JPH0128902B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は電気泳動度測定装置に係る。 更に詳しくは、本発明は試料検体中の粒子（本
発明において粒子とは、球又は円形のみでなく、
あらゆる形状のものを含む）の電気泳動度測定に
おいて、電場と直交する方向の任意の位置にある
複数Ｎ個の粒子の見掛けの電気泳動度と共に、所
定の位置を原点として電場と直交する方向に関し
て複数Ｎ個の粒子の位置を測定し、このデータ群
をもとに数値解析処理して、検体粒子の平均電気
泳動度、個々の粒子の真の電気泳動度を求める装
置に係る。 界面動電現象の測定装置として、例えば、コロ
イド荷電粒子の動きを観察する電気泳動装置は微
小表面荷電物質を扱う分野では良く知られてい
る。近年、免疫学の分野でも、例えば血液中の白
血球系の免疫細胞の動電現象から種々の免疫学的
情報を得る手段として、この電気泳動装置が注目
されている。一般に、電気泳動装置は測定セル、
電極及び電極槽、恒温槽、電源及び泳動度検出器
から構成されている。この電気泳動装置は測定セ
ルに直流電流を印加して電場を発生させ、この電
場に応じて測定セル内の荷電粒子が移動する時の
速度を測定することにより、粒子の荷電状態等を
知る機能を有するもので、かかる装置による基本
的な測定法は以下の通りである。即ち、メジウム
と称する泳動用電解液中に検体粒子を浮遊させた
測定セルに電場をかけ、そのときの検体粒子の移
動速度（Ｖ）と電場強さ（Ｅ）から、粒子の電気
泳動度を求める。求められる電気泳動度は電場強
さ当りの各粒子の移動速度、即ち、ボルト／セン
チメートル当りのミクロン／秒で表わされる。 ところで、上記泳動度は測定セルの帯電にもと
ずくメジウムの電気浸透効果を考慮しなければな
らない。通常の電気泳動装置では、測定セルとし
て光学的均質性、製作精度、洗浄の容易さ等の理
由でガラス製のものが用いられている。ガラス製
の容器は、ガラスの化学製造から推察されるよう
に、負に帯電している。この為、ガラス製測定セ
ル内のメジウム（泳動用電解液）は容器の壁近く
が正イオン濃度の高い状態で電気的に平衡とな
る。電気泳動を行なうため、この状態にある測定
セルの両側に電場をかけた場合、壁に沿つて電気
浸透による流動が同時に発生する。 従つて、測定される粒子の電気泳動度は、真の
電気泳動度とメジウムの電気浸透現象に伴う流れ
速度の代数和、即ち、見掛けの電気泳動度とな
る。この為、従来から実施されている真の電気泳
動度を求める方法は、流れの速度（Ｖ）＝０と推
定される位置、即ち理論的静止面上にある粒子の
みを測定対象とするものである。 しかしながら、理論的静止面上に位置する粒子
は確立的に極めて少ない。故に従来法では試料検
体に含まれる粒子の極く一部が測定されるのみで
あるため測定効率が悪く、また試料検体の統計学
的解析が困難である。更に従来法では測定セルと
して静止面決定の容易な形状、例えば角形（直方
体）、丸体（円筒状）等に制約され、しかもかか
る制約された測定セルの使用にもかかわらず、後
述の如く静止面上に位置する粒子を測定している
保証がない。 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究
の結果、個々の検体粒子の位置と見掛けの電気泳
動度との関係が通常の測定セルにおいて放物線上
にのる、という実験事実から、所定の位置を原点
として電場と直交する方向に関する複数Ｎ個の検
体粒子の位置と見掛けの電気泳動度の測定データ
群を未定のパラメーターを含む理論曲線（放物
線）にあてはめて、該パラメーターを決定し、更
にこの計算結果をもとに数値解析処理すれば、試
料検体の平均電気泳動度、或いは個々の粒子の真
の電気泳動度等を、静止面上に位置する粒子のみ
に測定が制約されることなく容易に求め得ること
を見い出し、本発明の完成に至つた。 上記知見に基ずく本発明は、 測定セルと、当該セル内に収容された試料検体
に電場をかけるための電場生成手段と、当該電場
生成手段によつて電場をかけられた試料検体中の
複数Ｎ個の粒子の見掛けの電気泳動度（M_j=1〜N）
を測定する測定手段と、所定の位置を原点として
電場と直交する方向に関して複数Ｎ個の前記粒子
の位置（X_j=1〜N）を測定する位置測定手段と、前
記測定手段からの測定値（M_j=1〜N）と前記位置
測定手段からの測定値（X_j=1〜N）とに基づいて粒
子の位置（Ｘ）と見掛けの電気泳動度（Ｍ）の関
係を示す二次多項式 Ｍ（Ｘ）＝−FX²＋AX＋Ｂ における係数Ｆ、Ａ及びＢを決定し、このように
して決定されたＦ、Ａ及びＢから測定セル内の泳
動用電解液の静止面を決定して粒子の真の電気泳
動度を決定する計算手段とを有した電気泳動度測
定装置を提供する。 上記試料検体とはあらゆる電解質溶液を含む。
また上記粒子とは、あらゆる帯電粒子を包含し、
例えば生体に係わる帯電粒子としては白血球、赤
血球、細胞（ガン細胞）、***等があり、その他
バクテリア、藻類、菌類、重金属粒子（例えば
TiO₂）等が例示され得る。 本発明は静止面上にある粒子のみを測定すると
いう従来の技術思想から完全に脱却したものであ
つて、下記の如き革新的な改善がなされる。 (1) 種々の実験条件に影響されることなく、真の
静止面を決定できる。従つて、測定値は極めて
信頼性の高いものとなる。 (2) 測定セル内の全粒子が測定対象粒子となるた
め、測定効率が大巾に改善され、検体粒子の少
ない試料であつても充分測定可能となる。 従つて本発明は個々の粒子の泳動度のバラツ
キが大きい免疫細胞についても統計学的な解析
を容易に且つ精度良く行うことができ、診断機
器設計への多大な貢献が期待される。 以下、本発明を詳述する。 本発明の装置の構成ブロツク図を第１図に例示
する。第１図の装置はデータ群の数値解析を円滑
にするため、顕微鏡２を有する電気泳動装置１、
粒子の位置測定手段としての位置測定器３、計算
処理制御装置４、個々の構成部分からの情報を転
送するためのデータ回線X_j，M_j及びそれを制御
するための制御回路C.S.からなる。なお、顕微鏡
２を有する電気泳動装置１は測定手段を構成し、
データ回線X_j，M_j、計算処理制御装置４及び制
御回路C.S.は計算手段を構成する。 測定については、通常の電気泳動度測定法に従
えば良く、この際、見掛けの電気泳動度と共に粒
子の位置をも同時に測定する。真の電気泳動度或
いは平均電気泳動度等は、測定された上記データ
群から、後述の如き数値解析処理して求められ
る。 本発明における顕微鏡電気泳動装置としては、
第２図の如き装置を例示し得る。位置測定器は、
所定の位置を原点として電場と直交する方向の検
体粒子の位置を検出できるものであれば特に限定
されないが、電気泳動度検出器として用いられる
顕微鏡の対物レンズ部の電場と直交する方向の移
動機構に、その移動量読み取り装置を付加したも
のが好ましい。該移動量のデータ伝送は、実験者
が直接目盛を読み取り、計算処理制御装置の入力
部分（キーボード等）から間接的に入力する方
法、或いは位置を電気信号に変換して計算処理制
御装置に直結し、直接的に入力する方法等により
行なわれる。 本発明は上記の如き構成の装置を用いて複数個
の検体粒子の位置及び見掛けの電気泳動度を測定
し、このデータ群を未定の係数としてのパラメー
ターを含む理論曲線にあてはめて数値解析するこ
とにより、簡単に検体粒子の平均電気泳動度又は
個々の粒子の真の電気泳動度を求め得る。ここで
該理論曲線は粒子の［位置、見掛けの電気泳動
度］のデータ群から仮定し得るが、通常の形状の
測定セル（例えば角型および円筒形）では放物線
である。 本発明に係る［位置・見掛けの泳動度］のデー
タ群の数値解析処理の基本的な原理は以下の通り
である。なお、ここでは角型測定セルについての
み説明するが、円筒形の測定セルについても同様
である。 試料検体中の任意の複数Ｎ個の粒子について、
粒子の位置（X_j=1〜N）と見掛けの電気泳動度
（M_j=1〜N）を測定し、データ群｛Xj、Mj｝_j=1〜Nを
収集する。角形測定セル内のメジウム流れ速度分
布が放物線であることから、上記測定値も平均的
には放物線分布となる。そこで、見掛けの電気泳
動度（Ｍ）と粒子位置（Ｘ）との関係が、未定の
係数としてのパラメータＦ、Ａ、Ｂをもつた二次
多項式 Ｍ（Ｘ）＝−FX²＋AX＋Ｂ ……(1) であると仮定する。これに前記データ群｛Xj、
Mj｝_j=1〜Nをあてはめ、最小自乗法を用いてパラメ
ータＦ、Ａ、Ｂを決定する。未定のパラメータ
Ｆ、ＡおよびＢを決定するためには、少なくとも
３個以上の粒子について位置および見掛けの電気
泳動度の測定が必要である。 式(1)の二次多項式が示す放物線Ｍ（Ｘ）のピー
クの位置（Ｃ）は、(1)式から明らかな通りＡ／
2Fである。 静止面（D^± _sp）はKomagataの公式(2)から求め
られる： ここにＣ：放物線のピークの位置（＝Ａ／2F） Ｄ：測定セルの厚み Ｈ：測定セルの高さ、を示す。 一方、個々の粒子の真の電気泳動度をmj、そ
の平均値をとすると、 Mj＝Ｖ（Xj）＋mj＝Ｖ（Xj）＋＋△ｊ ……(3) ここに、Ｖ（Xj）はメジウム流れ速度であり、
そして△ｊはmj−である。 放物線Ｍ（Ｘ）は見掛けの電気泳動度の平均値
であるから、 Ｍ（Xj）＝Ｖ（Xj）＋ ……(4) となる。 Ｖ（D^± _sp）＝０であるから、式(1)、(3)および(4)か
ら個々の粒子の真の電気泳動度mj及びその平均
値が次のように導き出される。 mj＝＋△ｊ＝＋Mj−Ｍ（Xj） ＝＋Mj−［−FXj²＋AXj＋Ｂ］ ＝Ｍ（D^± _sp）＝−Ｆ（D^± _sp）²＋Ａ（D^± _sp）＋Ｂ この時の粒子群の標本分布（S²）は S²＝_N 〓^j=1 ［Mj−Ｍ（Xj）］²／Ｎ−１ となる。 なお、上記数値解析で明らかな如く、Xjは必
らずしも測定セルの内壁面からの絶対距離である
必要はなく、相対距離さえ測定できれば、計算に
よつて求めた理論的静止面の値から絶対距離に補
正できる。 従来の電気泳動度測定は理論的静止面上の粒子
のみを測定対象としていたが、本発明によれば上
記解析原理で明らのかな如く、実測値の理論曲線
へのあてはめを行うので、測定セルの前面から後
面まで万べんなく測定することが好ましい。この
点、本発明は測定の容易さ、効率化という点で従
来法に比べて格段に有利である。 更に本発明は、実験的制約或いは検体試料の性
状から検体粒子の絶対数の少ない試料、又は泳動
度のバラツキの大きな試料の電気泳動度の測定に
も極めて有効な手段である。例えば、該試料の測
定においては、まず多数の検体粒子の準備可能な
バラツキの少ない標準試料から、前述の方法を用
いてメジウムの速度分布Ｖ（Ｘ）を求め、真の電
気泳動度mj＝Mj−Ｖ（Xj）とし、次いで検体粒
子の位置（Xj）と見掛けの電気泳動度（Mj）の
測定値を直接上記の式に代入する方法を教示し得
る。 以下、本発明における顕微鏡電気泳動装置の一
実施例を、第２図および第３図を参照しつつ説明
する。 かかる装置は、主として恒温槽５内に配置され
た測定セル６と、測定セル６の両端に接続された
電源装置７から泳動室への電流供給を行う電極
８，８′とよりなるものである。電源装置７と電
極８，８′は電場生成手段を構成する。恒温槽５
は、温度調節装置９及び温度センサー１０を具備
し測定セル６を定温に保つよう調整がなされてい
う。奥行550μｍ、高さ／奥行比＝10の石英製角
筒状の測定セル６はその両端にガラス管を有し、
これらはそれぞれサンプル注入口１１およびサン
プル排出口１２を具備しており、さらにこの各ガ
ラス管の開口端はガスケツト１３，１３′および
隔膜１４，１４′を介して、前記電極８，８′を有
する燐酸緩衝液の電解液槽１５，１５′に接続さ
れている。この隔膜１４，１４′は、電極８，
８′での電気分解に伴う発生ガスの検定粒子の泳
動への影響を防ぐためのものである。さらに、電
源装置７は、電圧V_bを設定し得るように構成さ
れている直流電源７′と測定セル６の流路内に設
置された１対の白金電圧検出針１６，１６′を具
備し、更に、この電圧検出針間の検出電圧V_aが
フイードバツクされ、この電圧V_aを一定とする
ように前記電極８，８′に直流電源７′から流す電
流を、V_a＞V_bのときは小さくする方向に、V_a＜
V_bのときは大きくする方向に制御する装置およ
び泳動測定を正負両極性のもとで行うための極性
変換器１７，１８を具備している。 次にかかる電気泳動装置を用いた電気泳動度の
測定操作法について述べる。 まず、測定セル６を、温度調節装置９の付いた
恒温槽５内に置き、一定温度に保つ。自動的にサ
ンプル注入口１１、排出口１２を開閉して、サン
プルを測定セル６内に供給し、安定したところで
直流電源装置７により、電圧検出針１６，１６′
間の電圧が一定となるよう電極８，８′に直流電
流を供給する。なおこの直流電源７′は、交流
100V入力で作動する最大20ｍＡ、200V出力のも
のである。 電圧検出針１６，１６′からの信号は、直流電
源装置７′に入る前に、一方向の極性にのみなる
ように一方向極性変換器１８に入つた後、直流電
源７′に伝えられる。 測定セル６内のサンプルは電極８，８′間の電
場により移動し、正・負の電場での移動速度によ
る泳動度が、光源１９を用いて顕微鏡２０により
測定される。この顕微鏡２０は位相差顕微鏡、限
外顕微鏡等であつて、測定セル６内の粒子位置と
移動を暗視野又は明視野で観察出来る。 以下、実施例をもつて本発明を更に説明する。 泳動実験条件は下記の通りである。 泳動サンプル：羊赤血球 浮 遊 液：燐酸緩衝液 PH7.2（15×10^-3／
cm） 泳動温度：24℃ 測定セル厚：550μｍ 実施例 １ 対物レンズ側測定セル内壁面を原点として電場
と直交する方向に関する各位置で各々20個の粒子
の見掛けの電気泳動度を測定し、各位置と各位置
での20粒子の見掛けの電気泳動度の平均値のデー
タ群を用いて前述のように数値解析処理した。そ
の結果を表１に示す。 見掛けの泳動度は各位置の20粒子の平均値であ
るから１個１個の粒子のバラツキは打消され、メ
ジウムの流れを正確に反映する。決定された曲線
Ｍ（Ｘ）は実測値全ての点を通つている。このこ
とは、測定セル中の流れが正確にＭ（Ｘ）＝−FX²
＋AX＋Ｂで示される放物線となつていることを
示している。ところで、この測定セルの厚み
（Ｄ）は550μｍであるから、流れの中心は従来の
考えでは275μｍ（550/2）であると思われていた
が、この信頼すべきデータ処理結果の示すところ
によれば、中心（Ｃ）は269μｍとなる。この6μ
ｍのずれは、暗視野照明という照明法に由来する
ものである。即ち、対物レンズの焦点位置が粒子
の手前6μｍにあるときにその粒子がいわゆる
「ピントが合つた」様に見えるという事実を示し
ている。 この275→269のずれに伴い真の静止面位置は

【式】による107か ら

【式】による101 に修正される。これは従来法では全く察知し得な
かつた新事実である。そして測定粒子の真の電気
泳動度の平均値として、 ＝Ｍ（101）＝0.87が得られる。

【表】 上記実験に続き、今度は前壁から後壁までの任
意の位置にある粒子の見掛けの電気泳動度を次々
と20個測定し、このデータ群を数値解析処理し
た。その結果を表２に示す。実測値は１点１粒子
データであるから、個々の粒子のバラツキに従つ
て適用曲線の上下に分布しているが、平均値を反
映する適用曲線は前記実験結果と非常によく一致
している（係数としてのパラメータの誤差２％以
内）。統計的に言えば、先の実験は各点について
20個平均したもので、メジウムの流れを正確に反
映しているデータであるのに対し、後の実験は
個々の粒子のバラツキを含んだデータである。し
かしながら、この高々20点の測定により正しいプ
ロフアイルを求め得るという点が、本発明の特徴
である。これにより、真の静止面及び個々の粒子
の真の電気泳動度を高信頼度で求めることができ
る。

【表】

【表】 本発明の装置は、所定の位置を原点として電場
と直交する方向に関して複数Ｎ個の粒子の位置
（X_j=1〜N）を測定する位置測定手段と、複数Ｎ個
の粒子の見掛けの電気泳動度（M_j=1〜N）を測定
する測定手段からの測定値（M_j=1〜N）と前記位
置測定手段からの測定値（X_j=1〜N）とに基づいて
粒子の位置（Ｘ）と見掛けの電気泳動度（Ｍ）の
関係を示す二次多項式 Ｍ（Ｘ）＝−FX²＋AX＋Ｂ における係数Ｆ、Ａ及びＢを決定し、このように
して決定されたＦ、Ａ及びＢから測定セル内の泳
動用電解液の静止面を決定して粒子の真の電気泳
動度を決定する計算手段とを有するが故に、静止
面上にある粒子のみを測定対象とすることなく、
測定セル内の全粒子を測定対象とするため、静止
面上にある粒子のみを測定対象とする電気泳動度
測定装置に較べて測定効率を著しく改善し得、そ
の結果、多数の粒子について容易に測定を行うこ
とができるため、二次多項式の係数Ｆ、Ａ及びＢ
を極めて精度良く決定でき、これらの係数に基づ
く静止面の決定と、個々の粒子の真の電気泳動度
の決定とを極めて精度良く行いうるという利点を
有する。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の電気泳動度測定装置の構成ブ
ロツク図を示す。第２図は、本発明に係る電気泳
動装置の正面概要図を示す。第３図は、第２図に
示す装置の側面概要図を示す。 １……顕微鏡電気泳動装置、３……位置測定
器、４……計算処理制御装置、５……恒温槽、６
……測定セル、７……電源装置、８，８′……電
極、１４，１４′……隔膜、１５，１５′……電解
液槽、１６，１６′……白金電圧検出針。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 測定セルと、当該セル内に収容された試料検
   体に電場をかけるための電場生成手段と、当該電
   場生成手段によつて電場をかけられた試料検体中
   の複数Ｎ個の粒子の見掛けの電気泳動度
   （M_j=1〜N）を測定する測定手段と、所定の位置を
   原点として電場と直交する方向に関して複数Ｎ個
   の前記粒子の位置（X_j=1〜N）を測定する位置測定
   手段と、前記測定手段からの測定値（M_j=1〜N）
   と前記位置測定手段からの測定値（X_j=1〜N）とに
   基づいて粒子の位置（Ｘ）と見掛けの電気泳動度
   （Ｍ）の関係を示す二次多項式 Ｍ（Ｘ）＝−FX²＋AX＋Ｂ における係数Ｆ、Ａ及びＢを決定し、このように
   して決定されたＦ、Ａ及びＢから測定セル内の泳
   動用電解液の静止面を決定して粒子の真の電気泳
   動度を決定する計算手段とを有した電気泳動度測
   定装置。