JPH0147159B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はアレスロロンの生化学的光学分割法に
関する。さらに詳しくは、アルスロバクター属、
クロモバクテリウム属、ノカルデイア属、シユー
ドモナス属に属する微生物の生産するエステラー
ゼを（±）−アレスロロンの有機カルボン酸（炭
素数１〜18個の飽和または不飽和のカルボン酸）
エステルに作用させて不斉加水分解して、光学純
度の高い光学活性アレスロロンとその対掌体のエ
ステルを得る工業的に有利な（±）−アレスロロ
ンの生化学的光学分割法に関する。 アレスロロンと第一菊酸のエステルであるアレ
スリンは天然ピレトリンに類似した構造を有し、
強い速効的殺虫性と温血動物に対する低毒性を兼
ね備えた優れた殺虫剤エステルとして汎用されて
いる。 アレスロロンは４位に不斉炭素を持ち、二種の
光学異性体が存在する。アレスリンにおいてはア
ルコール側（アレスロロン）の立体異性が効力上
重要な要因を占め（＋）−アレスロロンのエステ
ルは対応する（−）−アレスロロンのエステルに
比べ、その殺虫効力は数倍優れている。従つて工
業的に有利に（＋）−アレスロロンを製造する技
術が望まれている。 （＋）−アレスロロンを製造する方法としては、
これまで（＋）−トランス第一菊酸と（＋）−アレ
スロロンとのエステルである（＋）−トランス
（±）−アレスリンのセミカルバゾンを再結晶によ
り単離し、次いでこれを加水分解して（＋）−ア
レスロロンを得る方法（Journal of Organic
Chemistry，第19巻第457頁、1954年）や（±）−
アレスロロンをフタル酸の半エステルとし、次い
でこれを光学活性アミンを反応させ、（＋）−アレ
スロロンのジアステレオマー塩を生成させ、これ
を分解した後使用したアミンと半エステルとして
回収し、次いでこの半エステルを加水分解して
（＋）−アレスロロンを得る方法（特開昭49−
12047号、特開昭49−127952号公報）が知られて
いる。しかしながらこれらの方法は通算収率が低
いこと、複雑な工程を必要とすることおよび高価
な光学活性試薬を必要とすることなど、工業的製
法としては、必ずしも満足できるものではない。 また、このような有機合成化学的な光学分割法
の他には、特公昭56−9917号公報に記載されてい
るような微生物または酵素による（±）−アレス
ロロンの光学分割法が知られている。すなわち特
定の微生物の培養物もしくはこの培養物より分離
したエステラーゼを用いて（±）−アレスロロン
の脂肪酸エステルを不斉加水分解し、（−）−アレ
スロロンと（＋）−アレスロロンの脂肪酸エステ
ルに分割し後者を脱アシル化して（＋）−アレス
ロロンを取得するというものである。 この方法は複雑な工程を必要としない点で優れ
た方法ではあるが、不斉加水分解操作における
基質濃度が低いこと、すなわち、容積効率が低い
こと、および加水分解率も低いこと遊離して
くる（−）−アレスロロンが一部ラセミ化してい
ること、即ち、加水分解の光学選択性が低いこと
得られる（＋）−アレスロロンの収率および光
学純度が必ずしも高くないなどの種々の点で、必
ずしも満足できるものではない。 本発明者らはこれらの諸問題点を克服し、工業
的に真に有利な（±）−アレスロロンの生化学的
光学分割法を見出すべく、水に不溶なエステル基
質に対して活性を有する、リパーゼを含む広義の
エステラーゼ（本明細書においてエステラーゼと
記載されているのはリパーゼを含む広義のエステ
ラーゼを意味する。）について研究を重ねた結果、
アルスロバクター属、クロモバクテリウム属、ノ
カルデイア属、シユードモナス属に属する微生物
の生産するエステラーゼがアレスロロンの有機カ
ルボン酸エステルに対し、高い不斉加水分解活性
を有し、これらのエステラーゼ、または上記微生
物の生産するエステラーゼを含有する微生物の培
養液、培溶濾液もしくは菌体を（＋）−アレスロ
ロンの有機カルボン酸エステルに作用させること
により極めて光学純度の高い光学活性アレスロロ
ンとその対掌体のエステルが収率よく得られるこ
とを見い出しこれに種々の検討を加え、本発明を
完成するに至つた。 次に本発明を詳細に説明する。本発明方法にお
いて原料として使用される（±）−アレスロロン
の有機カルボン酸エステルは公知であり、一般の
エステル製造の常法、例えば（±）−アレスロロ
ンに有機カルボン酸の無水物を反応させる方法あ
るいは有機カルボン酸クロライドを有機塩基の存
在下で反応させることなどにより容易に製造する
ことができる。 また、本発明で使用される微生物はアルスロバ
クター属、クロモバクテリウム属、ノカルデイア
属、シユードモナス属に属する微生物であつて、
リパーゼを含む広義のエステラーゼを生産する微
生物である。この微生物の具体例として、例えば
次の菌株が挙げられる。 (1) アルスロバクター・ウレアフアシエンス Arthrobacter ureafaciens IFO12140 (2) アルスロバクター シンプレツクス Arthrobacter simplex IFO3530 (3) シユードモナス フルオレツセンス Pseudomonas fluorescens IFO3081 (4) シユードモナス・フラギ Pseudomonas fragi IFO3458 (5) クロモバクテリウム ビスコサム Chromobacterium viscosum ATCC6918 (6) ノカルデイア アステロイデス Nocardia asteroides IFO3424 (7) ノカルデイア エリスロポリス Nocardia erythropolis IFO12320 これらの菌株はいずれもAmerican Type
Culture Collection（ATCC）または日本微生物
株保存連盟（JFCC）に加入の保存機関に保存さ
れ、この保存機関より入手することができる。な
おIFOは大阪市の財団法人酸酵研究所を示す。 上記微生物の培養は、通常常法に従つて液体培
養を行うことにより培養液を得る。例えば、滅菌
した液体培地〔かび類、酵母類用には麦芽エキ
ス・酵母エキス培地（水１にペプトン5.0ｇ、
グルコース10.0ｇ、麦芽エキス3.0ｇ、酵母エキ
ス3.0ｇを溶解し、PH6.5とする）細菌類用には加
糖ブイヨン培地（水１にグルコース10.0ｇ、ペ
プトン5.0ｇ、肉エキス5.0ｇ、NaCl13.0ｇを溶解
しPH7.2とする）〕に微生物を接種し、通常、20〜
40℃で１〜３日間往復振盪培養を行う。また必要
に応じて固体培養を行つてもよい。 また、これらの微生物起源のエステラーゼのな
かには市販されているものがあり、容易に入手す
ることができる。市販エステラーゼの具体例とし
てはシユードモナス属のリパーゼ（天野製薬製）
アルスロバクター属のリパーゼ（リパーゼ合同
ISL（合同酒精製））、クロモバクテリウム属のリ
パーゼ（東洋醸造製）などが挙げられる。 本発明方法を実施するに際し、（±）−アレスロ
ロンの有機カルボン酸（炭素数１〜18個の飽和ま
たは不飽和のカルボン酸）エステルの不斉加水分
解は、上記微生物を培養した培養液、培養液から
分離した菌体、エステラーゼを含有する培養濾
液、あるいは各種酵素分離法によつて菌体または
培養濾液から分離した粗製エステラーゼ、精製エ
ステラーゼおよびエステラーゼ含有抽出液または
濃縮液と（±）−アレスロロンの有機カルボン酸
エステルを混合し、撹拌または振盪することによ
り行われる。また、固定化菌体あるいは固定化エ
ステラーゼも使用することもできる。 （±）−アレスロロンの有機カルボン酸エステ
ルの不斉加水分解を行なう条件としては、反応温
度は10〜70℃が適当であり、好熱菌の培養液また
は好熱菌の培養により得られた耐熱性エステラー
ゼでは50〜65℃、中温菌の培養液または特に耐熱
性を有しないエステラーゼでは20〜50℃が好まし
い。 反応時間は通常３〜48時間であるが、反応温度
を高めたり酵素量を増加させるなどにより反応時
間の短縮も可能である。 反応中のPHは好アルカリ性菌の培養液やアルカ
リ性エステラーゼではPH８〜11、好アルカリ性で
ない微生物の培養液や耐アルカリ性を有しないエ
ステラーゼではPH５〜８が好ましい。また、加水
分解によつて生成する酢酸などの酸を中和し、反
応中のPHを一定に保つために緩衝液の使用が望ま
しく、リン酸ナトリウム、リン酸カリウムなどの
無機酸塩の緩衝液、酢酸ナトリウム、クエン酸ナ
トリウムなどの有機酸塩の緩衝液を使用すること
ができる。 基質である（±）−アレスロロンの有機カルボ
ン酸エステルの使用濃度は反応液に対し１〜
50wt％であり、本発明における好ましい基質濃
度が高いことから工業的に有利である。 次に、このようにして不斉加水分解反応を行つ
た後、遊離した光学活性アレスロロンと未反応の
対掌体エステルを分離回収する。この分離回収に
際しては水蒸気蒸留、溶媒抽出、分別蒸留、カラ
ムクロマトグラフイーなどの操作を適宜採用する
たとができる。例えば反応液を水蒸気蒸留し、留
出物をエーテル抽出するかあるいは直接反応液を
エーテル、酢酸エチル、ベンゼンなどの有機溶媒
で抽出し、この抽出物を分別蒸留し光学活性アレ
スロロンとその対掌体のエステルを分離取得する
か、または抽出物をシリカゲルのカラムクロマト
グラフイーにかけ、例えばｎ−ヘキサン−アセト
ン（５：１）溶液で溶出することにより、先ず光
学活性アレスロロンの有機カルボン酸エステルが
分離され、次いでメタノール溶出を行なうことに
よりその対掌体の遊離のアレスロロンが分離され
る。また、以上のようにして分離された光学活性
アレスロロンのエステルは、さらに脱アシル化す
ることにより容易に光学活性アレスロロンに導く
ことができる。脱アシル化の方法としては例えば
アレスロロンの有機カルボン酸エステルをメタノ
ールに溶解し、微量のナトリウムメチラートを加
え、アルコリシス（室温にて10時間程度）を行な
うかまたはアンモニア飽和メタノールを用いてア
ンモノリシス（10℃にて48時間程度）を行なうこ
とにより容易に光学活性なアレスロロンが得られ
る。 以上、詳細に説明したように本発明方法による
（±）−アレスロロンの光学分割は有機合成化学的
光学分割法に比べ工程が簡略であり、また高価な
光学活性試薬を必要としないので経済的に有利で
ある。また、従来の生化学的光学分割法に比し、
得られる光学活性アレスロロンの光学純度および
収率が高く、また不斉加水分解時の基質濃度を高
く維持できることから効率的で工業的に極めて有
利である。 次に本発明を実施例によつてさらに詳細に説明
するが本発明がこれらに限定されるものではな
い。 実施例 １ （±）−アレスロニルカプリレート500mgとアル
スロバクター属に属する微生物由来エステラーゼ
（リパーゼ合同BSL）30mgを緩衝液（PH
7.0MoIivaing緩衝液）３mlに加え、30℃で撹拌
子を用いて激しく撹拌しつつ反応させた。24時間
反応を行つた後反応物を酢酸エチルで抽出した。
抽出液をガスクロマトグラフイー（５％DEGS、
1.1m180℃）で分析しアレスロニルカプリレート
とアレスロロンのピーク面積比より加水分解率を
算出し、表１の結果を得た。抽出液を濃縮しシリ
カゲルカラムクロマトグラフイーにかけｎ−ヘキ
サン−アセトン（５：１）溶液で溶出し、未反応
のアレスロニルカプリレートを分離取得し、次い
でメタノール溶出によつて遊離アレスロロンを取
得した。ここで得られた遊離アレスロロンのうち
10mgをトルエン１mlに溶解し、これにピリジン
0.2ml（−）−α−メトキシ−α−トリフルオロメ
チルフエニル酢酸クロライド（（−）−MTPAク
ロライド）45mgを加え、１時間加熱還流し、アレ
スロロンの（−）−MTPAジアステレオマーと
し、ガスクロマトグラフイー（シリコンDCQF−
１、30mキヤピラリーカラム180℃）で光学異性
体分析を行ない、（＋）−アレスロロンのジアステ
レオマーと（−）−アレスロロンのジアステレオ
マーのピーク面積比より、遊離アレスロロンの光
学異性体型および光学純度を求めた。 一方、カラムクロマトラフイーの操作により得
られた未反応エステルはメタノール15mlに溶解
し、70％ナトリウムメチラート−メタノール溶液
10μを加え、一夜室温に放置し脱アシル化を行
ない減圧蒸留によつてアレスロロンを分離取得し
た。このアレスロロンを上記遊離アレスロロンの
場合と同様にして光学異性体比を分析し、未反応
エステルの光学異性体型および光学純度を求め
た。 結果を以下に示す。

【表】 実施例 ２ （±）−アレスロニルブチレート１ｇとアルス
ロバクター属に属する微生物由来のエステラーゼ
（リパーゼ合同BSL）20mgを緩衝液10mlに加え、
30℃で撹拌子を用いて激しく撹拌しつつ反応させ
た。以後、実施例１と同様の操作を行い以下の結
果を得た。

【表】 実施例 ３〜４ （±）−アレスロニルアセテート1.0ｇと表３に
記載した各エステラーゼ20mgを緩衝液10mlに加
え、以後実施例１と同様の操作を行い、表１の結
果を得た。

【表】 実施例 ５ 500ml肩付フラスコに加糖ブイヨン培地（１
にグルコース10.0ｇ、ペプトン5.0ｇ、肉エキス
5.0ｇ、NaCl3.0ｇを溶解し、PH7.2とする）〕100
mlを入れて殺菌した後、ノカルデイア・アステロ
イデスIFO3424を斜面培養から２白金耳接種し、
30℃で48時間往復振盪培養した。この培養液１
を濾過して培養濾液を得た。 この培養濾液10mlに（±）−アレスロニルフオ
ルメート1.5ｇとPH7.0McIlvaine緩衝液５mlを加
え、30℃で撹拌子を用いて激しく撹拌しつつ反応
させた。 以後、実施例１と同様の操作を行い以下の結果
を得た。

【表】

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アルスロバクター属、クロモバクテリウム
   属、ノカルデイア属、シユードモナス属に属する
   微生物の生産するエステラーゼを（±）−アレス
   ロロンの有機カルボン酸（炭素数１〜18個の飽和
   または不飽和のカルボン酸エステルに作用させ
   て、これを不斉加水分解して、光学活性なアレス
   ロロンとその対掌体のエステルに分割することを
   特徴とする（±）−アレスロロンの生化学的光学
   分割法。