JPH01302138A - 粒子解析装置のデータ補正方法 - Google Patents
粒子解析装置のデータ補正方法Info
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- JPH01302138A JPH01302138A JP63133149A JP13314988A JPH01302138A JP H01302138 A JPH01302138 A JP H01302138A JP 63133149 A JP63133149 A JP 63133149A JP 13314988 A JP13314988 A JP 13314988A JP H01302138 A JPH01302138 A JP H01302138A
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- fluorescence
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- particle
- fluorescent agents
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- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、例えばフローサイトメータ等のように、検体
粒子からの散乱光及び蛍光を検出することにより検体粒
子の性質を解析する粒子解析装置のデータ補正方法に関
するものである。
粒子からの散乱光及び蛍光を検出することにより検体粒
子の性質を解析する粒子解析装置のデータ補正方法に関
するものである。
［従来の技術］
フローサイトメータ等に用いられる従来の粒子解析装置
では、フローセルの中央部の例えば２００ ＪＬｍＸ
２００４ｍの微小な断面を有する流通部内を、シース液
に包まれて通過する検体粒子に光ビームを照射し、その
結果生ずる散乱光及び蛍光により、検体粒子の形状、大
きさ、屈折率等の粒子的性質を解明することが可能であ
る。
では、フローセルの中央部の例えば２００ ＪＬｍＸ
２００４ｍの微小な断面を有する流通部内を、シース液
に包まれて通過する検体粒子に光ビームを照射し、その
結果生ずる散乱光及び蛍光により、検体粒子の形状、大
きさ、屈折率等の粒子的性質を解明することが可能であ
る。
発生した蛍光は分光され、赤色蛍光及び緑色蛍光として
検出されるが、赤色蛍光と緑色蛍光の波長領域には重な
り合う部分があるため、互いの検出器に他の蛍光が混入
することが避けられない。
検出されるが、赤色蛍光と緑色蛍光の波長領域には重な
り合う部分があるため、互いの検出器に他の蛍光が混入
することが避けられない。
これは例えば白血球中のリンパ球を赤色及び緑色の蛍光
剤を用いて同時に染色し、それぞれの蛍光強度により２
種類の免疫機能を検査する場合に、一方の蛍光色だけが
発生しても双方の検出器に出力が生じてしまうという問
題となる。
剤を用いて同時に染色し、それぞれの蛍光強度により２
種類の免疫機能を検査する場合に、一方の蛍光色だけが
発生しても双方の検出器に出力が生じてしまうという問
題となる。
そこで、混入した信号を除去する補正を必要とするが、
従来の補正方法では測定者が検体粒子から発生する赤色
及び緑色蛍光の信号強度を見ながら補正の程度を手動で
決定しているために、個人差が生じて客観性に欠け、ま
た時間が掛かる等の問題点がある。
従来の補正方法では測定者が検体粒子から発生する赤色
及び緑色蛍光の信号強度を見ながら補正の程度を手動で
決定しているために、個人差が生じて客観性に欠け、ま
た時間が掛かる等の問題点がある。
［発明の目的］
本発明の目的は、上述の問題点を解決し、測定者個人に
よる信号の補正誤差を無くして正確な補正を可能とし、
更に測定時間が短縮できる粒子解析装置のデータ補正方
法を提供することにある。
よる信号の補正誤差を無くして正確な補正を可能とし、
更に測定時間が短縮できる粒子解析装置のデータ補正方
法を提供することにある。
［発明の概要］
上述の目的を達成するための本発明の要旨は、蛍光剤に
より染色した検体粒子に光ビームを照射し、検体粒子か
ら発生する蛍光を分光して、分光された蛍光強度を測定
する検出波長範囲が異なる複数個の検出器を備えた粒子
解析装置において、予め特定の蛍光剤で染色した検体粒
子に対して光ビームを照射し、前記各検出器が測定した
蛍光強度から前記特定の蛍光剤に対する前記各検出器間
の補正係数を算出し、測定時における前記各検出器の出
力から他の検出器が測定すべき蛍光成分の影響を除去す
るように補正することを特徴とする粒子解析装置のデー
タ補正方法である。
より染色した検体粒子に光ビームを照射し、検体粒子か
ら発生する蛍光を分光して、分光された蛍光強度を測定
する検出波長範囲が異なる複数個の検出器を備えた粒子
解析装置において、予め特定の蛍光剤で染色した検体粒
子に対して光ビームを照射し、前記各検出器が測定した
蛍光強度から前記特定の蛍光剤に対する前記各検出器間
の補正係数を算出し、測定時における前記各検出器の出
力から他の検出器が測定すべき蛍光成分の影響を除去す
るように補正することを特徴とする粒子解析装置のデー
タ補正方法である。
［発明の実施例］
本発明に係る方法を図示の実施例に基づいて詳細に説明
する。
する。
第１図は光学系と信号処理系の構成図である。
フローセルｌの流通部ｌａ内を高速暦法となったシース
液に包まれて、赤色及び緑色の蛍光剤で染色された検体
粒子が通過し、この流れと直交する方向にレーザー光源
２が配置されている。このレーザー光源２から照射され
たレーザービームＬを流通部１ａに導くために、光軸Ｇ
１上に結像レンズ３が配置され、更に検体粒子からの９
０°散乱光及び蛍光を測定するために、検体粒子の流れ
の方向と光軸０１にそれぞれ直交する方向である光軸０
２上に、フローセル１側から集光レンズ４、緑色光を反
射するグイクロイックミラー５、赤色光を反射するグイ
クロイックミラー６が順次に配列されている。グイクロ
イックミラー５の反射方向には集光レンズ７、光検出器
８が、グイクロイックミラー６の反射方向には集光レン
ズ９、光検出器１０が配列されている。
液に包まれて、赤色及び緑色の蛍光剤で染色された検体
粒子が通過し、この流れと直交する方向にレーザー光源
２が配置されている。このレーザー光源２から照射され
たレーザービームＬを流通部１ａに導くために、光軸Ｇ
１上に結像レンズ３が配置され、更に検体粒子からの９
０°散乱光及び蛍光を測定するために、検体粒子の流れ
の方向と光軸０１にそれぞれ直交する方向である光軸０
２上に、フローセル１側から集光レンズ４、緑色光を反
射するグイクロイックミラー５、赤色光を反射するグイ
クロイックミラー６が順次に配列されている。グイクロ
イックミラー５の反射方向には集光レンズ７、光検出器
８が、グイクロイックミラー６の反射方向には集光レン
ズ９、光検出器１０が配列されている。
信号処理系としては、光検出器８，１０の出力は信号処
理部１１に接続され、この信号処理部１１の出力はＡ／
Ｄ変換部１２を経てインタフェイス１３に接続されてい
る。更に、インタフェイス１３は解析部１４と接続され
、この解析部１４の出力が再び信号処理部１１に入力さ
れるようになっている。
理部１１に接続され、この信号処理部１１の出力はＡ／
Ｄ変換部１２を経てインタフェイス１３に接続されてい
る。更に、インタフェイス１３は解析部１４と接続され
、この解析部１４の出力が再び信号処理部１１に入力さ
れるようになっている。
ここで、結像レンズ３を介してフローセルｌの流通部１
ａに集光されたレーザービームＬは検体粒子によって散
乱され、９０°蛍光は集光レンズ４を経て、緑色蛍光は
グイクロイックミラー５で、赤色蛍光はグイクロイック
ミラー６で反射され、それぞれ集光レンズ７．９を介し
て光検出器８．１０に入射し電気信号に変換される。光
検出器８．１０からの電気信号は後述する信号処理部１
１へ入力され１次にＡ／Ｄ変換部１２でＡ／Ｄ変換され
、インタフェイス１３を介して解析部１４に送られる。
ａに集光されたレーザービームＬは検体粒子によって散
乱され、９０°蛍光は集光レンズ４を経て、緑色蛍光は
グイクロイックミラー５で、赤色蛍光はグイクロイック
ミラー６で反射され、それぞれ集光レンズ７．９を介し
て光検出器８．１０に入射し電気信号に変換される。光
検出器８．１０からの電気信号は後述する信号処理部１
１へ入力され１次にＡ／Ｄ変換部１２でＡ／Ｄ変換され
、インタフェイス１３を介して解析部１４に送られる。
第２図は緑色及び赤色蛍光剤とグイクロイックミラー５
．６の波長特性図を示し、曲線Ｇ及びＲは緑色及び赤色
の蛍光剤波長特性であり、グイクロイックミラー５は波
長がＤ１以下の光、グイクロイックミラー６は波長がＤ
２以上の光を反射する。
．６の波長特性図を示し、曲線Ｇ及びＲは緑色及び赤色
の蛍光剤波長特性であり、グイクロイックミラー５は波
長がＤ１以下の光、グイクロイックミラー６は波長がＤ
２以上の光を反射する。
このため、０１以下の波長は緑色蛍光として、 ０２以
上の波長は赤色蛍光として検出されることになる。一方
１曲線Ｇ及びＲは波長特性の重なりが大きいため、波長
がＤ２以上の斜線で示す緑色蛍光部分Ｇ°は赤色蛍光に
混入し、逆に波長が旧以下の赤色蛍光部分Ｒ′は緑色蛍
光に混入する。
上の波長は赤色蛍光として検出されることになる。一方
１曲線Ｇ及びＲは波長特性の重なりが大きいため、波長
がＤ２以上の斜線で示す緑色蛍光部分Ｇ°は赤色蛍光に
混入し、逆に波長が旧以下の赤色蛍光部分Ｒ′は緑色蛍
光に混入する。
第３図はこれらの波長部分が混入した電気信号を補正す
るために設けられた信号処理部内の補正系ブロック図で
あり、Ｇｌ、 Ｇ２は信号処理系のゲイン、１１．１２
はそれぞれ緑色、赤色蛍光による光電流、Ｒ１，Ｒ２は
電流電圧変換用抵抗、）［１，Ｒ２は補正係数である。
るために設けられた信号処理部内の補正系ブロック図で
あり、Ｇｌ、 Ｇ２は信号処理系のゲイン、１１．１２
はそれぞれ緑色、赤色蛍光による光電流、Ｒ１，Ｒ２は
電流電圧変換用抵抗、）［１，Ｒ２は補正係数である。
第２図からも理解し得るように、入力信号の補正を行う
には一方の信号の混入比分の信号を他方の信号から差し
引けばよい、そこで、赤色蛍光剤の波長特性曲線Ｒの内
部において、波長がＤ２以上の領域に対する領域Ｒ°の
割合をα、同様に緑色蛍光の曲線Ｇの内部において、波
長がＯ１以下の領域に対する領域Ｇ′の割合をβとし、
また補正前の電圧をＶｌ’ 、 Ｖ２°、補正後の電圧
をｖｌ、ｖ２とすると、次式が成立する。
には一方の信号の混入比分の信号を他方の信号から差し
引けばよい、そこで、赤色蛍光剤の波長特性曲線Ｒの内
部において、波長がＤ２以上の領域に対する領域Ｒ°の
割合をα、同様に緑色蛍光の曲線Ｇの内部において、波
長がＯ１以下の領域に対する領域Ｇ′の割合をβとし、
また補正前の電圧をＶｌ’ 、 Ｖ２°、補正後の電圧
をｖｌ、ｖ２とすると、次式が成立する。
ｖｌ＝ｖｔ′−に２Ｖ２’ −（ｔ）
＝ ＧＩＲＩ（Ｉｔ◆α１２） −に２Ｇ２Ｒ２（１２
◆βＩＩ）＝ （ＧＩＲＩ−βに２Ｇ２Ｒ２）１１＋
（αＧＩＲＩ−に２Ｇ２Ｒ２）１２・・・（２） ここで、光電流Ｉ２の影響を無くすには、αＧＩＲＩ−
Ｋ２Ｇ２Ｒ２＝ ０ −”、に２＝αＧＩＲＩ／ Ｇ２Ｒ２・・・（３）同様
にして、 Ｖ２＝ Ｖ２’−ＫＩＶＩ’ ・（
４）が成立し、 Ｋ１＝βＧ２Ｒ２／ ＧＩＲＩ ・・
・（５）ここで、 （３） 、 （５）式から、Ｖｌ
＝ ＧＩＲＩ （１−（Ｘ ７３ ）１１
・・・（６）Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２（１−（Ｘ １３ ）
ｆ２ ・・・（７）αβ＝ ＫＩＫ
２ ・・・（８）（
８） 、 （７） 、 （８）式から、Ｖｌ＝ ＧＩＲ
Ｉ （１−ＫＩＫ２）１１ ・ （
９）Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２（１−ＫＩＫ２）１２
・ （１０）（９） 、 （１０）式から、
補正後の値Ｖｌ、 Ｖ２を真の値Ｖ１＝ ＧＩＲＩＩｌ
、 Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２Ｖ２ト等シくスルタメニハ、第４
図に示すようにＶｌ、・ｖ２を更に次式で書き換えれば
よい。
＝ ＧＩＲＩ（Ｉｔ◆α１２） −に２Ｇ２Ｒ２（１２
◆βＩＩ）＝ （ＧＩＲＩ−βに２Ｇ２Ｒ２）１１＋
（αＧＩＲＩ−に２Ｇ２Ｒ２）１２・・・（２） ここで、光電流Ｉ２の影響を無くすには、αＧＩＲＩ−
Ｋ２Ｇ２Ｒ２＝ ０ −”、に２＝αＧＩＲＩ／ Ｇ２Ｒ２・・・（３）同様
にして、 Ｖ２＝ Ｖ２’−ＫＩＶＩ’ ・（
４）が成立し、 Ｋ１＝βＧ２Ｒ２／ ＧＩＲＩ ・・
・（５）ここで、 （３） 、 （５）式から、Ｖｌ
＝ ＧＩＲＩ （１−（Ｘ ７３ ）１１
・・・（６）Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２（１−（Ｘ １３ ）
ｆ２ ・・・（７）αβ＝ ＫＩＫ
２ ・・・（８）（
８） 、 （７） 、 （８）式から、Ｖｌ＝ ＧＩＲ
Ｉ （１−ＫＩＫ２）１１ ・ （
９）Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２（１−ＫＩＫ２）１２
・ （１０）（９） 、 （１０）式から、
補正後の値Ｖｌ、 Ｖ２を真の値Ｖ１＝ ＧＩＲＩＩｌ
、 Ｖ２＝ Ｇ２Ｒ２Ｖ２ト等シくスルタメニハ、第４
図に示すようにＶｌ、・ｖ２を更に次式で書き換えれば
よい。
Ｖ１＝（Ｖｌｏ−に２Ｖ２’ ）／（１−ＫＩＫ２）
−（１１）Ｖ２ ＝ （Ｖ２’−ＫＩＶＩ’ ）
／（１−ＫＩＫ２） ・（１２）次に、補正係
数Ｋｌ、 Ｋ２の算出方法について述べる。第５図は赤
色蛍光剤のみにより染色された検体粒子の測定データで
あり、縦軸を赤色蛍光強度、横軸を緑色蛍光強度とした
二次元サイトグラム上に１つのまとまった粒子群として
表示される。この粒子群をウィンドウＷで囲み、ウィン
ドウＷ内の粒子群の緑色及び赤色蛍光強度の平均値をＭ
Ｃ）ｌ １及びＭｅＯ２とすると、ＭＣｌｌ０ＣＶＩ’ ＭＣＨ２ｏｃ Ｖ２’
・ （１３）となる、ここで、赤色蛍光の緑色
側への混入成分を除去するためには、（１１）式でｖ１
＝０として、Ｋ２＝Ｖ１’ ／Ｖ２° ＝ＭＣＨ１／Ｍ
ＧＨ２・（１４）となるように補正係数に２を定めれば
よい、同様に、補正係数Ｋｌについては、線色蛍光剤の
みにより染色された粒子を測定して求めることができる
。
−（１１）Ｖ２ ＝ （Ｖ２’−ＫＩＶＩ’ ）
／（１−ＫＩＫ２） ・（１２）次に、補正係
数Ｋｌ、 Ｋ２の算出方法について述べる。第５図は赤
色蛍光剤のみにより染色された検体粒子の測定データで
あり、縦軸を赤色蛍光強度、横軸を緑色蛍光強度とした
二次元サイトグラム上に１つのまとまった粒子群として
表示される。この粒子群をウィンドウＷで囲み、ウィン
ドウＷ内の粒子群の緑色及び赤色蛍光強度の平均値をＭ
Ｃ）ｌ １及びＭｅＯ２とすると、ＭＣｌｌ０ＣＶＩ’ ＭＣＨ２ｏｃ Ｖ２’
・ （１３）となる、ここで、赤色蛍光の緑色
側への混入成分を除去するためには、（１１）式でｖ１
＝０として、Ｋ２＝Ｖ１’ ／Ｖ２° ＝ＭＣＨ１／Ｍ
ＧＨ２・（１４）となるように補正係数に２を定めれば
よい、同様に、補正係数Ｋｌについては、線色蛍光剤の
みにより染色された粒子を測定して求めることができる
。
このように、２種類の蛍光剤を用いる粒子解析の蛍光補
正を行うには、予め一方の蛍光剤だけが発光する二次元
サイトグラム上の粒子群にウィンドウをかけ、解析部１
４において各蛍光強度の平均値を算出して補正係数に１
、Ｋ２を求め、それらの値を信号処理部１１に入力した
後に測定を開始すればよい。
正を行うには、予め一方の蛍光剤だけが発光する二次元
サイトグラム上の粒子群にウィンドウをかけ、解析部１
４において各蛍光強度の平均値を算出して補正係数に１
、Ｋ２を求め、それらの値を信号処理部１１に入力した
後に測定を開始すればよい。
なお、補正係数Ｋｌ、 Ｋ２を求めるに当り、蛍当強度
の平均値ＭＣＨＩ、ＭｅＯ２の代りに、最大頻度の蛍当
強度を使用することもできる。また、補正係数の算出に
ついては、補正前のアナログ信号をＡ／Ｄ変換して解析
部１４に送り、解析部１４において行うことも可能であ
る。なお、蛍光剤の種類が更に増加しても、同様な方法
で校正が可能である。
の平均値ＭＣＨＩ、ＭｅＯ２の代りに、最大頻度の蛍当
強度を使用することもできる。また、補正係数の算出に
ついては、補正前のアナログ信号をＡ／Ｄ変換して解析
部１４に送り、解析部１４において行うことも可能であ
る。なお、蛍光剤の種類が更に増加しても、同様な方法
で校正が可能である。
また、蛍光剤が１種類でも、結合する検体粒子によって
は発生する波長領域が異なる場合にも応用可能である。
は発生する波長領域が異なる場合にも応用可能である。
［発明の効果］
以上説明したように本発明に係る粒子解析装置のデータ
補正方法は、単一又は複数の蛍光剤を用いた場合の信号
強度から予め補正係数を算出して補正することにより、
補正値の客観性及び信頼性が向上し、また測定時間の短
縮や検体粒子の節約が可能となる。
補正方法は、単一又は複数の蛍光剤を用いた場合の信号
強度から予め補正係数を算出して補正することにより、
補正値の客観性及び信頼性が向上し、また測定時間の短
縮や検体粒子の節約が可能となる。
図面は本発明に係る粒子解析装置のデータ補正方法の実
施例を示し、第１図は構成図、第２図は蛍光剤及び分光
系の波長特性図、第３図、第４図は補正系の構成図、第
５図は二次元ヒストグラム図である。 符号１はフローセル、２はレーザー光源、５．６はグイ
クロイックミラー、８，１０は光検出器、１１は信号処
理部、１２はＡ／Ｄ変換部、１３はインタフェイス、１
４は解析部である。 特許出願人 キャノン株式会社 、５ 第１図
施例を示し、第１図は構成図、第２図は蛍光剤及び分光
系の波長特性図、第３図、第４図は補正系の構成図、第
５図は二次元ヒストグラム図である。 符号１はフローセル、２はレーザー光源、５．６はグイ
クロイックミラー、８，１０は光検出器、１１は信号処
理部、１２はＡ／Ｄ変換部、１３はインタフェイス、１
４は解析部である。 特許出願人 キャノン株式会社 、５ 第１図
Claims (1)
- １、蛍光剤により染色した検体粒子に光ビームを照射し
、検体粒子から発生する蛍光を分光して、分光された蛍
光強度を測定する検出波長範囲が異なる複数個の検出器
を備えた粒子解析装置において、予め特定の蛍光剤で染
色した検体粒子に対して光ビームを照射し、前記各検出
器が測定した蛍光強度から前記特定の蛍光剤に対する前
記各検出器間の補正係数を算出し、測定時における前記
各検出器の出力から他の検出器が測定すべき蛍光成分の
影響を除去するように補正することを特徴とする粒子解
析装置のデータ補正方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63133149A JPH01302138A (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | 粒子解析装置のデータ補正方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63133149A JPH01302138A (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | 粒子解析装置のデータ補正方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01302138A true JPH01302138A (ja) | 1989-12-06 |
Family
ID=15097862
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63133149A Pending JPH01302138A (ja) | 1988-05-31 | 1988-05-31 | 粒子解析装置のデータ補正方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01302138A (ja) |
-
1988
- 1988-05-31 JP JP63133149A patent/JPH01302138A/ja active Pending
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