JPH02103471A - 成人ｔ細胞白血病ウィルス感染診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、成人下細胞白血病（八ｄｕｌｔ　Ｔｃｅｌｌ
ｌｅｕｋｅｍｉａ　；以下ＡＴＬと略記する）の病因と
なる成人Ｔ細胞白血病ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｔｃｅｌ
ｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−Ｉ　：以下＋１ＴＬ
Ｖ−１と略記する）の、膜中及び膜の内側に位置する蛋
白であるｐ２１の抗体に対して抗原性を有するポリペプ
チドを抗原として用いる新規なＨＴＬＶ−１感染診断薬
に関する。

〔従来の技術） ＡＴＬは、成人が罹病する悪性の疾患であり、その病因
はＩ（ＴＬＶ−Ｉの感染によるもので、感染者のうち０
．１％前後の頻度で発病することが知られている。この
ＨＴＬＶ−Ｉの感染経路としては、輸血感染、母子感染
、性的感染等が知られており、ＨＴＬＶ−Ｉ感染者を早
期発見し、こうした感染の防止に努めることが望まれて
いる。

従来、こうしたＩＩＴＬＶ−［感染診断薬としては、Ｉ
ＩＴＬＶ−１に感染した場合に血漿又は血清中に生ずる
成人Ｔ細胞白血病関連抗原に対する抗体の検出を、成人
Ｔ細胞白血病関連抗原産生細胞の可溶性細胞蛋白質及び
）ＩＴＬＶ−１の可溶化処理蛋白から選ばれた少なくと
も１種（特開昭５８−１８７８６１号公報）、或いは該
細胞を界面活性剤により処理して得た抗原蛋白及びＩＩ
ＴＬＶ−１ウィルス粒子を利用して行うもの（特開昭５
９−６２５２７号公報）が知られている。

しかしながら、該診断薬は、Ｔ細胞膜、核等、成人Ｔ細
胞白血病関連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも
含んでおり、かかる抗原の非特異的免疫反応によりいわ
ゆる偽陽性の検体が生じ、ＨＴＬＶ−１感染の診断精度
が低下するという問題があった。

また、ＨＴＬＶ−１に対する抗体に対して抗原性を有す
るポリペプチドを生産するために、ＩＩＴＬＶ−１の外
皮蛋白（ｅｎｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　　；以下
ｅｎｖ蛋白と略記する）の遺伝子で組換えられた大腸菌
を増殖させ、産生ずるポリペプチドを回収する方法が試
みられている。

しかしながら、上記方法によって得られるポリペプチド
は、ＨＴＬＶ−Ｉに対する抗体に対して抗原性が低いも
のであった。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポ
リペプチドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないこと
によるものと推定される。

一方、診断薬として有用な蛋白の構造遺伝子をカイコ核
多角体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子部分に
組み換えた組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又は
カイコ生体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、
特開昭６２−２０８２７６号公報及び特開昭６１−９２
８８号公報において知られている。

ところが、これらの公報には、前記したＩＩＴＬＶ−１
の抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記の方
法を適用することに関しては何の具体的な記載もない。

かかる方法によるＨＴＬＶ−１の抗原蛋白であるポリペ
プチドを製造するには、ＨＴＬＶ−１の構造遺伝子のい
かなる部分によってカイコ核多角体病ウィルスＤＮＡの
多角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これにより
ポリペプチドの産生が可能であるか、更にはポリペプチ
ドが得られた場合、該ポリペプチドがＨＴＬＶ−１の抗
体に対して抗原性を有するかどうかに・ついては、更に
数多くの研究が必要であった。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、上記従来技術の問題点を克服して、１
ＩＴＬＶ４に対する抗体に対して高い抗原性を有するポ
リペプチドを開発し、該ポリペプチドを抗原として用い
たＩＩＴＬＶ−１感染の診断において極めて高感度で精
度良く診断できる診断薬を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、ＨＴＬＶ−１惑染の診断において、高感
度で精度良く診断できる診断薬を間発すべ（鋭意研究を
重ねた。その結果、ＨＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由
来するＤＮＡの特定の断片で、カイコ核多角体病ウィル
ス（Ｂｏｍｂｙｘ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒ
ｏｓｉｓ　Ｖｉ　ｒｕｓ　：以下、ＢｍＮＰＶと略記す
る）の多角体蛋白構造遺伝子の一部を、組換えた組換え
ウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
することによって発現させたポリペプチドを抗原として
用いることで、かかる目的が達成できることを見いだし
、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ＨＴＬシー１　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由
来するＤＮＡのうち、ｐ２１をコードするＤＮＡを含み
、且つＸｉ　Ｄ　Ｎ　Ａの５′末端から上流の１７塩基
対以内で切断された断片（以下、ＨＴＬＶ−１５’　−
３′断片と略す）により、ＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造
遺伝子の一部の組換えを行い、次いで、該組換えウィル
スをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させて発
現されたポリペプチドを抗原として用いたＨＴＬＶ−Ｉ
感染診断薬に関するものである。

本発明の診断薬において、抗原として用いるポリペプチ
ドは、上記＋１ＴＬＶ−１５’−３′断片により、Ｂｍ
ＮＰＶの多角体蛋白遺伝子の一部の組換えを行い、次い
で該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼
虫に感染させて発現されたものである。

以下、該ポリペプチドの製法について詳細に説明する。

１１組換えウィルスの製法 本発明において、上記ポリペプチドの製法に用いる組換
えウィルスの製法は特に制限されるものではない。代表
的な製法として、ＡＴＬ患者末梢血からリンパ球を分離
し、該リンパ球から抽出したＤＮＡよりＩＩＴＬＶ−１
５’　−３’断片を切り出し、これをカイコ発現系ベク
ター（ｐＢＦヘクター）のクローニング部位に挿入して
、組換えベクターとし、次いで、該ベクターを用いてＨ
ＴＬＶ−１５’−３′断片をＢＩＩＩＮＰνの多角体蛋
白構造遺伝子の一部と組換えることにより製造する方法
が挙げられる。

Ｔ　　Ｉ’ＢｍＮＰＶ 本発明において、ＨＴＬＶ−Ｉ　５’　−３’断片によ
って組換えられるＢｍＮＰＶは、養蚕業者に広く知られ
ているものであり、前用、古沢らが単離した代表的な株
としてＴ３株があり、この株のウィルスＤＮＡは、米国
の八ＴＣＣ（八ｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕ
ｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃＬｉｏｎ）にＡＴＣＣＮｏ、４０１
８８として寄託されており、容易に入手し得る。又、Ｂ
ｍＮＰＶに感染したカイコより公知の方法によって単離
することもできる。

上記Ｂｎ＋ＮＰＶのＤＮＡは、第１図の制限酵素地図で
表わすことができる。

コ（７）ＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（７）うち本発明に
おイテ、）ＩＴＬＶｌ　５′−３′断片によって組換え
られる部分は、第１図に示される多角体蛋白遺伝子のう
ちプロモータ一部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一
部分である。

１−２　１１ＴＬＶ−１５′−３′　　　の　′。法＋
１ＴＬＶ−Ｔは遺伝子としてＲＮＡを持つレトロウィル
スであり、感染細胞内でこの遺伝子ＲＮＡに由来して合
成されるＤＮＡのｅｎｖ遺伝子の塩基配列としては、５
ｅｉｋｉ　らが’Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、
　Ｓｃｉ。

ｔｌｓＡ　８０’（１９８３）第３６２１頁で発表した
ものが知られている。

本発明において、ＨＴＬＶ−１５’　−３′断片の取得
方法は特に制限されない。代表的な方法にはＡＴＬ患者
末梢血中のリンパ球に所在するＤＮＡから該ＨＴＬＶ４
５’　−３’断片を取得する方法が挙げられる。

代表的な方法を例示すれば、まず、ＡＴＬ患者末梢血か
らリンパ球を分離し、該リンパ球からＤＮＡを抽出し、
次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、約２０キロ塩基対
断片を含むＤＮＡを得、該ＤＮＡをシャロン（ｃｈａｒ
ｏｎ）　４　ＡベクターのＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位
に接続した後、ＩＩＴＬシー■のプロウィルスを含むフ
ァージをスクリーニングで単離し、該プロウィルスから
ｐＵｃベクターに代表される大腸菌のベクター基を使用
したサブ・クローニングおよび制限酵素による切断によ
りＩＩＴＬＶ−１５’　−３′断片を得る方法である。

）ＩＴＬＶ−１５’　−３’断片は、ｔ（ＴＬＶ−Ｔ　
ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、膜中及び膜
の内側に位置する蛋白であるｐ２１をコードしているＤ
ＮＡ　（第９図参照）を含み且つ、該ＤＮＡの５′末端
から上流の１７塩基対以内で切断されたものであれば、
すべて適用できる。

なお、ｐ２１をコードしているＤＮＡ配列は、第９図に
示す通り、前記５ｅｉｋｉ　らが発表している）ＩＴＬ
Ｖ−１ｅｎｖ蛋白遺伝子配列の６１１６番目から６６４
３番目の配列がこれに相当し、又、５′末端から上流の
１７塩基対は６０９９番目のものがこれに相当する。

本発明者等の知見によれば、上記ＨＴＬＶ４５’　−３
′断片がｐ２１をコードしているＤＮＡを含んでいても
、該ＤＮＡの５′末端から上流に１７塩基対より多くの
塩基対を含んでいる場合には、後記する方法により、該
断片を用いて得られたＢｍＮＰＶの組換えウィルスを増
殖させてポリペプチドを産生じようとしても、ポリペプ
チドが得られなかったり、たとえ得られたとしてもＨＴ
ＬＶ−Ｉのｐ２１に対する抗体に対して抗原性を有さす
、本発明の目的を達成できないのである。

好適なる部位を示せば、前記ｐ２１をコードしたＤＮＡ
の５′末端から上流に１７塩基対隔てた位置よりＧＡＴ
Ｃと配列されているＢａｍＨＥ制限酵素切断部位が挙げ
られる。

本発明におイテ、前記ＨＴＬＶ−１５’−３”断片は、
ｐＢＦベクターに組換えられた後、該組換えベクターに
よりＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造遺伝子の一部と組換え
て組換えウィルスとされる。組換えウィルス取得のため
に使用するｐＢＦベクターは、第２図の制限酵素地図に
より特徴づけられるものである。即ちｐＢＦヘクターは
、ＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（７）多角体蛋白遺伝子の
プロモーター領域と多角体蛋白構造遺伝子前後付近及び
大腸菌のベクターであるｐｕｃヘクターの遺伝子とを含
むベクターである。

上記ｐＢＦベクターは、Ｘｂａｌ、　ＥｃｏＲＩ、　５
ｔｕｌ制限酵素切断部位のクローニング部位がある。

かかるｐＢＦヘクターは、そのクローニング部位の上流
に塩基配列ＡＴＧから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで種類があり、第３図に示すよ
うなｐＢＦ　４〜ｐＢＦ１３３が存在している。

組換えベクターの製造においては、上記ベクターのうち
、挿入するＨＴＬＶ−［５’　−３′断片部分とｐＢＦ
ベクター上流部分とのリーディング・フレームが合うも
のであれば、どのベクターを使用してもよい。しかし、
５’−３’断片をカイコ樹立培養細胞及びカイコ幼虫で
効率よく発現できる組換えウィルスを作成するためには
、塩基配列ＡＴＧから開始されるＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　
Ａ由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコードした遺伝
子部分を多く含んでいるｐＢＦヘクター、例えばｐＢＦ
１２４．　ｐＢＦ１２９．　ｐＢＦ１３３等のｐＢＦヘ
クターを使用するのが望ましい。

上記ｐＢＦヘクターへのｌｌＴｌ、シー［５’　−３′
断片の挿入は、ｐＢＦヘクターのクローニング部位に存
在するＥｃｏＲＩ、　Ｘｂａｌ、　５ｔｕｌ制限酵素切
断部位を利用して行なえばよい。ｐ肝ヘクタークローニ
ング部位に＋１ＴＬＶ−Ｉ　５’−３′断片を挿入する
には、ＤＮＡ合成又は大腸菌のベクター基であるｐＵｃ
ヘクターへの挿入、切断等の公知の手段により、該断片
の両端にＥｃｏＲＩ、　’Ｘｂａｌ或いは５ｔｕｌ制限
酵素切断部位を接続するか、該断片の５′端にＥｃｏＲ
Ｉ、３′端に５ｊｕｌ制限酵素切断部位を接続するか、
更には該断片の５′端にＸｂａｌ、　３′端に５ｊｕｌ
制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの操作が一般
に行われる。以上のうらでも、ＨＴＬＶ−１５’　−３
”断片の両端にＥＣ０ＲＩ　ＩＩ、１２いはＸｈａ　ｒ
制限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。

そして５’−３′断片の両端にＥｃｏＲＩ制限酵素切断
部位を接続する場合、該断片はｐＢＦヘクターをＥｃｏ
ＲＩ制限酵素で切断したものと接続する。又、＋１ＴＬ
Ｖ−１５’　−３′断片の両端ニＸｂａｌ制限酵素切断
部位を接続した場合も同様に、該断片はｐＢＦヘクター
をＸｂａ　Ｉで切断したものと接続する。この場合接続
に際しては、予め制限酵素で切断したｐＢＦベクターに
対し、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、ｐＢＦ
ベクターのセルフライケーション（ｓｅｌｆｌｉｇａｔ
ｉｏｎ）を避けることが好ましい。

又、ＩＩＴＬＶ−［５’　−３′断片の５′端にＥｃｏ
ＲＩ、３′端にＳ　ｔ　ｕ　Ｉ　ＩＩＪ　ｆ＠酵素切断
部位を接続する場合、該断片は、ｐＢＦベクターをＥｃ
ｏＲＩ、　５ｔｕｌで切断したものと接続し、ＨＴＩ、
Ｖ−１５”−３′断片の５′端にＸｂａ　Ｉ、３′端に
５Ｌｕｒ制限酵素切断部位を接続する場合、該断片は、
ｐＢＦヘクターをＸｂａｌ、　５ｔｕｌで切断したもの
と接続すればよい。

かかる接続方法は、リガーゼを用いて公知の方法により
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたｐＢＦ
ヘクターのＤＮＡの最に対して、挿入すべき５’−３′
断片のＤＮＡ１が３〜８倍量になるように調整し、例え
ばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接続する方法である。

上記（７）　ＩＩＴＬＶ−１５’　−３”断片を挿入し
たｐＢＦヘクターの分離及び確認は、下記の方法により
行うことができる。

即ち、分離は前記の接続反応液を５１０９株（宝酒造Ｏ
ａ製　Ｎｏ、９０５２）　、ＭＶ１１８４株（宝酒造■
製）で代表される大腸菌のコンピテントセルに加え、公
知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、ｐＢＦベクター
がアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることから、形質
転換後の液をアンピシリンを含んだＩ、Ｂ寒天培地に接
種し、室温以上の適当な温度、例えば３７°Ｃで１２時
間〜２０時間培養して出現するシングル・コロニーを形
質転換株として取得するごとによって行うことができる
。

また、Ｈ且シー１５’　−３′断片を挿入したｐＢＦヘ
クターの確認は、形質転換株に存在する組換えベクター
ボイリング法（ｂｏｉｌｉＢ法）或いはアルカリ・リシ
ス法（ａｌｋａｌｉ　１ｙｓｉｓ法）を用いてミニ・プ
レバレージョン（ｍｉｎｉ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）
　Ｌ、組換えベクター懸濁液を取得し、このようにして
調製した組換えベクター懸濁液をＨＴＬＶ−１５’　−
３”断片が挿入されていることが確認できる任意の制限
酵素、例えばＥｃｏＲｒ、　Ｘｂａｒで切断し、切断物
をアガロースゲル電気泳動し、エチジウム・ブロマイド
による染色後、予想できる位置にハンドが存在するか否
かを確認することによって行うことができる。尚、５′
３′断片の両端をＥｃｏＲＩ或いはＸｂａ　Ｉ制限酵素
切断部位にしたものをｐＢＦ　ベクターのＥｃｏＲＩ、
　Ｘｂａｌ制限酵素切断部位に挿入した組換えベクター
の場合は、ｐＢＦベクターの上流部分と挿入する５’−
３′断片が正しい方向に結合しているかどうか確認でき
る制限酵素、例えば、ＢａｍＨＩ、　Ｘｈｏｌ等で切断
し、その切断物を同様にアガロースゲル電気泳動し、エ
チジウム・ブロマイドによる染色後、予想できる位置に
ハンドが存在するか否かも同時に確認するとよい。

上記方法で形質転換株として分離した組換えベクターは
、該形質転換株を増殖させることにより、その量を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだＬＢ液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば３７°
Ｃで１２時間〜２０時間振盪培養し、該培養物からアル
カリ・リシス法（ａｌｋａｌｉ　１ｙｓｉｓ法）を用い
てミデイアム・プレバレージョン（ｍｅｄｉｕｒｍ　ｐ
ｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　　シ、組換えベクター懸濁液
を取得することによって行うことができる。

取得した組換えベクターも前記した方法と同様な方法で
再度目的の組換えベクターであるか否かを４Ｔｔ認する
ことが好ましい。

得られた組換えベクター懸濁液は、アールエヌエース処
理（ＲＮａｓｅ処理）して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。

１−３−　　　　えウ　ルスの　７６ 本発明におイテ、ＩＩＴＬＶ−１５’−３′断片によッ
テ、多角体蛋白構造遺伝子の一部が組換えられた組換え
ＢｍＮＰＶは、ＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａと前記組換えベ
クターとをカイコ樹立細胞にカルシウム沈澱法を用いて
、同時にトランスフェクション（コ・トランスフェクシ
ョン）し、組換えベクターとＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａ間
の対立遺伝子を置き換えることにより取得することがで
きる。

上記のコ・トランスフェクションは、具体的には、０．
２５Ｍ塩化カルシウムおよびキャリヤＤ　Ｎ　Ａの存在
下でＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａと組換えベクターＤＮＡを
モル比１　：　１００になる様に混ぜ、その後、該混合
液に、０．２８Ｍ塩化ナトリウムを含むＨＥＰＥＳ　１
１衝液（ｐＨ７，１）とリン酸緩衝液の混合液を添加し
、混和後、該混和液を８ｍ培養細胞中に添加するという
前田、古沢らの方法（特公昭６１−９２９７号公報）に
従って行なうことが望ましい。

コ・トランスフェクションした後、組換えウィルスを含
む反応液は室温付近の温度、例えば２７°Ｃで５〜６日
間培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換え
ウィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェ
クションで得られた反応液の上清からの組換えウィルス
のクローニングは、プラークアッセイ法［Ｊ、５ｅｒｉ
ｃ　Ｓｃｉ、Ｊｐｎ、５３５４７（１９８４）　：ｌや
リミッティング・ダイリューション法により組換えウィ
ルスを単離することによって行えばよい。どちらの方法
を使用しても良いが、操作法の容易さ、分離回数の少な
くて済む点から、リミッティング・ダイリューション法
を使用する方が良好である。

上記リミッティング・グイリュージョン法を使用しての
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と１×１０Ｓ〜ｌＸｌ０６力イコ細胞数／ｍｆカイコ
培養培地、好ましくはＴＣ１０培地（第２表参照）の濃
度で調整しであるカイコ樹立細胞液とを１：１で混合す
ることにより感染させ、この混合液をマイクロタイター
トレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度、例えば２
７゛Ｃで培養し、培養２〜７日後、マイクロタイタート
レー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られるカイコ細
胞の形状、形態で組換えウィルス存在の有無を判定する
。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の形態には、
第６図に示すように３種ＭＧ’ｆｆｉ認できる。

第６図におけるウィルスが感染した形態を示しているカ
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することにより組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるＢｍＮＰＶと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・ダイリューションを繰り返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。

■、ポリペプチドの製法 ＝１　カイコ 本発明において組換えウィルスを感染させるカイコ樹立
培養細胞としては、ＢｍＮＰＶが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。

ＢｍＮＰＶが増殖可能なカイコ樹立培養細胞には、Ｖｏ
ｌｋｍａｎル、Ｅ、＋ａｎｄ　　Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ、
Ｐ、八、（１９８２）：　　Ａｌ）Ｔｌｌ。

Ｅｎｖｉｒｏｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、４４．２２７
−２３３に示されているＢｍ−Ｎ、　（ＡＴＣＣＮｏ、
ＣＲＬ−８９１０）および前用らがＢｍ−Ｎよりクロー
ニングしたＢｍ・Ｎ２＋　Ｂｍ・Ｎ４のようなセルライ
ンが知られている。ＢｍＮＰＶの増殖の良さ、扱いやす
さの点で、Ｂｍ−Ｎ４カイコ樹立培養細胞を使用するの
が適当である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は
、公知の培養条件、例えば、１０％小牛脂児血清を含む
ＴＣ−１０培地で２７°Ｃ，４日間の条件で、培養した
ものを使用するのが適当である。

本発明において、目的とするポリペプチドは、前記組換
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。該組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物に組換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、２７°
Ｃで数日間培養することによって行うことができる。

培養後、感染したカイコ樹立培養細胞培養物は、遠心分
離した後、沈澱した細胞は、ｔｌＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白
の発現確認及びＨＴＬＶ−１ｅｎν蛋白の精製に使用し
、また、−上清はカイコ幼虫に感染させる組換えウィル
ス液として使用してもよい。

また、組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法も
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ５令幼虫を使用するのが好ま、しい。カイコ幼虫
への感染は、前記のカイコ樹立培養細胞への感染で上清
として得られるウィルス力価を高めた組換えウィルス液
又は該操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に１
０〜１００μ尼程注入することで行なうことができる。

組換えウィルスを感染させた後、感染カイコを飼育する
ことで、組換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とＨＴ
ＬＶ−１ｅｎｖ蛋白の融合蛋白がカイコ幼虫の脂肪体内
に蓄積される。

カイコの飼育方法は、特に制限されないが、桑の葉或い
は桑の葉をホモジェネートし、滅菌後凍結乾燥したペー
スト様試料（協同試料Ｉ１１社製等）に蒸留水を浸した
ものいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、２７°
Ｃで培養する一般的な方法を採用すればよい。

飼育期間は、カイコ幼虫が死亡する直前まで行なうこと
が好ましい。感染させる徂換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異なるが、感染して３日〜５日後
を飼育期間の目安とすることができる。

上記のカイコ幼虫から、脂肪体を取り出し、該脂肪体を
ｔｌＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白発現の確認およびＩＩＴＬシ
ー■ｅｎｖ蛋白の精製に用いる。

上記脂肪体の取得方法は、組換えウィルスを感染したカ
イコ幼虫を中腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、中腸等の器官を除去後、スパチュラ等で下
腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得す
る方法が推奨される。

本発明において、前記方法で得られた組換えウィルス感
染カイコ樹立培養細胞及び組換えウィルス感染カイコ幼
虫の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限
されないが、例えば、ＰＢＳ？１衝液等の中性緩衝液に
該カイコ樹立培養細胞又は脂肪体を懸濁し、ソニケーシ
ョンによる分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケー
ションした後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好
適である。

上記方法で得られたポリペプチドは、必要に応じてＳＤ
Ｓ水溶液で溶解し、イオン交換樹脂による精製およびゲ
ル濾過による精製等の従来の方法により精製を行なった
後、本発明の診断薬の抗原として用いる。

尚、上記のポリペプチドはｐＢＦ１３３などの有す多角
体遺伝子部分がコードする多角体蛋白の一部とＨＴＬＶ
−１５′−３′断片がコードする、ｔｌＴＬＶ−１ｅｎ
ｖ蛋白のうち膜中及び膜の内側に位置する蛋白であるｐ
２１含有部分との融合蛋白であり、そのまま或いは目的
によって、化学的あるいは酵素的方法を組合わせて、多
角体蛋白を除くことにより更に精製して使用してもよい
。

多角体蛋白を除く方法を具体的に示せば、多角体蛋白と
ρ２１をつなぐペプチド部分のアミノ酸配列を認識する
蛋白質分解酵素を使用して、その部分を切断後、ゲル濾
過等の分子訃の違いを利用した精製手段で精製するのが
良好である。

次に、以上の製法により得られたポリペプチドを抗原に
用いたＩＩＴＬシーＩ惑染者感染断薬について説明する
。

即ち、本発明の診断薬は、上記ポリペプチドを抗原とし
、被検液中から該抗原と抗原−抗体反応を生じるｐ２１
に対する抗体を、検出することでＨＴＬＶ−Ｉへの感染
を診断するものである。従って、本発明の診断薬は、Ａ
ＴＬ患者だけでなく、ＨＴＬＶ４に感染した結果、該ｐ
２１に対する抗体を保有している未発病者をも診断する
ものである。また、上記被検液には、例えばＨＴＬＶ−
１への感染の診断を所望する検体者より常法に従い採血
した血液から分離された血漿又は血清、或いはこれを適
当な緩衝液で希釈したものが使用される。本発明におい
て、上記ｐ２１に対する抗体の検出は、上記ポリペプチ
ドを抗原として利用する限り特に制限されることなく公
知の免疫学的試験法が採用できる。好適に採用される方
法を例示すると、不溶性担体粒子に上記ポリペプチドを
感作し、抗原−抗体反応によって生じる該担体粒子の凝
集反応を検出する方法及びエンザイムイムノアッセイ法
等が挙げられる。

また、製造した上記ポリペプチドが微量であったり、精
製不十分である場合には、ウェスタンブロンド法により
検出することが好ましい。以下、上記した各検出法につ
いて説明する。

まず、上記凝集反応を検出する方法において、該凝集反
応は、マイクロタイタープレートのウェル中での粒子の
凝集状態を観察するマイクロタイター法、或いは凝集反
応の進行に伴い減少する測定系の透過率を測定する方法
等の公知の担体粒子凝集物の観察、定量方法により検出
できる。また、用いられる不溶性担体粒子は、抗原−抗
体反応に使用される公知のものが特に限定されることな
く使用される。好適に使用されるものを例示すると、ヒ
ト　ヒツジ、ニワトリ等の動物赤血球、ポリスチレン、
スチレン−ブタジェン共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタク
リレート、ポリカーボネート等の乳化重合により得られ
る有機高分子ラテックス、無機化合物粒子が重合体層で
被覆された複合重合体粒子、ガラスピーズ、シラスポー
ラスガラス、シリカ、アルミナ等の無機有機粒子が挙げ
られる。このうち、マイクロタイター法の実施に際して
は、特開昭６２−２８６５３３号公報に記載される複合
重合体粒子が、高い単粒子性を存し、非特異的な反応も
少ない為好ましい。上記不溶性担体粒子の平均粒子径は
、０．５〜３．０μｍ、好ましくは１．０〜２．０μｍ
のものが用いられる。上記不溶性担体粒子にポリペプチ
ドを感作する方法は、特に限定されることなく公知の抗
原感作方法が実施できる。好適な方法を例示すると、タ
ンニン酸。

ゲルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジジン。

トリレンジイソシアネート、ジクロロニトロヘンゼン、
カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のカンプリ
ング剤を用いた化学的結合法、又は物理的吸着法等が挙
げられる。また、不溶性担体粒子−粒子当りに感作され
るポリペプチド量は、ポリペプチド（ｍｇ）／不溶性担
体粒子の表面積（１１１２）の比が０．１〜１０■／　
ｍ　Ｚの範囲にあることが好ましい。

次に、エンザイムイムノアッセイ法は、固相に感作させ
た上記ポリペプチドと反応した被検液中のｐ２１に対す
る抗体を、酵素を抗体に化学的に結合させた酵素標識抗
体を用いた直接法５間接法等により検出することで実施
できる。使用される固相は、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート、ポリプロピレンおよびポリビニール製等のマイ
クロタイタープレート、ビーズ、スティック、試験管等
の物理的吸着に供される公知の固相が何ら制限されるこ
となく使用され、このうち特に市販されるエンザイムイ
ムノアッセイ用マイクロタイタープレートを用いること
が好ましい。該固相へのポリペプチドの感作は、ポリペ
プチドを０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液に懸濁し、
４〜３７°Ｃで１時間以上放置することで実施できる。

また、固相に感作させるポリペプチド量は、ポリペプチ
ド（ｍｇ）／固相の表面積（ｍ２）の比が０．５〜５０
ｍｇ／ｍ２の範囲にあることが好ましい。使用する酵素
標識抗体は、ヒト抗体と反応性を有し、標識酵素が化学
結合したものであれば特に限定されず、例えば市販され
るアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ等の酵素で標識されたヤギ抗ヒ）１ｇ
Ｇ抗体、マウス抗ヒ目ｇＧ抗体、ヤギ抗ヒ）ＩｇＭ抗体
、マウス抗ヒトＩｇ旧元体等が使用できる。検出に用い
られる基質は、上記酵素標識抗体に標識された酵素に応
じて適宜使用すれば良く、例えば該酵素としてアルカリ
フォスファターゼを選択した場合においては、ｐ−ニト
ロフェニルフォスフェート等を使用すれば良い。尚、測
定に際し、被検液である血漿又は血清は、原液のまま加
えても良いが、好ましくはＰＢＳ緩衝液、正常ヤギ血清
等で１００倍希釈して用いるのが良い。

また、ウェスタンプロット法は、例えば、Ｐｒｏｃ。

ＮａＬｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７６．４３５０
（１９７９）においてＴａｂｉｎ等が提案する公知の方
法に準じて実施することができる。前記ポリペプチドと
被検液中のｐ２１に対する抗体との抗原−抗体反応の検
出は、上記文献に記載されるラジオオートグラフィー、
蛍光免疫法及びエンザイムイムノアンセイが特に限定さ
れることな〈実施できる。しかしながら、簡便さと保存
性の面から上記エンザイムイムノアノセイの直接法又は
間接法を実施することが好ましい。転写に用いる膜は、
ウェスタンブロンドに使用される公知のものが特に限定
されることなく使用できる。好適に使用されるものを例
示すれば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニ
リデンジフルオライド膜、ジアゾ化アミノベンジルオキ
シメチル膜、ジアゾ化アミノフェニルチオエーテル膜。

ジエチルアミノエチル膜等が挙げられ、このうちニトロ
セルロース膜を用いるのが好ましい。

〔発明の効果〕

本発明の診断薬において、抗原として使用するポリペプ
チドは、ＩＩＴＬＶ−１ｅｎｖ蛋白のｐ２１に対応し、
１１ＴＬＶ−Ｉに対する抗体に対して良好な抗原性を有
すものである。従って、本発明の診断薬は、）ＩＴＬＶ
−１感染者の診断を高感度で行うことができる。また、
他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいないため
、ＨＴＬＶ−Ｔに感染していないにもかかわらず陽性と
しての結果となる偽陽性の検体を生ずることなく、ＨＴ
ＬＶ−１感染者の診断を行うことができる。

従って、本発明の診断薬は、例えば輸血における供血者
を検体者として診断すること等により、）ＩＴＬＶ−１
感染者を発見し、）ＩＴＬＶ−１への感染の防止を行う
ことができ、産業上の利用価値は極めて大きいものであ
る。

〔実施例〕

製造例１ （ＨＴＬシー１　ｅｎｖ蛋白遺伝子由来のＤＮＡの取得
）ＡＴＬ患者患者末梢血１０炉／公知の方法に従いリン
パ球を分離し、該リンパ球をプロテインナーゼＫ（シグ
マ社製ＰＯ３９０）で処理した後、フェノール・クロロ
ホルム抽出エタノール沈Ｈヲ行イＡ　ＴＬ患者由来のリ
ンパ球のＤＮＡ１■を得た。

該ＤＮＡｌ０μｇを第４表Ｎ０２１に示す組成の′溶液
中でＥｃｏＲＩ制限酵素（宝酒造■製　Ｎα１０４０）
により切断し、エタノール沈澱後、ＴＥ緩衝液２００μ
！に溶解した。

そして該溶液を、ショ糖密度勾配遠心（ショ糖１０〜４
０％ｗｔ／ｖｏｌ、　２６０００　ｒｐｍ、　１８時間
）にかけ、アガロースゲル電気泳動による確認で２０キ
ロ塩基対に相当するＤＮＡ断片を得た。次にこのＤＮＡ
断片１，０Ｍｇをシャロン４Ａベクター（ヘクターＤＮ
Ａ、榊　佳之講談社１９８６参照）のＥｃｏＲＩ制限酵
素切断部位への接続を行い、シャロン４Ａベクターに存
在するＥｃｏＲＩ切断部位に該ＤＮＡ断片を挿入した。

この接続は、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ（全酒造■製　Ｎｏ
、２０１１）を用い、接続反応は、第５表に示すような
組成の溶液中で、１５°Ｃ９１２時間行なった。次いで
、得られたＤＮＡについてイン・ビトロ・パッケージン
グを行なった後、処理液を遠心分離（７０００ｒｐｍ、
　２時間）し、上清をプラークハイブリダイゼーション
用の組換えファージ液とした。膝組換えファージ液を↑
旨示菌ＬＥ３９２　（全酒造（ｌｉｊ　”Ａ　）に感染
し、プラークを形成した後、３２ｐでラヘルした１１Ｔ
１、Ｖ−Ｔ　ｐｏｌ　Ｄ　Ｎ　Ａ含有断片をプローブに
プラークハイブリダイゼーションを行ない、ＨＴＬＶ−
Ｉｉｉ伝子内子由来ＮＡを含むファージを単離し７た。

得られた組換えファージを、第４表Ｎｏ、　１に示す組
成の溶液中で、ｌｌ１ｎｄＩＩｉ（全酒造■製）、Ｅｃ
ｏＲＩ（全酒造９＠製　Ｎｏ、１０４０）制限酵素によ
り切断し、ＨＴＬＶ−１遺伝子由来のＤＮＡのうちｅｎ
ｖ−ｐｘ−１，ＴＲ領域に相当し、且つｐ２１をコード
するＤＮＡを含む約３．９キロ塩基対のＤＮＡ断片を４
００μｇ得た。そして、大腸菌用ベクターｐＵｃ１９（
全酒造０菊製　Ｎｏ、３２１９）を同様な条件下で旧ｎ
ｄ　■、　ＥｃｏＲＩ制限酵素により切断し、切断部位
への上記ＤＮＡ断片の接続反応を行なった。得られた接
続反応液は、後述する、ＨＴＬＶ−１５’　−３′断片
を含むＢａｎ）Ｉ　Ｉ　−ＢａｍＨＩ断片ＤＮＡと、ρ
ＵＣ１９の接続反応液と同様に、大腸菌ＪＭ１０９（全
酒造（１＠製　Ｎα９０５２）の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プし・バレージョン
へと続く一連の操作に使用した。以上の操作の結果、Ｈ
ＴＬＶ−Ｔ　ｅｎｖ−ｐｘ−ＬＴＲｔｌ域遺伝子に由来
するＤＮＡ断片がｐＵｃ１９に正しい方向で挿入しテイ
ル組換エヘク’；’　−ＰＨＴ　３．９ｉ／ｐｕｃ１９
を４００　ｕ　ｇ得た。

上記組換えベクターＰＨＴ　３．９Ｋｂ／ｐＵｃ１９２
００μｇを、第４表Ｎｏ、　３に示す組成の溶液中で、
Ｐｓｔｌ　（全酒造Ｇ１製　Ｎｏ、１０７３）　、　　
Ｈｉｎｄ　［１（全酒造■製　Ｎｏ、１０６０）を使用
して、切断し、Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片（約１
７００塩基対）を得る。

一方、大腸菌ベクターｐＵｃ１９を第４表Ｎｏ１に示す
組成の溶液中で５ａｌｌ　（全酒造ｔｌｌ製　Ｎｏ、１
０８０）を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアー
ゼ（全酒造■製　Ｎｏ、２４２０　）処理後、接続し、
ＡＣＣＩｌＳａｉｌ、　Ｉ（ｉｎｃ口制比制限酵素切断
部位いｐＵｃ１９を得た。次に、該ｐＬｌｃ１９を第４
表Ｎｏ、　２に示す組成溶液中でｌｌ１ｎｄＩＩＩ、　
ＰｓｔＩを使用して切断し、該ベクターのｔｌｉｎｄＩ
ＩＩ、　Ｐｓｉ切断部位に上記旧ｎｄ　Ｉ［ｌ　＋　Ｐ
　ｓ　ｔ　Ｉ断片を接続した。

次いで、接続反応液を大腸菌Ｊ旧０９の形質転換、ミニ
プレバレージョンと続く一連の操作に使用し、１１ｉｎ
ｄ　ＩＩＩ−Ｐｓｔｌ断片が上記ｐＵｃ１９ベクターに
正しい方向で挿入している組換えｐＵｃ１９ベクターを
４００μｇ得た。更に、第４表ＮＯ１２に示す組成の溶
液中で、組換えｐＵＣ１９ヘクターをＡｃｃＩ（全酒造
■製　Ｎｏ。

１００１）、　Ｘｂａｌ（全酒造■製　Ｎｏ、１０９３
）を使用して切断し、ＩＩＴＬＶ−Ｔ　ｅｎｖ蛋白遺伝
子に由来するＤＮＡのうち後半部分に相当するＡｃｃ　
ｒ−Ｘｂａ　［断片（約１０６０塩基対）を取得した。

一方、組換えベクターＰＩＴ　３．９Ｋｂ／ｐＵｃ１９
．２００μｇを、第４表Ｎｏ、　５に示す組成の溶液中
でＮｃｏｌ制限酵素（宝酒造＠製　Ｎｏ、１１６０）を
使用して切断し、Ｎｃｏｌ　　Ｎｃｏｌ断片（約６１０
塩基対）を得た。一方、大腸菌ベクターｐＵｃ１８（全
酒造９１製　Ｎｏ、３２１８　）を第４表Ｎｏ、　３に
示す組成の溶液中で旧ｎｃＩＩ制限酵素（全酒造■製　
Ｎｏ、１０５９）で切断し、該ベクターのＨｉｎａｌｌ
制限酵素部位に上記Ｎｃｏｌ　−Ｎｃｏｌ断片をフィル
イン・ライゲーションによって、接続した。次いで、接
続反応液を、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プレバレージョンと
続（一連の操作に使用し、ＮｃｏｌＮｃｏＴｌ１片が上
記ｐＵｃ１８ベクターに正しい方向で挿入している組換
えｐＵｃ１８ベクターを４００μｇ得た。該ベクターを
第４表Ｎα６に示す組成の溶液中で、Ｘｂａｌ、　Ａｃ
ｃｌ制限酵素で切断し、ＨＴＬＶ４　ｅｎｖ蛋白遺伝子
に由来するＤＮＡの前半部分に相当するＸｂａＩ　　Ａ
ｃｃｌ断片（約５００塩基対）を得た。

次いで、大腸菌ベクターであるｐｕｃｌ１９（全酒造■
製　Ｎｏ、３３１９　）を第４表Ｎ０１６に示した組成
の溶液中でＸｂａＩ制限酵素（全酒造■製　Ｎα１０９
３）により切断し、得られたベクターと上記ＡｃｃＴ　
−Ｘｂａｌ断片及びＸｂａｌ−Ａｃｃｌ断片との接続を
行なった。そして、接続反応液を大腸菌ＪＭ１０９の形
質転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミデイアム・
プレバレージョンへと続く一連の操作に使用し、）ＩＴ
ＬＶ−１ｅｎν蛋白遺伝子由来のＤＮＡが　ｐＵｃ１１
９ベクターに正しい方向で挿入している組換えベクター
ｅｎｖ／ｐＵＣ１１９、２００μｇを得た。以上の工程
を第７図に示す。

（組換えベクターの製造） 前記の方法で得られた組換えベクターｅｎｖ／ｐＵｃ１
１９、２００μｇを第４表Ｎｏ、　６に示す組成の溶液
に溶解し、次いでＢａｎ＋ＨＩ制限酵素（全酒造■製　
Ｎα１０１０）を断続的に９時間添加していき、切断反
応を行なった。切断後、フェノール抽出、エタノール沈
澱を順次行なった後、沈澱したＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐ
Ｈ８，０）に溶解し、該ＤＮＡ溶解液をアガロースゲル
電気泳動した。そしてＩＩＴＬＶ−１５’　−３’断片
を含むＢａｍＨＴ　−ＢａｍＨＩ断片に相当するバンド
部分の寒天片を切り出し、電気泳動による溶出によって
該断片を抽出した。次いで、抽出液を更にフェノール抽
出し、エタノール沈澱して１ＩＴＬＶ４５’　−３′断
片を含むＢａｍｌｌｌ−Ｂａｍｔｌｌ断片を得た。

一方、大腸菌用ベクターｐＵｃ１９１０μｇをＢａｍ旧
制比制限酵素り、前記と同様の切断条件で切断した。次
いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁液
（全酒造■製　ｋ２１２０）　　１μ２により、６０°
Ｃで３０分間反応させた。アルカリフォスファターゼ反
応停止後、該反応液をフェノール抽出、エタノール沈澱
し、ＢａｍＨＩで切断されたｐＵｃ１９を得た。

このようにして得られた、ＢａｍＨＴで切断されたｐＵ
ｃ１９０．２ｕｇと前記ＨＴＬＶ−Ｉ　５’　−３′断
片を含む６ａｍｌｌＩ−ＢａｍＨＩ断片０．２５μｇを
混合し、第５表に示す組成の溶液中で、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼを用い、１６°Ｃ９３時間以上接続反応を行なった
。

そして該操作により得られた接続反応液２５μ！を大腸
菌ＪＭ１０９のコンピテントセル懸濁液２００μ２に添
加し、氷上で３０分放置した。その後、４２°Ｃで２分
間ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、ＬＢ液
体培地８００μｐを添加し、３７°Ｃで１時間おだやか
に振盪培養した。

該液体培地１００μｌを、アンピシリン１００７１ｇ／
−を含むＬＢ寒天培地１５ｍ１／プレートに接種後、３
７°Ｃで１２時間培養した。培養後出現したシングルコ
ロニー２０個を取り出し、それぞれをアンピシリン３０
ｕｇ／ｍｌ含むＬＢ液体培地１５ｍ１に接種し、３７°
Ｃで８時間培養した。それぞれの液体培地から１−ずつ
採取し、各採取培地中の大腸菌内に所在するプラスミド
をミニ・プレバレージョン法により抽出した。得られた
各プラスミドのそれぞれを、第４表Ｎｏ、　４に示す組
成の溶液中でＫｐｎｌ制限酵素（全酒造■製　Ｎｏ、１
０６８）により切断反応を行った。反応後、各反応液を
アガロースゲル電気泳動し、ＨＴＬＶ−Ｉ５’−３”断
片を含むＢａｍＨＩ−ＢａＩ１１旧断片がｐＵＣ１９に
正しい方向で挿入しているプラスミドを確認した。

この確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る前記液体培地から０．２　ｍｌを採取し、アンピシリ
ン１００μｇ７ｍｌを含むＬＢ液体培地５０−に接種後
、３７°Ｃで１２時間培養した。

得られた液体培地中の大腸菌内に所在するプラスミドを
ミデイアム・プレバレージョン法により抽出し、組換え
ベクターＢａｍ１ｌｌ　Ｅｎｖ（６００）／ｐＵｃ１９
４００μｇを得た。

膝組換えベクターＢａｍＨＩ　Ｅｎｖ（６００）／ｐＵ
ｃ１９２００μｇを第４表Ｎｏ、　６に示す組成の溶液
に溶解し、次いでＸｂａＩ制限酵素を断続的に９時間添
加していき、切断反応を行なった。得られた切断物を前
記アガロースゲル電気泳動することで、ＨＴＬＶ−１５
’　−３′断片を含むＸｂａ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片（
約６００ｂｐ）　０．１５　ｕ　ｇを得た。

又、カイコの発現系ベクターｐＢＦ１３３．１０μｇを
Ｘｂａｌ制限酵素により、前記と同様な切断条件で切断
し、次いでアルカリフォスファターゼ処理した。

上記ＨＴＬＶ−Ｉ　５’　−３’断片を含むＸｂａｌ−
Ｘｂａ［Ｄ　Ｎ　Ａ断片１．２５μｇとＸｂａ　Ｉで切
断されたｐＢＦ１３３０．２５μｇを混合し、Ｔ４ＤＮ
Ａリガーゼにより前述と同様な方法で接続反応を行なっ
た。

そして、前記と同様な方法により、この接続反応液を用
いた大腸菌ＪＭ１０９の形質転換及び、該形質転換菌の
分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで一
連のミニ・プレバレージョン操作を実施し、それぞれの
液体培地からプラスミドを抽出した。

次いで、各プラスミドに対して、ＢａｍＨＩによる切断
反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、ＨＴＬＶ
４５’　−３′断片を含むＸｂａｌ　−Ｘｂａｌ　Ｄ　
Ｎ　ＡがｐＢＦ１３３に正しい方向に挿入されているプ
ラスミドを確認した。

ごの確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る液体培地から０．２　ｍＺを採取し、アンピシリン３
０μｇ／−を含むＬＢ液体培地５０ｎｔｆに接種後、３
７°Ｃで１２時間培養した。

該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ーＢａｍＨＩ　Ｅｎｖ（６００）／ｐＢＦ１３３２００
μｇを得た。この組換えベクターＢａｍ１ｌＩ　Ｅｎｖ
（６００）／ｐＢＦ１３３はＥ、ｃｏｌｉに導入し、得
られる微生物をＥ、ｃｏｌｉｌｌＴＬＶ−１−Ｅｎｖｌ
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄
託番号は微工研菌寄第１００７２号（ＦＲＥＭ　Ｐ−１
００７２）である。以上の工程を第８図に示す。

（Ｍｉ換えウィルスの製造） ＢｍＮＰＶ　Ｔ　３株のウィルスＤＮＡと前記組換えベ
クターＢａｍｔ（Ｉ　Ｅｎｖ（６００）／ｐＢＦ１３３
とが１　：　１００のモ、ル比に調合された第１表の組
成液１２４５μ２を、第１表の組成液■２５５μでと混
合した。

（本頁以下余白） 第 表 生じた懸濁液０．５　ｍｌをＴＣ−１０（第２表）の培
地のカイコ樹立培養細胞ＢｍＮＪ液（４Ｘ１０５Ｂｍｃ
ｅｌｌｓ／＋＋ｓｆ）５ｍｌに加え、２７°Ｃｌ２Ｏ時
間の培養により、ＢａｍｔｌＩＥｎｖ（６００）／ｐＢ
Ｆ１３３とＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａのカイコ樹立細胞へ
の導入を行った。得られた培養物は、更にＴＣ１０培地
の交換を行った後、２７°Ｃで６日間培養した。次いで
この培養物を遠心分離（１５００ｒρｍ、１０分間）し
、得られた上清を組換えウィルスのクローニング用反応
液とした。

該クローニング用反応液をＴＣ−１０培地で１０−６１
０−７．１０−＠に希釈し、それぞれ１０ｒｎｌの希釈
反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカイコ
樹立培養細胞８ｍＮｄ液（１０５Ｂｍｃｅｌｌｓ／ｍＺ
）　１０−を混合し、該混合液を２００μρずつ９６穴
のマイクロタイター・トレーの中に分注し、２７°Ｃで
４日間培養した。４日間培養後、マイクロタイター・ト
レーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウィルスが感染し
た形態を示しているカイコ樹立培養細胞で且つ該細胞内
に多角体蛋白が検出されないウェルを見い出し、そこか
ら培養物を回収した。得られた培養物を遠心分離（１５
００ｒｐｍ、　１０分）し、上清１５０ｕｆを組換えウ
ィルスのポリペプチド発現用反応液とした。上記ＴＣ−
１０の培地は第２表の培地９００ｄをｐＨ６，３０〜６
．３５に調整し、濾過滅菌後、牛胎児血清１００ｍ１を
添加することにより調製される。

第 培−実ｍｌ−戊 ａＣＩ Ｃｌ ＣａＣ１ｚ　　’　　２ＨｚＯ ＭｇＣＩ□　・　６ＨｚＯ ＭｇＣＩ□　・　７Ｈ２０ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ デキストロース （ｇｌｕｃｏｓｅ） ［、−ｇｌ　ｕ　ｔａｌｌＬｉｎｅ ｓｏｌｎ　　Ａ” ５ｏｌｎ　Ｒ” ５ｏｌｎＣＩｌｌｌｌｌ Ｎａｌ＋ｚＰＯｎ　　・２Ｈ２０ （０，８９１ｇ／１００　ｍｌ） ＮａＨＣＯ：＋ （０，３５ｇ／１００滅） ０．５ｇ ２．８７ｇ １．３２ｇ ２、２８ｇ ２、７８ｇ ２．０ｇ １．１ｇ ０．３ｇ ００ｍ１ ００ｍｆ ｍ１ ００ｍｌ１ １００戒 Ｈ２Ｏで全ｆｆ１９００ｄとする ２１江り大Ｊη１戊 り−４ｒｇｉｎｍｅ Ｌ−八５ｐａｔｉｃ　　ａｃｉｄ Ｌ−八５ｐａｒａ８ｉｎｅ　　　９　　ＨｚＯＬ−八１
ａｎｉｎｅ β−Ａｌａｎｉｎｅ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｃ　ａｃｉｄ Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｌ　−Ｈｌｓｔｉｄｉｎｅ Ｌ−Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ し−Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ Ｌ　−Ｍｃｔｈｉｏｕｉｎｅ ［、−Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａ　ａｎｉｎｅ ＤＬ−５ｅｒｕｎｅ Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｍｅ ＋１ＣＩ ５．７９ｇ ３．５ｇ ３．９８ｇ ２、２５ｇ ２．０ｇ ６．０ｇ ３．０ｇ ６．５ｇ ２５．０ｇ ｏ、５ｇ ０．７５ｇ ６．２５ｇ ０．５ｇ ３．５ｇ １．５ｇ １１．０ｇ １．７５ｇ １１□０で全量１０００ｉ１とする 叩」壮し工ｍ収 Ｌ　−Ｃｙｓｔｉｎｅ Ｌ　−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ ０．２５ｇ １．０ｇ ）１２０で全量１０００戚とする 叩Ｖ匪罰」」λ１成 Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣＩ Ｒｉｂｏｆｌａｖｉｎｅ Ｄ−Ｃａ　　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅＰｒｙｄｏｘｉ
ｎｅ　　−ＨＣＩ Ｐａｒａ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄＦｏ
ｌｉｃ　　ａｃｉｄ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ Ｉｓｏｉｕｏｓｉｔｏｌ １ｏｔｉｎ Ｃｈｏｌｉｖｅ　　Ｃｌ Ｉｈ０で全量１０１００Ｏとする ２、０ｍｇ ２　、０　ｍｇ ２．０ｍｇ ２．０■ ２．０ｍｇ ２．０ｍｇ ２．０ｍｇ ２　、０　ｍｇ １．０ｍｇ ２０．０ｍｇ （ポリペプチドの製造） 上記ポリペプチド発現用反応液１００μ２をカイコ培養
細胞８ｍＮｄ液（１０５Ｂｍｃｅｌ　Ｉｓ／　ｍ／　）
　３０−に添加し、２７°Ｃ，５日間培養した。５日間
培養後、培養物を回収し、遠心分離（１５００ｒｐｍ、
　１５分）した。

沈澱物を（ウィルス成熟細胞）をＰＢＳ緩衝液で洗浄し
５（］ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４）　４００
ｕ　ｌに懸濁、ソニケーション後、遠心分離（８０００
ｒｐｍ、　２０分）した。沈澱物として得られたポリペ
プチドにレムリ緩衝液２００μ２を添加、懸濁したもの
を、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳゲル電気泳動の試料
とした。

ＳＤＳゲル電気泳動の結果、この試料は、ｐＢＦ１３３
の存す多角体蛋白遺伝子部分がコードする多角体蛋白の
一部（約５　Ｋｄ）とＨＴＬＶ−１５’　−３′断片が
コードするＨＴＬＶ−１外皮蛋白ノル２１含有部（約２
０Ｋｄ）の合計分子量にあたる約２５Ｋｄの位置にハン
ドが検出された（第４図に図示）。なお、第４図は、８
ｍ細胞内でのＨＴＬシー１　ｅｎｖ蛋白発現をＳＤＳゲ
ル電気泳動で確認したものである。第４図において１ａ
ｎｅ１はサイズマーカー、１ａｎｅ　２は非惑染カイコ
細胞の蛋白１ａｎｅ　３はＢａｍ１（Ｉ　Ｅｎｖ（０，
６）／ｐＢＦ１３３を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

一次抗体として抗多角体蛋白抗体及びＨＴＬＶ−１ｐ２
１に対するモノクローナル抗体を使用したウェスタン・
プロット実験で、２５Ｋｄのポリペプチドが多角体蛋白
とＨＴＬＶ−１ｐ２１とを含む融合蛋白であることを確
認した。又、同時に一次抗体として、正常人血清又は、
ＡＴＬ患者血清を使用したウェスタン・プロット実験を
行い、該２５ＫｄのポリペプチドがＨＴＬＶ−１に対す
る抗体に対して良好な抗原性を有していることが確認で
きた（第５図に図示）。

なお、第５図は、ＢＩ１１細胞内でのＨＴＬＶ−ｒ　ｅ
ｎｖ蛋白発現をウェスタン・プロット法で確認したもの
である。１ａｎｅ　１はサイズマーカー、１ａｎｅ　２
〜１ａｎｅ　５は抗原としてＢａｍＨＩ　Ｅｎｖ（６０
０）／ｐＢＦ１３３を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

ウェスタン・プロッティングは、第３表に示した一次抗
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたペルオキシダーゼによる呈色反応で行なった。

第 表 ）内は希釈率を示した 製造例２ 製造例１で得たポリペプチド発現用反応液１００ｕｐを
カイコ樹立培養細胞液（ｌｏ５Ｂｍｃｅｌｌｓ／ｍ／）
　３０ｍ１に添加し、２７°Ｃ，５日間培養した。５日
間培養後、培養物を回収し遠心分離（１５００ｒｐｍ、
　１５分）した。上清を０．１−ずつ５令１日目のカイ
コ１００匹にそれぞれ経皮的に注入し、２５°Ｃで５日
間、桑葉のペースト片を与えて飼育後、解剖し、脂肪体
を集めた。該脂肪体にＰＢＳ緩衝液ｔｏｉを加え懸濁し
、ソニケーション後、遠心分離（８０００ｒｐｍ、　２
０分）し、沈澱？１５−を取得した。該沈澱物２００μ
２を再度ソニケーションし、Ｂｉｏ−ＲＡＤプロティン
・アッセイにより、ポリペプチド量を測定した結果６０
μｇであった。

ポリペプチド盪測定後、５０μ２をレムリ緩衝液５０μ
りに懸濁し、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳゲル電気泳
動の試料とした。

ＳＤＳ電気泳動の結果、分子量的２５Ｋｄの位置にバン
ドが検出された、実施例４と同様な方法により、この２
５Ｋｄのポリペプチドが多角体蛋白とＨＴＬＶＩ　ｐ２
１とを含む融合蛋白で、ＨＴＬシー■の抗体に対して良
好な抗原性を有していることを確認した。

（本頁以下余白） 第 表 第５表 １ｍ門　　　ＡＴＰ 実施例１ 特開昭６２−２８６５３３号公報実施例１の方法に従っ
て、複合重合体粒子を製造した。即ち、撹拌機付きガラ
ス製フラスコ中にメタノール２８００ｃｃ、アンモニア
水（２５重量％）６１６ｃｃ、水酸化ナトリウム水溶液
（５モル／Ｎ）２１ｃｃを加え１０°Ｃに保った後に、
テトラエチルシリケートのメタノール溶液（２２％）１
４２８ｃｃを攪拌しながら２５．５ｃｃ／ｈｒの滴下速
度で添加して反応した。その後シリカ粒子を大量のメタ
ノール中でデカンテーションを繰り返して精製した。

得られたシリカ粒子を沈降させ、上清をのぞき、蒸留水
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を２回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度１０ｗｔ％になるよう
に蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。

攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、上記
で得られたシリカ分散液１００ｍｆｆ１を加えて４０°
Ｃに保ち、窒素雰囲気下、攪拌下にロアミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを２．９ミリ
モル／２となるように添加した。次いで４０°Ｃに保温
し攪拌下４時間重合を行った。重合後、遠心分離で上清
を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させ
た。この操作を６回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した
複合重合体粒子を得た。

次いで、該複合重合体粒子の０．０２Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ緩
衝液（ｐＨ７，２）への５％分散液を、前記製造例２に
従って得たポリペプチドが１０Ｍｇ７ｍｌの濃度で１％
ＳＤＳ含有ＬＭ　Ｔｈ１ｓ−１１ｃＩ（ｐＨ７，４））
１街液に懸濁している懸濁液と等量混合した。室温下で
１時間の放置後、０．０２Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓ緩衝液（ｐＨ
７，２）を用いた遠心分離により粒子の洗浄を行い、得
られたポリペプチド感作粒子が５％濃度で分散した溶液
を調合した。

ＡＴＬ患者血清、正常ヒト血清、全身性エリテマ１−−
デス患者血゛清、原発性胆汁性肝硬変患者血清、リウマ
チ患者血清のそれぞれの被検液につき、２倍希釈液を原
液とし倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液（ｐＨ７，２）
を用いた希釈を行い、各希釈液をマイクロタイタープレ
ートのウェル中に２５μ２ずつ加えた。次いで、前記調
合した感作粒子溶液を、該ウェル中に２５μｌずつ加え
ていき、３分間の攪拌の後室温下で放置した。３０分後
、粒子の凝集状態を観察し各被検液ごとで、粒子リング
が明らかに太き（、リング内に凝集粒子が膜状に広がっ
ているものが認められるウェルにおける希釈液の最高希
釈倍数をもとめ、鋭敏性を評価した。そして、抗体価が
８以上になる被検液を陽性であると診断した。以上の結
果を第６表に示す。

（本頁以下余白） 第 表 比較例１ ＭＴ−２細胞（Ｇａｎｎ　７２巻９８９頁１９８１年）
を１０％仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地（Ｍ
ＡＢ社製Ｎｏ、５３００５８９１）で３７°Ｃにて３日
間培養した。その後、該培養上清を１０．ＯＯＯｒｐｍ
、　３０分間遠心分離し、上清を回収し、該回収した上
清をｔｏｏ、　０００ｇで２時間超遠心分離し、沈渣を
得た。該沈渣を０．０１Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（
ｐＨ７，４）（１００ｍＭ　ＮａＣ１１０ｍＭ　ＥＤＴ
Ａを含む）で溶解した後、３０，０００ｒｐｎ＋、　１
時間遠心分離し、謹上清を回収した。２０−６５％のシ
ョ糖密度勾配液を作成し、それに上記上清を層積し、３
０．ＯＯＯｒｐｍで１８時間超遠心処理し、ＭＴ−２細
胞の可溶性細胞質蛋白液を得た。次いで、製造例２で得
たポリペプチドに変えて、上記可溶性細胞蛋白を用いる
以外は、実施例１と同様な方法で、各種被検液のＩＩＴ
ＬＶ−１ｉ染の診断を行なった。結果を第７表に示す。

（本頁以下余白） 第 表 実施例２ 製造例２に従って得たポリペプチドを００２８０値が０
．４となるように１％ＳＤＳ含有Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−１
１ｃＩ（ｐＨ７，４）緩衝液に希釈し、エンザイムイム
ノアッセイ用マイクロタイターのカップに１５０ｍｆｆ
１加えた。

４°Ｃで１夜間放置し、その後排液し、脱イオン水にて
カップを洗浄した。こうして得られたポリペプチドが感
作したエンザイムイムノアッセイ用マイクロタイターの
カップに、実施例１で使用した各種被検液のＰＢＳ緩衝
液による１００倍希釈液を１００μｌ加えた。３７°Ｃ
で１時間放置した後、脱イオン水にてカップを洗浄し、
抗ヒトｒｇＧ抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲ
ートのリン酸緩衝液溶液１００μ２を加えた。３７°Ｃ
で１時間放置後、脱イオン水にてカップを洗浄し、基質
（ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを４■／　ｍｌと
なるように４　ｍＭ　ＭｇＣｌ□含有炭酸緩衝液（ｐＨ
９，５）に溶解したもの）１００μ！を加えた。３７°
Ｃで１時間放置後、ＩＮ　ＮａＯＨ１００μｌを加えて
反応を停止し、０口、。、値を求めた。該ｏｏ、。、値
が０．０７以上となるものを陽性の被検液であると診断
したところ、実施例１と同一の診断結果が得られた。

実施例３ 製造例１に従って得たポリペプチドのＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気床動を行った後、実施例１で用いた各
種被検液の３％牛アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）による１０倍希釈液を一次抗体として、エンザイ
ムイムノアッセイによるウェスタン・プロット実験を行
なった。尚、転写用膜には、ニトロセルロース膜を使用
し、二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社製　Ｎｏ、５Ｏ−０４１０−０６
）　とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ（Ｖｅｃ
ｔｏｒ社製　Ｎｏ、５Ｏ−０４１０−０３）の１：１混
合液を使用した。また、呈色液には、０．０５ｍｏｌ　
Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ７，２）２０ｍｌ、　３
．３′−ジアミノベンジジン４塩酸塩１０ｍｇ、３０％
過酸化水素水１０μ℃の組成のペルオキシダーゼ用呈色
液を使用した。呈色してバンドが認められたものの、−
次抗体に使用した被検液を、陽性と診断したところ、実
施例１と同一の診断結果が得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はカイコ核多角体病ウィルスのＤＮＡの制限酵素
地図、第２図はｐＢＦベクターの制限酵素地図、第３図
はｐＢＦベクターの種類、第４図は８ｍ細胞内でのＨＴ
ＬＶ蛋白発現をＳＤＳゲル電気末動で確認した図、第５
図は８ｍ細胞内でのｔｔＴＬＶ−Ｉ　ｅｎｖ蛋白発現を
ウェスタン・プロット法で確認した図、第６図はカイコ
核多角体席ウィルス及び組換えウィルスが感染したカイ
コ細胞、第７図はＨＴＬシー■ｅｎｖ蛋白遺伝子由来の
ＤＮＡの調製法、第８図は組換えベクターの調製法をそ
れぞれ示す、第９図はｆｌＴＬＶ４　ｅｎｖ遺伝子配列
のうちのｐ２１蛋白部分の遺伝子及びアミノ酸配列図を
示す。 ｌｉｄ　ｌｌｌ−・・旧ｎｄＩＩＩ　、　Ｎ−ＮｃｏＩ
、　　八ｃ−Ａｃｃｌ、　　Ｅｃ−ＥｃｏＲＩＸＳｐ−
５ｐｈｌ、Ｓａ　−Ｓａ　Ｉ　Ｉ、旧ＩＴ　・＝Ｈｉｎ
ｃ　ＩＩ、Ｂ　＝４ａｍｌｌｌ、　Ｘ　・”ＸｂａＩ。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 成人Ｔ細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来するＤ
   ＮＡのうち、ｐ２１をコードするＤＮＡを含み、且つ該
   ＤＮＡの５′末端から上流の１７塩基対以内で切断され
   た断片により、カイコ核多角体病ウィルスの多角体蛋白
   構造遺伝子の一部の組換えを行い、次いで該組換えウィ
   ルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させて
   発現されたポリペプチドを抗原とする成人Ｔ細胞白血病
   ウィルス感染診断薬。