistant transformant, and the plasmid pEAP6
A plasmid pEAP7 (about 6.1 Kbp) in which the CAT gene was inserted in the counterclockwise direction in Fig. 12 was prepared. Figure 12 shows how to create pEAP7.

こうして得られたプラスミドpEAP7を実施例４の方法に
準じて制限酵素Hind IIIで切断し、実施例11の方法に準
じてDNAポリメラーゼＩラージ・フラグメントにより末
端を平滑化した。実施例２の方法に準じT4−DNAリガー
ゼを用いて自己連結反応を行ない、上記と同様にして、
プラスミドpEAP7のHind IIIサイトを欠失させた形のプ
ラスミドpEAP7ΔＨ（約6.1Kbp）を作成した。第13図にp
EAP7ΔＨの作成方法を示す。The thus obtained plasmid pEAP7 was cleaved with the restriction enzyme HindIII according to the method of Example 4, and the ends were blunted with the DNA polymerase I large fragment according to the method of Example 11. According to the method of Example 2, self-ligation reaction was carried out using T4-DNA ligase, and the same procedure as above was performed.
A plasmid pEAP7ΔH (about 6.1 Kbp) in a form in which the HindIII site of the plasmid pEAP7 was deleted was prepared. P in Figure 13
The method for creating EAP7ΔH is shown below.

さらにプラスミドpEAP7ΔＨを、実施例４の方法に準じ
て制限酵素ClaIで切断し、実施例11の方法に準じてDNA
ポリメラーゼＩ・ラージ・フラグメントにより末端を平
滑化する。実施例２の方法に準じT4−DNAリガーゼを用
いて連結反応を行ない、上記と同様にしてエシェリヒア
・コリHB101株に導入形質転換し、クロラムフェニコー
ル耐性・アンピシリン感受性の形質転換株からプラスミ
ドを分離精製し、プラスミドpEAP7ΔＨ中に２ケ所存在
するClaIサイトを両方共欠失させた形のプラスミドpEAP
7ΔCCH（約6.1Kbp）を作成した。第13図にpEAP7ΔCCHの
作成方法を示す。Further, the plasmid pEAP7ΔH was cleaved with the restriction enzyme ClaI according to the method of Example 4, and the DNA was obtained according to the method of Example 11.
The ends are blunted with polymerase I large fragment. Ligation reaction was carried out using T4-DNA ligase according to the method of Example 2, and the Escherichia coli HB101 strain was transformed by transformation in the same manner as above, and a plasmid was obtained from the transformant strain resistant to chloramphenicol and sensitive to ampicillin. Separated and purified plasmid pEAP in the form of which both ClaI sites existing at two sites in plasmid pEAP7ΔH were deleted
7ΔCCH (about 6.1 Kbp) was created. Figure 13 shows how to create pEAP7ΔCCH.

得られたプラスミドpEAP7ΔCCHを、実施例４の方法に準
じて制限酵素Hinc IIで切断し、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度0.8％）の後、ペニシリナーゼ遺伝子（一
部欠失）を含まない約3.8KbpのHinc IIHinc IIのDNA
断片をエレクトロエリューション法より回収する。一
方、上述のプラスミドpEAP7も同様にして制限酵素Hinc
II切断、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）を
行ない、ペニシリナーゼ遺伝子を含む約2.3KbpのHinc I
IHinc IIのDNA断片を回収する。これら２種のDNA断片
を、実施例２の方法に準じてT4−DNAリガーゼを用いて
連結し、上記と同様にしてエシェリヒア・コリHB101株
に導入形質転換し、クロラムフェニコール及びアンピシ
リンに耐性の形質転換株の中からプラスミドを分離精製
し、プラスミドpEAP7ΔCH（約6.1Kbp）を作成した。第1
3図にpEAP7ΔCHの作成方法を示す。The obtained plasmid pEAP7ΔCCH was cleaved with the restriction enzyme Hinc II according to the method of Example 4 and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) to obtain about 3.8 Kbp containing no penicillinase gene (partially deleted). Hinc II Hinc II DNA
The fragment is recovered by the electroelution method. On the other hand, the above-mentioned plasmid pEAP7 was similarly treated with the restriction enzyme Hinc.
II digestion and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) were performed, and Hinc I of about 2.3 Kbp containing the penicillinase gene.
Collect the IHinc II DNA fragment. These two DNA fragments were ligated according to the method of Example 2 using T4-DNA ligase, and transformed into Escherichia coli HB101 strain in the same manner as described above, resistant to chloramphenicol and ampicillin. The plasmid was separated and purified from the transformant of E. coli to prepare plasmid pEAP7ΔCH (about 6.1 Kbp). First
Figure 3 shows how to create pEAP7ΔCH.

こうして得られたプラスミドpEAP7ΔCHを、実施例４の
方法に準じて制限酵素HpaIで切断した後、末端をリン酸
化したSalIリンカー（宝酒造）の混合し、実施例２の方
法に準じてT4−DNAリガーゼを用いて連結反応を行な
う。エタノール沈澱の後、実施例４の方法に準じて制限
酵素ClaI及びSalIで切断、アガロースゲル電気泳動（ゲ
ル濃度0.8％）を行ない、ペニシリナーゼ遺伝子後半
部、Exプロモーター領域及びベクターの大部分を含む4.
5KbpのClaISalIのDNA断片をエレクトロエリューショ
ン法により回収する。一方、後述の実施例16で得られた
プラスミドp329PSを同様にして制限酵素ClaI及びSalIで
切断、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５
％）を行ない、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域
及びシグナルペプチド領域を含む約200bpのSalIClaI
のDNA断片をエレクトロエリューション法により回収す
る。こうして得られた２種のDNA断片を結合し、実施例
２の方法に準じてT4−DNAリガーゼで連結後、上記と同
様にしてエシェリヒア・コリHB101株に導入形質転換
し、クロラムフェニコール耐性の形質転換株の中からプ
ラスミドを分離精製し、分泌プラスミドベクターpEAP8
（4.7Kbp）を作成した。第14図にpEAP8の作成方法を示
す。The thus obtained plasmid pEAP7ΔCH was cleaved with the restriction enzyme HpaI according to the method of Example 4, and then SalI linker (Takara Shuzo) having phosphorylated ends was mixed, and T4-DNA ligase was added according to the method of Example 2. Is used to perform the ligation reaction. After ethanol precipitation, cleavage with restriction enzymes ClaI and SalI and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) were performed according to the method of Example 4, and the latter half of the penicillinase gene, Ex promoter region and most of the vector were included. .
A 5 Kbp ClaISalI DNA fragment is recovered by the electroelution method. On the other hand, the plasmid p329PS obtained in Example 16 described later was similarly digested with restriction enzymes ClaI and SalI, and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5
%), And contains about 200 bp SalIClaI containing the penicillinase gene promoter region and signal peptide region.
The DNA fragment of is recovered by the electroelution method. The two DNA fragments thus obtained were ligated, ligated with T4-DNA ligase according to the method of Example 2, and transformed into Escherichia coli HB101 strain in the same manner as described above, and transformed with chloramphenicol resistance. Plasmids were isolated and purified from the transformants of Escherichia coli and secreted plasmid vector pEAP8
(4.7 Kbp) was created. Figure 14 shows how to create pEAP8.

先に作成したプラスミドpEAP6を実施例４の方法に準じ
て制限酵素HinfIで切断し、アガロースゲル電気泳動
（ゲル濃度0.8％）の後、好アルカリ性バチルスNo.17株
染色体DNA由来Exプロモーター領域とプラスミドpMB9由
来Ki1遺伝子から成る菌体外分泌生産に関与する領域を
含む約0.95KbpのHinfIHinfIのDNA断片を、エレクトロ
エリューション法により回収する。このDNA断片につい
て、実施例11の方法に準じてDNAポリメラーゼＩ・ラー
ジ・フラグメントを用いた末端の平滑化を行ない、実施
例２の方法に準じて末端をリン酸化したEcoRIリンカー
（宝酒造）とT4−DNAリガーゼによって連結する。エタ
ノール沈澱の後、実施例４の方法に準じて制限酵素EcoR
Iで切断、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）・
エレクトロエリューション法によって末端にEcoRIサイ
トを有するEcoRIEcoRIのDNA断片（約0.95Kbp）を回収
する。次に、プラスミドpBR329を、実施例４の方法に準
じて制限酵素EcoRIで切断し、上記約0.95KbpのEcoRIE
coRIのDNA断片と混合、実施例２の方法に準じてT4−DNA
リガーゼによる連結反応を行なった。上記と同様にエシ
ェリヒア・コリHB101株に導入形質転換し、アンピシリ
ン及びテトラサイクリン耐性の形質転換株よりプラスミ
ドを分離精製し、多コピー型分泌プラスミドベクターp3
29EXK（約5.1Kbp）を作成した。第15図にp329EXKの作成
方法を示す。The plasmid pEAP6 prepared above was cleaved with the restriction enzyme HinfI according to the method of Example 4, subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), and then the Ex promoter region derived from the alkalophilic Bacillus No. 17 strain chromosomal DNA and the plasmid. A HinfI HinfI DNA fragment of about 0.95 Kbp containing a region involved in exocrine secretory production consisting of pMB9-derived Ki1 gene is recovered by the electroelution method. This DNA fragment was blunted with DNA polymerase I large fragment according to the method of Example 11 and phosphorylated at the end according to the method of Example 2 with EcoRI linker (Takara Shuzo) and T4. -Ligate with DNA ligase. After ethanol precipitation, the restriction enzyme EcoR was used according to the method of Example 4.
Cut with I, agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%)
An EcoRIEcoRI DNA fragment (about 0.95 Kbp) having an EcoRI site at the end is recovered by the electroelution method. Next, the plasmid pBR329 was cleaved with the restriction enzyme EcoRI according to the method of Example 4 to give the above-mentioned EcoRIE of about 0.95 Kbp.
Mix with the coRI DNA fragment, and according to the method of Example 2, T4-DNA
The ligation reaction with ligase was performed. Escherichia coli HB101 strain was introduced and transformed in the same manner as above, and the plasmid was separated and purified from the transformant resistant to ampicillin and tetracycline, and a multicopy secretory plasmid vector p3
29EXK (about 5.1Kbp) was created. Figure 15 shows how to create p329EXK.

実施例17（好アルカリ性菌ペニシリナーゼ遺伝子プロモ
ーター領域・シグナル領域を有するプラスミドの作成） CAT遺伝子誘導体を含むプラスミドpCM1（約4.1Kbpファ
ルマシア）を実施例４の方法に準じて制限酵素EcoRI及
びSalIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.
8％）の後、実施例15の方法に準じて約0.5bpのCAT遺伝
子の後半部分を含むEcoRISalIのDNA断片を回収する。
さらに、CAT遺伝子誘導体を含むプラスミドpCM7（約4.1
Kbp,ファルマシア）を上記と同様にして、制限酵素EcoR
I及びSalIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃
度0.8％）の後、CAT遺伝子前半部分とベクターの大部分
から成る約3.1KbpのEcoRISalIのDNA断片を回収する。
これらのDNA断片を混合し、実施例２の方法に準じてT4
−DNAリガーゼで連結し、実施例16の方法に準じてCAT遺
伝子誘導体を含む新規プラスミドpCM71（約3.6Kbp）を
作成した。第16図にpCM71の作成方法を示す。Example 17 (Preparation of plasmid having alkalophilic penicillinase gene promoter region / signal region) Plasmid pCM1 (about 4.1 Kbp Pharmacia) containing a CAT gene derivative was cleaved with restriction enzymes EcoRI and SalI according to the method of Example 4. , Agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.
8%), the DNA fragment of EcoRISalI containing the latter half of the CAT gene of about 0.5 bp is recovered according to the method of Example 15.
Furthermore, plasmid pCM7 (about 4.1
Kbp, Pharmacia) in the same manner as above, but with the restriction enzyme EcoR
After digestion with I and SalI and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), a DNA fragment of about 3.1 Kbp consisting of the first half of the CAT gene and the majority of the vector is recovered.
These DNA fragments were mixed, and T4 was prepared according to the method of Example 2.
-A ligation was carried out with DNA ligase to prepare a new plasmid pCM71 (about 3.6 Kbp) containing a CAT gene derivative according to the method of Example 16. Figure 16 shows how to create pCM71.

前記実施例16で得られたプラスミドpEAP3を実施例４の
方法に準じて制限酵素RsaIで切断し、ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）後、実施例16の方法に
準じてペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグ
ナル領域を含むRsaIRsaIのDNA断片（約200bp）を回収
する。このRsaIRsaIのDNA断片を、末端をリン酸化し
たHind IIIリンカー（宝酒造）と混合、実施例２の方法
に準じてT4−DNAリガーゼを用いて連結した後、実施例
４の方法に準じて制限酵素Hind IIIで切断する。ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、実施
例15の方法に準じて末端がHind IIIサイトに変換された
ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナルペ
プチド領域を含むDNA断片（約210bp）を回収する。一
方、プラスミドpCM71を実施例４の方法に準じて制限酵
素Hind IIIで切断し、上記のペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域及びシグナルペプチド領域を含むHind III
Hind IIIのDNA断片と混合し、実施例２の方法に準じ
てT4−DNAリガーゼを用いて連結させ、実施例16の方法
に準じてアンピシリン耐性、クロラムフェニコール耐性
の形質転換株よりプラスミドpPS1（約3.7Kbp）を分離・
精製した。このプラスミドpPS1においては、ペニシリナ
ーゼ遺伝子プロモーター領域及びシグナルペプチド領域
が、CAT遺伝子の上流に同じ読み取り方向で挿入された
構造を有している。第17図にpPS1の作成方法を示した。The plasmid pEAP3 obtained in Example 16 was cleaved with the restriction enzyme RsaI according to the method of Example 4 and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), and then the penicillinase gene promoter according to the method of Example 16. A DNA fragment of RsaIRsaI (about 200 bp) containing the region and the signal region is recovered. This DNA fragment of RsaIRsaI was mixed with a HindIII linker (Takara Shuzo) whose ends were phosphorylated, and ligated using T4-DNA ligase according to the method of Example 2, and then a restriction enzyme according to the method of Example 4. Cut with Hind III. After polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), a DNA fragment (about 210 bp) containing the penicillinase gene promoter region and the signal peptide region, whose ends have been converted to Hind III sites, is recovered according to the method of Example 15. . On the other hand, the plasmid pCM71 was cleaved with the restriction enzyme Hind III according to the method of Example 4 to obtain Hind III containing the above penicillinase gene promoter region and signal peptide region.
The mixture was mixed with the HindIII DNA fragment and ligated using T4-DNA ligase according to the method of Example 2, and the plasmid pPS1 was obtained from the transformant resistant to ampicillin and chloramphenicol according to the method of Example 16. (About 3.7 Kbp) separated
Purified. This plasmid pPS1 has a structure in which the penicillinase gene promoter region and signal peptide region are inserted upstream of the CAT gene in the same reading direction. Figure 17 shows how to make pPS1.

こうして得られたプラスミドpPS1を実施例４の方法に準
じて制限酵素Hind IIIで部分分解し、アガロースゲル電
気泳動（ゲル濃度0.8％）の後、上記と同様にして２ケ
所存在するHind IIIサイトのうち１ケ所のみが切断され
たHind IIIHind IIIのDNA断片（約3.7Kbp）を回収す
る。このHind IIIHind IIIのDNA断片を実施例11の方
法に準じてDNAポリメラーゼＩ・ラージ・フラグメント
を用いて末端を平滑化した後、実施例２の方法に準じて
T4−DNAリガーゼによって自己閉環させる。このように
して上記方法に準じて、プラスミドpPS1中のペニシリナ
ーゼ遺伝子プロモーター領域上流に存在するHind IIIサ
イトを欠失させた形のプラスミドpPS1ΔＨ（約3.7Kbp）
を作成した。第18図にpPS1ΔＨの作成方法を示す。The thus obtained plasmid pPS1 was partially digested with the restriction enzyme Hind III according to the method of Example 4, and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%). A HindIII-HindIII DNA fragment (about 3.7 Kbp) cleaved at only one site is recovered. This Hind III Hind III DNA fragment was blunt-ended with DNA polymerase I large fragment according to the method of Example 11, and then according to the method of Example 2.
Self-closing by T4-DNA ligase. Thus, according to the above method, the plasmid pPS1ΔH (about 3.7 Kbp) in a form in which the HindIII site existing upstream of the penicillinase gene promoter region in the plasmid pPS1 was deleted
It was created. FIG. 18 shows a method for preparing pPS1ΔH.

さらにプラスミドpPS1ΔＨを実施例４の方法に準じて制
限酵素ClaIで切断した後、末端をリン酸化したSalIリン
カー（宝酒造）と混合し、実施例２の方法に準じてT4−
DNAリガーゼを用いて連結反応を行なう。エタノール沈
澱の後、実施例４の方法に準じて制限酵素Hind III及び
SalIで切断し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル
濃度５％）を行ない、ペニシリナーゼ遺伝子プロモータ
ー領域及びシグナルペプチド領域を含む約210bpのSalI
Hind IIIのDNA断片をエレクトロエリューション法に
より回収する。一方、プラスミドpBR329も同様にして制
限酵素Hind III及びSalIで切断し、アガロースゲル電気
泳動（ゲル濃度0.8％）を行ない、ベクターの大部分を
含む約3.6KbpのHind IIISalIのDNA断片を回収する。
こうして得られた２種類のDNA断片を混合し、実施例２
の方法に準じてT4−DNAリガーゼで連結した後、上記方
法に準じて、プラスミドp329PSを作成した。第18図にp3
29PSの作成方法を示す。Further, the plasmid pPS1ΔH was cleaved with the restriction enzyme ClaI according to the method of Example 4, and then mixed with a SalI linker (Takara Shuzo) having a phosphorylated end, and T4-
Ligation reaction is performed using DNA ligase. After ethanol precipitation, the restriction enzyme Hind III and the restriction enzyme were prepared according to the method of Example 4.
Cleavage with SalI, polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%) was performed, and SalI of approximately 210 bp containing the penicillinase gene promoter region and signal peptide region
The HindIII DNA fragment is recovered by the electroelution method. On the other hand, the plasmid pBR329 is similarly cleaved with restriction enzymes Hind III and Sal I, and subjected to agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%) to recover a Hind III Sal I DNA fragment of about 3.6 Kbp containing most of the vector.
The two kinds of DNA fragments thus obtained were mixed, and the mixture of Example 2
After ligation with T4-DNA ligase according to the method described in 1., plasmid p329PS was prepared according to the method described above. P3 in Figure 18
Shows how to create 29PS.

実施例18（Fc領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プラス
ミドの作成） 実施例11で作成したFc領域遺伝子菌体内発現型プラスミ
ドpFC362を、実施例４の方法に準じて制限酵素Sst II及
びEcoRIで切断し、アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度
0.8％）の後、tacプロモーター領域・ｈ部位遺伝子・CH
2部位遺伝子の前半部分を含む約0.4KbpのEcoRISst II
のDNA断片と、ベクターの大部分・CH2部位遺伝子後半部
分・CH3部位遺伝子を含む約4.5KbpのEcoRISst IIのDN
A断片とを、実施例５の方法に準じてゲルより回収す
る。このうちのtacプロモーター領域・ｈ部位遺伝子・C
H2部位遺伝子前半部位を有するEcoRISst IIのDNA断片
を、実施例４の方法により制限酵素BstNIで切断し、ポ
リアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、
CH2部位遺伝子の一部を含む約171bpのBstNISst IIのD
NA断片を、実施例７の方法に準じてゲルより回収する。
さらに、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域・シグ
ナルペプチド領域とFc領域遺伝子との連結部分に相当す
る第19図記載の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオ
チド（約51bp）を、実施例８の方法に準じて作成した。
このEcoRIBstNIのDNA断片中には、後のサブクローニ
ングに必要な制限酵素SalIサイト、ペニシリナーゼ遺伝
子シグナルペプチド領域遺伝子との連結のための制限酵
素Hind IIIサイト、アミノ酸セリンをコードするTCAの
コドン、ｈ部位遺伝子及びCH2部位遺伝子の一部が含ま
れている。このDNA断片を用いることにより、大腸菌内
で正しくシグナルペプチドが切断され、Fc領域蛋白質の
アミノ末端にアミノ酸セリンが１個余分についた形の蛋
白質の産生が期待できる。以上のようにして得られた、
ベクターの大部分・CH2部位遺伝子後半部分・CH3部位遺
伝子を含むEcoRISst IIのDNA断片、CH2部位の遺伝子
の一部を含むBstNISst IIのDNA断片、及びペニシリナ
ーゼ遺伝子シグナルペプチド領域とFc領域遺伝子との連
結部分に相当するEcoRIBstNIのDNA断片とを混合し、
実施例５の方法に準じて、プラスミドpSEC−FC（約4.7K
bp）を作成した。第19図にpSEC−FCを示す。Example 18 (Preparation of Fc region gene periplasmic secretory expression type plasmid) The Fc region gene intracellular expression plasmid pFC362 prepared in Example 11 was cleaved with restriction enzymes Sst II and EcoRI according to the method of Example 4, Agarose gel electrophoresis (gel concentration
0.8%), followed by tac promoter region, h site gene, C H
About 0.4 Kbp EcoRISst II containing the first half of the two-site gene
DNA fragment of about 4.5 Kbp, including most of the vector, the second half of the C H 2 site gene, and the C H 3 site gene, and the DN of EcoRISst II.
The A fragment and the A fragment are recovered from the gel according to the method of Example 5. Of these, tac promoter region, h site gene, C
The EcoRISst II DNA fragment having the first half site of the H 2 site gene was cleaved with the restriction enzyme BstNI by the method of Example 4, and after polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%),
Approximately 171 bp Bst NISst II D containing part of the C H 2 site gene
The NA fragment is recovered from the gel according to the method of Example 7.
Furthermore, a double-stranded oligonucleotide (about 51 bp) having the base sequence shown in FIG. 19 corresponding to the connecting portion between the penicillinase gene promoter region / signal peptide region and the Fc region gene was prepared according to the method of Example 8. did.
In this EcoRIBstNI DNA fragment, the restriction enzyme SalI site necessary for subsequent subcloning, the restriction enzyme Hind III site for ligation with the penicillinase gene signal peptide region gene, the TCA codon encoding the amino acid serine, and the h site gene And a portion of the C H 2 site gene is included. By using this DNA fragment, it is expected that the signal peptide will be correctly cleaved in Escherichia coli, and the Fc region protein will be produced with an extra amino acid serine at the amino terminus. Obtained as described above,
Most of the vector, the second half of the C H 2 site gene, the EcoRISst II DNA fragment containing the C H 3 site gene, the Bst NISst II DNA fragment containing a part of the C H 2 site gene, and the penicillinase gene signal peptide region Mixing with the EcoRIBstNI DNA fragment corresponding to the connecting portion with the Fc region gene,
According to the method of Example 5, the plasmid pSEC-FC (about 4.7K
bp) was created. Figure 19 shows pSEC-FC.

こうして得られたプラスミドpSEC−FCを、実施例４の方
法に準じて制限酵素Hind IIIで切断する。一方、実施例
17で得られたペニシリナーゼ遺伝子プロモーター領域・
シグナルペプチド領域を含むプラスミドpPS1を、実施例
４の方法に準じて制限酵素Hind IIIで切断し、ポリアク
リルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度５％）の後、ペニシ
リナーゼ遺伝子プロモーター領域・シグナル領域を含む
Hind IIIHind IIIのDNA断片（約210bp）をエレクトロ
エリューション法により回収する。このDNA断片を先に
調製したプラスミドpSEC−FCの制限酵素Hind III切断物
と混合し、実施例17の方法に準じて、Fc領域遺伝子ペリ
プラズム分泌発現型プラスミドpPS−FCを作成した。第2
0図にpPS−FCの作成方法を示した。The plasmid pSEC-FC thus obtained is cleaved with the restriction enzyme Hind III according to the method of Example 4. On the other hand, Example
Penicillinase gene promoter region obtained in 17
The plasmid pPS1 containing the signal peptide region was cleaved with the restriction enzyme Hind III according to the method of Example 4, and after polyacrylamide gel electrophoresis (gel concentration 5%), the penicillinase gene promoter region / signal region was included.
Hind III Hind III DNA fragment (about 210 bp) is recovered by electroelution method. This DNA fragment was mixed with the restriction enzyme HindIII digestion product of the previously prepared plasmid pSEC-FC, and the Fc region gene periplasmic secretory expression type plasmid pPS-FC was prepared according to the method of Example 17. No. 2
Figure 0 shows how to make pPS-FC.

実施例19（Fc領域遺伝子菌体外分泌発現型プラスミドの
作成） 実施例18で作成したプラスミドpSEC−FCを、実施例４の
方法に準じて制限酵素BamHIで切断し、実施例８の方法
に準じて作成した制限酵素ClaIサイトを含む第19図記載
の塩基配列を有する２本鎖オリゴヌクレオチド（約14b
p）と混合し、実施例２の方法に準じてT4−DNAリガーゼ
を用いて連結反応を行なう。実施例16の方法に準じて、
プラスミドpSEC−FC中に存在する制限酵素BamHIサイト
を制限酵素ClaIサイトに変換した形のプラスミドpSEC−
FCC（約4.7Kbp）を作成した。第19図にプラスミドpSEC
−FCCの作成方法を示す。このようにして得られたプラ
スミドpSEC−FCCを実施例４の方法に準じて制限酵素Hin
d III及びClaIで切断、アガロースゲル電気泳動（ゲル
濃度0.8％）の後、Fc領域遺伝子を含む約0.7KbpのHind
IIIClaIのDNA断片を上記と同様に回収する。一方、実
施例16で作成した分泌プラスミドベクターpEAP8を実施
例４の方法に準じて制限酵素Hind III及びClaIで切断、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）の後、プラ
スミドpEAP8の大部分を有するClaIHind IIIのDNA断片
（約4.7Kbp）を上記と同様に回収する。これら２種のDN
A断片を混合、実施例２の方法に準じてT4−DNAリガーゼ
で連結させ、実施例16の方法に準じてFc領域遺伝子菌体
外分泌発現型プラスミドpEXFC10（約5.6Kbp）を作成し
た。第21図にpEXFC10の作成方法を示す。Example 19 (Preparation of Fc region gene exocrine expression plasmid) The plasmid pSEC-FC prepared in Example 18 was cleaved with restriction enzyme BamHI according to the method of Example 4 and according to the method of Example 8. A double-stranded oligonucleotide having the nucleotide sequence shown in FIG. 19 containing the restriction enzyme ClaI site (about 14b
p) and ligate according to the method of Example 2 using T4-DNA ligase. According to the method of Example 16,
Plasmid pSEC-a plasmid pSEC-in the form in which the restriction enzyme BamHI site present in FC is converted into a restriction enzyme ClaI site
FCC (about 4.7 Kbp) was created. Figure 19 shows the plasmid pSEC
-Indicate how to create FCC. The plasmid pSEC-FCC thus obtained was treated with the restriction enzyme Hin according to the method of Example 4.
After digestion with dIII and ClaI and agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), Hind of about 0.7 Kbp containing Fc region gene
The IIIClaI DNA fragment is recovered as described above. On the other hand, the secretion plasmid vector pEAP8 prepared in Example 16 was cleaved with the restriction enzymes Hind III and ClaI according to the method of Example 4,
After agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), the ClaIHind III DNA fragment (about 4.7 Kbp) containing most of the plasmid pEAP8 is recovered as described above. These two DN
The A fragments were mixed and ligated with T4-DNA ligase according to the method of Example 2 to prepare the Fc region gene exocrine expression plasmid pEXFC10 (about 5.6 Kbp) according to the method of Example 16. Figure 21 shows how to make pEXFC10.

一方、実施例18で得られたFc領域遺伝子ペリプラズム分
泌発現型プラスミドpPS−FCを実施例４の方法に準じて
制限酵素BamHI及びSalIで切断、アガロースゲル電気泳
動（ゲル濃度0.8％）の後、ペニシリナーゼ遺伝子プロ
モーター領域・シグナルペプチド領域及びFc領域遺伝子
を含む約0.9KbpのSalIBamHIのDNA断片をエレクトロエ
リューション法により回収する。また、実施例16で得ら
れた多コピー型分泌プラスミドベクターp329EXKを実施
例４の方法に準じて制限酵素BamHI及びSalIで切断し、
アガロースゲル電気泳動（ゲル濃度0.8％）の後、上記
と同様にしてプラスミドp329EXKの大部分を含む約4.8Kb
pのBamHISalIのDNA断片を回収する。これら２種のDNA
断片を実施例２の方法に準じてT4−DNAリガーゼで連結
し、実施例16の方法に準じてFc領域遺伝子菌体外分泌発
現型プラスミドpEXFC100（約5.7Kbp）を作成した。第22
図にpEXFC100の作成方法を示す。On the other hand, the Fc region gene periplasmic secretory expression type plasmid pPS-FC obtained in Example 18 was cleaved with restriction enzymes BamHI and SalI according to the method of Example 4, and after agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), A DNA fragment of SalIBamHI of about 0.9 Kbp containing the penicillinase gene promoter region / signal peptide region and Fc region gene is recovered by the electroelution method. The multicopy secretory plasmid vector p329EXK obtained in Example 16 was cleaved with restriction enzymes BamHI and SalI according to the method of Example 4,
After agarose gel electrophoresis (gel concentration 0.8%), approximately 4.8 Kb containing most of plasmid p329EXK as above.
The BamHISalI DNA fragment of p is recovered. These two types of DNA
The fragments were ligated with T4-DNA ligase according to the method of Example 2 to prepare the Fc region gene exocrine expression plasmid pEXFC100 (about 5.7 Kbp) according to the method of Example 16. No. 22
The figure shows how to make pEXFC100.

実施例20（Fc領域蛋白質の分泌発現確認） 前記実施例11で得られたFc領域遺伝子菌体内発現型プラ
スミドpFC362を有するエシェリヒア・コリC600株、実施
例18で得られたFc領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プ
ラスミドpPS−FCを有するエシェリヒア・コリHB101株、
及び実施例19で得られたFc領域遺伝子菌体外分泌発現型
プラスミドpEXFC10又はpEXFC100を有するエシェリヒア
・コリHB101株を、最終濃度30μ/mlのアンピシリンを含
むLBGG培地〔１％ トリプン、0.5％ 酵母エキス、１
％ NaCl,0.1％ グルコース、0.2％ グリセロール（p
H7.2）〕に接種し、37℃で24時間振とう培養を行なう。
ただし、プラスミドpEXFC10を有するエシェリヒア・コ
リHB101株の場合には、アンピシリンのかわりに最終濃
度20μg/mlのクロラムフェニコールを用いた。培養終了
後、オスモティック・ショック法（C.Katoら、前出）に
より、培養物を、菌体外画分、ペリプラズム画分、菌体
内画分に分画する。すなわち、遠心分離によって菌体を
分離した培養上清を菌体外画分とする。次に菌体を生理
食塩水で洗浄した後、1mM EDTAを含む25％ショ糖水溶
液に懸濁させて、37℃で10分間振とうする。遠心分離に
よって菌体を集めた後、菌体を氷冷した水に懸濁させ、
４℃で10分間振とうする。この懸濁液に等量の0.1Mリン
酸バッファー（pH7.0）を加えた後、遠心分離を行な
い、菌体と分離した上清部分をペリプラズム画分とす
る。さらに、この菌体を0.05Mリン酸バッファー（pH7.
0）に懸濁させ、超音波により菌体を破壊する。遠心分
離によって菌体残渣を除去した上清部分を菌体内画分と
した。Example 20 (Confirmation of secretory expression of Fc region protein) Escherichia coli C600 strain having the Fc region gene intracellular expression plasmid pFC362 obtained in Example 11, Fc region gene periplasmic secretory expression obtained in Example 18 Escherichia coli HB101 strain having the type plasmid pPS-FC,
And Escherichia coli HB101 strain having the Fc region gene exocytosis expression type plasmid pEXFC10 or pEXFC100 obtained in Example 19, LBGG medium containing ampicillin at a final concentration of 30 μ / ml [1% trypne, 0.5% yeast extract, 1
% NaCl, 0.1% glucose, 0.2% glycerol (p
H7.2)] and shake culture at 37 ° C for 24 hours.
However, in the case of the Escherichia coli HB101 strain having the plasmid pEXFC10, chloramphenicol at a final concentration of 20 μg / ml was used instead of ampicillin. After completion of the culture, the culture is fractionated into an extracellular fraction, a periplasmic fraction, and an intracellular fraction by the osmotic shock method (C. Kato et al., Supra). That is, the culture supernatant obtained by separating the cells by centrifugation is used as the extracellular fraction. Next, the cells are washed with physiological saline, suspended in a 25% aqueous sucrose solution containing 1 mM EDTA, and shaken at 37 ° C for 10 minutes. After collecting the cells by centrifugation, suspend the cells in ice-cooled water,
Shake for 10 minutes at 4 ° C. After adding an equal volume of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.0) to this suspension, centrifugation is performed, and the supernatant portion separated from the cells is used as a periplasmic fraction. In addition, the cells were mixed with 0.05M phosphate buffer (pH 7.
Suspend in 0) and destroy the cells by ultrasonic waves. The supernatant portion obtained by removing the bacterial cell residue by centrifugation was used as the intracellular fraction.

得られた各画分のサンプルは、アセトン乾燥を行なった
後、Tris−HClバッファー（pH6.8）、SDS、２−メルカ
プトエタノール、グリセロールを、それぞれ最終濃度60
mM、２％、４％、10％になるように加えて、SDS−ポリ
アクリルアミドゲル電気泳動〔鈴木、遺伝、31、43（19
77）〕を行なった。分離用ゲルは12.5％とし、泳動バッ
ファーはSDS・Tris−グリシン系〔U.K.Laemmli,Natur
e、227、680（1970）〕を用いた。電気泳動終了後、ゲ
ル中の蛋白質を、25mM Tris−192mM グリシン（pH8.
3）−20％ メタノールのバッファー中で、電気泳動的
にニトロセルロース・フィルターに吸着させ、ウエスタ
ン・ブロッティングを行なった。蛋白質を吸着させたニ
トロセルロース・フィルターを３％ ゼラチンを含むTB
Sバッファー〔20mM Tris−HCl（pH7.5）、500mM NaC
l〕中に60分間浸した後、一次抗体としてウサギ抗ヒトI
gG−Fc成分抗血清（カツペル）を用いた間接法で、ペル
オキシターゼ標識抗体を用いたイミュン・ブロット・ア
ッセイ・キット（バイオ・ラッド）により、ヒトIgG F
c領域蛋白質を特異的に染色した。結果の一部を複写し
て第23図に示した。この際に、後記参考例記載の方法に
より調製した既知量の天然型ヒトIgG Fc領域蛋白質も
同一のSDS−ポリアクリルアミドゲルで電気泳動等を行
なった。The obtained samples of each fraction were dried with acetone, and then Tris-HCl buffer (pH 6.8), SDS, 2-mercaptoethanol, and glycerol were respectively added to a final concentration of 60.
mM, 2%, 4%, 10%, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis [Suzuki, Gene, 31 , 43 (19
77)] was performed. Separation gel is 12.5%, running buffer is SDS / Tris-glycine system [UK Laemmli, Natur
e, 227 , 680 (1970)] was used. After the electrophoresis, the proteins in the gel were washed with 25 mM Tris-192 mM glycine (pH 8.
3) In a buffer of -20% methanol, it was electrophoretically adsorbed on a nitrocellulose filter and subjected to Western blotting. TB containing 3% gelatin with nitrocellulose filter that adsorbed protein
S buffer [20mM Tris-HCl (pH7.5), 500mM NaC
l] for 60 minutes, rabbit anti-human I was used as the primary antibody.
Indirect method using gG-Fc component antiserum (Kuppel) and human IgG F by immun blot assay kit (Bio-Rad) using peroxidase-labeled antibody
The c region protein was specifically stained. A copy of part of the results is shown in FIG. At this time, a known amount of natural human IgG Fc region protein prepared by the method described in Reference Example below was also electrophoresed on the same SDS-polyacrylamide gel.

第23図より、Fc領域遺伝子菌体内発現型プラスミドpFC3
62を有するエシェリヒア・コリC600株の場合には、Fc領
域蛋白質は菌体内画分にのみ局在しているのに対して、
ペリプラズム分泌発現型プラスミドpPS−FCを有するエ
シェリヒア・コリHB101株の場合にはペリプラズムま
で、菌体外分泌発現型プラスミドpEXFC10またはpEXFC10
0を有するエシェリヒア・コリHB101株の場合には菌体外
画分にまで、それぞれFc領域蛋白質が分泌されているこ
とがわかる。また、菌体外画分をアセトン乾燥した後、
Tris−HClバッファー（pH6.8）、SDSグリセロールをそ
れぞれ最終濃度60mM、２％、10％になるように加えて、
SDS−ポリアルリルアミドゲル電気泳動（分離用ゲル濃
度12.5％）を行った。上記と同様な手法により、ヒトIg
G Fc領域蛋白質を特異的に染色した結果の一部を複写
して、第24図に示した。この際に、後期参考例記載の方
法により調製した。天然型ヒトIgG Fc領域蛋白質も同
一のSDS−ポリアルリルアミドゲルで電気泳動等を行っ
た。From Fig. 23, the Fc region gene intracellular expression plasmid pFC3
In the case of the Escherichia coli C600 strain having 62, the Fc region protein is localized only in the intracellular fraction,
In the case of the Escherichia coli HB101 strain having the periplasmic secretory expression type plasmid pPS-FC, up to the periplasm, the extracellular secretory expression type plasmid pEXFC10 or pEXFC10
In the case of the Escherichia coli HB101 strain having 0, it can be seen that the Fc region protein is secreted up to the extracellular fraction. In addition, after the extracellular fraction was dried with acetone,
Tris-HCl buffer (pH 6.8) and SDS glycerol were added to final concentrations of 60 mM, 2% and 10%, respectively,
SDS-polyallylamide gel electrophoresis (gel concentration for separation 12.5%) was performed. By the same method as above, human Ig
A part of the result of specifically staining the G Fc region protein is reproduced and shown in FIG. At this time, it was prepared by the method described in the latter reference example. The native human IgG Fc region protein was also electrophoresed on the same SDS-polyallylamide gel.

第24図より、Fc領域遺伝子菌体外分泌発現型プラスミド
pEXFC10を有するエシェリヒアコリHB101株が菌体外に分
泌したFc領域蛋白質は、その大部分が天然型Fc領域蛋白
質と同様のジスルフィド結合を介した二量体構造をとっ
ていることがわかる。From Fig. 24, the Fc region gene extracellular secretory expression type plasmid
It can be seen that most of the Fc region proteins secreted extracellularly by the Escherichia coli HB101 strain having pEXFC10 have a dimer structure through a disulfide bond similar to the natural Fc region protein.

実施例21（分泌Fc領域蛋白質の精製） 3mlの活性型アフィニティー支持体アフィーゲル10（バ
イオ・ラッド）と6.2mgのアフィニティー精製ヒツジ抗
ヒトIgG−Fc成分抗体（カッペル）とを、0.1M MOPSバ
ッファー（pH7.5、半井化学薬品）中でカップリングさ
せて、ヒトIgG Fc領域蛋白質精製用アフィニティー・
カラムを作成した。４℃で２時間カップリングを行った
ところ、用いたヒツジ抗ヒトIgG−Fc成分抗体の約40％
が支持体上に固定化された。Example 21 (Purification of secreted Fc region protein) 3 ml of active affinity support Affi-gel 10 (Bio-Rad) and 6.2 mg of affinity purified sheep anti-human IgG-Fc component antibody (cappel) were mixed with 0.1 M MOPS buffer ( Affinity for purification of human IgG Fc region protein
Created a column. After coupling for 2 hours at 4 ° C, about 40% of the sheep anti-human IgG-Fc component antibody used
Were immobilized on the support.

前記実施例20で調製したFc領域遺伝子菌体外分泌発現型
プラスミドpEXFC10を有するエシェリヒアコリHB101株培
養物の菌体外画分の蛋白質を上記アフィニティー・カラ
ムに通し、Fc領域蛋白質のみを特異的にカラムに吸着さ
せた。カラムをPBSバッファー［100mMリン酸バッファー
（pH7.4）、140mM NaCl］及び500mM NaClを含む20mM
リン酸バッファー（pH7.4）で充分洗浄した後、0.1Mグ
リシン−HClバッファー（pH2.3）を用いて、Fc領域蛋白
質を溶出させた。溶出したFc領域蛋白質を水に対して透
析し、凍結乾燥した後に、実施例20の方法に準じてSDS
−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（分離用ゲル濃度1
2.5％）を行なった。電気泳動終了後、ゲル中の蛋白質
のバンドを銀染色試薬（第一化学薬品）を用いて染色し
たところ、98％以上の純度の大腸菌菌体外分泌Fc領域蛋
白質が得られたことが確認できた。The protein of the extracellular fraction of the Escherichia coli HB101 strain culture having the Fc region gene extracellular secretory expression type plasmid pEXFC10 prepared in Example 20 was passed through the affinity column to specifically column the Fc region protein only. Adsorbed on. 20 mM column containing PBS buffer [100 mM phosphate buffer (pH 7.4), 140 mM NaCl] and 500 mM NaCl
After thoroughly washing with phosphate buffer (pH 7.4), the Fc region protein was eluted with 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 2.3). The eluted Fc region protein was dialyzed against water, freeze-dried, and then subjected to SDS according to the method of Example 20.
-Polyacrylamide gel electrophoresis (concentration of gel for separation 1
2.5%). After the electrophoresis, the protein band in the gel was stained with a silver staining reagent (Daiichi Pure Chemicals), and it was confirmed that E. coli extracellular Fc region protein with a purity of 98% or higher was obtained. .

実施例22（分泌Fc領域蛋白質の解析） 前記実施例21で得られた大腸菌菌体外分泌Fc領域蛋白質
精製品を、気相プロテインシークエンサー（アプライ
ド、バイオシステムズ、モデル470A）にかけ、アミノ酸
末端のアミノ酸配列解析を行ったところ、 H2N−Ser−Thr−（ ）−Pro−Pro−（ ）−Pro−
… という結果が得られた。この結果はペニシリナーゼのシ
グナルペプチドが分泌の際に正しく切断されたことを示
すものである。また、分泌Fc領域蛋白質精製品を２％チ
オグリコール酸を含む6N HCl中に110℃で22時間保つこ
とによって加水分解した後、アミノ酸分析計（日立835
型）を用いたアミノ酸組成分析を行ない下記の結果が得
られた。Example 22 (Analysis of secretory Fc region protein) The Escherichia coli extracellular exocrine Fc region protein purified product obtained in Example 21 was applied to a gas phase protein sequencer (Applied, Biosystems, model 470A), and the amino acid sequence of the amino acid terminal was obtained. When analyzed, H 2 N-Ser-Thr- () -Pro-Pro- () -Pro-
The result was ... This result shows that the signal peptide of penicillinase was correctly cleaved during secretion. In addition, the secreted Fc region protein purified product was hydrolyzed by keeping it in 6N HCl containing 2% thioglycolic acid at 110 ° C for 22 hours, and then hydrolyzed with an amino acid analyzer (Hitachi 835
The following results were obtained by conducting an amino acid composition analysis using the (type).

遺伝子の塩基配列より類推した計算値が実験値とよく一
致していることから、大腸菌が菌体外に分泌したFc領域
蛋白質は計画通りのものであることがわかる。更に、天
然型Fc領域蛋白質の分子量が約5000ダルトン程度小さい
という第23図の結果から考えて、大腸菌が菌体外に分泌
したFc領域蛋白質には糖鎖の付加はおこっていないもの
と思われる。 The calculated value inferred from the nucleotide sequence of the gene is in good agreement with the experimental value, indicating that the Fc region protein secreted by E. coli extracellularly is as planned. Furthermore, considering that the molecular weight of the native Fc region protein is about 5000 daltons, which is small, it is considered that no sugar chain is added to the Fc region protein secreted extracellularly by Escherichia coli. .

参考例（天然型ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質の
調製） 0.3gのヒトIgG（シグマ）、17.5mgのシステイン、7.5mg
のEDTA・2NaをPBSバッファーに溶解し、150μｇのパパ
イン（シグマ，タイプIV）を添加して、37℃で７時間放
置する。パパイン処理後のIgGを、PBSバッファーで平衡
化したセファデックスＧ−200スーパー・ファイン・ゲ
ル（ファルマシア）を用いたゲル濾過カラムにかけ、パ
パイン処理によって生成したFc領域蛋白質及びFad領域
蛋白質を、未反応のIgGと分離した。得られたFc領域蛋
白質とFab領域蛋白質とを含む溶液を水に対して透析
し、凍結乾燥によって濃縮した後、DE52・DEAEセルロー
ス（ワットマン）を用いたイオン交換カラムにかけた。
カラムを10mMリン酸バッファー（pH7.4）で洗浄し、Fab
領域蛋白質を完全に溶出させた後、NaCl濃度を0mMから3
50mMまで直線的に変化させた10mM リン酸バッファー
（pH7.4）用いて、Fc領域蛋白質を溶出させた。上記と
同様にして透析、凍結乾燥を行ない、天然型ヒトIgG F
c領域蛋白質を取得した。Reference example (preparation of natural human immunoglobulin G Fc region protein) 0.3 g human IgG (Sigma), 17.5 mg cysteine, 7.5 mg
EDTA.2Na is dissolved in PBS buffer, 150 μg of papain (Sigma, type IV) is added, and the mixture is left at 37 ° C. for 7 hours. The papain-treated IgG was applied to a gel filtration column using Sephadex G-200 Super Fine Gel (Pharmacia) equilibrated with PBS buffer, and the Fc region protein and Fad region protein produced by the papain treatment were not reacted. Was separated from IgG. The obtained solution containing the Fc region protein and the Fab region protein was dialyzed against water, concentrated by freeze-drying, and then applied to an ion exchange column using DE52 / DEAE cellulose (Whatman).
The column was washed with 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) and Fab
After the domain protein was completely eluted, the NaCl concentration was changed from 0 mM to 3 mM.
The Fc region protein was eluted with 10 mM phosphate buffer (pH 7.4) which was linearly changed to 50 mM. Dialysis and freeze-drying were performed in the same manner as above to obtain natural human IgG F
The c region protein was obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of drawings]

第１図は、ヒトIgG Fc領域遺伝子ペリプラズム分泌発
現型プラスミドpPS−FCのDNA塩基配列の一部と、それに
対応する好アルカリ性バチルスNo.170株ペニシリナーゼ
・シグナルペプチドとFc領域蛋白質のアミノ酸配列を示
したものである。 第２図は、プラスミドpMB9中に存在するKil遺伝子のDNA
塩基配列を示したものでる。 第３図は、好アルカリ性バチルスNo.170株染色体DNA中
に存在するExプロモーター領域のDNA塩基配列を示した
ものである。 第４図は、ヒトIgG遺伝子を含むファージ・クローンの
制限酵素切断点地図とFc領域遺伝子を含むサブクローン
の制限酵素切断点地図とを示したものである。 第５図は、CH3部位遺伝子を含むプラスミドpFC70の作成
方法を示したものであり、第６図はCH2−CH3部位遺伝子
を含むプラスミドpFC77の作成方法を示したものであ
る。 第７図、第８図、第９図はそれぞれFc領域遺伝子菌体内
発現型プラスミドpFC203、pFC211、pFC362の作成方法を
示したものである。 第10図は、プラスミドDNAの大腸菌からの分離・精製方
法を示したものである。 第11図は、好アルカリ性バチルスNo.170ペニシリナーゼ
遺伝子のクローン化の方法を示したものである。 第12図、第13図、第14図、第15図は、菌体外分泌生産に
関与する情報を担うDNA領域を含むプラスミドpEAP3、pE
AP6、pEAP7、pEAP7ΔＨ、pEAP7ΔCCH、pEAP7ΔCH、pEAP
8、p329EXKの作成方法を示したものである。 第16図は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ構造遺伝子を含むプラスミドpCM71の作成方法を
示したものである。 第17図、第18図は、ペニシリナーゼ遺伝子プロモーター
領域・シグナルペプチド領域を含むプラスミドpPSI1、p
PS1ΔＨ、p329PSの作成方法を示したものである。 第19図は、シグナルペプチド領域遺伝子との連結用ジョ
イントを有するFc領域遺伝子を含むプラスミドpSEC−F
C、pSEC−FCCの作成方法を示したものである。 第20図は、Fc領域遺伝子ペリプラズム分泌発現型プラス
ミドpPS−FCの作成方法を示したものである。 第21図、第22図は、Fc領域遺伝子菌外分泌発現型プラス
ミドpEXFC10、pEXFC100の作成方法を示したものであ
る。 第23図は、Fc領域蛋白質の分泌確認結果を示したもので
ある。 第24図は、Fc領域蛋白質の構造確認結果を示したもので
ある。FIG. 1 shows a part of the DNA base sequence of the human IgG Fc region gene periplasmic secretory expression plasmid pPS-FC and the corresponding amino acid sequences of the alkaliphilic Bacillus No. 170 strain penicillinase signal peptide and the Fc region protein. It is a thing. Figure 2 shows the DNA of the Kil gene present in plasmid pMB9.
It shows the base sequence. FIG. 3 shows the DNA base sequence of the Ex promoter region present in the chromosomal DNA of the alkalophilic Bacillus No. 170 strain. FIG. 4 shows a restriction enzyme cleavage point map of a phage clone containing a human IgG gene and a restriction enzyme cleavage point map of a subclone containing an Fc region gene. FIG. 5 shows a method for constructing a plasmid pFC70 containing a C H 3 site gene, and FIG. 6 shows a method for constructing a plasmid pFC77 containing a C H 2 -C H 3 site gene. . FIG. 7, FIG. 8 and FIG. 9 show the method for preparing the Fc region gene intracellular expression plasmids pFC203, pFC211 and pFC362, respectively. FIG. 10 shows a method for separating and purifying plasmid DNA from Escherichia coli. FIG. 11 shows a method for cloning the alkalophilic Bacillus No. 170 penicillinase gene. Figures 12, 13, 14, and 15 show plasmids pEAP3 and pE containing a DNA region that carries information involved in extracellular secretion production.
AP6, pEAP7, pEAP7ΔH, pEAP7ΔCCH, pEAP7ΔCH, pEAP
8, shows how to create p329EXK. FIG. 16 shows a method for constructing a plasmid pCM71 containing a chloramphenicol acetyltransferase structural gene. 17 and 18 show plasmids pPSI1 and p containing the penicillinase gene promoter region / signal peptide region.
It shows how to make PS1ΔH and p329PS. FIG. 19 is a plasmid pSEC-F containing an Fc region gene having a joint for ligation with a signal peptide region gene.
It shows how to create C and pSEC-FCC. FIG. 20 shows a method for constructing the Fc region gene periplasmic secretion expression plasmid pPS-FC. FIG. 21 and FIG. 22 show the method for preparing the Fc region gene exocrine expression plasmids pEXFC10 and pEXFC100. FIG. 23 shows the results of confirmation of Fc region protein secretion. FIG. 24 shows the results of confirming the structure of the Fc region protein.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 中村 聡 東京都日野市旭が丘４丁目３番２号 帝人 株式会社中央研究所内─────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (51) Int.Cl. 6 Identification number Internal reference number FI Technical indication C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (72) Inventor Satoshi Nakamura Hino, Tokyo 4-3-2 Asahigaoka, Ichi, Central Research Institute, Teijin Limited

Claims (11)

【特許請求の範囲】[Claims] 【請求項１】ｉ）ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質
をコードするDNA領域、該蛋白質の発現調節を行なうプ
ロモーター機能を有するDNA領域及びシグナルペプチド
をコードするDNA領域を有するDNA断片、及び ii）プラスミドpMB9から得ることができるKil遺伝子及
び好アルカリ性バチルスから得ることができるExプロモ
ーターを有するDNA断片、 を有するプラスミド。1. A DNA region encoding a human immunoglobulin G Fc region protein, a DNA region having a promoter function for regulating the expression of the protein and a DNA region encoding a signal peptide, and ii) a plasmid. A DNA fragment having a Kil gene obtainable from pMB9 and an Ex promoter obtainable from an alkalophilic Bacillus. 【請求項２】ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質をコ
ードするDNA領域が、第１図に示されたアミノ酸配列の3
2番目（Thr）から254番目（Lys）までによって示された
ポリペプチドをコードするDNA領域を少なくとも含むこ
とを特徴とする第１項記載のプラスミド。2. A DNA region encoding a human immunoglobulin G Fc region protein has the amino acid sequence 3 shown in FIG.
The plasmid according to claim 1, which comprises at least a DNA region encoding a polypeptide shown by the second (Thr) to the 254th (Lys). 【請求項３】第１項ｉ）におけるプロモーター機能を有
するDNA領域が、好アルカリ性バチルス（Bacillus）No.
170株の染色体DNA由来であることを特徴とする第１項記
載のプラスミド。3. A DNA region having a promoter function according to item 1 i) has an alkaliphilic Bacillus No.
The plasmid according to item 1, which is derived from chromosomal DNA of 170 strains. 【請求項４】シグナルペプチドをコードするDNA領域
が、好アルカリ性バチルス（Bacillus）No.170株の染色
体DNA由来であることを特徴とする第１項記載のプラス
ミド。4. The plasmid according to claim 1, wherein the DNA region encoding the signal peptide is derived from the chromosomal DNA of the alkalophilic Bacillus No. 170 strain. 【請求項５】該Kil遺伝子がプラスミドpMB9由来である
ことを特徴とする第１項記載のプラスミド。5. The plasmid according to claim 1, wherein the Kil gene is derived from the plasmid pMB9. 【請求項６】第１項ii）における該Exプロモーターが、
好アルカリ性バチルス（Bacillus）No.170株の染色体DN
A由来であることを特徴とする第１項記載のプラスミ
ド。6. The Ex promoter according to claim 1 ii),
Chromosomal DN of alkalophilic Bacillus No. 170 strain
The plasmid according to item 1, which is derived from A. 【請求項７】プラスミドpEXFC10である第１項記載のプ
ラスミド。7. The plasmid according to claim 1, which is the plasmid pEXFC10. 【請求項８】プラスミドpEXFC100である第１項記載のプ
ラスミド。8. The plasmid according to claim 1, which is the plasmid pEXFC100. 【請求項９】ｉ）ヒト免疫グロブリンＧ Fc領域蛋白質
をコードするDNA領域、該蛋白質の発現調節を行なうプ
ロモーター機能を有するDNA領域及びシグナルペプチド
をコードするDNA領域を有するDNA断片、及び ii）プラスミドpMB9から得ることができるKil遺伝子及
び好アルカリ性バチルスから得ることができるExプロモ
ーターを有するDNA断片、 を含むプラスミドによって形質転換された組換え大腸
菌。9. A DNA region encoding a human immunoglobulin G Fc region protein, a DNA region having a promoter function for controlling the expression of the protein and a DNA region encoding a signal peptide, and ii) a plasmid. A recombinant Escherichia coli transformed with a plasmid containing a Kil gene obtainable from pMB9 and a DNA fragment having an Ex promoter obtainable from an alkalophilic Bacillus. 【請求項１０】該大腸菌がエシェリヒア（Escherichi
a）属に属することを特徴とする第９項記載の大腸菌。10. The Escherichia coli is Escherichia.
a) The Escherichia coli according to item 9, which belongs to the genus. 【請求項１１】該大腸菌がエシェリヒア・コリ（Escher
ichia coli）HB101株であることを特徴とする第９項記
載の大腸菌。11. The Escherichia coli is Escherichia coli.
ichia coli) HB101 strain, E. coli according to item 9.
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US8110665B2 (en) 2003-11-13 2012-02-07 Hanmi Holdings Co., Ltd. Pharmaceutical composition comprising an immunoglobulin FC region as a carrier
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