JP2573767B2

JP2573767B2 - 分泌大腸菌突然変異体からのヒトインターロイキン―４の精製

Info

Publication number: JP2573767B2
Application number: JP3503528A
Authority: JP
Inventors: タン，ジョン・チュータイ; ナーベー，デービッド; ナガビュシャン，ティー・エル
Original assignee: Schering Plough Corp
Current assignee: Schering Plough Corp
Priority date: 1990-05-31
Filing date: 1991-01-04
Publication date: 1997-01-22
Anticipated expiration: 2012-01-22
Also published as: MY130013A; DE69118696D1; US5077388A; CA2084186C; EP0537148B1; DE69118696T2; DK0537148T3; CA2084186A1; AU7222091A; GR3019705T3; IE910027A1; AU659993B2; JPH05505934A; WO1991018919A1; IE73668B1; IL96880A0; NZ236699A; ZA9193B; ES2085986T3; EP0537148A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の分野本発明は、細菌からタンパク質を抽出し且つ精製する
方法、更に詳しくは、大腸菌（Escherichia Coli）（E.
Coli）において発現された可溶性活性ヒトインターロイ
キン−４を抽出し且つ精製する方法に関する。

背景ヒトインターロイキン−４（IL-4）は、感染、癌およ
び自己免疫疾患に対して治療の可能性を有すると考えら
れる天然のタンパク質であり、ヨコタ（Yokota）ら、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA,83,5894〜5898（1986）によっ
て特徴化された。マウスIL-4は、リー（Lee）ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.,USA,83,2061〜2065（1986）およびノー
マ（Noma）ら、Nature,319,640〜646（1986）に報告さ
れている。

遺伝子工学処理されたIL-4の製造において、形質転換
された宿主細胞またはそれらの培養物上澄みからの発現
されたタンパク質の分離は主要な問題であることがあ
る、ドワイアー（Dwyer）、Biotechnology,2,957（198
4）。

大腸菌におけるIL-4の大腸菌発現は、細胞内不溶性凝
集体（本体を含む）または周辺腔若しくは培地（発酵ブ
イヨン）中に分泌された活性可溶性物質であることがで
きる。本発明は、大腸菌のある種の菌株における発現か
ら得られた活性可溶性IL-4を抽出し且つ精製することに
関する。

活性IL-4の臨床的使用は、IL-4発現細胞の細胞成分ま
たは細胞破片が混入していない高純度の物質を必要とす
る。したがって、IL-4発現性大腸菌の発酵ブイヨン中の
活性IL-4を高収率および高純度で精製することは不可欠
である。

発明の要約本発明は、高純度の活性IL-4を、IL-4発現性大腸菌の
発酵ブイヨンから下記の三工程処理で得ることができる
という知見に基づく。

1.粗製発酵ブイヨンに、金属キレート−アガロースゲル
カラム、例えば、ファーマシア・ファイン・ケミカルズ
（Pharmacia Fine Chemicals）、ピスカタウェイ、ニュ
ージャージ州からキレート−セファロース・ファスト・
フロー（Sepharose Fast Flow）およびキレート−セ
ファロース（Sepharose）6Bの名称で入手可能なキレ
ート−セファロースゲル上でアフィニティークロマトグ
ラフィーを施す。キレートセファロース・ファスト・フ
ローは、セファロース６ファスト・フローに対して安定
なエーテル結合によって結合したスペーサー上のイミノ
二酢酸基から成る。セファロース６ファスト・フローは
６％の架橋アガロースである。緩衝液、好ましくは、リ
ン酸緩衝液を用いる。用いられたリン酸緩衝液は、高塩
化ナトリウム濃度、すなわち、約0.5〜1.5M、好ましく
は、1.0Mの、中性〜僅かにアルカリ性pH、すなわち、約
pH6.7〜８、好ましくは、約7.2のものである。高塩濃度
および中性付近の約7.2のpHは、カラムに対する活性イ
ンターロイキン−４の結合を最大にし且つ他のタンパク
質の結合を最小にするのに役立つ。好ましい金属キレー
トは亜鉛であるが、他の金属キレート、例えば、銅、コ
バルトまたはニッケルを用いることもできる。結合が完
了した後に、カラムを、最初に、20mMリン酸ナトリウ
ム、pH7.2および1.0M塩化ナトリウムを含む平衡緩衝液
で２回洗浄する。次に、それを約10％グリセロールおよ
び低濃度の塩化ナトリウム、すなわち、約150mMを20mM
リン酸ナトリウム緩衝液中に含むリン酸緩衝液で洗浄す
る。第二の洗浄で、不純物を分離するのが難しい極めて
類似のものを含む不純物を除去する。最後に、活性IL-4
を、0.50M塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液を用いてpH
5.0で溶離する。

2.工程１からの活性IL-4の溶液に、Ｓ−セファロース・
ファスト・フローカラム上において大部分の不純物が結
合しない中性付近の約6.75のpHおよび15mS（導電率）で
陽イオン交換クロマトグラフィーを施した。次に、緩衝
液中で更に精製したIL-4をカラムから溶離し；そして 3.活性IL-4溶液に、pH4.5で最大20mg/mlまで濃縮後に、
pH4.5の10mMクエン酸ナトリウムで平衡にしたサイズ排
除カラム上のゲル濾過クロマトグラフィーを施す。次
に、95％〜99％純度の精製活性IL-4溶液を集める。

詳細な説明本発明の方法は、活性組換え体ヒトインターロイキン
４の粗製溶液に、アフィニティークロマトグラフィー、
陽イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロ
マトグラフィーを施して、高純度の活性IL-4を得ること
を可能にする。中性付近、好ましくはpH7.2および高濃
度の塩化ナトリウム、好ましくは、1M塩化ナトリウムで
緩衝液を用いることにより、活性IL-4分子を、アフィニ
ティークロマトグラフィーによって金属キレート−アガ
ロースゲルカラム、好ましくは、キレートセファロース
・ファスト・フローまたはセファロース6Bに対して選択
的に結合して、溶液中に存在する混入しているタンパク
質を実質的に排除する。

活性IL-4の粗製溶液源は本発明の方法に対して臨界的
ではない。好ましい源は、その中に溶解したまたは分泌
された活性ヒトIL-4を含む発酵ブイヨンである。好まし
くは、活性ヒトIL-4を、大腸菌のある種の菌株によって
ブイヨン中に発現させる。

したがって、本発明は、活性組換え体ヒトIL-4の粗製
溶液を精製する方法であって、（ａ）中性〜僅かにアルカリ性pHで且つ約0.5〜1.5モル
塩化ナトリウムを含む該IL-4の緩衝粗製溶液に、金属キ
レート−アガロースゲル上のアフィニティークロマトグ
ラフィーを施してIL-4を選択的に結合させ；（ｂ）カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2の20mMリン酸平衡緩衝液で、次に、10容量％グリセ
ロールおよび約150mM塩化ナトリウムを含む緩衝液で洗
浄し；（ｃ）結合したIL-4を、酸性pHの溶離用緩衝液またはキ
レート化剤、ヒスチジン類似物若しくはアミノ酸を含む
中性pH緩衝液で溶離し；（ｄ）工程（ｃ）からの活性IL-4溶離液を、陽イオン交
換クロマトグラフィーカラム、例えば、Ｓ−セファロー
ス（ファーマシア・ファイン・ケミカルズから入手可
能）を用いて中性付近〜僅かに酸性pHで且つ導電率15mS
で処理し、Ｓ−セファロースは、それに結合したイオン
交換基−CH₂−、SO₃−、Na⁺を有する架橋アガロースマ
トリックスであり；（ｅ）工程（ｄ）からの溶離液を、限外濾過膜（10,000
分子量カットオフ）を用いて濃縮し；（ｆ）濃縮された保持物質を、サイズ排除カラム上のゲ
ル濾過クロマトグラフィーによって処理し；そして（ｇ）精製活性IL-4を集めることを含む前記の方法である。

最も好ましい実施態様において、本発明の方法は下
記、すなわち、（ａ）活性組換え体ヒトIL-4の粗製溶液を、金属キレー
ト−アガロースゲル、好ましくは、キレートセファロー
ス・ファスト・フローのアフィニティークロマトグラフ
ィーカラムに対して1.0M塩化ナトリウムを含む中性〜僅
かにアルカリ性pHリン酸緩衝液中において充填し；（ｂ）カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含むpH
7.2〜7.5のリン酸緩衝液で、次に、グリセロール10容量
％および約150mM塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝液で
２回洗浄し；（ｃ）活性IL-4をカラムから、0.5M塩化ナトリウムを含
むpH5.0の溶離用酢酸緩衝液を用いて無勾配に溶離し；（ｄ）工程（ｃ）からのpH6.75で導電率15mSの緩衝液中
の活性IL-4溶離液に、20mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH
6.75および0.12M塩化ナトリウムで平衡にしたＳ−セフ
ァロースなどのカラム上の陽イオン交換クロマトグラフ
ィーを施し；そして0.12〜0.6M-NaClを有するpH6.75の
リン酸緩衝液で勾配溶離し；（ｅ）工程（ｄ）からの溶離液を、限外濾過膜を用いて
濃縮し；（ｆ）濃縮された溶離液を、pH4.5の10mMクエン酸ナト
リウム緩衝液で平衡にしたサイズ排除カラム上のゲル濾
過クロマトグラフィーによって処理し；そして（ｇ）精製活性IL-4溶液を集めるという工程を含む前記の方法である。

工程（ａ）において、金属キレートアガロースカラム
に充填された粗製溶液はいずれの源からであることもで
きるが、しかしながら、本発明の実施においては、予め
処理されて、発酵工程から生じた細胞破片および他の大
型粒子が除去された発酵ブイヨンを利用するのが好適で
ある。更に詳しくは、本発明の方法は、活性ヒトIL-4を
生産し且つその活性ヒトIL-4を培地（発酵ブイヨン）中
に分泌するように遺伝子工学処理されている大腸菌菌株
によって生産される活性ヒトIL-4の精製に適用しうる。
本明細書中で用いられる「活性ヒトIL-4」という用語
は、生物学的に活性の自然のコンホメーションで存在し
ている非変性組換え体ヒトIL-4を意味する。

このような遺伝子工学処理は、通常、細菌中への発現
ベクターの導入を伴う。発現ベクターは、細菌ゲノムの
遺伝子に関して自律複製およびタンパク質発現が可能で
ある。細菌ベクターの構築は、当該技術分野において、
望ましいタンパク質をコードするヌクレオチド配列が知
られているかさもなければ入手可能であるという条件に
おいて周知である。

好ましくは、IL-4は、1989年10月31日出願の出願人譲
受人の米国特許出願第07/429,588号明細書に記載の分泌
大腸菌菌株によって生産され、その出願を完全に本明細
書中に参考文献として後述する。特に関連するのは、25
〜33頁の実施例、34〜36頁のデータ、36頁の培養付着物
の詳説および図面である。

本発明によって精製された活性IL-4を製造するのに用
いられた好ましい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11お
よびRL7321/pRGT857-11である。

工程（ａ）で用いられた好ましい金属キレート−アガ
ロースはキレートセファロース・ファスト・フローであ
るが、キレートセファロース6Bでも十分である。セファ
ロースはファーマシア・ファイン・ケミカルズ、ピスカ
タウェイ、ニュージャージー州の製品である。本発明で
用いるのに好ましい亜鉛キレートセファロースカラムを
製造する好ましい方法は、セファロースゲルをクロマト
グラフィーカラムに注入し、脱イオン水で洗浄した後、
塩、好ましくは酢酸亜鉛溶液および脱イオン水をカラム
を介してポンプ輸送し、次に、平衡緩衝液、すなわち、
20mMリン酸ナトリウム、pH7.2、1.0MのNaCl溶液をカラ
ムを介してポンプ輸送することによる。酢酸亜鉛の代わ
りに他の亜鉛塩、例えば、塩化亜鉛または硫酸亜鉛を用
いてもよい。

クロマトグラフィーカラムは連通した２本のカラムで
ある。第一のすなわち上部カラムは亜鉛キレート−セフ
ァロースゲルを含み、第二のすなわち下部カラムは、亜
鉛塩または他の金属塩で処理されたなかったキレートセ
ファロースゲルを含む。２本のカラムの容量比は、亜鉛
処理したキレートセファロース約３容量対未処理キレー
トセファロース１容量である。

カラムを平衡にするのに用いられる好ましい緩衝液は
1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2〜7.5のリン酸緩衝液で
ある。

工程（ｂ）において、最初に、平衡緩衝液として1.0M
塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液を用い、次
に、10％グリセロールおよび低濃度の塩化ナトリウム
（150mM）を含むpH7.2〜7.5のリン酸ナトリウム緩衝液
を用いる特別の二部洗浄液をカラムに充填する。洗浄に
よって、極めて類似であり且つ分離するのが難しいもの
を含む不純物を除去する。

活性IL-4の溶液のpHを保持するのに好ましい緩衝液
は、1.0M塩化ナトリウムを含むpH7.2のリン酸緩衝液で
ある。緩衝された粗製活性IL-4溶液をカラムに通過させ
た時に、IL-4はゲルに対して選択的に吸着する。

工程（ｃ）において、亜鉛キレート−セファロースお
よび未処理キレートセファロースゲルを、1.0M塩化ナト
リウムを含むpH6.75のリン酸緩衝液で平衡にした後、吸
着した活性IL-4を、亜鉛キレート−セファロースから未
処理キレート−セファロースを介して、0.5N塩化ナトリ
ウムを含むpH5.0の酢酸緩衝液を用いて或いは50mMのEDT
A（エチチレンジアミン四酢酸）などのキレート化剤若
しくは50mMイミダゾールなどのヒスチジン類似体または
50mMヒスチジンなどのアミノ酸を含む中性pHの緩衝液を
用いて無勾配に溶離する。活性IL-4を含む溶離液を集め
る。慣用的なSDS-PAGEおよびタンパク質検定法に基づい
て最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプールする。

工程（ｄ）において、工程（ｃ）からプールした画分
のpHをpH6.75まで調整し且つpH6.75の20mM緩衝液で稀釈
して、導電率が15mSになるようにする。クロマトグラフ
ィーカラム中の陽イオン交換ゲル材料を、0.12M塩化ナ
トリウムを含むpH6.75の20mMリン酸緩衝液で平衡にす
る。好ましい陽イオン交換は、基−CH₂−、SO₃ ^-、Na⁺で
置換した架橋アガロース、例えば、ファーマシアから入
手可能なＳ−セファロース・ファスト・フローである。
活性IL-4を、0.12〜0.6M-NaClを含むpH6.75の20mMリン
酸緩衝液で勾配溶離する。SDS-PAGEおよびタンパク質検
定法に基づいて最も高い濃度の活性IL-4を含む画分をプ
ールする。陽イオン交換クロマトグラフィーの条件を選
択して、活性IL-4画分が陽イオン交換器マトリックスに
結合することを確実にする。陽イオン交換クロマトグラ
フィー用には比較的高い中性付近のpH6.75およびイオン
交換クロマトグラフィー用には比較的高い15mSの導電率
によって、大部分の不純物がカラムに結合しない穏やか
な結合条件が得られ、溶離は比較的容易であり、そして
高純度の、すなわち、約90％〜95％の活性IL-4溶液が得
られる。

工程（ｅ）において、工程（ｄ）でプールした溶離画
分を、分子量が10,000より大きい材料全部を保持する膜
を備えた撹拌されたセルの上で濃縮する。これは活性IL
-4を含む。この処理状態での活性IL-4溶液は約90〜95％
純度であるので、膜の上部に残った濃縮溶液中にあるの
は活性IL-を除いては極めて少量である。好ましい膜
は、アミコン・カンパニー（Amicon Co.）,U.S.A.によ
って製造されたYM-10である。得られた濃縮度は活性IL-
4が最大約20mg/mlまでである。

工程（ｆ）において、工程（ｅ）からプールされた活
性IL-4の濃縮溶離液を、分子量によって溶液中のタンパ
ク質を分別するサイズ排除ゲル濾過カラムに充填する。
適当である典型的なカラムは、セファクリル（Sephacry
l）S-200HRまたはS-100HR（ファーマシア）ゲル濾過
カラムである。セファクリルS-200HR（高分離度）およ
びS-100HRは、アリルデキストランおよびN,N′−メチレ
ンビスアクリルアミドの架橋コポリマーである。ダルト
ンでのそれらの分別範囲は、それぞれ5,000〜250,000お
よび1,000〜100,000である。他の適当な材料は、架橋デ
キストランゲルであるセファデックシズ（Sephadexe
s）（ファーマシア）である。好ましくは、活性IL-4
の溶液を、pH4.5の10mMクエン酸緩衝液で予め平衡にし
たS-200HRカラムに充填する。工程（ｇ）の条件下にお
いて、安定なIL-4濃縮物は最大20mg/mlまで達すること
ができる。これによって、ゲル濾過クロマトグラフィー
の容量および性能が増大する。

SDS-PAGEおよびタンパク質検定法によって決定される
最も高い濃度の活性IL-4を含む溶離液の画分を集め且つ
プールして、95〜99％純度の活性IL-4溶液を得る。

可溶化された生物学的に活性の不純な組換え体ヒトイ
ンターロイキン−４はいずれも本発明の方法によって精
製することができるが、最も実際的には、本発明の方法
は、活性IL-4を培地中に分泌する細菌である大腸菌によ
って発現された組換え体ヒト活性IL-4に適用しうる。

その好ましい実施態様において、本発明の方法は、活
性ヒトIL-4を生産し且つそれを発酵ブイヨンの溶液中に
***するように遺伝子工学処理された大腸菌によって生
産された活性ヒトIL-4の抽出および精製用に提供され
る。

上記に示したように、本発明の好ましい実施態様によ
って精製された活性IL-4を製造するのに用いられた好ま
しい大腸菌菌株は、RL2117/pRGT857-11およびRL7321/pR
GT855-11である。

培地からの活性IL-4の回収は、培地を遠心分離して細
胞破片および他の比較的大型の粒子を除去することによ
って行うのが好ましい。次に、得られた溶液に、分子量
が10,000より大きいタンパク質を保持するYM-10膜また
はペリコン（Pellicon）フィルターPTGCカセット（ミリ
ポア・コーポレーション（Millipore Corp.），ベッド
フォード、マサチューセッツ州）などのフィルター上で
の限外濾過を施す。活性IL-4の濃縮粗製溶液である保持
物質を、1.0M-NaClを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液を用
いてダイアフィルトレーションを行う。

次に、このように処理されたIL-4の粗製溶液を前記に
記載したように精製する。

本発明によって精製することができる粗製ブイヨンを
得るための変法は、培地を遠心分離して細胞破片および
他の比較的大型の粒子を除去し、リン酸でpH4.0に調整
した0.50Mトリクロロ酢酸ナトリウムを用いてタンパク
質の沈殿を生成させた後、そのタンパク質を、0.1M-NaC
lを含むpH7.2の20mMリン酸緩衝液で可溶化して、活性IL
-4の濃縮溶液を得ることである。次に、粗製溶液を前記
に記載したように精製する。

本発明の方法で用いられた緩衝液は、それらが、活性
IL-4をクロマトグラフィーゲルに吸着させるかまたは選
択的にそれらを介して溶離させるのに適切な結合、洗浄
および溶離の条件を提供するという理由で選択される。
好ましい緩衝液は、20mM濃度のリン酸ナトリウム緩衝液
または実施例に示されたような濃度およびpH、更には、
指示された塩化ナトリウムの具体的な量でのクエン酸ナ
トリウム若しくは酢酸ナトリウム緩衝液である。pHを水
酸化ナトリウムまたは酸で調整する。工程（ｂ）の二部
洗浄において、第一の洗浄は1.0N塩化ナトリウムを含む
pH7.2の20mMリン酸ナトリウム平衡緩衝液を用い、そし
て第二の洗浄は、第二の洗浄緩衝液に必要とされる約15
mM塩化ナトリウムおよび10％グリセロールを含むリン酸
緩衝液を用いる。

亜鉛キレート−セファロースカラムと一緒に用いられ
た緩衝液中の塩化ナトリウム濃度は、高塩、好ましく
は、1M塩化ナトリウムがトリクロロ酢酸（TCA）ペレッ
トからの可溶化活性IL-4の回収を改良し、更には、金属
キレートセファロースに対する活性IL-4の結合を強化す
るので、本発明に対して臨界的である。濃度は、IL-4
が、亜鉛キレートセファロースカラムに対して発酵ブイ
ヨン中の不純物よりも選択的に吸着することを可能にす
る。

下記の実施例で、本発明の好ましい実施態様を例証す
る。

実施例１亜鉛キレート−セファロース・ファスト・フローの製造キレートセファロース・ファスト・フローゲルを脱イ
オン水中のスラリーにする。３リットルのカラムを製造
するために、そのスラリーを高さ500mmで直径180mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入する。カラム中の液体
を、カラムの底部を介して流動させるかまたはポンプ輸
送させる。

カラム上に上部フローアダプターを置き、脱イオン水
を用いてゲルを充填／洗浄する。水をカラムを介して約
1cm/分の線速度でポンプ輸送する。上部フローアダプタ
ーを調整して樹脂床の上部にしっかりと加圧する。少く
とも５床容量の脱イオン水をカラムを介して約1cm/分の
線速度でポンプ輸送する。

約５床容量の0.025M酢酸亜鉛溶液を、カラムを介して
約1cm/分の線速度でポンプ輸送する。約10床容量の脱イ
オン水を、カラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸
送する。

リン酸緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度でポ
ンプ輸送することを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで
続ける。

実施例２キレートセファロース・ファスト・フロー（金属塩で未
処理）の製造キレートセファロース・ファスト・フローゲルを、1.
0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸ナトリウムから成る
緩衝液中のスラリーにする。１リットルのカラムを製造
するために、そのゲルを直径140mmおよび高さ500mmのク
ロマトグラフィーカラムに注入し且つカラム底部から溶
離する。ゲルを、1.0MのNaClを含むpH7.2の20mMリン酸
ナトリウムから成る約５床容量の緩衝液で平衡にする。
緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度でポンプ輸送
する。緩衝液をカラムを介して同一流量でポンプ輸送す
ることを、流出液のpHが7.1〜7.3になるまで続ける。

実施例３連続カラムの製造亜鉛キレートセファロース・ファスト・フローおよび
未処理キレートセファロースのカラムを実施例１および
２にしたがって製造した後、カラムを連続して連通させ
て、流れが最初に亜鉛キレートカラム中に入り、次に、
非亜鉛（未処理）キレートカラム中に入るようにする。
バブルトラップをカラム間に挿入してはならない。

実施例４Ｓ−セファロースカラムの製造Ｓ−セファロースゲル陽イオン交換樹脂を、20mMリン
酸ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaClおよび0.001Mエチレ
ンジアミン四酢酸（EDTA）から成る緩衝液中のスラリー
にする。ゲルを直径100mmで高さ45cmのクロマトグラフ
ィーカラムに注入し且つ液体をカラム底部を介して流動
させまたはポンプ輸送させる。

カラム上に上部フローアダプターを置き、20mMリン酸
ナトリウム、pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成
る５床容量の緩衝液を用いてその緩衝液をカラムを介し
て約1cm/分の線速度でポンプ輸送することによって平衡
にする。上部フローアダプターを調整して樹脂床の上部
にしっかりと加圧する。次に、20mMリン酸ナトリウム、
pH6.75、0.12M-NaCl、0.001M-EDTAから成る少なくとも
約５床容量の緩衝液をカラムを介して約1cm/分の線速度
でポンプ輸送し、必要ならば、緩衝液をカラムを介して
同一流量でポンプ輸送することを、流出液のpHが6.6〜
6.9になるまで続ける。

実施例５セファクリルS-200HRカラムの製造 10mMクエン酸ナトリウム、pH4.5から成る少なくとも
１床容量の緩衝液を、直径50mmで高さ100cmのクロマト
グラフィーカラム中のS200HRゲルを介して約0.2cm/分の
線速度でポンプ輸送してカラムを平衡にする。

実施例６緩衝液の製造（ａ）0.02Mリン酸ナトリウム、pH7.2、1.0M塩化ナトリ
ウム脱イオン水中において、リン酸ナトリウム−塩基−水
和物2.78g/L、塩化ナトリウム58.44g/LおよびpHを7.2
（±0.1）まで調整するのに十分な量の6.3N水酸化ナト
リウムを一緒に混合する。バッチは、金属キレートセフ
ァロースカラム中のゲル１リットル当り少くとも30リッ
トルを与えるように十分に大きくなければならない。

（ｂ）0.02Mリン酸ナトリウム、pH7.2、0.15M塩化ナト
リウム、10％グリセロール脱イオン水中において、リン酸ナトリウム一塩基一水
和物2.78g/Lおよび塩化ナトリウム8.7g/Lを一緒に混合
する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.2（±0.1）
まで調整する。0.1L/Lにするのに十分なグリセロールを
加える。緩衝液が用いられるゲル１リットル当り少くと
も６リットルを与える十分な量の緩衝液を製造する。

（ｃ）0.02M酢酸ナトリウム、pH5.0、0.5M塩化ナトリウ
ム脱イオン水中において、99.7％酢酸1.15ml/Lおよび塩
化ナトリウム29.2g/Lを一緒に混合する。6.3N水酸化ナ
トリウムを用いてpHを5.0（±0.1）まで調整する。緩衝
液が用いられるゲル１リットル当り少なくとも10リット
ルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。

（ｄ）0.03Mリン酸ナトリウム、pH7.0、0.003M-EDTA 脱イオン水中において、リン酸ナトリウム一塩基一水
和物4.17g/Lおよび四ナトリウムEDTA1.14g/Lを一緒に混
合する。6.3N水酸化ナトリウムを用いてpHを7.0（±0.
1）まで調整する。ゲル１リットル当り少なくとも２リ
ットルを与えるのに十分な量の緩衝液を製造する。

（ｅ）10mMクエン酸ナトリウム、pH4.5 クエン酸一水和物210グラム（2.1g/L）を脱イオン水1
00Lと一緒に、クエン酸一水和物が溶解するまで混合す
る。必要ならば、4N塩酸および6.3N水酸化ナトリウムを
用いて緩衝液のpHを4.5まで調整する。この緩衝液を、
ダイアフィルトレーションおよび限外濾過並びにゲル濾
過クロマトグラフィーに用いる。

実施例７活性組換え体ヒトインターロイキン−４の精製（亜鉛キレートセファロースクロマトグラフィー）活性ヒト組換え体IL-4が溶解している発酵ブイヨン70
リットルを20リットルまで濃縮した後、その溶液に、実
施例６（ａ）の緩衝液に対する25倍ダイアフィルトレー
ションを施す。4N-HClおよび／または6.3N塩化ナトリウ
ムを用いて溶液のpHを7.2（±0.1）まで調整する。溶液
の導電率を70〜90mSに調整する。

溶液を濾過によって透明にし且つ濃縮する。フィルタ
ーを実施例６（ａ）の緩衝液で洗浄して溶液の容量を20
リットルに戻す。

溶液を亜鉛キレートセファロース・ファスト・フロー
および未処理セファロース・ファスト・フローのカラム
を介して約0.5cm/分の線速度でポンプ輸送する。フロー
スルーを１個の画分に集める。

カラムを２回洗浄しなければならないが、最初に、約
10床容量の実施例６（ａ）で製造した緩衝液を約0.5cm/
分の線速度で用い、洗浄液を５個以下の画分に集め、次
に、約５床容量の実施例６（ｂ）で製造した緩衝液を約
0.5cm/分の線速度で用い、そして洗浄液を１個の画分に
集める。

活性IL-4をカラムから、約８床容量の実施例６（ｃ）
で製造した緩衝液を用いて約0.25cm/分の線速度で溶離
する。容量が約0.2床容量の画分を、採取用に0.5ml/ml
の稀釈剤として実施例６（ｄ）で製造した緩衝液が入っ
ている別個の容器に集める。

各試料の活性IL-4についてSDS-PAGEおよびタンパク質
検定法によって試験する。

実施例７によって処理された活性IL-4溶液の純度は約
20％〜40％である。粗製発酵ブイヨン中の量に基づく活
性IL-4の収率は90％である。

実施例８Ｓ−セファロースクロマトグラフィー用緩衝液の製造（ａ）20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.12M塩化ナトリ
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム7.03g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオ
ン水1L/Lを適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。

緩衝液のpHを6.3N水酸化ナトリウムを用いて6.75（±
0.1）まで調整する。

（ｂ）20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.55M塩化ナトリ
ウム、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、塩化ナト
リウム32.14g/L、四ナトリウムEDTA0.38g/Lおよび脱イ
オン水を適当な容器に入れ、溶解するまで撹拌する。緩
衝液のpHを6.3N水酸化ナトリウムを用いて6.75（±0.
1）まで調整する。

（ｃ）20Mリン酸ナトリウム、pH6.75、0.001M-EDTA リン酸ナトリウム一塩基一水和物2.78g/L、四ナトリ
ウムEDTA0.38g/Lおよび脱イオン水を保持するのに十分
な大きさの容器に入れる。溶解するまで撹拌し、必要な
らば、緩衝液のpHを6.3N-NaOHを用いて6.75（±0.1）ま
で調整する。

実施例９精製活性インターロイキン−４溶液の陽イオン交換カラ
ムでの勾配溶離実施例７によって製造された活性IL-4溶液のpHを、必
要ならば、4N-HClかまたは6.3N-NaOHを用いて6.75（±
0.1）に調整する。

0.45ミクロンのフィルターを介して濾過する。そのフ
ィルターを、実施例８（ｃ）で製造した緩衝液約１リッ
トルで洗浄する。

得られた溶液の導電率を、実施例８（ｃ）で製造した
緩衝液を用いて15（±0.5mS）に調整する。

溶液を、実施例４で製造のＳ−セファロースカラムを
介して約1cm/分またはそれ未満の線速度でポンプ輸送す
る。流出液を一つの画分に集める。

カラムを約５床容量の実施例８（ａ）で製造した緩衝
液を用いて約1.0cm/分またはそれ未満の線速度で洗浄す
る。

洗浄液を１個の画分に集める。カラムを、約4.5mS/床
容量の勾配および約0.2cm/分の線流量を用いて溶離す
る。

勾配で用いられた低塩緩衝液は、５床容量の実施例８
（ａ）で製造されたものであり、勾配で用いられた高塩
緩衝液は、５床容量の実施例８（ｂ）で製造されたもの
である。

５個の大きい画分を集め、それぞれの容量は約0.8床
容量である。

残りの画分（約40〜50個）を0.1床容量の容量で集め
る。

画分の活性IL-4についてSDS-PAGEおよびタンパク質検
定法によって試験する。

活性IL-4画分をプールする。亜鉛キレー用のプールさ
れた溶離液中の活性IL-4の量に基づく苛性IL-4の収率は
90％である。

活性IL-4溶液の純度は約90％〜95％である。

実施例10 限外濾過および濃縮実施例９からのプール画分を、YM10膜を備えたアミコ
ン撹拌室を用いて、活性ヒトIL-4を含む実施例９からの
プール画分を容器中に入れ且つその容量をYM-10膜上の
限外濾過によって元の容量の約0.1まで濃縮することに
よって濃縮する。濃縮された保持物質を実施例６（ｅ）
で製造した緩衝液４容量で稀釈し、そしてそれをYM-10
膜上の限外濾過によって約0.2容量まで濃縮する。

濃縮工程は、最初のプール画分の容量の約0.1になる
まで繰り返すことができる。濃縮物を適当な容器に移し
且つ冷蔵室温度で保持するかまたは−20℃で冷凍貯蔵す
る。

実施例11 ゲル濾過（サイズ排除）実施例10で製造された溶液を、実験室遠心機で２℃〜
６℃において4500rpmで30分間遠心分離することによっ
て透明にする。Å₂₈₀を測定し、そして15Å₂₈₀/mlであ
るように溶液を実施例６（ｅ）で製造した緩衝液で稀釈
する。

得られた溶液をセファクリルS-200HRカラムに約0.1cm
/分の線速度でポンプ輸送する。実施例６（ｅ）の緩衝
液をカラムを介して約0.1cm/分の流量でポンプ輸送する
ことを続ける。全容量が0.4〜0.55床容量である５個の
画分を集めた後、約0.01床容量の50個の画分を集める。

SDS-PAGEおよびタンパク質検定法によって決定される
活性IL-4を含む画分を選択する。活性IL-4画分をプール
し、そして0.2ミクロンの滅菌フィルターを介して濾過
する。95％〜99％純度の活性IL-4溶液である濾液を回収
する。発酵ブイヨン中の活性IL-4に基づく全体の収率は
70〜80％である。

回収された活性IL-4の純度は、SDS-PAGE検定法によっ
て実証される95％〜99％である。

インターロイキン−４の活性画分を決定するのに用い
られた検定法はいずれも慣用的である。溶離液から活性
画分を選択するのに必要な検定法は、280nmでの紫外線
吸収測定法である。精製IL-4に対して、1.0Å₂₈₀の光学
濃度単位（OD）は、アミノ酸組成分析による1.6mgおよ
びローリー法による2.0mgに相当する。

SDS-PAGE検定法は、更に、活性画分を選択するのに必
要である。この方法は、レームリ（Laemmli）,U.K.,Nat
ure,227:680（1970）に論及されている。

ローリー法は、ローリー（Lowry）ら、J.Biol.Chem.,
193,265〜275（1951）に記載されている。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ナガビュシャン，ティー・エルアメリカ合衆国ニュージャージー州 07054，パーシッパニー，サンセット・レーン３ (56)参考文献特開昭63−501401（ＪＰ，Ａ) 特開平４−506299（ＪＰ，Ａ) ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＬｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ. 18（1988）Ｐ．577−584

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】大腸菌により生産される活性組換え体ヒト
インターロイキン−４の溶液を精製する方法であって、（ａ）約pH6.7〜８、好ましくは約7.2で緩衝され且つ約
0.5〜1.5M塩化ナトリウムを含む活性組み換え体ヒトイ
ンターロイキン−４の溶液を、亜鉛キレートアガロース
ゲルクロマトグラフィーカラム上に充填して、活性組み
換え体ヒトインターロイキン−４をカラムに選択的に結
合させ；そして（ｂ）結合した活性組み換え体ヒトインターロイキン−
４を、約pH4.5〜5.5で溶離用緩衝液を用いてカラムから
溶離することを含む上記の方法。
【請求項２】大腸菌により生産される活性組み換え体ヒ
トインターロイキン−４の粗製溶液を精製する方法であ
って、（ａ）約pH6.7〜８、好ましくは約7.2で緩衝され且つ約
0.5〜1.5M塩化ナトリウムを含むインターロイキン−４
の粗製溶液を、亜鉛キレートアガロースゲルクロマトグ
ラフィーカラム上に充填して、活性組み換え体ヒトイン
ターロイキン−４をカラムに選択的に結合させ；（ｂ）カラムを、最初に、1.0M塩化ナトリウムを含む平
衡緩衝液で、次に、10％グリセロールおよび0.15M塩化
ナトリウムを含む緩衝液で２回洗浄し；（ｃ）結合した活性ヒトインターロイキン−４を、約pH
4.5〜5.5で溶離用緩衝液を用いてカラムから溶離し；（ｄ）工程（ｃ）からの活性ヒトインターロイキン−４
に、陽イオン交換器でのクロマトグラフィーに続いてカ
ラムからの活性ヒトインターロイキン−４の緩衝液の勾
配溶離を施し；（ｅ）工程（ｄ）からの溶離液を、分子量が10,000ダル
トン未満の物質を通過させる撹拌されたセルの膜上で濃
縮し；（ｆ）工程（ｅ）からの濃縮物にサイズ排除クロマトグ
ラフィーを施し；そして（ｇ）精製活性組み換え体ヒトインターロイキン−４を
回収することを含む上記の方法。
【請求項３】活性ヒトインターロイキン−４を分泌大腸
菌突然変異体の粗製発酵ブイヨンから精製する方法であ
って、（ａ）粗製溶液を遠心分離して大型粒子不純物を除去
し；（ｂ）遠心分離した粗製溶液に、ダイアフィルトレーシ
ョンを施して粗製溶液を濃縮し；そして（ｃ）濃縮した粗製溶液を請求項１または２に記載の方
法によって処理することを含む上記の方法。