JPH0150382B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は新規なゲル化物の製造法に関する。 既存蛋白資源の中には、生物価が低い、機能特
性が乏しい等の理由から利用が制限されているも
のが多い。これらの蛋白資源を意図的に組織化食
品に適するような機能性、栄養性を有する蛋白素
材の改質する技術が確立されるなら、その利用度
が増加するだけでなく、高品質の蛋白食品を作り
うる。改質技術の１つとして酵素修飾による改質
があるが、現状では加水分解酵素による改質が主
なものであり、他の酵素の利用例は少ない。 本発明者らはアシル転移酵素の一つであるトラ
ンスグルタミナーゼに着目し、食品蛋白中に含量
の多いグルタミン（Glnと略す）残基とリジン
（Lysと略す）残基間に架橋を形成させ、ゲル状
物質を製造できることを発見し、本発明を完成し
た。 即ち、本発明は蛋白質濃度２重量％以上の蛋白
含有溶液に、トランスグルタミナーゼを蛋白１ｇ
に対して１ユニツト以上、添加してゲル化させる
ことを特徴とするゲル化物の製造法である。 本発明に用いられる蛋白質は、その起源に制約
されるものではなく植物性蛋白質、動物性蛋白質
などいかなるものでも使用できる。植物性蛋白質
としては油糧種子の脱脂物（脱脂大豆）及びそれ
らより分離した蛋白質を挙げることができる。ま
た、動物性蛋白質としては乳蛋白質、ゼラチン、
コラーゲン等を例示することができる。 これらの蛋白質の２重量％以上の蛋白含有溶液
を調製する。蛋白含有溶液の濃度は比較的高いこ
とが望ましく通常２重量％以上、好ましくは５重
量％ないし15重量％であればよい。この場合、澱
粉、多糖類、調味料、着色料、香辛料などの食品
添加物を配合することができる。これらの使用量
は、後のトランスグルタミナーゼによるゲル化を
阻害しない範囲で適宜選択して添加すればよい。
蛋白溶液の濃度が２重量％より少ない場合には、
溶液状態のまま、もしくは沈澱を生じゲル化しな
い。また、蛋白含有溶液のPHは６ないし９であれ
ば好ましい。 この蛋白含有溶液にトランスグルタミナーゼを
蛋白１ｇに対して１ユニツト以上添加してゲル化
させる。このトランスグルタミナーゼは
Connellanらの方法〔Journal of Biological
Chemistry、246（４）、1093（1971）〕に従つて、
モルモツトの肝臓により調製される。即ち、モル
モツトの肝臓をシヨ糖溶液に分散させたものを遠
心分離し、上清液を回収し、これジエチルアミノ
エチルセルロースカラムにて分画することによつ
て、粗製トランスグルコシダーゼを得る。これを
１％硫酸プロタミンで沈澱させ、沈澱物を回収す
る。さらにこの沈澱物を0.2M Tris−酢酸緩衝液
で洗浄後、0.05M硫安−５ｍＭ Tris−HCl緩衝
液（２ｍＭエチレンジアミン４酢酸（以下
EDTAと略す）を含む）を用いて抽出し、得ら
れた抽出液をカルボキシメチルセルロースカラム
でプロタミンを除去し、口液に硫酸アンモニウム
溶液（1M EDTAを含む）を添加し遠心分離を
行ない、沈澱物を回収する。沈澱物を10ｍＭ
Tris−酢酸緩衝液（１ｍＭ EPTA、0.16M
KClを含む）で溶解し、遠心分離した上清液を10
％アガロース（Bio Gel Ａ−0.5M）でゲル濾過
し、得られた高活性画分を限外濾過で濃縮し、精
製されたトランスグルタミナーゼを得る。 他のトランスグルタミナーゼの調製法として
は、Clarkeらの方法〔Archives of
Biochemistry and Biophysics、79、338（1959）〕
がある。即ち、モルモツト肝300ｇに、0.25Mシ
ヨ糖溶液600mlを加え、ホモゲナイズする。これ
を遠心分離し、上清を得る。 0.01Mとなるよう酢酸ナトリウムを加え、酢酸
にてPH5.0に調整し、遠心分離する。得られた沈
澱に0.05Mリン酸緩衝液（PH6.5）30ml添加した
ホモゲナイズする。この懸濁液を遠心分離し、そ
の上清を0.001Mリン酸緩衝液（PH7.5）に対して
透析し、これを粗トランスグルタミナーゼ溶液と
して用いる方法である。 これらの方法は、操作順序を変化させたり、添
加量、濃度、PH値分離装置などを若干変えても差
しつかえない。このようにして得たトランスグル
タミナーゼの蛋白濃度をロウリー法Journal of
Biological Chemistry、193、265（1951）〕で、
酵素活性をＮ−カルボベンゾキシ−Ｌ−グルタミ
ニルグリシンとヒドロキシアミンを用いたヒドロ
キシサム酸法〔Journal of Bilogical
Chemistry、241（23）、5518（1966）〕で測定すれ
ば、調製した酵素溶液の比活性は6.0ないし13.0
の範囲の値を示す。また、電気泳動によつて分子
量を測定すると8.0万ないし9.0万の範囲の値であ
る。このトランスグルタミナーゼ溶液は−30℃程
度の低温にて保存し、適時解凍して使用すること
ができる。 このようにして得られるトランスグルタミナー
ゼを蛋白１ｇに対して１ユニツト以上、添加して
ゲル化させる。添加量が１ユニツトより少ない場
合には、高粘性の溶液となる。また、2000ユニツ
トより多く添加しても効果はそれほど変わらな
い。 トランスグルタミナーゼで蛋白分子にGlu−
Lye架橋が生じることは知られている（J.E.Folk
and J.S.Finlayson “Advances in Protein
Chemistry”Vol.31 ed.by C.B.Anfinsen、J.T.
Edsall and F.M.Richards、Academic Press
Inc.、New York、N.Y.、1977、p.l.）が、高い
蛋白溶液にトランスグルタミナーゼを作用させた
時に生成されるゲルがGlu−Lye架橋によるもの
である事は、以下の実験データから推察された。 トランスグルタミナーゼの反応部位となる
Lys残基をアセチル化及びサクシニル化した
αslガゼインにトランスグルタミナーゼを作用
させてもゲル化しなかつた。 反応溶液中に、Ｓ−Ｓ環元剤であるジチオス
レイトールを共存させて反応を行なわせている
ので、Ｓ−Ｓ結合を主体とするゲルではない。 加熱・冷却して得られる通常のゼラチンゲル
とトランスグルタミナーゼでゲル化させたゼラ
チンゲルの各々の弾性率を測定したところ、通
常のゼラチンゲルは温度が高くなるにつれ、著
しく弾性率が低下した。これはゲルの網目構造
をつくる架橋が共有結合などのような強い結合
でなく、二次的結合であるため、温度上昇とと
もにこの弱い結合が切れるためであると考えら
れる。これに比してトランスグルタミナーゼに
よるゲルは温度が変化しても、その変化量は少
なく、共有結合性の強いゲルである事が示唆さ
れた。事実両方のゲルを40℃以上にさらすとト
ランスグルタミナーゼによるゲルは、そのまま
であるが通常のゼラチンゲルは溶融した。 以上より、Glu−Lys架橋によつてゲルが生成
されており、Ｓ−Ｓの架橋によるゲルではないと
考えられる。 このようにして得られたゲル化物は、比較的短
時間、即ち、１分以内、長くとも30分以内にてゲ
ル化し、しかも一般のゲル化物と同等のゲル物性
を備えたものである。 また、本発明で用いる蛋白含有溶液は単に蛋白
質と水との混合物に限らず、蛋白質、水及び油脂
を混合したエマルジヨンであつてもよい。 更にこのゲル化物は加熱することにより、強度
のより強いゲルを作ることができる。 本発明のゲル化物は、従来のゲル状食品と同様
にヨーグルト、ゼリーなどとして用いることもも
ちろん、未加熱で製造でき、熱に安定なゲルであ
るため、マイクロカプセルの素材、固定化酵素の
素材などとしても用いることができるものであ
る。 実施例 １ 以下の方法によりトランスグルタミナーゼを調
製した。モルモツト肝800ｇに冷0.25Mシヨ糖溶
液約２加え、20000rpm、２分でホモゲイズし、
遠心分離（105000×ｇ、５℃、１時間）を行ない
上清を得た。 これを５ｍＭトリス・塩酸緩衝液（２ｍ
MEDTA 含有、PH7.5）で平衡化してある
DEAEセルロースカラムに添加・吸着させた後、
上記緩衝液の食塩濃度を0Mから1.0Mまで変化さ
せる勾配溶離法で分画し、酵素活性の高い画分を
得た。 これをゆつくりと撹拌しながら１％硫酸プロタ
ミン40mlを添加し、遠心分離（14600×ｇ、15分、
５℃）で沈澱を集め、これを0.2Mトリス・酢酸
緩衝液（PH6.0）に懸濁、ホモゲイズして洗い、
遠心分離（2500×ｇ、１分、５℃）で、沈澱を集
めた。 この沈澱より、0.05M硫安を含む５ｍＭトリス
塩酸緩衝液（２ｍＭ EDTA含有、PH7.5）を添
加し、ホモゲイズすることによつて、トランスグ
ルタミナーゼを抽出した。これを３度繰り返し、
集めた抽出液を５ｍＭトリス・コハク酸緩衝液
（２ｍＭ EDTA含有、PH6.0）で平衡化したカル
ボキシメチル・セルロースカラムに添加し、プロ
タミンを除去し、濾液に1M EDTA（PH8.0）2.4
mlと硫安47.4ｇを加え、よく撹拌した後に、遠心
分離（15000×ｇ、10分、５℃）で沈澱を集めた。 これを10ｍＭトリス・酢酸緩衝液（１ｍＭ
EDTA 0.16M KCl 含有、PH6.0）に溶解し、遠
心分離（27000×ｇ、30分、５℃）で難溶物を除
いた後、上清を同じ緩衝液で平衡化している10％
アガロース（Bio Ge Ａ−0.5M）でゲル濾過を
行ない、活性の高い画分を集め、これを10〜20
mg／mlの濃度となるよう限外濾過（UM−10、ア
ミコン社製）で濃縮し、トランスグルタミナーゼ
溶液とした。この溶液を−30℃以下で凍結保存
し、適時溶解し使用した（尚、これは常時５℃で
操作し調製した。）。 表１に示した基質蛋白にトランスグルタミナー
ゼを作用させ、ゲル化物を得た。

【表】

【表】 実施例 ２ α_slカゼイン、Na−カゼイネート、大豆蛋白
11Sグロブリン、水抽出大豆蛋白、各々500mgを
0.1Mトリス塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl₂、20ｍＭ
ジチオスレイトール含有、PHを7.6）3.5mlに溶解
し、これに大豆油1.5mlを加えて20000rpmで３分
間ホモゲナイズして乳化物を得た。これにトラン
スグルタミナーゼを蛋白１mgに対して0.09ユニツ
ト加えると即座にゲル化物を得た。 実施例 ３ α_slカゼイン、大豆蛋白11Sグロブリン及び大豆
蛋白7Sグロブリンの２、５、10重量％溶液を
0.1Mトリス・塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl₂、20ｍ
Ｍジチオスレイトール含有PH7.6）で0.5ml作成
し、37℃で各々にトランスグルタミナーゼを蛋白
１mgに対して0.1ユニツトの割合で加えて、ゲル
化するか否を判定し、表２の結果を得た。

【表】 ○：ゲル化
△：弱いゲル
×：溶液のまま
実施例 ４ α_slカゼインの５重量％溶液と大豆蛋白11Sグロ
ブリンの10重量％溶液を0.1Mトリス−塩酸緩衝
液（５ｍＭ CaCl₂、200ｍＭジチオスレイトー
ル含有、PH7.6）で調製し、これら溶液0.8mlに対
して、トランスグルタミナーゼを蛋白１mgあたり
５×10^-4〜2.0ユニツト添加してゲル化するか否
かを観察したところ、表３に示すような結果を得
た。

【表】 実施例 ５ ５ｍＭ CaCl₂と20ｍＭジチオスレイトールを
含んだPH7.0〜PH9.0のトリス−塩酸緩衝液を調製
し、それを用いて、５重量％α_slカゼイン溶液と
10重量％大豆蛋白11Sグロブリン溶液を各0.8mlず
つ作成し、トランスグルタミナーゼを蛋白１mgに
対して0.1ユニツト添加してゲル化するか否かを
観察した。結果を表４に示す。

【表】 ◎：即座にゲル化
○：ややゲル化に時間を要した
×：溶液のまま
実施例 ６ 直径9.3mm、高さ15mmのテストピース作成容器
に試料溶液１mlを流し込み、下記に示す様にゲル
化させて円筒ゲルを作成し、これをレオログラム
（東洋精機製作所(株)、CV−100）にて、18から25
℃まで昇温させ、各温度の貯蔵弾性率を測定し
た。 ゼラチン冷却ゲル 10重量％溶液となるように、ゼラチンに水を
加え、60℃、３分で完全にゼラチンを溶解後、
１mlをテストピース作成容器に流し込み、３℃
にて20分放置し、ゲル化させ室温に戻して測定
した。 ゼラチンTGaseゲル ゼラチンに10重量％溶液となるように0.1M
トリス塩酸溶液（５ｍＭ CaCl₂、20ｍＭジチ
オレイトール含有、PH7.6）を加え、60℃、３
分で完全にゼラチンを溶解し、テストピース作
成容器に流し込み、すばやくトランスグルタミ
ナーゼをゼラチン１mgに対して0.1ユニツトの
割合で加え、室温に１時間放置しゲル化させ、
測定した。 結果を図１に示す。ゼラチン冷却ゲルは温度が
増加するとともに貯蔵弾性率が著しく低下する
が、それに比してゼラチンTGaseゲルは温度変
化の影響が少なかつた。 実施例 ７ α_slカゼインについて５重量％、大豆11Sグロブ
リンについては10重量％となるように0.1Mトリ
ス・塩酸緩衝液（５ｍＭ CaCl₂、20ｍＭジチオ
スレイトール含有、PH7.6）で１mlを調製し、こ
れにトランスグルタミナーゼを蛋白１mgに対して
0.1ユニツトを加えてゲルを得た。このゲルを、
さらに100℃に20分間保つた後、室温まで冷却し
た。 ゲル化させた直後のゲルと、加熱処理したゲル
についてレオメーター（不動工業(株)、NRM−
2002J）で、プランジヤー5Φ、ボール型）を侵入
させた時の最高荷重を測定し、ゲル強度とした。
結果を表５に示す。

【表】 上表からわかるようにいずれの場合も加熱処理
した方がゲル強度が増加した。

【図面の簡単な説明】

図１は実施例６の結果を示す。図中、横軸は温
度（℃）、縦軸は貯蔵弾性率（dyn／cm²）であり、
実線は本発明のゼラチンTGaseゲルを、破線は
ゼラチン冷却ゲルを示す。

【特許請求の範囲】

１ カゼインナトリウムまたはカゼインカルシウ
ムに環状リン酸類の少なくとも１種と多糖類の少
なくとも１種を配合してなることを特徴とする耐
酸性カゼイン粉末。 ２ 環状リン酸類として、ヘキサメタリン酸ナト
リウム、ウルトラリン酸ナトリウムおよびフイチ
ン酸からなる群から選ばれる１種または２種以上
を用いる第１項記載の粉末。 ３ 多糖類として、アルギン酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、タイク
ロン酸、コロミン酸、λ−カラゲナン、κ−カラ
ゲナン、カロニン硫酸、ポリリポースリン酸、ポ
リアセチルガラクトサミンリン酸、アルギン酸ナ
トリウム、カルボキシメチルセルロース、繊維素
グリコール酸カルシウム、繊維素グリコール酸ナ
トリウム、デンプングリコール酸ナトリウム、デ
ンプンリン酸エステルまたはポリアクリル酸ナト
リウムからなる群から選ばれる１種または２種以
上を用いる第１項記載の粉末。