JPH02103471A - 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 - Google Patents
成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬Info
- Publication number
- JPH02103471A JPH02103471A JP19798489A JP19798489A JPH02103471A JP H02103471 A JPH02103471 A JP H02103471A JP 19798489 A JP19798489 A JP 19798489A JP 19798489 A JP19798489 A JP 19798489A JP H02103471 A JPH02103471 A JP H02103471A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- silkworm
- virus
- dna
- fragment
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 60
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 title claims abstract description 16
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 title claims abstract description 16
- 208000009746 Adult T-Cell Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000016683 Adult T-cell leukemia/lymphoma Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 201000006966 adult T-cell leukemia Diseases 0.000 title claims abstract description 9
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 title description 22
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 241000255789 Bombyx mori Species 0.000 claims abstract description 70
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 57
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 56
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 56
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 52
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 43
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 20
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 74
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 7
- 241000701366 unidentified nuclear polyhedrosis viruses Species 0.000 claims description 6
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 claims 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 65
- 238000010367 cloning Methods 0.000 abstract description 12
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 abstract description 5
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 4
- 230000006798 recombination Effects 0.000 abstract description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 abstract description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000010903 husk Substances 0.000 abstract 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 47
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 36
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 25
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 25
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 25
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 21
- 241000409811 Bombyx mori nucleopolyhedrovirus Species 0.000 description 20
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 17
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 14
- 239000002585 base Substances 0.000 description 12
- 108010078428 env Gene Products Proteins 0.000 description 12
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 206010020460 Human T-cell lymphotropic virus type I infection Diseases 0.000 description 9
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 9
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 9
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 9
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 9
- 102100034353 Integrase Human genes 0.000 description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 6
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 6
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002468 fat body Anatomy 0.000 description 6
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 5
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 5
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 5
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 4
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 4
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 4
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 3
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzoic acid Chemical compound NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 ALYNCZNDIQEVRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 241000255791 Bombyx Species 0.000 description 2
- 101100313164 Caenorhabditis elegans sea-1 gene Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000666657 Homo sapiens Rho-related GTP-binding protein RhoQ Proteins 0.000 description 2
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 102100038339 Rho-related GTP-binding protein RhoQ Human genes 0.000 description 2
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 108700004025 env Genes Proteins 0.000 description 2
- 101150030339 env gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 2
- 210000003127 knee Anatomy 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 2
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 description 2
- XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O XDIYNQZUNSSENW-UUBOPVPUSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 1-O-galloyl-3,6-(R)-HHDP-beta-D-glucose Natural products OC1C(O2)COC(=O)C3=CC(O)=C(O)C(O)=C3C3=C(O)C(O)=C(O)C=C3C(=O)OC1C(O)C2OC(=O)C1=CC(O)=C(O)C(O)=C1 TUSDEZXZIZRFGC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRIMLDXJAPZHJE-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(O)CO QRIMLDXJAPZHJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WRRQKFXVKRQPDB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-aminophenyl)sulfanylaniline Chemical compound NC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC=C1N WRRQKFXVKRQPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- FISSZNVLAUEXSO-UHFFFAOYSA-N C(C(=C)C)(=O)OCCOC(C(=C)C)=O.C(=O)C=C Chemical compound C(C(=C)C)(=O)OCCOC(C(=C)C)=O.C(=O)C=C FISSZNVLAUEXSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910021555 Chromium Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000501458 Cultus Species 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 239000001263 FEMA 3042 Substances 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 101150098499 III gene Proteins 0.000 description 1
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010086093 Mung Bean Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N Penta-digallate-beta-D-glucose Natural products OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-PPKXGCFTSA-N 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 description 1
- FCASKLHVRFDIJB-UHFFFAOYSA-N Riboflavine Natural products Cc1cc2N=C3C(NC(=O)NC3=O)N(CC(O)C(O)C(O)CO)c2cc1C FCASKLHVRFDIJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N Tetraethyl orthosilicate Chemical compound CCO[Si](OCC)(OCC)OCC BOTDANWDWHJENH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N [[4-(4-diazonioiminocyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)cyclohexa-2,5-dien-1-ylidene]hydrazinylidene]azanide Chemical compound C1=CC(N=[N+]=[N-])=CC=C1C1=CC=C(N=[N+]=[N-])C=C1 XUGUHTGSMPZQIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003276 anti-hypertensive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- QSWDMMVNRMROPK-UHFFFAOYSA-K chromium(3+) trichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Cl-].[Cr+3] QSWDMMVNRMROPK-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- PYRZPBDTPRQYKG-UHFFFAOYSA-N cyclopentene-1-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1=CCCC1 PYRZPBDTPRQYKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000002224 dissection Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005520 electrodynamics Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000007720 emulsion polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010954 inorganic particle Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001968 nicotinic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011664 nicotinic acid Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000011146 organic particle Substances 0.000 description 1
- 229920000620 organic polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 229920002454 poly(glycidyl methacrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000010926 purge Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 150000004053 quinones Chemical class 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000384 rearing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000009366 sericulture Methods 0.000 description 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229920003048 styrene butadiene rubber Polymers 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003760 tallow Substances 0.000 description 1
- 229920002258 tannic acid Polymers 0.000 description 1
- LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N tannic acid Chemical compound OC1=C(O)C(O)=CC(C(=O)OC=2C(=C(O)C=C(C=2)C(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)[C@@H](OC(=O)C=3C=C(OC(=O)C=4C=C(O)C(O)=C(O)C=4)C(O)=C(O)C=3)O2)OC(=O)C=2C=C(OC(=O)C=3C=C(O)C(O)=C(O)C=3)C(O)=C(O)C=2)O)=C1 LRBQNJMCXXYXIU-NRMVVENXSA-N 0.000 description 1
- 229940033123 tannic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000015523 tannic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N toluene 2,4-diisocyanate Chemical compound CC1=CC=C(N=C=O)C=C1N=C=O DVKJHBMWWAPEIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、成人下細胞白血病(八dult Tcell
leukemia ;以下ATLと略記する)の病因と
なる成人T細胞白血病ウィルス(Human Tcel
l leukemiavirus−I :以下+1TL
V−1と略記する)の、膜中及び膜の内側に位置する蛋
白であるp21の抗体に対して抗原性を有するポリペプ
チドを抗原として用いる新規なHTLV−1感染診断薬
に関する。
leukemia ;以下ATLと略記する)の病因と
なる成人T細胞白血病ウィルス(Human Tcel
l leukemiavirus−I :以下+1TL
V−1と略記する)の、膜中及び膜の内側に位置する蛋
白であるp21の抗体に対して抗原性を有するポリペプ
チドを抗原として用いる新規なHTLV−1感染診断薬
に関する。
〔従来の技術)
ATLは、成人が罹病する悪性の疾患であり、その病因
はI(TLV−Iの感染によるもので、感染者のうち0
.1%前後の頻度で発病することが知られている。この
HTLV−Iの感染経路としては、輸血感染、母子感染
、性的感染等が知られており、HTLV−I感染者を早
期発見し、こうした感染の防止に努めることが望まれて
いる。
はI(TLV−Iの感染によるもので、感染者のうち0
.1%前後の頻度で発病することが知られている。この
HTLV−Iの感染経路としては、輸血感染、母子感染
、性的感染等が知られており、HTLV−I感染者を早
期発見し、こうした感染の防止に努めることが望まれて
いる。
従来、こうしたIITLV−[感染診断薬としては、I
ITLV−1に感染した場合に血漿又は血清中に生ずる
成人T細胞白血病関連抗原に対する抗体の検出を、成人
T細胞白血病関連抗原産生細胞の可溶性細胞蛋白質及び
)ITLV−1の可溶化処理蛋白から選ばれた少なくと
も1種(特開昭58−187861号公報)、或いは該
細胞を界面活性剤により処理して得た抗原蛋白及びII
TLV−1ウィルス粒子を利用して行うもの(特開昭5
9−62527号公報)が知られている。
ITLV−1に感染した場合に血漿又は血清中に生ずる
成人T細胞白血病関連抗原に対する抗体の検出を、成人
T細胞白血病関連抗原産生細胞の可溶性細胞蛋白質及び
)ITLV−1の可溶化処理蛋白から選ばれた少なくと
も1種(特開昭58−187861号公報)、或いは該
細胞を界面活性剤により処理して得た抗原蛋白及びII
TLV−1ウィルス粒子を利用して行うもの(特開昭5
9−62527号公報)が知られている。
しかしながら、該診断薬は、T細胞膜、核等、成人T細
胞白血病関連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも
含んでおり、かかる抗原の非特異的免疫反応によりいわ
ゆる偽陽性の検体が生じ、HTLV−1感染の診断精度
が低下するという問題があった。
胞白血病関連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも
含んでおり、かかる抗原の非特異的免疫反応によりいわ
ゆる偽陽性の検体が生じ、HTLV−1感染の診断精度
が低下するという問題があった。
また、HTLV−1に対する抗体に対して抗原性を有す
るポリペプチドを生産するために、IITLV−1の外
皮蛋白(envelope protein ;以下
env蛋白と略記する)の遺伝子で組換えられた大腸菌
を増殖させ、産生ずるポリペプチドを回収する方法が試
みられている。
るポリペプチドを生産するために、IITLV−1の外
皮蛋白(envelope protein ;以下
env蛋白と略記する)の遺伝子で組換えられた大腸菌
を増殖させ、産生ずるポリペプチドを回収する方法が試
みられている。
しかしながら、上記方法によって得られるポリペプチド
は、HTLV−Iに対する抗体に対して抗原性が低いも
のであった。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポ
リペプチドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないこと
によるものと推定される。
は、HTLV−Iに対する抗体に対して抗原性が低いも
のであった。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポ
リペプチドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないこと
によるものと推定される。
一方、診断薬として有用な蛋白の構造遺伝子をカイコ核
多角体病ウィルスDNAの多角体蛋白構造遺伝子部分に
組み換えた組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又は
カイコ生体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、
特開昭62−208276号公報及び特開昭61−92
88号公報において知られている。
多角体病ウィルスDNAの多角体蛋白構造遺伝子部分に
組み換えた組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又は
カイコ生体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、
特開昭62−208276号公報及び特開昭61−92
88号公報において知られている。
ところが、これらの公報には、前記したIITLV−1
の抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記の方
法を適用することに関しては何の具体的な記載もない。
の抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記の方
法を適用することに関しては何の具体的な記載もない。
かかる方法によるHTLV−1の抗原蛋白であるポリペ
プチドを製造するには、HTLV−1の構造遺伝子のい
かなる部分によってカイコ核多角体病ウィルスDNAの
多角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これにより
ポリペプチドの産生が可能であるか、更にはポリペプチ
ドが得られた場合、該ポリペプチドがHTLV−1の抗
体に対して抗原性を有するかどうかに・ついては、更に
数多くの研究が必要であった。
プチドを製造するには、HTLV−1の構造遺伝子のい
かなる部分によってカイコ核多角体病ウィルスDNAの
多角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これにより
ポリペプチドの産生が可能であるか、更にはポリペプチ
ドが得られた場合、該ポリペプチドがHTLV−1の抗
体に対して抗原性を有するかどうかに・ついては、更に
数多くの研究が必要であった。
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を克服して、1
ITLV4に対する抗体に対して高い抗原性を有するポ
リペプチドを開発し、該ポリペプチドを抗原として用い
たIITLV−1感染の診断において極めて高感度で精
度良く診断できる診断薬を提供することにある。
ITLV4に対する抗体に対して高い抗原性を有するポ
リペプチドを開発し、該ポリペプチドを抗原として用い
たIITLV−1感染の診断において極めて高感度で精
度良く診断できる診断薬を提供することにある。
本発明者等は、HTLV−1惑染の診断において、高感
度で精度良く診断できる診断薬を間発すべ(鋭意研究を
重ねた。その結果、HTLV−1env蛋白遺伝子に由
来するDNAの特定の断片で、カイコ核多角体病ウィル
ス(Bombyx Nuclear Po1yhedr
osis Vi rus :以下、BmNPVと略記す
る)の多角体蛋白構造遺伝子の一部を、組換えた組換え
ウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
することによって発現させたポリペプチドを抗原として
用いることで、かかる目的が達成できることを見いだし
、本発明を完成するに至った。
度で精度良く診断できる診断薬を間発すべ(鋭意研究を
重ねた。その結果、HTLV−1env蛋白遺伝子に由
来するDNAの特定の断片で、カイコ核多角体病ウィル
ス(Bombyx Nuclear Po1yhedr
osis Vi rus :以下、BmNPVと略記す
る)の多角体蛋白構造遺伝子の一部を、組換えた組換え
ウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
することによって発現させたポリペプチドを抗原として
用いることで、かかる目的が達成できることを見いだし
、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、HTLシー1 env蛋白遺伝子に由
来するDNAのうち、p21をコードするDNAを含み
、且つXi D N Aの5′末端から上流の17塩基
対以内で切断された断片(以下、HTLV−15’ −
3′断片と略す)により、BmNPVの多角体蛋白構造
遺伝子の一部の組換えを行い、次いで、該組換えウィル
スをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させて発
現されたポリペプチドを抗原として用いたHTLV−I
感染診断薬に関するものである。
来するDNAのうち、p21をコードするDNAを含み
、且つXi D N Aの5′末端から上流の17塩基
対以内で切断された断片(以下、HTLV−15’ −
3′断片と略す)により、BmNPVの多角体蛋白構造
遺伝子の一部の組換えを行い、次いで、該組換えウィル
スをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させて発
現されたポリペプチドを抗原として用いたHTLV−I
感染診断薬に関するものである。
本発明の診断薬において、抗原として用いるポリペプチ
ドは、上記+1TLV−15’−3′断片により、Bm
NPVの多角体蛋白遺伝子の一部の組換えを行い、次い
で該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼
虫に感染させて発現されたものである。
ドは、上記+1TLV−15’−3′断片により、Bm
NPVの多角体蛋白遺伝子の一部の組換えを行い、次い
で該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼
虫に感染させて発現されたものである。
以下、該ポリペプチドの製法について詳細に説明する。
11組換えウィルスの製法
本発明において、上記ポリペプチドの製法に用いる組換
えウィルスの製法は特に制限されるものではない。代表
的な製法として、ATL患者末梢血からリンパ球を分離
し、該リンパ球から抽出したDNAよりIITLV−1
5’ −3’断片を切り出し、これをカイコ発現系ベク
ター(pBFヘクター)のクローニング部位に挿入して
、組換えベクターとし、次いで、該ベクターを用いてH
TLV−15’−3′断片をBIIINPνの多角体蛋
白構造遺伝子の一部と組換えることにより製造する方法
が挙げられる。
えウィルスの製法は特に制限されるものではない。代表
的な製法として、ATL患者末梢血からリンパ球を分離
し、該リンパ球から抽出したDNAよりIITLV−1
5’ −3’断片を切り出し、これをカイコ発現系ベク
ター(pBFヘクター)のクローニング部位に挿入して
、組換えベクターとし、次いで、該ベクターを用いてH
TLV−15’−3′断片をBIIINPνの多角体蛋
白構造遺伝子の一部と組換えることにより製造する方法
が挙げられる。
T I’BmNPV
本発明において、HTLV−I 5’ −3’断片によ
って組換えられるBmNPVは、養蚕業者に広く知られ
ているものであり、前用、古沢らが単離した代表的な株
としてT3株があり、この株のウィルスDNAは、米国
の八TCC(八merican Type Cu1tu
re Co11ecLion)にATCCNo、401
88として寄託されており、容易に入手し得る。又、B
mNPVに感染したカイコより公知の方法によって単離
することもできる。
って組換えられるBmNPVは、養蚕業者に広く知られ
ているものであり、前用、古沢らが単離した代表的な株
としてT3株があり、この株のウィルスDNAは、米国
の八TCC(八merican Type Cu1tu
re Co11ecLion)にATCCNo、401
88として寄託されており、容易に入手し得る。又、B
mNPVに感染したカイコより公知の方法によって単離
することもできる。
上記Bn+NPVのDNAは、第1図の制限酵素地図で
表わすことができる。
表わすことができる。
コ(7)BmNPV D N A (7)うち本発明に
おイテ、)ITLVl 5′−3′断片によって組換え
られる部分は、第1図に示される多角体蛋白遺伝子のう
ちプロモータ一部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一
部分である。
おイテ、)ITLVl 5′−3′断片によって組換え
られる部分は、第1図に示される多角体蛋白遺伝子のう
ちプロモータ一部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一
部分である。
1−2 11TLV−15′−3′ の ′。法+
1TLV−Tは遺伝子としてRNAを持つレトロウィル
スであり、感染細胞内でこの遺伝子RNAに由来して合
成されるDNAのenv遺伝子の塩基配列としては、5
eiki らが’Proc、 Natl、 Acad、
Sci。
1TLV−Tは遺伝子としてRNAを持つレトロウィル
スであり、感染細胞内でこの遺伝子RNAに由来して合
成されるDNAのenv遺伝子の塩基配列としては、5
eiki らが’Proc、 Natl、 Acad、
Sci。
tlsA 80’(1983)第3621頁で発表した
ものが知られている。
ものが知られている。
本発明において、HTLV−15’ −3′断片の取得
方法は特に制限されない。代表的な方法にはATL患者
末梢血中のリンパ球に所在するDNAから該HTLV4
5’ −3’断片を取得する方法が挙げられる。
方法は特に制限されない。代表的な方法にはATL患者
末梢血中のリンパ球に所在するDNAから該HTLV4
5’ −3’断片を取得する方法が挙げられる。
代表的な方法を例示すれば、まず、ATL患者末梢血か
らリンパ球を分離し、該リンパ球からDNAを抽出し、
次いで制限酵素EcoRIで切断し、約20キロ塩基対
断片を含むDNAを得、該DNAをシャロン(char
on) 4 AベクターのEcoRI制限酵素切断部位
に接続した後、IITLシー■のプロウィルスを含むフ
ァージをスクリーニングで単離し、該プロウィルスから
pUcベクターに代表される大腸菌のベクター基を使用
したサブ・クローニングおよび制限酵素による切断によ
りIITLV−15’ −3′断片を得る方法である。
らリンパ球を分離し、該リンパ球からDNAを抽出し、
次いで制限酵素EcoRIで切断し、約20キロ塩基対
断片を含むDNAを得、該DNAをシャロン(char
on) 4 AベクターのEcoRI制限酵素切断部位
に接続した後、IITLシー■のプロウィルスを含むフ
ァージをスクリーニングで単離し、該プロウィルスから
pUcベクターに代表される大腸菌のベクター基を使用
したサブ・クローニングおよび制限酵素による切断によ
りIITLV−15’ −3′断片を得る方法である。
)ITLV−15’ −3’断片は、t(TLV−T
env蛋白遺伝子に由来するDNAのうち、膜中及び膜
の内側に位置する蛋白であるp21をコードしているD
NA (第9図参照)を含み且つ、該DNAの5′末端
から上流の17塩基対以内で切断されたものであれば、
すべて適用できる。
env蛋白遺伝子に由来するDNAのうち、膜中及び膜
の内側に位置する蛋白であるp21をコードしているD
NA (第9図参照)を含み且つ、該DNAの5′末端
から上流の17塩基対以内で切断されたものであれば、
すべて適用できる。
なお、p21をコードしているDNA配列は、第9図に
示す通り、前記5eiki らが発表している)ITL
V−1env蛋白遺伝子配列の6116番目から664
3番目の配列がこれに相当し、又、5′末端から上流の
17塩基対は6099番目のものがこれに相当する。
示す通り、前記5eiki らが発表している)ITL
V−1env蛋白遺伝子配列の6116番目から664
3番目の配列がこれに相当し、又、5′末端から上流の
17塩基対は6099番目のものがこれに相当する。
本発明者等の知見によれば、上記HTLV45’ −3
′断片がp21をコードしているDNAを含んでいても
、該DNAの5′末端から上流に17塩基対より多くの
塩基対を含んでいる場合には、後記する方法により、該
断片を用いて得られたBmNPVの組換えウィルスを増
殖させてポリペプチドを産生じようとしても、ポリペプ
チドが得られなかったり、たとえ得られたとしてもHT
LV−Iのp21に対する抗体に対して抗原性を有さす
、本発明の目的を達成できないのである。
′断片がp21をコードしているDNAを含んでいても
、該DNAの5′末端から上流に17塩基対より多くの
塩基対を含んでいる場合には、後記する方法により、該
断片を用いて得られたBmNPVの組換えウィルスを増
殖させてポリペプチドを産生じようとしても、ポリペプ
チドが得られなかったり、たとえ得られたとしてもHT
LV−Iのp21に対する抗体に対して抗原性を有さす
、本発明の目的を達成できないのである。
好適なる部位を示せば、前記p21をコードしたDNA
の5′末端から上流に17塩基対隔てた位置よりGAT
Cと配列されているBamHE制限酵素切断部位が挙げ
られる。
の5′末端から上流に17塩基対隔てた位置よりGAT
Cと配列されているBamHE制限酵素切断部位が挙げ
られる。
本発明におイテ、前記HTLV−15’−3”断片は、
pBFベクターに組換えられた後、該組換えベクターに
よりBmNPVの多角体蛋白構造遺伝子の一部と組換え
て組換えウィルスとされる。組換えウィルス取得のため
に使用するpBFベクターは、第2図の制限酵素地図に
より特徴づけられるものである。即ちpBFヘクターは
、BmNPV D N A (7)多角体蛋白遺伝子の
プロモーター領域と多角体蛋白構造遺伝子前後付近及び
大腸菌のベクターであるpucヘクターの遺伝子とを含
むベクターである。
pBFベクターに組換えられた後、該組換えベクターに
よりBmNPVの多角体蛋白構造遺伝子の一部と組換え
て組換えウィルスとされる。組換えウィルス取得のため
に使用するpBFベクターは、第2図の制限酵素地図に
より特徴づけられるものである。即ちpBFヘクターは
、BmNPV D N A (7)多角体蛋白遺伝子の
プロモーター領域と多角体蛋白構造遺伝子前後付近及び
大腸菌のベクターであるpucヘクターの遺伝子とを含
むベクターである。
上記pBFベクターは、Xbal、 EcoRI、 5
tul制限酵素切断部位のクローニング部位がある。
tul制限酵素切断部位のクローニング部位がある。
かかるpBFヘクターは、そのクローニング部位の上流
に塩基配列ATGから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで種類があり、第3図に示すよ
うなpBF 4〜pBF133が存在している。
に塩基配列ATGから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで種類があり、第3図に示すよ
うなpBF 4〜pBF133が存在している。
組換えベクターの製造においては、上記ベクターのうち
、挿入するHTLV−[5’ −3′断片部分とpBF
ベクター上流部分とのリーディング・フレームが合うも
のであれば、どのベクターを使用してもよい。しかし、
5’−3’断片をカイコ樹立培養細胞及びカイコ幼虫で
効率よく発現できる組換えウィルスを作成するためには
、塩基配列ATGから開始されるBmNPV D N
A由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコードした遺伝
子部分を多く含んでいるpBFヘクター、例えばpBF
124. pBF129. pBF133等のpBFヘ
クターを使用するのが望ましい。
、挿入するHTLV−[5’ −3′断片部分とpBF
ベクター上流部分とのリーディング・フレームが合うも
のであれば、どのベクターを使用してもよい。しかし、
5’−3’断片をカイコ樹立培養細胞及びカイコ幼虫で
効率よく発現できる組換えウィルスを作成するためには
、塩基配列ATGから開始されるBmNPV D N
A由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコードした遺伝
子部分を多く含んでいるpBFヘクター、例えばpBF
124. pBF129. pBF133等のpBFヘ
クターを使用するのが望ましい。
上記pBFヘクターへのllTl、シー[5’ −3′
断片の挿入は、pBFヘクターのクローニング部位に存
在するEcoRI、 Xbal、 5tul制限酵素切
断部位を利用して行なえばよい。p肝ヘクタークローニ
ング部位に+1TLV−I 5’−3′断片を挿入する
には、DNA合成又は大腸菌のベクター基であるpUc
ヘクターへの挿入、切断等の公知の手段により、該断片
の両端にEcoRI、 ’Xbal或いは5tul制限
酵素切断部位を接続するか、該断片の5′端にEcoR
I、3′端に5jul制限酵素切断部位を接続するか、
更には該断片の5′端にXbal、 3′端に5jul
制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの操作が一般
に行われる。以上のうらでも、HTLV−15’ −3
”断片の両端にEC0RI II、12いはXha r
制限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。
断片の挿入は、pBFヘクターのクローニング部位に存
在するEcoRI、 Xbal、 5tul制限酵素切
断部位を利用して行なえばよい。p肝ヘクタークローニ
ング部位に+1TLV−I 5’−3′断片を挿入する
には、DNA合成又は大腸菌のベクター基であるpUc
ヘクターへの挿入、切断等の公知の手段により、該断片
の両端にEcoRI、 ’Xbal或いは5tul制限
酵素切断部位を接続するか、該断片の5′端にEcoR
I、3′端に5jul制限酵素切断部位を接続するか、
更には該断片の5′端にXbal、 3′端に5jul
制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの操作が一般
に行われる。以上のうらでも、HTLV−15’ −3
”断片の両端にEC0RI II、12いはXha r
制限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。
そして5’−3′断片の両端にEcoRI制限酵素切断
部位を接続する場合、該断片はpBFヘクターをEco
RI制限酵素で切断したものと接続する。又、+1TL
V−15’ −3′断片の両端ニXbal制限酵素切断
部位を接続した場合も同様に、該断片はpBFヘクター
をXba Iで切断したものと接続する。この場合接続
に際しては、予め制限酵素で切断したpBFベクターに
対し、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、pBF
ベクターのセルフライケーション(selfligat
ion)を避けることが好ましい。
部位を接続する場合、該断片はpBFヘクターをEco
RI制限酵素で切断したものと接続する。又、+1TL
V−15’ −3′断片の両端ニXbal制限酵素切断
部位を接続した場合も同様に、該断片はpBFヘクター
をXba Iで切断したものと接続する。この場合接続
に際しては、予め制限酵素で切断したpBFベクターに
対し、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、pBF
ベクターのセルフライケーション(selfligat
ion)を避けることが好ましい。
又、IITLV−[5’ −3′断片の5′端にEco
RI、3′端にS t u I IIJ f@酵素切断
部位を接続する場合、該断片は、pBFベクターをEc
oRI、 5tulで切断したものと接続し、HTI、
V−15”−3′断片の5′端にXba I、3′端に
5Lur制限酵素切断部位を接続する場合、該断片は、
pBFヘクターをXbal、 5tulで切断したもの
と接続すればよい。
RI、3′端にS t u I IIJ f@酵素切断
部位を接続する場合、該断片は、pBFベクターをEc
oRI、 5tulで切断したものと接続し、HTI、
V−15”−3′断片の5′端にXba I、3′端に
5Lur制限酵素切断部位を接続する場合、該断片は、
pBFヘクターをXbal、 5tulで切断したもの
と接続すればよい。
かかる接続方法は、リガーゼを用いて公知の方法により
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたpBF
ヘクターのDNAの最に対して、挿入すべき5’−3′
断片のDNA1が3〜8倍量になるように調整し、例え
ばT4DNAリガーゼを用いて接続する方法である。
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたpBF
ヘクターのDNAの最に対して、挿入すべき5’−3′
断片のDNA1が3〜8倍量になるように調整し、例え
ばT4DNAリガーゼを用いて接続する方法である。
上記(7) IITLV−15’ −3”断片を挿入し
たpBFヘクターの分離及び確認は、下記の方法により
行うことができる。
たpBFヘクターの分離及び確認は、下記の方法により
行うことができる。
即ち、分離は前記の接続反応液を5109株(宝酒造O
a製 No、9052) 、MV1184株(宝酒造■
製)で代表される大腸菌のコンピテントセルに加え、公
知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、pBFベクター
がアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることから、形質
転換後の液をアンピシリンを含んだI、B寒天培地に接
種し、室温以上の適当な温度、例えば37°Cで12時
間〜20時間培養して出現するシングル・コロニーを形
質転換株として取得するごとによって行うことができる
。
a製 No、9052) 、MV1184株(宝酒造■
製)で代表される大腸菌のコンピテントセルに加え、公
知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、pBFベクター
がアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることから、形質
転換後の液をアンピシリンを含んだI、B寒天培地に接
種し、室温以上の適当な温度、例えば37°Cで12時
間〜20時間培養して出現するシングル・コロニーを形
質転換株として取得するごとによって行うことができる
。
また、H且シー15’ −3′断片を挿入したpBFヘ
クターの確認は、形質転換株に存在する組換えベクター
ボイリング法(boiliB法)或いはアルカリ・リシ
ス法(alkali 1ysis法)を用いてミニ・プ
レバレージョン(mini preparation)
L、組換えベクター懸濁液を取得し、このようにして
調製した組換えベクター懸濁液をHTLV−15’ −
3”断片が挿入されていることが確認できる任意の制限
酵素、例えばEcoRr、 Xbarで切断し、切断物
をアガロースゲル電気泳動し、エチジウム・ブロマイド
による染色後、予想できる位置にハンドが存在するか否
かを確認することによって行うことができる。尚、5′
3′断片の両端をEcoRI或いはXba I制限酵素
切断部位にしたものをpBF ベクターのEcoRI、
Xbal制限酵素切断部位に挿入した組換えベクター
の場合は、pBFベクターの上流部分と挿入する5’−
3′断片が正しい方向に結合しているかどうか確認でき
る制限酵素、例えば、BamHI、 Xhol等で切断
し、その切断物を同様にアガロースゲル電気泳動し、エ
チジウム・ブロマイドによる染色後、予想できる位置に
ハンドが存在するか否かも同時に確認するとよい。
クターの確認は、形質転換株に存在する組換えベクター
ボイリング法(boiliB法)或いはアルカリ・リシ
ス法(alkali 1ysis法)を用いてミニ・プ
レバレージョン(mini preparation)
L、組換えベクター懸濁液を取得し、このようにして
調製した組換えベクター懸濁液をHTLV−15’ −
3”断片が挿入されていることが確認できる任意の制限
酵素、例えばEcoRr、 Xbarで切断し、切断物
をアガロースゲル電気泳動し、エチジウム・ブロマイド
による染色後、予想できる位置にハンドが存在するか否
かを確認することによって行うことができる。尚、5′
3′断片の両端をEcoRI或いはXba I制限酵素
切断部位にしたものをpBF ベクターのEcoRI、
Xbal制限酵素切断部位に挿入した組換えベクター
の場合は、pBFベクターの上流部分と挿入する5’−
3′断片が正しい方向に結合しているかどうか確認でき
る制限酵素、例えば、BamHI、 Xhol等で切断
し、その切断物を同様にアガロースゲル電気泳動し、エ
チジウム・ブロマイドによる染色後、予想できる位置に
ハンドが存在するか否かも同時に確認するとよい。
上記方法で形質転換株として分離した組換えベクターは
、該形質転換株を増殖させることにより、その量を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだLB液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば37°
Cで12時間〜20時間振盪培養し、該培養物からアル
カリ・リシス法(alkali 1ysis法)を用い
てミデイアム・プレバレージョン(mediurm p
reparation) シ、組換えベクター懸濁液
を取得することによって行うことができる。
、該形質転換株を増殖させることにより、その量を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだLB液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば37°
Cで12時間〜20時間振盪培養し、該培養物からアル
カリ・リシス法(alkali 1ysis法)を用い
てミデイアム・プレバレージョン(mediurm p
reparation) シ、組換えベクター懸濁液
を取得することによって行うことができる。
取得した組換えベクターも前記した方法と同様な方法で
再度目的の組換えベクターであるか否かを4Tt認する
ことが好ましい。
再度目的の組換えベクターであるか否かを4Tt認する
ことが好ましい。
得られた組換えベクター懸濁液は、アールエヌエース処
理(RNase処理)して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。
理(RNase処理)して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。
1−3− えウ ルスの 76
本発明におイテ、IITLV−15’−3′断片によッ
テ、多角体蛋白構造遺伝子の一部が組換えられた組換え
BmNPVは、BmNPV D N Aと前記組換えベ
クターとをカイコ樹立細胞にカルシウム沈澱法を用いて
、同時にトランスフェクション(コ・トランスフェクシ
ョン)し、組換えベクターとBmNPV D N A間
の対立遺伝子を置き換えることにより取得することがで
きる。
テ、多角体蛋白構造遺伝子の一部が組換えられた組換え
BmNPVは、BmNPV D N Aと前記組換えベ
クターとをカイコ樹立細胞にカルシウム沈澱法を用いて
、同時にトランスフェクション(コ・トランスフェクシ
ョン)し、組換えベクターとBmNPV D N A間
の対立遺伝子を置き換えることにより取得することがで
きる。
上記のコ・トランスフェクションは、具体的には、0.
25M塩化カルシウムおよびキャリヤD N Aの存在
下でBmNPV D N Aと組換えベクターDNAを
モル比1 : 100になる様に混ぜ、その後、該混合
液に、0.28M塩化ナトリウムを含むHEPES 1
1衝液(pH7,1)とリン酸緩衝液の混合液を添加し
、混和後、該混和液を8m培養細胞中に添加するという
前田、古沢らの方法(特公昭61−9297号公報)に
従って行なうことが望ましい。
25M塩化カルシウムおよびキャリヤD N Aの存在
下でBmNPV D N Aと組換えベクターDNAを
モル比1 : 100になる様に混ぜ、その後、該混合
液に、0.28M塩化ナトリウムを含むHEPES 1
1衝液(pH7,1)とリン酸緩衝液の混合液を添加し
、混和後、該混和液を8m培養細胞中に添加するという
前田、古沢らの方法(特公昭61−9297号公報)に
従って行なうことが望ましい。
コ・トランスフェクションした後、組換えウィルスを含
む反応液は室温付近の温度、例えば27°Cで5〜6日
間培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換え
ウィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェ
クションで得られた反応液の上清からの組換えウィルス
のクローニングは、プラークアッセイ法[J、5eri
c Sci、Jpn、53547(1984) :lや
リミッティング・ダイリューション法により組換えウィ
ルスを単離することによって行えばよい。どちらの方法
を使用しても良いが、操作法の容易さ、分離回数の少な
くて済む点から、リミッティング・ダイリューション法
を使用する方が良好である。
む反応液は室温付近の温度、例えば27°Cで5〜6日
間培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換え
ウィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェ
クションで得られた反応液の上清からの組換えウィルス
のクローニングは、プラークアッセイ法[J、5eri
c Sci、Jpn、53547(1984) :lや
リミッティング・ダイリューション法により組換えウィ
ルスを単離することによって行えばよい。どちらの方法
を使用しても良いが、操作法の容易さ、分離回数の少な
くて済む点から、リミッティング・ダイリューション法
を使用する方が良好である。
上記リミッティング・グイリュージョン法を使用しての
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と1×10S〜lXl06力イコ細胞数/mfカイコ
培養培地、好ましくはTC10培地(第2表参照)の濃
度で調整しであるカイコ樹立細胞液とを1:1で混合す
ることにより感染させ、この混合液をマイクロタイター
トレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度、例えば2
7゛Cで培養し、培養2〜7日後、マイクロタイタート
レー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られるカイコ細
胞の形状、形態で組換えウィルス存在の有無を判定する
。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の形態には、
第6図に示すように3種MG’ffi認できる。
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と1×10S〜lXl06力イコ細胞数/mfカイコ
培養培地、好ましくはTC10培地(第2表参照)の濃
度で調整しであるカイコ樹立細胞液とを1:1で混合す
ることにより感染させ、この混合液をマイクロタイター
トレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度、例えば2
7゛Cで培養し、培養2〜7日後、マイクロタイタート
レー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られるカイコ細
胞の形状、形態で組換えウィルス存在の有無を判定する
。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の形態には、
第6図に示すように3種MG’ffi認できる。
第6図におけるウィルスが感染した形態を示しているカ
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することにより組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるBmNPVと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・ダイリューションを繰り返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することにより組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるBmNPVと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・ダイリューションを繰り返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。
■、ポリペプチドの製法
=1 カイコ
本発明において組換えウィルスを感染させるカイコ樹立
培養細胞としては、BmNPVが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。
培養細胞としては、BmNPVが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。
BmNPVが増殖可能なカイコ樹立培養細胞には、Vo
lkmanル、E、+and Goldsmith、
P、八、(1982): Al)Tll。
lkmanル、E、+and Goldsmith、
P、八、(1982): Al)Tll。
Environ、Microbiol、、44.227
−233に示されているBm−N、 (ATCCNo、
CRL−8910)および前用らがBm−Nよりクロー
ニングしたBm・N2+ Bm・N4のようなセルライ
ンが知られている。BmNPVの増殖の良さ、扱いやす
さの点で、Bm−N4カイコ樹立培養細胞を使用するの
が適当である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は
、公知の培養条件、例えば、10%小牛脂児血清を含む
TC−10培地で27°C,4日間の条件で、培養した
ものを使用するのが適当である。
−233に示されているBm−N、 (ATCCNo、
CRL−8910)および前用らがBm−Nよりクロー
ニングしたBm・N2+ Bm・N4のようなセルライ
ンが知られている。BmNPVの増殖の良さ、扱いやす
さの点で、Bm−N4カイコ樹立培養細胞を使用するの
が適当である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は
、公知の培養条件、例えば、10%小牛脂児血清を含む
TC−10培地で27°C,4日間の条件で、培養した
ものを使用するのが適当である。
本発明において、目的とするポリペプチドは、前記組換
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。該組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物に組換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、27°
Cで数日間培養することによって行うことができる。
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。該組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物に組換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、27°
Cで数日間培養することによって行うことができる。
培養後、感染したカイコ樹立培養細胞培養物は、遠心分
離した後、沈澱した細胞は、tlTLV−1env蛋白
の発現確認及びHTLV−1enν蛋白の精製に使用し
、また、−上清はカイコ幼虫に感染させる組換えウィル
ス液として使用してもよい。
離した後、沈澱した細胞は、tlTLV−1env蛋白
の発現確認及びHTLV−1enν蛋白の精製に使用し
、また、−上清はカイコ幼虫に感染させる組換えウィル
ス液として使用してもよい。
また、組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法も
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ5令幼虫を使用するのが好ま、しい。カイコ幼虫
への感染は、前記のカイコ樹立培養細胞への感染で上清
として得られるウィルス力価を高めた組換えウィルス液
又は該操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に1
0〜100μ尼程注入することで行なうことができる。
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ5令幼虫を使用するのが好ま、しい。カイコ幼虫
への感染は、前記のカイコ樹立培養細胞への感染で上清
として得られるウィルス力価を高めた組換えウィルス液
又は該操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に1
0〜100μ尼程注入することで行なうことができる。
組換えウィルスを感染させた後、感染カイコを飼育する
ことで、組換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とHT
LV−1env蛋白の融合蛋白がカイコ幼虫の脂肪体内
に蓄積される。
ことで、組換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とHT
LV−1env蛋白の融合蛋白がカイコ幼虫の脂肪体内
に蓄積される。
カイコの飼育方法は、特に制限されないが、桑の葉或い
は桑の葉をホモジェネートし、滅菌後凍結乾燥したペー
スト様試料(協同試料I11社製等)に蒸留水を浸した
ものいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、27°
Cで培養する一般的な方法を採用すればよい。
は桑の葉をホモジェネートし、滅菌後凍結乾燥したペー
スト様試料(協同試料I11社製等)に蒸留水を浸した
ものいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、27°
Cで培養する一般的な方法を採用すればよい。
飼育期間は、カイコ幼虫が死亡する直前まで行なうこと
が好ましい。感染させる徂換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異なるが、感染して3日〜5日後
を飼育期間の目安とすることができる。
が好ましい。感染させる徂換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異なるが、感染して3日〜5日後
を飼育期間の目安とすることができる。
上記のカイコ幼虫から、脂肪体を取り出し、該脂肪体を
tlTLV−1env蛋白発現の確認およびIITLシ
ー■env蛋白の精製に用いる。
tlTLV−1env蛋白発現の確認およびIITLシ
ー■env蛋白の精製に用いる。
上記脂肪体の取得方法は、組換えウィルスを感染したカ
イコ幼虫を中腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、中腸等の器官を除去後、スパチュラ等で下
腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得す
る方法が推奨される。
イコ幼虫を中腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、中腸等の器官を除去後、スパチュラ等で下
腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得す
る方法が推奨される。
本発明において、前記方法で得られた組換えウィルス感
染カイコ樹立培養細胞及び組換えウィルス感染カイコ幼
虫の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限
されないが、例えば、PBS?1衝液等の中性緩衝液に
該カイコ樹立培養細胞又は脂肪体を懸濁し、ソニケーシ
ョンによる分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケー
ションした後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好
適である。
染カイコ樹立培養細胞及び組換えウィルス感染カイコ幼
虫の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限
されないが、例えば、PBS?1衝液等の中性緩衝液に
該カイコ樹立培養細胞又は脂肪体を懸濁し、ソニケーシ
ョンによる分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケー
ションした後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好
適である。
上記方法で得られたポリペプチドは、必要に応じてSD
S水溶液で溶解し、イオン交換樹脂による精製およびゲ
ル濾過による精製等の従来の方法により精製を行なった
後、本発明の診断薬の抗原として用いる。
S水溶液で溶解し、イオン交換樹脂による精製およびゲ
ル濾過による精製等の従来の方法により精製を行なった
後、本発明の診断薬の抗原として用いる。
尚、上記のポリペプチドはpBF133などの有す多角
体遺伝子部分がコードする多角体蛋白の一部とHTLV
−15′−3′断片がコードする、tlTLV−1en
v蛋白のうち膜中及び膜の内側に位置する蛋白であるp
21含有部分との融合蛋白であり、そのまま或いは目的
によって、化学的あるいは酵素的方法を組合わせて、多
角体蛋白を除くことにより更に精製して使用してもよい
。
体遺伝子部分がコードする多角体蛋白の一部とHTLV
−15′−3′断片がコードする、tlTLV−1en
v蛋白のうち膜中及び膜の内側に位置する蛋白であるp
21含有部分との融合蛋白であり、そのまま或いは目的
によって、化学的あるいは酵素的方法を組合わせて、多
角体蛋白を除くことにより更に精製して使用してもよい
。
多角体蛋白を除く方法を具体的に示せば、多角体蛋白と
ρ21をつなぐペプチド部分のアミノ酸配列を認識する
蛋白質分解酵素を使用して、その部分を切断後、ゲル濾
過等の分子訃の違いを利用した精製手段で精製するのが
良好である。
ρ21をつなぐペプチド部分のアミノ酸配列を認識する
蛋白質分解酵素を使用して、その部分を切断後、ゲル濾
過等の分子訃の違いを利用した精製手段で精製するのが
良好である。
次に、以上の製法により得られたポリペプチドを抗原に
用いたIITLシーI惑染者感染断薬について説明する
。
用いたIITLシーI惑染者感染断薬について説明する
。
即ち、本発明の診断薬は、上記ポリペプチドを抗原とし
、被検液中から該抗原と抗原−抗体反応を生じるp21
に対する抗体を、検出することでHTLV−Iへの感染
を診断するものである。従って、本発明の診断薬は、A
TL患者だけでなく、HTLV4に感染した結果、該p
21に対する抗体を保有している未発病者をも診断する
ものである。また、上記被検液には、例えばHTLV−
1への感染の診断を所望する検体者より常法に従い採血
した血液から分離された血漿又は血清、或いはこれを適
当な緩衝液で希釈したものが使用される。本発明におい
て、上記p21に対する抗体の検出は、上記ポリペプチ
ドを抗原として利用する限り特に制限されることなく公
知の免疫学的試験法が採用できる。好適に採用される方
法を例示すると、不溶性担体粒子に上記ポリペプチドを
感作し、抗原−抗体反応によって生じる該担体粒子の凝
集反応を検出する方法及びエンザイムイムノアッセイ法
等が挙げられる。
、被検液中から該抗原と抗原−抗体反応を生じるp21
に対する抗体を、検出することでHTLV−Iへの感染
を診断するものである。従って、本発明の診断薬は、A
TL患者だけでなく、HTLV4に感染した結果、該p
21に対する抗体を保有している未発病者をも診断する
ものである。また、上記被検液には、例えばHTLV−
1への感染の診断を所望する検体者より常法に従い採血
した血液から分離された血漿又は血清、或いはこれを適
当な緩衝液で希釈したものが使用される。本発明におい
て、上記p21に対する抗体の検出は、上記ポリペプチ
ドを抗原として利用する限り特に制限されることなく公
知の免疫学的試験法が採用できる。好適に採用される方
法を例示すると、不溶性担体粒子に上記ポリペプチドを
感作し、抗原−抗体反応によって生じる該担体粒子の凝
集反応を検出する方法及びエンザイムイムノアッセイ法
等が挙げられる。
また、製造した上記ポリペプチドが微量であったり、精
製不十分である場合には、ウェスタンブロンド法により
検出することが好ましい。以下、上記した各検出法につ
いて説明する。
製不十分である場合には、ウェスタンブロンド法により
検出することが好ましい。以下、上記した各検出法につ
いて説明する。
まず、上記凝集反応を検出する方法において、該凝集反
応は、マイクロタイタープレートのウェル中での粒子の
凝集状態を観察するマイクロタイター法、或いは凝集反
応の進行に伴い減少する測定系の透過率を測定する方法
等の公知の担体粒子凝集物の観察、定量方法により検出
できる。また、用いられる不溶性担体粒子は、抗原−抗
体反応に使用される公知のものが特に限定されることな
く使用される。好適に使用されるものを例示すると、ヒ
ト ヒツジ、ニワトリ等の動物赤血球、ポリスチレン、
スチレン−ブタジェン共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタク
リレート、ポリカーボネート等の乳化重合により得られ
る有機高分子ラテックス、無機化合物粒子が重合体層で
被覆された複合重合体粒子、ガラスピーズ、シラスポー
ラスガラス、シリカ、アルミナ等の無機有機粒子が挙げ
られる。このうち、マイクロタイター法の実施に際して
は、特開昭62−286533号公報に記載される複合
重合体粒子が、高い単粒子性を存し、非特異的な反応も
少ない為好ましい。上記不溶性担体粒子の平均粒子径は
、0.5〜3.0μm、好ましくは1.0〜2.0μm
のものが用いられる。上記不溶性担体粒子にポリペプチ
ドを感作する方法は、特に限定されることなく公知の抗
原感作方法が実施できる。好適な方法を例示すると、タ
ンニン酸。
応は、マイクロタイタープレートのウェル中での粒子の
凝集状態を観察するマイクロタイター法、或いは凝集反
応の進行に伴い減少する測定系の透過率を測定する方法
等の公知の担体粒子凝集物の観察、定量方法により検出
できる。また、用いられる不溶性担体粒子は、抗原−抗
体反応に使用される公知のものが特に限定されることな
く使用される。好適に使用されるものを例示すると、ヒ
ト ヒツジ、ニワトリ等の動物赤血球、ポリスチレン、
スチレン−ブタジェン共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタク
リレート、ポリカーボネート等の乳化重合により得られ
る有機高分子ラテックス、無機化合物粒子が重合体層で
被覆された複合重合体粒子、ガラスピーズ、シラスポー
ラスガラス、シリカ、アルミナ等の無機有機粒子が挙げ
られる。このうち、マイクロタイター法の実施に際して
は、特開昭62−286533号公報に記載される複合
重合体粒子が、高い単粒子性を存し、非特異的な反応も
少ない為好ましい。上記不溶性担体粒子の平均粒子径は
、0.5〜3.0μm、好ましくは1.0〜2.0μm
のものが用いられる。上記不溶性担体粒子にポリペプチ
ドを感作する方法は、特に限定されることなく公知の抗
原感作方法が実施できる。好適な方法を例示すると、タ
ンニン酸。
ゲルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジジン。
トリレンジイソシアネート、ジクロロニトロヘンゼン、
カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のカンプリ
ング剤を用いた化学的結合法、又は物理的吸着法等が挙
げられる。また、不溶性担体粒子−粒子当りに感作され
るポリペプチド量は、ポリペプチド(mg)/不溶性担
体粒子の表面積(1112)の比が0.1〜10■/
m Zの範囲にあることが好ましい。
カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のカンプリ
ング剤を用いた化学的結合法、又は物理的吸着法等が挙
げられる。また、不溶性担体粒子−粒子当りに感作され
るポリペプチド量は、ポリペプチド(mg)/不溶性担
体粒子の表面積(1112)の比が0.1〜10■/
m Zの範囲にあることが好ましい。
次に、エンザイムイムノアッセイ法は、固相に感作させ
た上記ポリペプチドと反応した被検液中のp21に対す
る抗体を、酵素を抗体に化学的に結合させた酵素標識抗
体を用いた直接法5間接法等により検出することで実施
できる。使用される固相は、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート、ポリプロピレンおよびポリビニール製等のマイ
クロタイタープレート、ビーズ、スティック、試験管等
の物理的吸着に供される公知の固相が何ら制限されるこ
となく使用され、このうち特に市販されるエンザイムイ
ムノアッセイ用マイクロタイタープレートを用いること
が好ましい。該固相へのポリペプチドの感作は、ポリペ
プチドを0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液に懸濁し、
4〜37°Cで1時間以上放置することで実施できる。
た上記ポリペプチドと反応した被検液中のp21に対す
る抗体を、酵素を抗体に化学的に結合させた酵素標識抗
体を用いた直接法5間接法等により検出することで実施
できる。使用される固相は、ポリスチレン、ポリカーボ
ネート、ポリプロピレンおよびポリビニール製等のマイ
クロタイタープレート、ビーズ、スティック、試験管等
の物理的吸着に供される公知の固相が何ら制限されるこ
となく使用され、このうち特に市販されるエンザイムイ
ムノアッセイ用マイクロタイタープレートを用いること
が好ましい。該固相へのポリペプチドの感作は、ポリペ
プチドを0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液に懸濁し、
4〜37°Cで1時間以上放置することで実施できる。
また、固相に感作させるポリペプチド量は、ポリペプチ
ド(mg)/固相の表面積(m2)の比が0.5〜50
mg/m2の範囲にあることが好ましい。使用する酵素
標識抗体は、ヒト抗体と反応性を有し、標識酵素が化学
結合したものであれば特に限定されず、例えば市販され
るアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ等の酵素で標識されたヤギ抗ヒ)1g
G抗体、マウス抗ヒ目gG抗体、ヤギ抗ヒ)IgM抗体
、マウス抗ヒトIg旧元体等が使用できる。検出に用い
られる基質は、上記酵素標識抗体に標識された酵素に応
じて適宜使用すれば良く、例えば該酵素としてアルカリ
フォスファターゼを選択した場合においては、p−ニト
ロフェニルフォスフェート等を使用すれば良い。尚、測
定に際し、被検液である血漿又は血清は、原液のまま加
えても良いが、好ましくはPBS緩衝液、正常ヤギ血清
等で100倍希釈して用いるのが良い。
ド(mg)/固相の表面積(m2)の比が0.5〜50
mg/m2の範囲にあることが好ましい。使用する酵素
標識抗体は、ヒト抗体と反応性を有し、標識酵素が化学
結合したものであれば特に限定されず、例えば市販され
るアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ等の酵素で標識されたヤギ抗ヒ)1g
G抗体、マウス抗ヒ目gG抗体、ヤギ抗ヒ)IgM抗体
、マウス抗ヒトIg旧元体等が使用できる。検出に用い
られる基質は、上記酵素標識抗体に標識された酵素に応
じて適宜使用すれば良く、例えば該酵素としてアルカリ
フォスファターゼを選択した場合においては、p−ニト
ロフェニルフォスフェート等を使用すれば良い。尚、測
定に際し、被検液である血漿又は血清は、原液のまま加
えても良いが、好ましくはPBS緩衝液、正常ヤギ血清
等で100倍希釈して用いるのが良い。
また、ウェスタンプロット法は、例えば、Proc。
NaLl、Acad、Sci、USA 76.4350
(1979)においてTabin等が提案する公知の方
法に準じて実施することができる。前記ポリペプチドと
被検液中のp21に対する抗体との抗原−抗体反応の検
出は、上記文献に記載されるラジオオートグラフィー、
蛍光免疫法及びエンザイムイムノアンセイが特に限定さ
れることな〈実施できる。しかしながら、簡便さと保存
性の面から上記エンザイムイムノアノセイの直接法又は
間接法を実施することが好ましい。転写に用いる膜は、
ウェスタンブロンドに使用される公知のものが特に限定
されることなく使用できる。好適に使用されるものを例
示すれば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニ
リデンジフルオライド膜、ジアゾ化アミノベンジルオキ
シメチル膜、ジアゾ化アミノフェニルチオエーテル膜。
(1979)においてTabin等が提案する公知の方
法に準じて実施することができる。前記ポリペプチドと
被検液中のp21に対する抗体との抗原−抗体反応の検
出は、上記文献に記載されるラジオオートグラフィー、
蛍光免疫法及びエンザイムイムノアンセイが特に限定さ
れることな〈実施できる。しかしながら、簡便さと保存
性の面から上記エンザイムイムノアノセイの直接法又は
間接法を実施することが好ましい。転写に用いる膜は、
ウェスタンブロンドに使用される公知のものが特に限定
されることなく使用できる。好適に使用されるものを例
示すれば、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ポリビニ
リデンジフルオライド膜、ジアゾ化アミノベンジルオキ
シメチル膜、ジアゾ化アミノフェニルチオエーテル膜。
ジエチルアミノエチル膜等が挙げられ、このうちニトロ
セルロース膜を用いるのが好ましい。
セルロース膜を用いるのが好ましい。
本発明の診断薬において、抗原として使用するポリペプ
チドは、IITLV−1env蛋白のp21に対応し、
11TLV−Iに対する抗体に対して良好な抗原性を有
すものである。従って、本発明の診断薬は、)ITLV
−1感染者の診断を高感度で行うことができる。また、
他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいないため
、HTLV−Tに感染していないにもかかわらず陽性と
しての結果となる偽陽性の検体を生ずることなく、HT
LV−1感染者の診断を行うことができる。
チドは、IITLV−1env蛋白のp21に対応し、
11TLV−Iに対する抗体に対して良好な抗原性を有
すものである。従って、本発明の診断薬は、)ITLV
−1感染者の診断を高感度で行うことができる。また、
他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいないため
、HTLV−Tに感染していないにもかかわらず陽性と
しての結果となる偽陽性の検体を生ずることなく、HT
LV−1感染者の診断を行うことができる。
従って、本発明の診断薬は、例えば輸血における供血者
を検体者として診断すること等により、)ITLV−1
感染者を発見し、)ITLV−1への感染の防止を行う
ことができ、産業上の利用価値は極めて大きいものであ
る。
を検体者として診断すること等により、)ITLV−1
感染者を発見し、)ITLV−1への感染の防止を行う
ことができ、産業上の利用価値は極めて大きいものであ
る。
製造例1
(HTLシー1 env蛋白遺伝子由来のDNAの取得
)ATL患者患者末梢血10炉/公知の方法に従いリン
パ球を分離し、該リンパ球をプロテインナーゼK(シグ
マ社製PO390)で処理した後、フェノール・クロロ
ホルム抽出エタノール沈Hヲ行イA TL患者由来のリ
ンパ球のDNA1■を得た。
)ATL患者患者末梢血10炉/公知の方法に従いリン
パ球を分離し、該リンパ球をプロテインナーゼK(シグ
マ社製PO390)で処理した後、フェノール・クロロ
ホルム抽出エタノール沈Hヲ行イA TL患者由来のリ
ンパ球のDNA1■を得た。
該DNAl0μgを第4表N021に示す組成の′溶液
中でEcoRI制限酵素(宝酒造■製 Nα1040)
により切断し、エタノール沈澱後、TE緩衝液200μ
!に溶解した。
中でEcoRI制限酵素(宝酒造■製 Nα1040)
により切断し、エタノール沈澱後、TE緩衝液200μ
!に溶解した。
そして該溶液を、ショ糖密度勾配遠心(ショ糖10〜4
0%wt/vol、 26000 rpm、 18時間
)にかけ、アガロースゲル電気泳動による確認で20キ
ロ塩基対に相当するDNA断片を得た。次にこのDNA
断片1,0Mgをシャロン4Aベクター(ヘクターDN
A、榊 佳之講談社1986参照)のEcoRI制限酵
素切断部位への接続を行い、シャロン4Aベクターに存
在するEcoRI切断部位に該DNA断片を挿入した。
0%wt/vol、 26000 rpm、 18時間
)にかけ、アガロースゲル電気泳動による確認で20キ
ロ塩基対に相当するDNA断片を得た。次にこのDNA
断片1,0Mgをシャロン4Aベクター(ヘクターDN
A、榊 佳之講談社1986参照)のEcoRI制限酵
素切断部位への接続を行い、シャロン4Aベクターに存
在するEcoRI切断部位に該DNA断片を挿入した。
この接続は、T4 DNAリガーゼ(全酒造■製 No
、2011)を用い、接続反応は、第5表に示すような
組成の溶液中で、15°C912時間行なった。次いで
、得られたDNAについてイン・ビトロ・パッケージン
グを行なった後、処理液を遠心分離(7000rpm、
2時間)し、上清をプラークハイブリダイゼーション
用の組換えファージ液とした。膝組換えファージ液を↑
旨示菌LE392 (全酒造(lij ”A )に感染
し、プラークを形成した後、32pでラヘルした11T
1、V−T pol D N A含有断片をプローブに
プラークハイブリダイゼーションを行ない、HTLV−
Iii伝子内子由来NAを含むファージを単離し7た。
、2011)を用い、接続反応は、第5表に示すような
組成の溶液中で、15°C912時間行なった。次いで
、得られたDNAについてイン・ビトロ・パッケージン
グを行なった後、処理液を遠心分離(7000rpm、
2時間)し、上清をプラークハイブリダイゼーション
用の組換えファージ液とした。膝組換えファージ液を↑
旨示菌LE392 (全酒造(lij ”A )に感染
し、プラークを形成した後、32pでラヘルした11T
1、V−T pol D N A含有断片をプローブに
プラークハイブリダイゼーションを行ない、HTLV−
Iii伝子内子由来NAを含むファージを単離し7た。
得られた組換えファージを、第4表No、 1に示す組
成の溶液中で、ll1ndIIi(全酒造■製)、Ec
oRI(全酒造9@製 No、1040)制限酵素によ
り切断し、HTLV−1遺伝子由来のDNAのうちen
v−px−1,TR領域に相当し、且つp21をコード
するDNAを含む約3.9キロ塩基対のDNA断片を4
00μg得た。そして、大腸菌用ベクターpUc19(
全酒造0菊製 No、3219)を同様な条件下で旧n
d ■、 EcoRI制限酵素により切断し、切断部位
への上記DNA断片の接続反応を行なった。得られた接
続反応液は、後述する、HTLV−15’ −3′断片
を含むBan)I I −BamHI断片DNAと、ρ
UC19の接続反応液と同様に、大腸菌JM109(全
酒造(1@製 Nα9052)の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プし・バレージョン
へと続く一連の操作に使用した。以上の操作の結果、H
TLV−T env−px−LTRtl域遺伝子に由来
するDNA断片がpUc19に正しい方向で挿入しテイ
ル組換エヘク’;’ −PHT 3.9i/puc19
を400 u g得た。
成の溶液中で、ll1ndIIi(全酒造■製)、Ec
oRI(全酒造9@製 No、1040)制限酵素によ
り切断し、HTLV−1遺伝子由来のDNAのうちen
v−px−1,TR領域に相当し、且つp21をコード
するDNAを含む約3.9キロ塩基対のDNA断片を4
00μg得た。そして、大腸菌用ベクターpUc19(
全酒造0菊製 No、3219)を同様な条件下で旧n
d ■、 EcoRI制限酵素により切断し、切断部位
への上記DNA断片の接続反応を行なった。得られた接
続反応液は、後述する、HTLV−15’ −3′断片
を含むBan)I I −BamHI断片DNAと、ρ
UC19の接続反応液と同様に、大腸菌JM109(全
酒造(1@製 Nα9052)の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プし・バレージョン
へと続く一連の操作に使用した。以上の操作の結果、H
TLV−T env−px−LTRtl域遺伝子に由来
するDNA断片がpUc19に正しい方向で挿入しテイ
ル組換エヘク’;’ −PHT 3.9i/puc19
を400 u g得た。
上記組換えベクターPHT 3.9Kb/pUc192
00μgを、第4表No、 3に示す組成の溶液中で、
Pstl (全酒造G1製 No、1073) 、
Hind [1(全酒造■製 No、1060)を使用
して、切断し、Hind III−Pstl断片(約1
700塩基対)を得る。
00μgを、第4表No、 3に示す組成の溶液中で、
Pstl (全酒造G1製 No、1073) 、
Hind [1(全酒造■製 No、1060)を使用
して、切断し、Hind III−Pstl断片(約1
700塩基対)を得る。
一方、大腸菌ベクターpUc19を第4表No1に示す
組成の溶液中で5all (全酒造tll製 No、1
080)を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアー
ゼ(全酒造■製 No、2420 )処理後、接続し、
ACCIlSail、 I(inc口制比制限酵素切断
部位いpUc19を得た。次に、該pLlc19を第4
表No、 2に示す組成溶液中でll1ndIII、
PstIを使用して切断し、該ベクターのtlindI
II、 Psi切断部位に上記旧nd I[l + P
s t I断片を接続した。
組成の溶液中で5all (全酒造tll製 No、1
080)を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアー
ゼ(全酒造■製 No、2420 )処理後、接続し、
ACCIlSail、 I(inc口制比制限酵素切断
部位いpUc19を得た。次に、該pLlc19を第4
表No、 2に示す組成溶液中でll1ndIII、
PstIを使用して切断し、該ベクターのtlindI
II、 Psi切断部位に上記旧nd I[l + P
s t I断片を接続した。
次いで、接続反応液を大腸菌J旧09の形質転換、ミニ
プレバレージョンと続く一連の操作に使用し、11in
d III−Pstl断片が上記pUc19ベクターに
正しい方向で挿入している組換えpUc19ベクターを
400μg得た。更に、第4表NO12に示す組成の溶
液中で、組換えpUC19ヘクターをAccI(全酒造
■製 No。
プレバレージョンと続く一連の操作に使用し、11in
d III−Pstl断片が上記pUc19ベクターに
正しい方向で挿入している組換えpUc19ベクターを
400μg得た。更に、第4表NO12に示す組成の溶
液中で、組換えpUC19ヘクターをAccI(全酒造
■製 No。
1001)、 Xbal(全酒造■製 No、1093
)を使用して切断し、IITLV−T env蛋白遺伝
子に由来するDNAのうち後半部分に相当するAcc
r−Xba [断片(約1060塩基対)を取得した。
)を使用して切断し、IITLV−T env蛋白遺伝
子に由来するDNAのうち後半部分に相当するAcc
r−Xba [断片(約1060塩基対)を取得した。
一方、組換えベクターPIT 3.9Kb/pUc19
.200μgを、第4表No、 5に示す組成の溶液中
でNcol制限酵素(宝酒造@製 No、1160)を
使用して切断し、Ncol Ncol断片(約610
塩基対)を得た。一方、大腸菌ベクターpUc18(全
酒造91製 No、3218 )を第4表No、 3に
示す組成の溶液中で旧ncII制限酵素(全酒造■製
No、1059)で切断し、該ベクターのHinall
制限酵素部位に上記Ncol −Ncol断片をフィル
イン・ライゲーションによって、接続した。次いで、接
続反応液を、大腸菌JM109の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プレバレージョンと
続(一連の操作に使用し、NcolNcoTl1片が上
記pUc18ベクターに正しい方向で挿入している組換
えpUc18ベクターを400μg得た。該ベクターを
第4表Nα6に示す組成の溶液中で、Xbal、 Ac
cl制限酵素で切断し、HTLV4 env蛋白遺伝子
に由来するDNAの前半部分に相当するXbaI A
ccl断片(約500塩基対)を得た。
.200μgを、第4表No、 5に示す組成の溶液中
でNcol制限酵素(宝酒造@製 No、1160)を
使用して切断し、Ncol Ncol断片(約610
塩基対)を得た。一方、大腸菌ベクターpUc18(全
酒造91製 No、3218 )を第4表No、 3に
示す組成の溶液中で旧ncII制限酵素(全酒造■製
No、1059)で切断し、該ベクターのHinall
制限酵素部位に上記Ncol −Ncol断片をフィル
イン・ライゲーションによって、接続した。次いで、接
続反応液を、大腸菌JM109の形質転換、ミニ・プレ
バレージョン、そしてミデイアム・プレバレージョンと
続(一連の操作に使用し、NcolNcoTl1片が上
記pUc18ベクターに正しい方向で挿入している組換
えpUc18ベクターを400μg得た。該ベクターを
第4表Nα6に示す組成の溶液中で、Xbal、 Ac
cl制限酵素で切断し、HTLV4 env蛋白遺伝子
に由来するDNAの前半部分に相当するXbaI A
ccl断片(約500塩基対)を得た。
次いで、大腸菌ベクターであるpucl19(全酒造■
製 No、3319 )を第4表N016に示した組成
の溶液中でXbaI制限酵素(全酒造■製 Nα109
3)により切断し、得られたベクターと上記AccT
−Xbal断片及びXbal−Accl断片との接続を
行なった。そして、接続反応液を大腸菌JM109の形
質転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミデイアム・
プレバレージョンへと続く一連の操作に使用し、)IT
LV−1enν蛋白遺伝子由来のDNAが pUc11
9ベクターに正しい方向で挿入している組換えベクター
env/pUC119、200μgを得た。以上の工程
を第7図に示す。
製 No、3319 )を第4表N016に示した組成
の溶液中でXbaI制限酵素(全酒造■製 Nα109
3)により切断し、得られたベクターと上記AccT
−Xbal断片及びXbal−Accl断片との接続を
行なった。そして、接続反応液を大腸菌JM109の形
質転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミデイアム・
プレバレージョンへと続く一連の操作に使用し、)IT
LV−1enν蛋白遺伝子由来のDNAが pUc11
9ベクターに正しい方向で挿入している組換えベクター
env/pUC119、200μgを得た。以上の工程
を第7図に示す。
(組換えベクターの製造)
前記の方法で得られた組換えベクターenv/pUc1
19、200μgを第4表No、 6に示す組成の溶液
に溶解し、次いでBan+HI制限酵素(全酒造■製
Nα1010)を断続的に9時間添加していき、切断反
応を行なった。切断後、フェノール抽出、エタノール沈
澱を順次行なった後、沈澱したDNAをTE緩衝液(p
H8,0)に溶解し、該DNA溶解液をアガロースゲル
電気泳動した。そしてIITLV−15’ −3’断片
を含むBamHT −BamHI断片に相当するバンド
部分の寒天片を切り出し、電気泳動による溶出によって
該断片を抽出した。次いで、抽出液を更にフェノール抽
出し、エタノール沈澱して1ITLV45’ −3′断
片を含むBamlll−Bamtll断片を得た。
19、200μgを第4表No、 6に示す組成の溶液
に溶解し、次いでBan+HI制限酵素(全酒造■製
Nα1010)を断続的に9時間添加していき、切断反
応を行なった。切断後、フェノール抽出、エタノール沈
澱を順次行なった後、沈澱したDNAをTE緩衝液(p
H8,0)に溶解し、該DNA溶解液をアガロースゲル
電気泳動した。そしてIITLV−15’ −3’断片
を含むBamHT −BamHI断片に相当するバンド
部分の寒天片を切り出し、電気泳動による溶出によって
該断片を抽出した。次いで、抽出液を更にフェノール抽
出し、エタノール沈澱して1ITLV45’ −3′断
片を含むBamlll−Bamtll断片を得た。
一方、大腸菌用ベクターpUc1910μgをBam旧
制比制限酵素り、前記と同様の切断条件で切断した。次
いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁液
(全酒造■製 k2120) 1μ2により、60°
Cで30分間反応させた。アルカリフォスファターゼ反
応停止後、該反応液をフェノール抽出、エタノール沈澱
し、BamHIで切断されたpUc19を得た。
制比制限酵素り、前記と同様の切断条件で切断した。次
いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁液
(全酒造■製 k2120) 1μ2により、60°
Cで30分間反応させた。アルカリフォスファターゼ反
応停止後、該反応液をフェノール抽出、エタノール沈澱
し、BamHIで切断されたpUc19を得た。
このようにして得られた、BamHTで切断されたpU
c190.2ugと前記HTLV−I 5’ −3′断
片を含む6amllI−BamHI断片0.25μgを
混合し、第5表に示す組成の溶液中で、T4DNAリガ
ーゼを用い、16°C93時間以上接続反応を行なった
。
c190.2ugと前記HTLV−I 5’ −3′断
片を含む6amllI−BamHI断片0.25μgを
混合し、第5表に示す組成の溶液中で、T4DNAリガ
ーゼを用い、16°C93時間以上接続反応を行なった
。
そして該操作により得られた接続反応液25μ!を大腸
菌JM109のコンピテントセル懸濁液200μ2に添
加し、氷上で30分放置した。その後、42°Cで2分
間ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、LB液
体培地800μpを添加し、37°Cで1時間おだやか
に振盪培養した。
菌JM109のコンピテントセル懸濁液200μ2に添
加し、氷上で30分放置した。その後、42°Cで2分
間ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、LB液
体培地800μpを添加し、37°Cで1時間おだやか
に振盪培養した。
該液体培地100μlを、アンピシリン10071g/
−を含むLB寒天培地15m1/プレートに接種後、3
7°Cで12時間培養した。培養後出現したシングルコ
ロニー20個を取り出し、それぞれをアンピシリン30
ug/ml含むLB液体培地15m1に接種し、37°
Cで8時間培養した。それぞれの液体培地から1−ずつ
採取し、各採取培地中の大腸菌内に所在するプラスミド
をミニ・プレバレージョン法により抽出した。得られた
各プラスミドのそれぞれを、第4表No、 4に示す組
成の溶液中でKpnl制限酵素(全酒造■製 No、1
068)により切断反応を行った。反応後、各反応液を
アガロースゲル電気泳動し、HTLV−I5’−3”断
片を含むBamHI−BaI11旧断片がpUC19に
正しい方向で挿入しているプラスミドを確認した。
−を含むLB寒天培地15m1/プレートに接種後、3
7°Cで12時間培養した。培養後出現したシングルコ
ロニー20個を取り出し、それぞれをアンピシリン30
ug/ml含むLB液体培地15m1に接種し、37°
Cで8時間培養した。それぞれの液体培地から1−ずつ
採取し、各採取培地中の大腸菌内に所在するプラスミド
をミニ・プレバレージョン法により抽出した。得られた
各プラスミドのそれぞれを、第4表No、 4に示す組
成の溶液中でKpnl制限酵素(全酒造■製 No、1
068)により切断反応を行った。反応後、各反応液を
アガロースゲル電気泳動し、HTLV−I5’−3”断
片を含むBamHI−BaI11旧断片がpUC19に
正しい方向で挿入しているプラスミドを確認した。
この確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る前記液体培地から0.2 mlを採取し、アンピシリ
ン100μg7mlを含むLB液体培地50−に接種後
、37°Cで12時間培養した。
る前記液体培地から0.2 mlを採取し、アンピシリ
ン100μg7mlを含むLB液体培地50−に接種後
、37°Cで12時間培養した。
得られた液体培地中の大腸菌内に所在するプラスミドを
ミデイアム・プレバレージョン法により抽出し、組換え
ベクターBam1ll Env(600)/pUc19
400μgを得た。
ミデイアム・プレバレージョン法により抽出し、組換え
ベクターBam1ll Env(600)/pUc19
400μgを得た。
膝組換えベクターBamHI Env(600)/pU
c19200μgを第4表No、 6に示す組成の溶液
に溶解し、次いでXbaI制限酵素を断続的に9時間添
加していき、切断反応を行なった。得られた切断物を前
記アガロースゲル電気泳動することで、HTLV−15
’ −3′断片を含むXba I −Xba I断片(
約600bp) 0.15 u gを得た。
c19200μgを第4表No、 6に示す組成の溶液
に溶解し、次いでXbaI制限酵素を断続的に9時間添
加していき、切断反応を行なった。得られた切断物を前
記アガロースゲル電気泳動することで、HTLV−15
’ −3′断片を含むXba I −Xba I断片(
約600bp) 0.15 u gを得た。
又、カイコの発現系ベクターpBF133.10μgを
Xbal制限酵素により、前記と同様な切断条件で切断
し、次いでアルカリフォスファターゼ処理した。
Xbal制限酵素により、前記と同様な切断条件で切断
し、次いでアルカリフォスファターゼ処理した。
上記HTLV−I 5’ −3’断片を含むXbal−
Xba[D N A断片1.25μgとXba Iで切
断されたpBF1330.25μgを混合し、T4DN
Aリガーゼにより前述と同様な方法で接続反応を行なっ
た。
Xba[D N A断片1.25μgとXba Iで切
断されたpBF1330.25μgを混合し、T4DN
Aリガーゼにより前述と同様な方法で接続反応を行なっ
た。
そして、前記と同様な方法により、この接続反応液を用
いた大腸菌JM109の形質転換及び、該形質転換菌の
分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで一
連のミニ・プレバレージョン操作を実施し、それぞれの
液体培地からプラスミドを抽出した。
いた大腸菌JM109の形質転換及び、該形質転換菌の
分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで一
連のミニ・プレバレージョン操作を実施し、それぞれの
液体培地からプラスミドを抽出した。
次いで、各プラスミドに対して、BamHIによる切断
反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、HTLV
45’ −3′断片を含むXbal −Xbal D
N AがpBF133に正しい方向に挿入されているプ
ラスミドを確認した。
反応を行い、アガロースゲル電気泳動により、HTLV
45’ −3′断片を含むXbal −Xbal D
N AがpBF133に正しい方向に挿入されているプ
ラスミドを確認した。
ごの確認したプラスミドを所有している大腸菌が存在す
る液体培地から0.2 mZを採取し、アンピシリン3
0μg/−を含むLB液体培地50ntfに接種後、3
7°Cで12時間培養した。
る液体培地から0.2 mZを採取し、アンピシリン3
0μg/−を含むLB液体培地50ntfに接種後、3
7°Cで12時間培養した。
該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ーBamHI Env(600)/pBF133200
μgを得た。この組換えベクターBam1lI Env
(600)/pBF133はE、coliに導入し、得
られる微生物をE、colillTLV−1−Envl
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄
託番号は微工研菌寄第10072号(FREM P−1
0072)である。以上の工程を第8図に示す。
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ーBamHI Env(600)/pBF133200
μgを得た。この組換えベクターBam1lI Env
(600)/pBF133はE、coliに導入し、得
られる微生物をE、colillTLV−1−Envl
として工業技術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄
託番号は微工研菌寄第10072号(FREM P−1
0072)である。以上の工程を第8図に示す。
(Mi換えウィルスの製造)
BmNPV T 3株のウィルスDNAと前記組換えベ
クターBamt(I Env(600)/pBF133
とが1 : 100のモ、ル比に調合された第1表の組
成液1245μ2を、第1表の組成液■255μでと混
合した。
クターBamt(I Env(600)/pBF133
とが1 : 100のモ、ル比に調合された第1表の組
成液1245μ2を、第1表の組成液■255μでと混
合した。
(本頁以下余白)
第
表
生じた懸濁液0.5 mlをTC−10(第2表)の培
地のカイコ樹立培養細胞BmNJ液(4X105Bmc
ells/++sf)5mlに加え、27°Cl2O時
間の培養により、BamtlIEnv(600)/pB
F133とBmNPV D N Aのカイコ樹立細胞へ
の導入を行った。得られた培養物は、更にTC10培地
の交換を行った後、27°Cで6日間培養した。次いで
この培養物を遠心分離(1500rρm、10分間)し
、得られた上清を組換えウィルスのクローニング用反応
液とした。
地のカイコ樹立培養細胞BmNJ液(4X105Bmc
ells/++sf)5mlに加え、27°Cl2O時
間の培養により、BamtlIEnv(600)/pB
F133とBmNPV D N Aのカイコ樹立細胞へ
の導入を行った。得られた培養物は、更にTC10培地
の交換を行った後、27°Cで6日間培養した。次いで
この培養物を遠心分離(1500rρm、10分間)し
、得られた上清を組換えウィルスのクローニング用反応
液とした。
該クローニング用反応液をTC−10培地で10−61
0−7.10−@に希釈し、それぞれ10rnlの希釈
反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカイコ
樹立培養細胞8mNd液(105Bmcells/mZ
) 10−を混合し、該混合液を200μρずつ96穴
のマイクロタイター・トレーの中に分注し、27°Cで
4日間培養した。4日間培養後、マイクロタイター・ト
レーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウィルスが感染し
た形態を示しているカイコ樹立培養細胞で且つ該細胞内
に多角体蛋白が検出されないウェルを見い出し、そこか
ら培養物を回収した。得られた培養物を遠心分離(15
00rpm、 10分)し、上清150ufを組換えウ
ィルスのポリペプチド発現用反応液とした。上記TC−
10の培地は第2表の培地900dをpH6,30〜6
.35に調整し、濾過滅菌後、牛胎児血清100m1を
添加することにより調製される。
0−7.10−@に希釈し、それぞれ10rnlの希釈
反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカイコ
樹立培養細胞8mNd液(105Bmcells/mZ
) 10−を混合し、該混合液を200μρずつ96穴
のマイクロタイター・トレーの中に分注し、27°Cで
4日間培養した。4日間培養後、マイクロタイター・ト
レーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウィルスが感染し
た形態を示しているカイコ樹立培養細胞で且つ該細胞内
に多角体蛋白が検出されないウェルを見い出し、そこか
ら培養物を回収した。得られた培養物を遠心分離(15
00rpm、 10分)し、上清150ufを組換えウ
ィルスのポリペプチド発現用反応液とした。上記TC−
10の培地は第2表の培地900dをpH6,30〜6
.35に調整し、濾過滅菌後、牛胎児血清100m1を
添加することにより調製される。
第
培−実ml−戊
aCI
Cl
CaC1z ’ 2HzO
MgCI□ ・ 6HzO
MgCI□ ・ 7H20
Tryptose
デキストロース
(glucose)
[、−gl u tallLine
soln A”
5oln R”
5olnCIlllll
Nal+zPOn ・2H20
(0,891g/100 ml)
NaHCO:+
(0,35g/100滅)
0.5g
2.87g
1.32g
2、28g
2、78g
2.0g
1.1g
0.3g
00m1
00mf
m1
00ml1
100戒
H2Oで全ff1900dとする
21江り大Jη1戊
り−4rginme
L−八5patic acid
L−八5para8ine 9 HzOL−八1
anine β−Alanine L−Glutamic acid L−Glutamine Glycine L −Hlstidine L−Isoleucine し−Leucine L−Lysine L −Mcthiouine [、−Proline L−Phenyla anine DL−5erune L−Threonme +1CI 5.79g 3.5g 3.98g 2、25g 2.0g 6.0g 3.0g 6.5g 25.0g o、5g 0.75g 6.25g 0.5g 3.5g 1.5g 11.0g 1.75g 11□0で全量1000i1とする 叩」壮し工m収 L −Cystine L −Tryptophane 0.25g 1.0g )120で全量1000戚とする 叩V匪罰」」λ1成 Thiamine−HCI Riboflavine D−Ca pantothenatePrydoxi
ne −HCI Para−aminobenzoic acidFo
lic acid Nicotinic acid Isoiuositol 1otin Cholive Cl Ih0で全量10100Oとする 2、0mg 2 、0 mg 2.0mg 2.0■ 2.0mg 2.0mg 2.0mg 2 、0 mg 1.0mg 20.0mg (ポリペプチドの製造) 上記ポリペプチド発現用反応液100μ2をカイコ培養
細胞8mNd液(105Bmcel Is/ m/ )
30−に添加し、27°C,5日間培養した。5日間
培養後、培養物を回収し、遠心分離(1500rpm、
15分)した。
anine β−Alanine L−Glutamic acid L−Glutamine Glycine L −Hlstidine L−Isoleucine し−Leucine L−Lysine L −Mcthiouine [、−Proline L−Phenyla anine DL−5erune L−Threonme +1CI 5.79g 3.5g 3.98g 2、25g 2.0g 6.0g 3.0g 6.5g 25.0g o、5g 0.75g 6.25g 0.5g 3.5g 1.5g 11.0g 1.75g 11□0で全量1000i1とする 叩」壮し工m収 L −Cystine L −Tryptophane 0.25g 1.0g )120で全量1000戚とする 叩V匪罰」」λ1成 Thiamine−HCI Riboflavine D−Ca pantothenatePrydoxi
ne −HCI Para−aminobenzoic acidFo
lic acid Nicotinic acid Isoiuositol 1otin Cholive Cl Ih0で全量10100Oとする 2、0mg 2 、0 mg 2.0mg 2.0■ 2.0mg 2.0mg 2.0mg 2 、0 mg 1.0mg 20.0mg (ポリペプチドの製造) 上記ポリペプチド発現用反応液100μ2をカイコ培養
細胞8mNd液(105Bmcel Is/ m/ )
30−に添加し、27°C,5日間培養した。5日間
培養後、培養物を回収し、遠心分離(1500rpm、
15分)した。
沈澱物を(ウィルス成熟細胞)をPBS緩衝液で洗浄し
5(]wM Tris−HCI(pH7,4) 400
u lに懸濁、ソニケーション後、遠心分離(8000
rpm、 20分)した。沈澱物として得られたポリペ
プチドにレムリ緩衝液200μ2を添加、懸濁したもの
を、煮沸し、遠心した上清をSDSゲル電気泳動の試料
とした。
5(]wM Tris−HCI(pH7,4) 400
u lに懸濁、ソニケーション後、遠心分離(8000
rpm、 20分)した。沈澱物として得られたポリペ
プチドにレムリ緩衝液200μ2を添加、懸濁したもの
を、煮沸し、遠心した上清をSDSゲル電気泳動の試料
とした。
SDSゲル電気泳動の結果、この試料は、pBF133
の存す多角体蛋白遺伝子部分がコードする多角体蛋白の
一部(約5 Kd)とHTLV−15’ −3′断片が
コードするHTLV−1外皮蛋白ノル21含有部(約2
0Kd)の合計分子量にあたる約25Kdの位置にハン
ドが検出された(第4図に図示)。なお、第4図は、8
m細胞内でのHTLシー1 env蛋白発現をSDSゲ
ル電気泳動で確認したものである。第4図において1a
ne1はサイズマーカー、1ane 2は非惑染カイコ
細胞の蛋白1ane 3はBam1(I Env(0,
6)/pBF133を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
の存す多角体蛋白遺伝子部分がコードする多角体蛋白の
一部(約5 Kd)とHTLV−15’ −3′断片が
コードするHTLV−1外皮蛋白ノル21含有部(約2
0Kd)の合計分子量にあたる約25Kdの位置にハン
ドが検出された(第4図に図示)。なお、第4図は、8
m細胞内でのHTLシー1 env蛋白発現をSDSゲ
ル電気泳動で確認したものである。第4図において1a
ne1はサイズマーカー、1ane 2は非惑染カイコ
細胞の蛋白1ane 3はBam1(I Env(0,
6)/pBF133を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
一次抗体として抗多角体蛋白抗体及びHTLV−1p2
1に対するモノクローナル抗体を使用したウェスタン・
プロット実験で、25Kdのポリペプチドが多角体蛋白
とHTLV−1p21とを含む融合蛋白であることを確
認した。又、同時に一次抗体として、正常人血清又は、
ATL患者血清を使用したウェスタン・プロット実験を
行い、該25KdのポリペプチドがHTLV−1に対す
る抗体に対して良好な抗原性を有していることが確認で
きた(第5図に図示)。
1に対するモノクローナル抗体を使用したウェスタン・
プロット実験で、25Kdのポリペプチドが多角体蛋白
とHTLV−1p21とを含む融合蛋白であることを確
認した。又、同時に一次抗体として、正常人血清又は、
ATL患者血清を使用したウェスタン・プロット実験を
行い、該25KdのポリペプチドがHTLV−1に対す
る抗体に対して良好な抗原性を有していることが確認で
きた(第5図に図示)。
なお、第5図は、BI11細胞内でのHTLV−r e
nv蛋白発現をウェスタン・プロット法で確認したもの
である。1ane 1はサイズマーカー、1ane 2
〜1ane 5は抗原としてBamHI Env(60
0)/pBF133を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
nv蛋白発現をウェスタン・プロット法で確認したもの
である。1ane 1はサイズマーカー、1ane 2
〜1ane 5は抗原としてBamHI Env(60
0)/pBF133を使用した組換えウィルスを感染し
たカイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
ウェスタン・プロッティングは、第3表に示した一次抗
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたペルオキシダーゼによる呈色反応で行なった。
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたペルオキシダーゼによる呈色反応で行なった。
第
表
)内は希釈率を示した
製造例2
製造例1で得たポリペプチド発現用反応液100upを
カイコ樹立培養細胞液(lo5Bmcells/m/)
30m1に添加し、27°C,5日間培養した。5日
間培養後、培養物を回収し遠心分離(1500rpm、
15分)した。上清を0.1−ずつ5令1日目のカイ
コ100匹にそれぞれ経皮的に注入し、25°Cで5日
間、桑葉のペースト片を与えて飼育後、解剖し、脂肪体
を集めた。該脂肪体にPBS緩衝液toiを加え懸濁し
、ソニケーション後、遠心分離(8000rpm、 2
0分)し、沈澱?15−を取得した。該沈澱物200μ
2を再度ソニケーションし、Bio−RADプロティン
・アッセイにより、ポリペプチド量を測定した結果60
μgであった。
カイコ樹立培養細胞液(lo5Bmcells/m/)
30m1に添加し、27°C,5日間培養した。5日
間培養後、培養物を回収し遠心分離(1500rpm、
15分)した。上清を0.1−ずつ5令1日目のカイ
コ100匹にそれぞれ経皮的に注入し、25°Cで5日
間、桑葉のペースト片を与えて飼育後、解剖し、脂肪体
を集めた。該脂肪体にPBS緩衝液toiを加え懸濁し
、ソニケーション後、遠心分離(8000rpm、 2
0分)し、沈澱?15−を取得した。該沈澱物200μ
2を再度ソニケーションし、Bio−RADプロティン
・アッセイにより、ポリペプチド量を測定した結果60
μgであった。
ポリペプチド盪測定後、50μ2をレムリ緩衝液50μ
りに懸濁し、煮沸し、遠心した上清をSDSゲル電気泳
動の試料とした。
りに懸濁し、煮沸し、遠心した上清をSDSゲル電気泳
動の試料とした。
SDS電気泳動の結果、分子量的25Kdの位置にバン
ドが検出された、実施例4と同様な方法により、この2
5Kdのポリペプチドが多角体蛋白とHTLVI p2
1とを含む融合蛋白で、HTLシー■の抗体に対して良
好な抗原性を有していることを確認した。
ドが検出された、実施例4と同様な方法により、この2
5Kdのポリペプチドが多角体蛋白とHTLVI p2
1とを含む融合蛋白で、HTLシー■の抗体に対して良
好な抗原性を有していることを確認した。
(本頁以下余白)
第
表
第5表
1m門 ATP
実施例1
特開昭62−286533号公報実施例1の方法に従っ
て、複合重合体粒子を製造した。即ち、撹拌機付きガラ
ス製フラスコ中にメタノール2800cc、アンモニア
水(25重量%)616cc、水酸化ナトリウム水溶液
(5モル/N)21ccを加え10°Cに保った後に、
テトラエチルシリケートのメタノール溶液(22%)1
428ccを攪拌しながら25.5cc/hrの滴下速
度で添加して反応した。その後シリカ粒子を大量のメタ
ノール中でデカンテーションを繰り返して精製した。
て、複合重合体粒子を製造した。即ち、撹拌機付きガラ
ス製フラスコ中にメタノール2800cc、アンモニア
水(25重量%)616cc、水酸化ナトリウム水溶液
(5モル/N)21ccを加え10°Cに保った後に、
テトラエチルシリケートのメタノール溶液(22%)1
428ccを攪拌しながら25.5cc/hrの滴下速
度で添加して反応した。その後シリカ粒子を大量のメタ
ノール中でデカンテーションを繰り返して精製した。
得られたシリカ粒子を沈降させ、上清をのぞき、蒸留水
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を2回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度10wt%になるよう
に蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を2回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度10wt%になるよう
に蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。
攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、上記
で得られたシリカ分散液100mff1を加えて40°
Cに保ち、窒素雰囲気下、攪拌下にロアミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを2.9ミリ
モル/2となるように添加した。次いで40°Cに保温
し攪拌下4時間重合を行った。重合後、遠心分離で上清
を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させ
た。この操作を6回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した
複合重合体粒子を得た。
で得られたシリカ分散液100mff1を加えて40°
Cに保ち、窒素雰囲気下、攪拌下にロアミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを2.9ミリ
モル/2となるように添加した。次いで40°Cに保温
し攪拌下4時間重合を行った。重合後、遠心分離で上清
を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させ
た。この操作を6回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した
複合重合体粒子を得た。
次いで、該複合重合体粒子の0.02M P B S緩
衝液(pH7,2)への5%分散液を、前記製造例2に
従って得たポリペプチドが10Mg7mlの濃度で1%
SDS含有LM Th1s−11cI(pH7,4))
1街液に懸濁している懸濁液と等量混合した。室温下で
1時間の放置後、0.02M P B S緩衝液(pH
7,2)を用いた遠心分離により粒子の洗浄を行い、得
られたポリペプチド感作粒子が5%濃度で分散した溶液
を調合した。
衝液(pH7,2)への5%分散液を、前記製造例2に
従って得たポリペプチドが10Mg7mlの濃度で1%
SDS含有LM Th1s−11cI(pH7,4))
1街液に懸濁している懸濁液と等量混合した。室温下で
1時間の放置後、0.02M P B S緩衝液(pH
7,2)を用いた遠心分離により粒子の洗浄を行い、得
られたポリペプチド感作粒子が5%濃度で分散した溶液
を調合した。
ATL患者血清、正常ヒト血清、全身性エリテマ1−−
デス患者血゛清、原発性胆汁性肝硬変患者血清、リウマ
チ患者血清のそれぞれの被検液につき、2倍希釈液を原
液とし倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液(pH7,2)
を用いた希釈を行い、各希釈液をマイクロタイタープレ
ートのウェル中に25μ2ずつ加えた。次いで、前記調
合した感作粒子溶液を、該ウェル中に25μlずつ加え
ていき、3分間の攪拌の後室温下で放置した。30分後
、粒子の凝集状態を観察し各被検液ごとで、粒子リング
が明らかに太き(、リング内に凝集粒子が膜状に広がっ
ているものが認められるウェルにおける希釈液の最高希
釈倍数をもとめ、鋭敏性を評価した。そして、抗体価が
8以上になる被検液を陽性であると診断した。以上の結
果を第6表に示す。
デス患者血゛清、原発性胆汁性肝硬変患者血清、リウマ
チ患者血清のそれぞれの被検液につき、2倍希釈液を原
液とし倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液(pH7,2)
を用いた希釈を行い、各希釈液をマイクロタイタープレ
ートのウェル中に25μ2ずつ加えた。次いで、前記調
合した感作粒子溶液を、該ウェル中に25μlずつ加え
ていき、3分間の攪拌の後室温下で放置した。30分後
、粒子の凝集状態を観察し各被検液ごとで、粒子リング
が明らかに太き(、リング内に凝集粒子が膜状に広がっ
ているものが認められるウェルにおける希釈液の最高希
釈倍数をもとめ、鋭敏性を評価した。そして、抗体価が
8以上になる被検液を陽性であると診断した。以上の結
果を第6表に示す。
(本頁以下余白)
第
表
比較例1
MT−2細胞(Gann 72巻989頁1981年)
を10%仔ウシ血清を含むRPMI 1640培地(M
AB社製No、53005891)で37°Cにて3日
間培養した。その後、該培養上清を10.OOOrpm
、 30分間遠心分離し、上清を回収し、該回収した上
清をtoo、 000gで2時間超遠心分離し、沈渣を
得た。該沈渣を0.01M Tris−HCI緩衝液(
pH7,4)(100mM NaC110mM EDT
Aを含む)で溶解した後、30,000rpn+、 1
時間遠心分離し、謹上清を回収した。20−65%のシ
ョ糖密度勾配液を作成し、それに上記上清を層積し、3
0.OOOrpmで18時間超遠心処理し、MT−2細
胞の可溶性細胞質蛋白液を得た。次いで、製造例2で得
たポリペプチドに変えて、上記可溶性細胞蛋白を用いる
以外は、実施例1と同様な方法で、各種被検液のIIT
LV−1i染の診断を行なった。結果を第7表に示す。
を10%仔ウシ血清を含むRPMI 1640培地(M
AB社製No、53005891)で37°Cにて3日
間培養した。その後、該培養上清を10.OOOrpm
、 30分間遠心分離し、上清を回収し、該回収した上
清をtoo、 000gで2時間超遠心分離し、沈渣を
得た。該沈渣を0.01M Tris−HCI緩衝液(
pH7,4)(100mM NaC110mM EDT
Aを含む)で溶解した後、30,000rpn+、 1
時間遠心分離し、謹上清を回収した。20−65%のシ
ョ糖密度勾配液を作成し、それに上記上清を層積し、3
0.OOOrpmで18時間超遠心処理し、MT−2細
胞の可溶性細胞質蛋白液を得た。次いで、製造例2で得
たポリペプチドに変えて、上記可溶性細胞蛋白を用いる
以外は、実施例1と同様な方法で、各種被検液のIIT
LV−1i染の診断を行なった。結果を第7表に示す。
(本頁以下余白)
第
表
実施例2
製造例2に従って得たポリペプチドを00280値が0
.4となるように1%SDS含有I M Tris−1
1cI(pH7,4)緩衝液に希釈し、エンザイムイム
ノアッセイ用マイクロタイターのカップに150mff
1加えた。
.4となるように1%SDS含有I M Tris−1
1cI(pH7,4)緩衝液に希釈し、エンザイムイム
ノアッセイ用マイクロタイターのカップに150mff
1加えた。
4°Cで1夜間放置し、その後排液し、脱イオン水にて
カップを洗浄した。こうして得られたポリペプチドが感
作したエンザイムイムノアッセイ用マイクロタイターの
カップに、実施例1で使用した各種被検液のPBS緩衝
液による100倍希釈液を100μl加えた。37°C
で1時間放置した後、脱イオン水にてカップを洗浄し、
抗ヒトrgG抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲ
ートのリン酸緩衝液溶液100μ2を加えた。37°C
で1時間放置後、脱イオン水にてカップを洗浄し、基質
(p−ニトロフェニルフォスフェートを4■/ mlと
なるように4 mM MgCl□含有炭酸緩衝液(pH
9,5)に溶解したもの)100μ!を加えた。37°
Cで1時間放置後、IN NaOH100μlを加えて
反応を停止し、0口、。、値を求めた。該oo、。、値
が0.07以上となるものを陽性の被検液であると診断
したところ、実施例1と同一の診断結果が得られた。
カップを洗浄した。こうして得られたポリペプチドが感
作したエンザイムイムノアッセイ用マイクロタイターの
カップに、実施例1で使用した各種被検液のPBS緩衝
液による100倍希釈液を100μl加えた。37°C
で1時間放置した後、脱イオン水にてカップを洗浄し、
抗ヒトrgG抗体−アルカリホスファターゼコンジュゲ
ートのリン酸緩衝液溶液100μ2を加えた。37°C
で1時間放置後、脱イオン水にてカップを洗浄し、基質
(p−ニトロフェニルフォスフェートを4■/ mlと
なるように4 mM MgCl□含有炭酸緩衝液(pH
9,5)に溶解したもの)100μ!を加えた。37°
Cで1時間放置後、IN NaOH100μlを加えて
反応を停止し、0口、。、値を求めた。該oo、。、値
が0.07以上となるものを陽性の被検液であると診断
したところ、実施例1と同一の診断結果が得られた。
実施例3
製造例1に従って得たポリペプチドのSDSポリアクリ
ルアミドゲル電気床動を行った後、実施例1で用いた各
種被検液の3%牛アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7
,2)による10倍希釈液を一次抗体として、エンザイ
ムイムノアッセイによるウェスタン・プロット実験を行
なった。尚、転写用膜には、ニトロセルロース膜を使用
し、二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトI
gG(Vector社製 No、5O−0410−06
) とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgM(Vec
tor社製 No、5O−0410−03)の1:1混
合液を使用した。また、呈色液には、0.05mol
Tris−HCI緩衝液(pH7,2)20ml、 3
.3′−ジアミノベンジジン4塩酸塩10mg、30%
過酸化水素水10μ℃の組成のペルオキシダーゼ用呈色
液を使用した。呈色してバンドが認められたものの、−
次抗体に使用した被検液を、陽性と診断したところ、実
施例1と同一の診断結果が得られた。
ルアミドゲル電気床動を行った後、実施例1で用いた各
種被検液の3%牛アルブミン含有リン酸緩衝液(pH7
,2)による10倍希釈液を一次抗体として、エンザイ
ムイムノアッセイによるウェスタン・プロット実験を行
なった。尚、転写用膜には、ニトロセルロース膜を使用
し、二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトI
gG(Vector社製 No、5O−0410−06
) とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgM(Vec
tor社製 No、5O−0410−03)の1:1混
合液を使用した。また、呈色液には、0.05mol
Tris−HCI緩衝液(pH7,2)20ml、 3
.3′−ジアミノベンジジン4塩酸塩10mg、30%
過酸化水素水10μ℃の組成のペルオキシダーゼ用呈色
液を使用した。呈色してバンドが認められたものの、−
次抗体に使用した被検液を、陽性と診断したところ、実
施例1と同一の診断結果が得られた。
第1図はカイコ核多角体病ウィルスのDNAの制限酵素
地図、第2図はpBFベクターの制限酵素地図、第3図
はpBFベクターの種類、第4図は8m細胞内でのHT
LV蛋白発現をSDSゲル電気末動で確認した図、第5
図は8m細胞内でのttTLV−I env蛋白発現を
ウェスタン・プロット法で確認した図、第6図はカイコ
核多角体席ウィルス及び組換えウィルスが感染したカイ
コ細胞、第7図はHTLシー■env蛋白遺伝子由来の
DNAの調製法、第8図は組換えベクターの調製法をそ
れぞれ示す、第9図はflTLV4 env遺伝子配列
のうちのp21蛋白部分の遺伝子及びアミノ酸配列図を
示す。 lid lll−・・旧ndIII 、 N−NcoI
、 八c−Accl、 Ec−EcoRIXSp−
5phl、Sa −Sa I I、旧IT ・=Hin
c II、B =4amlll、 X ・”XbaI。
地図、第2図はpBFベクターの制限酵素地図、第3図
はpBFベクターの種類、第4図は8m細胞内でのHT
LV蛋白発現をSDSゲル電気末動で確認した図、第5
図は8m細胞内でのttTLV−I env蛋白発現を
ウェスタン・プロット法で確認した図、第6図はカイコ
核多角体席ウィルス及び組換えウィルスが感染したカイ
コ細胞、第7図はHTLシー■env蛋白遺伝子由来の
DNAの調製法、第8図は組換えベクターの調製法をそ
れぞれ示す、第9図はflTLV4 env遺伝子配列
のうちのp21蛋白部分の遺伝子及びアミノ酸配列図を
示す。 lid lll−・・旧ndIII 、 N−NcoI
、 八c−Accl、 Ec−EcoRIXSp−
5phl、Sa −Sa I I、旧IT ・=Hin
c II、B =4amlll、 X ・”XbaI。
Claims (1)
- 成人T細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来するD
NAのうち、p21をコードするDNAを含み、且つ該
DNAの5′末端から上流の17塩基対以内で切断され
た断片により、カイコ核多角体病ウィルスの多角体蛋白
構造遺伝子の一部の組換えを行い、次いで該組換えウィ
ルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させて
発現されたポリペプチドを抗原とする成人T細胞白血病
ウィルス感染診断薬。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1197984A JP2525054B2 (ja) | 1989-08-01 | 1989-08-01 | 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1197984A JP2525054B2 (ja) | 1989-08-01 | 1989-08-01 | 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63152375A Division JPH0257191A (ja) | 1988-06-22 | 1988-06-22 | ポリペプチドの製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02103471A true JPH02103471A (ja) | 1990-04-16 |
JP2525054B2 JP2525054B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=16383578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1197984A Expired - Lifetime JP2525054B2 (ja) | 1989-08-01 | 1989-08-01 | 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2525054B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0643835A1 (en) * | 1992-02-24 | 1995-03-22 | Genelabs Technologies, Inc. | Htlv-i/htlv-ii assay and method |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58187861A (ja) * | 1982-04-26 | 1983-11-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 成人型t細胞性白血病関連抗体の測定法 |
JPS5962527A (ja) * | 1982-09-30 | 1984-04-10 | Eisai Co Ltd | 成人t細胞白血病関連抗原の製造方法 |
JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
-
1989
- 1989-08-01 JP JP1197984A patent/JP2525054B2/ja not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58187861A (ja) * | 1982-04-26 | 1983-11-02 | Otsuka Pharmaceut Co Ltd | 成人型t細胞性白血病関連抗体の測定法 |
JPS5962527A (ja) * | 1982-09-30 | 1984-04-10 | Eisai Co Ltd | 成人t細胞白血病関連抗原の製造方法 |
JPS619288A (ja) * | 1984-06-21 | 1986-01-16 | Dai Ichi Seiyaku Co Ltd | ペプチド類の製法 |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0643835A1 (en) * | 1992-02-24 | 1995-03-22 | Genelabs Technologies, Inc. | Htlv-i/htlv-ii assay and method |
EP0643835A4 (en) * | 1992-02-24 | 1996-04-03 | Genelabs Tech Inc | TITRATION OF HTLV-I / HTLV-II AND METHOD. |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2525054B2 (ja) | 1996-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kunz et al. | Characterization of the interaction of Lassa fever virus with its cellular receptor α-dystroglycan | |
JPH10500281A (ja) | 非病原性hiv−1種 | |
CN111450244B (zh) | 一种防治冠状病毒感染的细胞组合及其应用 | |
RU2743963C1 (ru) | Средство для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 в жидкой форме (варианты) | |
JP3095219B2 (ja) | LAVに対する抗体と反応性であるgagによりコードされたペプチド及びその使用 | |
JP2001505778A (ja) | HIV感染の初期の検出のための未変性の(non―dentured)HIV抗原を使用する新規のEIA試験 | |
JP7369276B2 (ja) | 重症急性呼吸器症候群ウイルスsars-cov-2に対する発現ベクター | |
US6924095B2 (en) | Retrovirus isolated from mantle histiocytes in mantle cell lymphoma | |
JPH04507100A (ja) | Hivのペプチドフラグメント | |
Mahnke et al. | Specific enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to the human spumavirus | |
JPH02203793A (ja) | ヒト免疫不全ウイルスタイプ1のエンベロープ遺伝子から誘導されたポリペプチドを含むワクチン | |
JPH02103471A (ja) | 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 | |
CN108218982A (zh) | 人巨细胞病毒anti-UL148多克隆抗体及其制备方法与应用 | |
JP2656119B2 (ja) | 成人t細胞白血病ウイルス感染診断薬 | |
JPH0367172A (ja) | 成人t細胞白血病ウィルス感染診断薬 | |
WO2001085928A1 (fr) | Procede de preparation de vecteur de virus | |
US20100178302A1 (en) | Chronic pathogen-expressing cell lines | |
Lairmore et al. | Other human retrovirus infections: HTLV-I and HTLV-II | |
RU2761904C1 (ru) | Применение средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 у детей | |
JP5409361B2 (ja) | 猫免疫不全ウイルスワクチン接種猫の検査方法、および該検査用抗原 | |
WO2024001845A1 (zh) | 一种缺陷型丝状病毒的制备方法及其应用 | |
JP2656088B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法並びにその方法に用いる、組換えベクターおよび組換えウイルス | |
JPH0231674A (ja) | 組換えウィルス | |
JPH0231679A (ja) | 組換えベクター | |
CN116376977A (zh) | 风疹病毒重组病毒样颗粒表达载体及其用途 |