JPH0212063A - 肺腺癌抗原の定量法 - Google Patents
肺腺癌抗原の定量法Info
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Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
産業上の利用分野
本発明は、ヒト肺腺癌の臨床診断に適用できる&1i腺
癌抗原の定量法を提供する。
癌抗原の定量法を提供する。
従来の技術
抗ヒト肺繍平」二皮癌モノクロー°ナル抗体SLC−4
54は、本発明者が作製したモノクローナル抗体C1こ
れを用いる肺癌の陽性率は、25%で肺腺癌の陽性率は
30%である(特開昭63−195(il)。
54は、本発明者が作製したモノクローナル抗体C1こ
れを用いる肺癌の陽性率は、25%で肺腺癌の陽性率は
30%である(特開昭63−195(il)。
発明が解決し、ようとする課題
SLC−454を用いる肺腺癌の血清診断は、現状にB
いて臨床的価値は大きいが、必ずしも肺腺癌特異的とは
いえず、特に肺などの良性疾患での偽陽性率が高いため
、さらに肺腺癌に特W性の1:5い+Iit /+1診
断法が要望されている。
いて臨床的価値は大きいが、必ずしも肺腺癌特異的とは
いえず、特に肺などの良性疾患での偽陽性率が高いため
、さらに肺腺癌に特W性の1:5い+Iit /+1診
断法が要望されている。
課題を解決するための手段
本発明者は、抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体Δし、C
−1’lG4を第一抗体とし2、酵素あるいは放射線線
、!il& した抗ヒトI)Ii Q 承−L皮癌モノ
クローナル抗体SLC−454を第二抗体とするサンド
イッチ方式の免疫測定法によれば、ル1711!i!癌
に特異性の高い血清診断を行うことができることを見い
出し本発明を完成するに至った。
−1’lG4を第一抗体とし2、酵素あるいは放射線線
、!il& した抗ヒトI)Ii Q 承−L皮癌モノ
クローナル抗体SLC−454を第二抗体とするサンド
イッチ方式の免疫測定法によれば、ル1711!i!癌
に特異性の高い血清診断を行うことができることを見い
出し本発明を完成するに至った。
以下、本発明について詳細に説明する。
本発明によれば、抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体A
L C−864を第一抗体とし、これを固相化し、これ
にヒト血lO検体を反応させて肺腺癌抗原を結合させ、
ついで酵素標識あるいは放射線標識した抗ヒト肺扁平」
−皮癌千ノクローナル抗体S+、C454を第二抗体と
して前記第一抗体に結合した肺腺癌抗原に結合させ、結
合した第二抗体の量を標識した酵素の活性あるいは放射
能を測定することにより血清検体中の肺腺癌抗原を定M
することができる。
L C−864を第一抗体とし、これを固相化し、これ
にヒト血lO検体を反応させて肺腺癌抗原を結合させ、
ついで酵素標識あるいは放射線標識した抗ヒト肺扁平」
−皮癌千ノクローナル抗体S+、C454を第二抗体と
して前記第一抗体に結合した肺腺癌抗原に結合させ、結
合した第二抗体の量を標識した酵素の活性あるいは放射
能を測定することにより血清検体中の肺腺癌抗原を定M
することができる。
SLC−454は、本発明者らが先に特開昭63−1.
9561で開示したモノクローナル抗体であり、該モノ
クローナル抗体産生渣を有するバイブリド−7株Sし、
C−454(以下SLC−454株という)を用いてr
!A造できる。St、C−454株は、Europea
n Co11ection or^n1llalCel
l Cu1tureにECACC86070306とし
て寄託しである。
9561で開示したモノクローナル抗体であり、該モノ
クローナル抗体産生渣を有するバイブリド−7株Sし、
C−454(以下SLC−454株という)を用いてr
!A造できる。St、C−454株は、Europea
n Co11ection or^n1llalCel
l Cu1tureにECACC86070306とし
て寄託しである。
△LC−864は、次の通りにして製造することができ
る。
る。
(1)動物の免疫と抗体産生細11?!1の調製3〜1
0週令、望ましくは8週令のマウスに、肺腺癌患者真水
の高分子分画を免疫して、その動物の牌、リンパ節、末
梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスはヒ
ト正常肺細胞で1111処理して免疫寛容にしたマウス
を用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当tエアシュバント〔
例えば、70インドの完全アジユバント(Comple
te Freund’s AdjuvanL)または、
水酸化アルミニウドゲルと釘日咳閑ワクチンなど〕とと
もにヒト肺腺癌患者真水の高分子分画(10〜500爬
/匹)を投与する。以後、1〜2週問おき1と抗原を2
〜5回投与する。各免疫後3〜70目に眼底静脈叢より
採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に
示す酵素免疫測定法[酵素免疫測定法(ELISA):
医学書院刊1976年]などで調べる。
0週令、望ましくは8週令のマウスに、肺腺癌患者真水
の高分子分画を免疫して、その動物の牌、リンパ節、末
梢血中の抗体産生細胞を調製する。免疫するマウスはヒ
ト正常肺細胞で1111処理して免疫寛容にしたマウス
を用いるのが好ましい。免疫の方法は、動物の皮下ある
いは静脈内あるいは腹腔内に、適当tエアシュバント〔
例えば、70インドの完全アジユバント(Comple
te Freund’s AdjuvanL)または、
水酸化アルミニウドゲルと釘日咳閑ワクチンなど〕とと
もにヒト肺腺癌患者真水の高分子分画(10〜500爬
/匹)を投与する。以後、1〜2週問おき1と抗原を2
〜5回投与する。各免疫後3〜70目に眼底静脈叢より
採血し、その血清がヒト肺腺癌と反応することを以下に
示す酵素免疫測定法[酵素免疫測定法(ELISA):
医学書院刊1976年]などで調べる。
酵素免疫測定法:
96穴のE I A用プレート〔フロー・ラボラトリー
ズ(Flow Laboratories)社製〕に、
正常あるいは腫瘍細胞9組織の膜成分(蛋白量としてl
O〜1,000μg /all含をする膜断片)を10
0〜200μm/穴ずつ分注し、4tでl〜2晩放圃し
て、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、PBS
(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸−カリウム0
.21g、食塩?、05g。
ズ(Flow Laboratories)社製〕に、
正常あるいは腫瘍細胞9組織の膜成分(蛋白量としてl
O〜1,000μg /all含をする膜断片)を10
0〜200μm/穴ずつ分注し、4tでl〜2晩放圃し
て、上清を抜き去った後、レジン水あるいは、PBS
(リン酸二ナトリウム1.83g、リン酸−カリウム0
.21g、食塩?、05g。
蒸溜水1j’、pH7,2)でよく洗浄後、1%口S^
(牛血清アルブミン)を含むPBS溶液(IIS^−P
us)を100〜200μm/穴分注し、4℃でl〜2
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック(プロフキング)した。
(牛血清アルブミン)を含むPBS溶液(IIS^−P
us)を100〜200μm/穴分注し、4℃でl〜2
晩放置して、プレート上に残った蛋白質との結合残基を
ブロック(プロフキング)した。
その後、l3SA−PBSを捨て、レジン水あるいはP
[3Sでよく洗浄した後、第一抗体として、BSA−r
’13sで希釈した試料(マウス血清。
[3Sでよく洗浄した後、第一抗体として、BSA−r
’13sで希釈した試料(マウス血清。
バイブリド−7培養上清、精製モノクローナル抗体)を
100μl/穴分注し、4tで1晩放置する。レジン水
で1回、2M NaCj!溶液で6回洗浄した後、第
二抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリン[gG
−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ(i)AKO)社製、
販売元協和メデックス〕の100倍希釈液を100m/
穴分注し、室温で2時間放置する。
100μl/穴分注し、4tで1晩放置する。レジン水
で1回、2M NaCj!溶液で6回洗浄した後、第
二抗体としてウサギの抗マウスイムノグロブリン[gG
−ペルオキシダーゼ結合物〔ダコ(i)AKO)社製、
販売元協和メデックス〕の100倍希釈液を100m/
穴分注し、室温で2時間放置する。
PBSでよく洗浄後、ABTS基質液〔2゜2′−アジ
ノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸
)ニアンモニウム55011gを0.1Mクエンl’i
i2緩衝液(pH4,2>11に溶かした溶液に、使用
直前に過酸化水素1 d/mlを加えた溶液〕を用い、
発色をOD s + Sn*の吸光度で測定する。この
とき、肺腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対し
て強く反応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとしてバ
イブリド−7作製のための抗体産生細胞の供給源として
用いる。
ノビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸
)ニアンモニウム55011gを0.1Mクエンl’i
i2緩衝液(pH4,2>11に溶かした溶液に、使用
直前に過酸化水素1 d/mlを加えた溶液〕を用い、
発色をOD s + Sn*の吸光度で測定する。この
とき、肺腺癌細胞、組織あるいはそれらの膜成分に対し
て強く反応するマウスをヒト肺腺癌免疫マウスとしてバ
イブリド−7作製のための抗体産生細胞の供給源として
用いる。
酵素免疫測定法を行うにあたって、抗原として、細胞そ
のものを用いる場合は、ファルコン(Falcon)
3072プレート中で、標的細胞を培養し、0.25%
ゲルタールアルデヒド−PBSを加え、室温に1〜2時
間放置し、 PBSでよく洗浄後、1%BSΔ−PBS
100〜21)0μgを加え、2時間放置し、レジン水
または、 l’flsでよく洗浄し、そのプレートを用
いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方
法にて、抗体価の測定を行った。
のものを用いる場合は、ファルコン(Falcon)
3072プレート中で、標的細胞を培養し、0.25%
ゲルタールアルデヒド−PBSを加え、室温に1〜2時
間放置し、 PBSでよく洗浄後、1%BSΔ−PBS
100〜21)0μgを加え、2時間放置し、レジン水
または、 l’flsでよく洗浄し、そのプレートを用
いて、一般の抗原コートプレートを用いるのと同様の方
法にて、抗体価の測定を行った。
細胞融合に供するにあたって、免疫化マウスに融合処理
の3〜4日前に、ヒ) I)Ii Illll癌患者胸
高分子分画10〜400μg/匹を腹腔内に投与し、I
IQ!臓細胞全細胞し、肺細胞を調製する。
の3〜4日前に、ヒ) I)Ii Illll癌患者胸
高分子分画10〜400μg/匹を腹腔内に投与し、I
IQ!臓細胞全細胞し、肺細胞を調製する。
ff1tl臓をMEM (日永製薬社製)中で細断し、
ビンセットでほぐし、l 20 Orpm、5分間遠心
分離し、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩lj
i液(pH7,(i5)で1〜2分間処理し赤血球を除
去し、M E Mで3回洗浄して融合用1庫細胞として
提供する。
ビンセットでほぐし、l 20 Orpm、5分間遠心
分離し、上清を捨て、トリス−塩化アンモニウム緩lj
i液(pH7,(i5)で1〜2分間処理し赤血球を除
去し、M E Mで3回洗浄して融合用1庫細胞として
提供する。
免疫原として用いる肺腺癌患者真水の高分子分画の調製
は以下の通り行う。
は以下の通り行う。
すなわち−80℃に保存しておいた肺腺癌忠者胸水を融
解後、3.00 Orpm、 10分間遠心分離し、固
形分を除いた上清をセルロファインGCL−2000S
F (生化学工業社I!JJ、)カラムに通塔し、分子
m +、ooo、ooo以上の高分子画分を集め、肺腺
癌患者真水の高分子分画とする。
解後、3.00 Orpm、 10分間遠心分離し、固
形分を除いた上清をセルロファインGCL−2000S
F (生化学工業社I!JJ、)カラムに通塔し、分子
m +、ooo、ooo以上の高分子画分を集め、肺腺
癌患者真水の高分子分画とする。
(2)骨髄腫細胞の調製
骨Mill細胞としては、マウスから得られた株化細胞
を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(
BALB/c山来)骨髄腫細胞株P3−X63八g8−
Ul (P3−Ul)〔カレント・トピックス・イン
・ミクロバイオロジイ・アンド帝イムノロシイ−1(C
urrentTopics 線量 Microbiol
ogy and 1mmunology −1)]〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブーイ12ノロジ4 (f
lturopean J、 Immunology)
6 、 511−519(1976)] 、SP21
0−Ag 14 (SP−2)〔ネイチャー(Natu
re)276、269−270 (1978))、P
3−X 63−A g8653 (653) C’)+
−f−ル・オブ・イムノロジ4 (J、1mmuno
logy) 123.1548−1550 (1979
) ] 、P 3−X 63−Δg8(X63) 〔ネ
イチャー (Nature) 256.495−49
7(1975)]などが用いられる。これらの細胞株は
、8−アザグアニン培地(RPMI−16/lo培地に
グルタミン(1,5mM)、2メルカプトエタノール(
5X10−’M)、ジェンタマイシン(10μg/ll
1)および牛胎児血清(F’C3)(C5L社製、10
%)を加えた正常培地に、さらに8−アブグアニン(1
5μs/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合
の3−4日前に正常培地に継代し、融合当日2X10’
以上の細胞数を確保する。
を使用する。たとえば、8−アザグアニン耐性マウス(
BALB/c山来)骨髄腫細胞株P3−X63八g8−
Ul (P3−Ul)〔カレント・トピックス・イン
・ミクロバイオロジイ・アンド帝イムノロシイ−1(C
urrentTopics 線量 Microbiol
ogy and 1mmunology −1)]〔ヨ
ーロピアン・ジャーナル・オブーイ12ノロジ4 (f
lturopean J、 Immunology)
6 、 511−519(1976)] 、SP21
0−Ag 14 (SP−2)〔ネイチャー(Natu
re)276、269−270 (1978))、P
3−X 63−A g8653 (653) C’)+
−f−ル・オブ・イムノロジ4 (J、1mmuno
logy) 123.1548−1550 (1979
) ] 、P 3−X 63−Δg8(X63) 〔ネ
イチャー (Nature) 256.495−49
7(1975)]などが用いられる。これらの細胞株は
、8−アザグアニン培地(RPMI−16/lo培地に
グルタミン(1,5mM)、2メルカプトエタノール(
5X10−’M)、ジェンタマイシン(10μg/ll
1)および牛胎児血清(F’C3)(C5L社製、10
%)を加えた正常培地に、さらに8−アブグアニン(1
5μs/ml)を加えた培地〕で継代するが、細胞融合
の3−4日前に正常培地に継代し、融合当日2X10’
以上の細胞数を確保する。
(3)細胞融合
(1)で免疫した抗体産生細胞と(2)で得られた骨髄
腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜IO:lになるよ
う混合し、遠心分離(1,200rpm、 5分)し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
撹拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−
1,000(I’EG−1,000)2 g、MEM2
miおよびジメチルスルホキシド0.7011の混液0
.2〜1ml/ I O’抗体産生細胞を加え、1〜2
分間毎にMEM1〜21を数回加えた後、MEMを加え
て全量が501になるようにする。遠心分離(900r
ρm、5分)後、上清を橋で、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地(Fe2 10%を含むRPMI−16
40培地)100+nlを加え、メスピペットによる吸
込み、吹出しでゆるやかに細胞を懸濁する。
腫細胞をMEM培地またはPBSでよく洗浄し、細胞数
が、抗体産生細胞:骨髄腫細胞=5〜IO:lになるよ
う混合し、遠心分離(1,200rpm、 5分)し
た後、上清を捨て、沈殿した細胞群をよくほぐした後、
撹拌しながら、37℃で、ポリエチレングライコール−
1,000(I’EG−1,000)2 g、MEM2
miおよびジメチルスルホキシド0.7011の混液0
.2〜1ml/ I O’抗体産生細胞を加え、1〜2
分間毎にMEM1〜21を数回加えた後、MEMを加え
て全量が501になるようにする。遠心分離(900r
ρm、5分)後、上清を橋で、ゆるやかに細胞をほぐし
た後、正常培地(Fe2 10%を含むRPMI−16
40培地)100+nlを加え、メスピペットによる吸
込み、吹出しでゆるやかに細胞を懸濁する。
この懸濁液を96穴培養用プレートに100〃/穴ずつ
分注し、5%CO□インキュベーター中、37℃で24
時間培養する。培養プレートに1ooALI/穴のHA
T培地〔正常培地にヒポキサンチン(10−’M)、
チミジン(1,5X10−’M)およびアミノブチリ7
(4X10−’M)を加えた培地〕を加え、さらに24
時間培養する。以後2日間、24時間毎に、培養上清1
oou1をゆで、新たに同mのHAT培地を加え、5%
COtインキュベーター中、37℃でlO〜14日間培
養する。
分注し、5%CO□インキュベーター中、37℃で24
時間培養する。培養プレートに1ooALI/穴のHA
T培地〔正常培地にヒポキサンチン(10−’M)、
チミジン(1,5X10−’M)およびアミノブチリ7
(4X10−’M)を加えた培地〕を加え、さらに24
時間培養する。以後2日間、24時間毎に、培養上清1
oou1をゆで、新たに同mのHAT培地を加え、5%
COtインキュベーター中、37℃でlO〜14日間培
養する。
コロニー状に生育してきた融合細胞の認められる穴につ
いて、上清100ノtQを捨て、o ′r Jr’;地
(1)Δ1゛培地からアミノプテリンを除いた培地)を
同量加え、以後2日間24時間毎にト1′F培地への変
換を行う。
いて、上清100ノtQを捨て、o ′r Jr’;地
(1)Δ1゛培地からアミノプテリンを除いた培地)を
同量加え、以後2日間24時間毎にト1′F培地への変
換を行う。
IIT培地で3〜4目間培養後、培養上清の一部をとり
上記の酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法(AB
C法)(酵素抗体法、学際企画刊、106頁、1985
年)により、ヒト肺腺癌に対する抗体価を測定する。こ
のとき、同様の方法で、ヒト正常細胞、組織あるいはそ
の膜成分、などとの反応性も測定し1、ヒト肺腺癌細胞
1組織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選
択する。ヒト肺腺癌細胞1組織あるいはその膜成分に強
く反応し、ヒト正常細胞。
上記の酵素免疫測定法又は、免疫組織学的判定法(AB
C法)(酵素抗体法、学際企画刊、106頁、1985
年)により、ヒト肺腺癌に対する抗体価を測定する。こ
のとき、同様の方法で、ヒト正常細胞、組織あるいはそ
の膜成分、などとの反応性も測定し1、ヒト肺腺癌細胞
1組織あるいはその膜成分に特異的に反応するものを選
択する。ヒト肺腺癌細胞1組織あるいはその膜成分に強
く反応し、ヒト正常細胞。
組織あるいはその膜成分などに反応しない穴について、
限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し、安定し
てヒト肺腺癌細胞1組織あるいはその膜成分に強い抗体
価の認められたものを抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。該ハイプリドー
マ株の具体例としては、ハイプリドーマ株へLC864
(以下ALC−864株という)があげられる。
限界希釈法によりクローニングを2回繰り返し、安定し
てヒト肺腺癌細胞1組織あるいはその膜成分に強い抗体
価の認められたものを抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体
産生ハイブリドーマ株として選択する。該ハイプリドー
マ株の具体例としては、ハイプリドーマ株へLC864
(以下ALC−864株という)があげられる。
ΔLC−8611株は昭和63年3月9日付で工業技術
院微生物工業技術研究所にFERMB P −1783
として寄託しである。
院微生物工業技術研究所にFERMB P −1783
として寄託しである。
(4) 単クローン性抗体の調製
ブリスタン処理〔2゜6. 10. 14−ブトラメチ
ルベンタデカン (I’risLane) 0.5 m
lを1復腔内投与し、2週間飼育する〕した8〜IO週
令のBΔLB/cflマウスに、(3)で得られたΔL
C−864株細胞2〜4 X 10’細胞/匹を腹腔内
注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化す
る。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,00
Orρm、 5分)して固形分を除去後、50%φ酸
アンモニウムにて塩析し、0.04 Mリン酸緩衝液(
p H8,0,0,03M NaCj!を含む)で透
析後、D E 52 (Whata+an社製;ベット
ポリコーム50o+I)のカラムに流速20〜3011
11/時で通塔し、IgG画分を集め、精製モノタロ・
−ナル抗体ALC−8(i4とする。
ルベンタデカン (I’risLane) 0.5 m
lを1復腔内投与し、2週間飼育する〕した8〜IO週
令のBΔLB/cflマウスに、(3)で得られたΔL
C−864株細胞2〜4 X 10’細胞/匹を腹腔内
注射する。10〜21日でハイブリドーマは腹水癌化す
る。このマウスから腹水を採取し、遠心分離(3,00
Orρm、 5分)して固形分を除去後、50%φ酸
アンモニウムにて塩析し、0.04 Mリン酸緩衝液(
p H8,0,0,03M NaCj!を含む)で透
析後、D E 52 (Whata+an社製;ベット
ポリコーム50o+I)のカラムに流速20〜3011
11/時で通塔し、IgG画分を集め、精製モノタロ・
−ナル抗体ALC−8(i4とする。
抗体のイソタイプの決定は、オクタロニイ(Oucht
er 1ony)法(二重免疫拡散法) (免疫学実験
入門、生物化学実験法15、学会出版セン・ター刊、7
4頁、1981年)によって行う。
er 1ony)法(二重免疫拡散法) (免疫学実験
入門、生物化学実験法15、学会出版セン・ター刊、7
4頁、1981年)によって行う。
蛋白量の定量は、フォーリン法および280nmでの吸
光度(1,4(OD2−、)ζイムノグロブリン1mg
/ml〕より算出する。
光度(1,4(OD2−、)ζイムノグロブリン1mg
/ml〕より算出する。
得られたモノクローナル抗体の特異性の決定は複数の検
体から得られたヒトの各種の&1器山来のiト常あるい
は腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、8種ヒト正
常あるいは腫瘍細胞17ζ養株またはヒト胎児細胞培養
株もしくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られ
ている癌胎児性抗原(例えばCEΔ)との反応性、重心
。
体から得られたヒトの各種の&1器山来のiト常あるい
は腫瘍組織あるいはその膜成分との反応性、8種ヒト正
常あるいは腫瘍細胞17ζ養株またはヒト胎児細胞培養
株もしくはそれらの膜成分との反応性、従来から知られ
ている癌胎児性抗原(例えばCEΔ)との反応性、重心
。
各種患者血清との反応性などを、酵素免疫測定法、蛍光
抗体法、免疫組織′ン的判定法(ABC法)などにより
測定することにより行う。
抗体法、免疫組織′ン的判定法(ABC法)などにより
測定することにより行う。
モノクローナル抗体SLC−454の酵素標識は、酵素
としてペル1゛キシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどを用い、過ヨ
ウ素酸架橋法〔ジャーナル・才ブ・ヒストケミストリイ
・了′ンド・サイトケミストリイ(J、IIistoc
hegl、Cytochem、)22.1084〜10
91. (1971) )に従って行う。
としてペル1゛キシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリフォ
スファターゼ、β−ガラクトシダーゼなどを用い、過ヨ
ウ素酸架橋法〔ジャーナル・才ブ・ヒストケミストリイ
・了′ンド・サイトケミストリイ(J、IIistoc
hegl、Cytochem、)22.1084〜10
91. (1971) )に従って行う。
ペルオキシダーゼを用いる過ヨウ素酸架橋法は、例、え
ば次の通り行う。
ば次の通り行う。
ペルオキシダーゼを0.3M重炭酸ソーダ緩衝液(pH
8,1)In+lに溶かし、フルオロ−2,4−ジニト
ロベンゼン(DNP)エタノール1%溶液0.1mlを
加え、これに0.06Maヨウ素酸1mlを加え、室温
で30分+111反応さ「る。これをp H9,5の0
゜01M炭酸緩衝液で透析してDNP化したアルデヒド
基がついたペルオキシダーゼを含む透析液を()る。こ
の透析後の溶液に蛋白量として5mgの抗体を加え、室
温で2時間反応させ、pH7,2の0.01M リン
酸緩衝液で透析し、透析後の溶液を5ephadex
G4.100カラムクロマトグラフイーにかけゲルp遇
する。
8,1)In+lに溶かし、フルオロ−2,4−ジニト
ロベンゼン(DNP)エタノール1%溶液0.1mlを
加え、これに0.06Maヨウ素酸1mlを加え、室温
で30分+111反応さ「る。これをp H9,5の0
゜01M炭酸緩衝液で透析してDNP化したアルデヒド
基がついたペルオキシダーゼを含む透析液を()る。こ
の透析後の溶液に蛋白量として5mgの抗体を加え、室
温で2時間反応させ、pH7,2の0.01M リン
酸緩衝液で透析し、透析後の溶液を5ephadex
G4.100カラムクロマトグラフイーにかけゲルp遇
する。
活性画分を酵素標識抗体として使う。
酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合はΔBTS基
質液を用い、発色をOD*+sn+aの吸光度で測定す
る。ウレアーゼの基質としでは8i+gブロムクレゾー
ルパープル、 100 mglR累オよび0.2mM
EDTAを100m1中に含むr+)(4,8の溶
液を使い、測定はジャーナル・:4゛ブ・イムノロジカ
ル・メソッ゛ゾ(J、 [mmunol、 M耐h o
d s )53 、187〜194 (1982)
に記載の方法に従って行う。アルカリフォスファターゼ
の基質としては1mg/ml p−ニトロフェニルリ
ン酸ヲ0.1Mジェタノールアミン緩(Φ1故に溶かし
たものを使う。
質液を用い、発色をOD*+sn+aの吸光度で測定す
る。ウレアーゼの基質としでは8i+gブロムクレゾー
ルパープル、 100 mglR累オよび0.2mM
EDTAを100m1中に含むr+)(4,8の溶
液を使い、測定はジャーナル・:4゛ブ・イムノロジカ
ル・メソッ゛ゾ(J、 [mmunol、 M耐h o
d s )53 、187〜194 (1982)
に記載の方法に従って行う。アルカリフォスファターゼ
の基質としては1mg/ml p−ニトロフェニルリ
ン酸ヲ0.1Mジェタノールアミン緩(Φ1故に溶かし
たものを使う。
酵素’tFAJはビオチン−アビジンの結合を介して行
うこともできる。ビオチン4+Wlは、ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリイ・アンド・サイトケミストリイ
(J、 llistochem、 Cytochem、
)27 、11.31〜1139 (1979)に記
載の方法で行うことができる。
うこともできる。ビオチン4+Wlは、ジャーナル・オ
ブ・ヒストケミストリイ・アンド・サイトケミストリイ
(J、 llistochem、 Cytochem、
)27 、11.31〜1139 (1979)に記
載の方法で行うことができる。
血清診断は次の通り行う。
96穴ElΔ用プレートに、第一抗体として、ΔF、C
−864In〜lonμg/mlを50〜200d/穴
4°つ分注し、4℃〜室温で2時間〜2晩放置する。P
13 Sで洗浄後、1%[35△PBS 200μ
Q/穴を加え、さらに4″C〜室温で2時間〜1晩放置
する。このプレートをP B Sでよく洗浄後、各式に
、血清検体を1〜100倍希釈で、50〜100ρ加え
る。4℃〜室温で2時間〜1晩放置後、P[3Sでよく
洗浄する。次にビオチン化したSLC−454(10〜
100 q/ml)を第二抗体として50〜100m/
穴加え、さらに4℃〜室温で2時間〜1晩放置する。プ
レートをPBSでよく洗浄後、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ〔ベクトール(Vector)社製)
(10m/ml)を50〜100■/穴加え、室温で
10〜30分間放置し、5%SDS溶液50〜100μ
m/穴加え反応を停止する。各式のOD、、、値を測定
し、その発色度より、血清検体中の抗原量を算出する。
−864In〜lonμg/mlを50〜200d/穴
4°つ分注し、4℃〜室温で2時間〜2晩放置する。P
13 Sで洗浄後、1%[35△PBS 200μ
Q/穴を加え、さらに4″C〜室温で2時間〜1晩放置
する。このプレートをP B Sでよく洗浄後、各式に
、血清検体を1〜100倍希釈で、50〜100ρ加え
る。4℃〜室温で2時間〜1晩放置後、P[3Sでよく
洗浄する。次にビオチン化したSLC−454(10〜
100 q/ml)を第二抗体として50〜100m/
穴加え、さらに4℃〜室温で2時間〜1晩放置する。プ
レートをPBSでよく洗浄後、アビジン−ビオチン−ペ
ルオキシダーゼ〔ベクトール(Vector)社製)
(10m/ml)を50〜100■/穴加え、室温で
10〜30分間放置し、5%SDS溶液50〜100μ
m/穴加え反応を停止する。各式のOD、、、値を測定
し、その発色度より、血清検体中の抗原量を算出する。
このようにして得られた健常人血清中の抗原量と癌患者
血清中の抗原量を比較することにより、正常値を決定し
、その正常値を超えるものを肺腺癌陽性とする。第一抗
体としてSLC−154、第二抗体としてビオチン化し
たALC−864を用いても同様に肺腺癌抗原を定量す
ることができる。
血清中の抗原量を比較することにより、正常値を決定し
、その正常値を超えるものを肺腺癌陽性とする。第一抗
体としてSLC−154、第二抗体としてビオチン化し
たALC−864を用いても同様に肺腺癌抗原を定量す
ることができる。
以下に本発明の実施例を示1゜
実施例1゜
96穴E Iへ用プレート〔フロー・ラボラlリーズ(
Flow l、aboraLories)社製〕に、参
考例1.により製造したA1.、C−864(I OJ
1g/ml) 1004/穴を第一抗体として加え、4
℃で1晩放置後、PI35′T!沈浄し、1%T3 S
Δ−I’BS 200#/穴加え4℃で1晩放置し、
PBSでよく洗浄したプレートに、健常人血清(144
検体)および肺癌患者血清(92検体)、胃癌患者血清
(33検体)、乳IFiS忠者血清(27検体)、人I
l!癌II者血清(25検体)、膵癌患者血清(IO検
体)、胆嚢・胆管癌患者血清(5検体)、純良性疾患患
者血清(+6検体)、胃潰瘍患者血清(l−0検体)、
肝硬変患者血l#(3検体)、膵炎患者血l?j(3検
体)の10倍希釈液を504/穴加え、4℃で1晩放置
後、P B Sでよく洗浄した。ビオチン化SLC−4
54(10q/ml) l 00 雇/穴を第二抗体
として加え、4℃で1晩放置し、PBSでよく洗浄した
後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ(10に/
11)を100パ/穴加え、室温で1時間放置した後、
PBSでよく洗浄した。
Flow l、aboraLories)社製〕に、参
考例1.により製造したA1.、C−864(I OJ
1g/ml) 1004/穴を第一抗体として加え、4
℃で1晩放置後、PI35′T!沈浄し、1%T3 S
Δ−I’BS 200#/穴加え4℃で1晩放置し、
PBSでよく洗浄したプレートに、健常人血清(144
検体)および肺癌患者血清(92検体)、胃癌患者血清
(33検体)、乳IFiS忠者血清(27検体)、人I
l!癌II者血清(25検体)、膵癌患者血清(IO検
体)、胆嚢・胆管癌患者血清(5検体)、純良性疾患患
者血清(+6検体)、胃潰瘍患者血清(l−0検体)、
肝硬変患者血l#(3検体)、膵炎患者血l?j(3検
体)の10倍希釈液を504/穴加え、4℃で1晩放置
後、P B Sでよく洗浄した。ビオチン化SLC−4
54(10q/ml) l 00 雇/穴を第二抗体
として加え、4℃で1晩放置し、PBSでよく洗浄した
後、アビジン−ビオチン−ペルオキシダーゼ(10に/
11)を100パ/穴加え、室温で1時間放置した後、
PBSでよく洗浄した。
次にABTS基質液100d/穴を加え、室温で30分
間反応させ、5%SDS溶液1oad/穴を加え反応を
停止した。各式の発色を吸光度計(OD、、S )で測
定した。その結果を第1図に示した。
間反応させ、5%SDS溶液1oad/穴を加え反応を
停止した。各式の発色を吸光度計(OD、、S )で測
定した。その結果を第1図に示した。
第1図に示したごとく、本血清診断法において、肺腺癌
での陽性率は高く、また抗原量の多いものが多かった。
での陽性率は高く、また抗原量の多いものが多かった。
肺扁平上皮癌、肺大細胞癌、胃癌、大腸癌、膵癌、胆嚢
・胆管癌でも陽性例は散見されたが、抗原量は比較的低
値であった。健常人および肺、胃、肝、膵などの良性疾
患では全く陽性例は認められなかった。
・胆管癌でも陽性例は散見されたが、抗原量は比較的低
値であった。健常人および肺、胃、肝、膵などの良性疾
患では全く陽性例は認められなかった。
以上の結果は、本発明の血清診断法が、肺癌、特にル1
1腺癌の臨床検査上有効な手段を提供することを示して
いる。
1腺癌の臨床検査上有効な手段を提供することを示して
いる。
参考例■、 抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体^LC−
−864の調製 (1) 免疫原の調製 免疫原としての肺腺癌患者磨水の高分子分画の調製は、
以下の通り行った。
−864の調製 (1) 免疫原の調製 免疫原としての肺腺癌患者磨水の高分子分画の調製は、
以下の通り行った。
一80℃に保存しておいた肺腺癌患者磨水を融解後、3
.00Orpm、 I O分間遠心分離し、固形分を
除いた上清8mlを0.5M NaCj!を含む10
mM!Jン酸緩衝液(1117,2)で平衡化したベツ
ドボリューム750m1のセルロファインGCL−20
00SF C生化学工業社製)カラムに通塔し、分子f
fi 1,000,000以上の高分子画分(ボイドフ
ラクション;フラクション番号41〜50)を集め、こ
れを肺腺癌患者磨水の高分子分画とした。セルロファイ
ンGCL−2000SFの溶出パターンを第2図に示し
た。
.00Orpm、 I O分間遠心分離し、固形分を
除いた上清8mlを0.5M NaCj!を含む10
mM!Jン酸緩衝液(1117,2)で平衡化したベツ
ドボリューム750m1のセルロファインGCL−20
00SF C生化学工業社製)カラムに通塔し、分子f
fi 1,000,000以上の高分子画分(ボイドフ
ラクション;フラクション番号41〜50)を集め、こ
れを肺腺癌患者磨水の高分子分画とした。セルロファイ
ンGCL−2000SFの溶出パターンを第2図に示し
た。
(2)抗体産生細胞の調製
ヒト正常肺組m膜成分(100■蛋白質/匹)を、生後
24時間以内の新生仔BALB/cマウスに静脈内投与
した。8週間経過後のマウスに肺腺癌患者磨水の高分子
分画100μg(蛋白質換算)7匹を水酸化アルミニウ
ムゲル2mg/匹、百日咳菌死菌ワクチンlXl0’/
匹とともに腹腔内投与した。以後1〜2週おきに、同一
抗原100μg(蛋白質換算)7匹で3〜5回免疫した
。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血i11が
、ヒト肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、牌細n包を調製して、細胞融合に供した。
24時間以内の新生仔BALB/cマウスに静脈内投与
した。8週間経過後のマウスに肺腺癌患者磨水の高分子
分画100μg(蛋白質換算)7匹を水酸化アルミニウ
ムゲル2mg/匹、百日咳菌死菌ワクチンlXl0’/
匹とともに腹腔内投与した。以後1〜2週おきに、同一
抗原100μg(蛋白質換算)7匹で3〜5回免疫した
。これら免疫処理したマウスのうち、その抗血i11が
、ヒト肺腺癌細胞または組織あるいはそれらの膜断片と
強く反応したマウスを免疫マウスとして、そのマウスよ
り、牌細n包を調製して、細胞融合に供した。
(3) マウス骨髄腫細胞の調製
8−アザグアニン耐性マウス骨髄腫細胞株P3−Ulを
正常培地でj8養し、細胞融合時に2xio’以上の細
胞を()、細胞融合に親株として供した。
正常培地でj8養し、細胞融合時に2xio’以上の細
胞を()、細胞融合に親株として供した。
(4) ハイブリドーマの作製
(2)と(3)で得られた牌細胞と骨髄腫細胞とを5:
lの割合で用い、前述した方法で融合させ、HへT培地
で37℃、14日間CO□5%下で培養した。融合細胞
を選択し、HT培地に変えてさらに培養した後、抗ヒト
肺lIl癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選
び、さらに正常培地に変え、2回クローニングを繰り返
して、酵素免疫測定法、免疫組織学的判定法(へBC法
)により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌に全く反
応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイプリドーマ株ALC−864を選択
した。
lの割合で用い、前述した方法で融合させ、HへT培地
で37℃、14日間CO□5%下で培養した。融合細胞
を選択し、HT培地に変えてさらに培養した後、抗ヒト
肺lIl癌に対する抗体価の測定をして、活性な穴を選
び、さらに正常培地に変え、2回クローニングを繰り返
して、酵素免疫測定法、免疫組織学的判定法(へBC法
)により、ヒト正常細胞や組織あるいは他の癌に全く反
応せず、ヒト肺腺癌に特異的に反応するモノクローナル
抗体を産生ずるハイプリドーマ株ALC−864を選択
した。
(5)単クローン性抗体の精製
ブリスタン処理した8週令Bへ1、B/c雌マウマウス
イ)で得られたハイプリドーマ株ALC−864を4×
10“細胞7匹を腹腔的注射した。
イ)で得られたハイプリドーマ株ALC−864を4×
10“細胞7匹を腹腔的注射した。
10〜21日後に、ハイブリドーマは腹水癌化した。腹
水のたまったマウスから、腹水を採取(5〜l0m1/
匹ンし、遠心分RI! (3,000rpm。
水のたまったマウスから、腹水を採取(5〜l0m1/
匹ンし、遠心分RI! (3,000rpm。
5分)して固形分を除去した。50%硫酸アンモニウム
にて塩析し、0.04 Mリン酸tjt衝液(p H8
,0,0,03M NaC1を含む)で透析後、DE
52 (Whatg+an社製) (ベットポリ5−
L501)0)力51−ニ流M20〜301/時で通塔
し、IgG画分を集め、精製モノクローナル抗体式LC
−864とした。このようにして(辱られた八LC−8
64は、オクタロニイ法により[gG、lに属すること
が判明した。
にて塩析し、0.04 Mリン酸tjt衝液(p H8
,0,0,03M NaC1を含む)で透析後、DE
52 (Whatg+an社製) (ベットポリ5−
L501)0)力51−ニ流M20〜301/時で通塔
し、IgG画分を集め、精製モノクローナル抗体式LC
−864とした。このようにして(辱られた八LC−8
64は、オクタロニイ法により[gG、lに属すること
が判明した。
(G) ALC−864の特異性
抗ヒト肺腺癌型クローン性抗体AL(、−864の反応
特異性を第1表に示した。
特異性を第1表に示した。
第 1 表
子宮癌培養細胞株2株と反応
発明の効果
本発明によればヒトIjli 11!i11F6に特異
的なll11清診断を簡便にかつ効率よく行うことがで
きる。
的なll11清診断を簡便にかつ効率よく行うことがで
きる。
第1図は、実施例1の血清診断の結果を示す。
第2図は、参考49セルロフアインG CL −200
0SFの溶出パターンを示す。 第 図 特許出願人(1(12)協和醗酵工業株式会社第 図 手続補正S(方式) 事件の表示 昭和63年特許願第163434号 発明の名称 肺腺癌抗原の定量法 補正をする者 事件との関係 特許出廓人 郵便番号 100 住 所 東京都千代田区大手町−丁口6番1号名 称
(102)協和醗酵工業株式会社(社) す0 60 ワo g
。 フラ7為7香号(9敞/11鉋p 第1図を十分に濃厚な黒色で鮮明に記載する。
0SFの溶出パターンを示す。 第 図 特許出願人(1(12)協和醗酵工業株式会社第 図 手続補正S(方式) 事件の表示 昭和63年特許願第163434号 発明の名称 肺腺癌抗原の定量法 補正をする者 事件との関係 特許出廓人 郵便番号 100 住 所 東京都千代田区大手町−丁口6番1号名 称
(102)協和醗酵工業株式会社(社) す0 60 ワo g
。 フラ7為7香号(9敞/11鉋p 第1図を十分に濃厚な黒色で鮮明に記載する。
Claims (1)
- 抗ヒト肺腺癌モノクローナル抗体ALC−864を第一
抗体とし、これを固相化し、これにヒト血清検体を反応
させて肺腺癌抗体を結合させ、ついで酵素あるいは放射
線化合物で標識した抗ヒト肺扁平上皮癌モノクローナル
抗体SLC−454を第二抗体として前記第一抗体に結
合した肺腺抗原に結合させ、結合した第二抗体の量を標
識した酵素の活性測定あるいは放射線量を測定すること
により血清検体中の肺腺癌抗原量を定量することを特徴
とする肺腺癌抗原の定量法。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63163434A JPH0212063A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 肺腺癌抗原の定量法 |
US07/371,808 US5081032A (en) | 1988-06-30 | 1989-06-27 | Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |
CA000604273A CA1337049C (en) | 1988-06-30 | 1989-06-28 | Anti-human pulmonary adenocarcinoma monoclonal antibody |
EP89111857A EP0348973B1 (en) | 1988-06-30 | 1989-06-29 | Anti-human pulmonary adenocarcinome monoclonal antibody |
DE68913601T DE68913601T2 (de) | 1988-06-30 | 1989-06-29 | Monoklonaler Antikörper gegen menschliches Lungenadenokarzinom. |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63163434A JPH0212063A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 肺腺癌抗原の定量法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0212063A true JPH0212063A (ja) | 1990-01-17 |
Family
ID=15773819
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63163434A Pending JPH0212063A (ja) | 1988-06-30 | 1988-06-30 | 肺腺癌抗原の定量法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH0212063A (ja) |
-
1988
- 1988-06-30 JP JP63163434A patent/JPH0212063A/ja active Pending
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