JPH012572A - DNA and transformants - Google Patents
DNA and transformantsInfo
- Publication number
- JPH012572A JPH012572A JP62-157495A JP15749587A JPH012572A JP H012572 A JPH012572 A JP H012572A JP 15749587 A JP15749587 A JP 15749587A JP H012572 A JPH012572 A JP H012572A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- kinase
- dna
- amino acid
- acid sequence
- protein kinase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 73
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims description 49
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims description 49
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 45
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 36
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 27
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 26
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003923 Protein Kinase C Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 claims 9
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 claims 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 108090000244 Rat Proteins Proteins 0.000 claims 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 71
- 238000000034 method Methods 0.000 description 59
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 51
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 50
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 47
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 46
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 45
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 23
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 20
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000011160 research Methods 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 12
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 11
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 11
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 10
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 9
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 8
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 6
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 5
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 4
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 3
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 101100096502 Danio rerio spring gene Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 241001452028 Escherichia coli DH1 Species 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 101100096504 Mus musculus Spring1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 101100426090 Rattus norvegicus Trim9 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100096505 Xenopus laevis spring1 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 2
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N guanidine;isothiocyanic acid Chemical compound N=C=S.NC(N)=N YQOKLYTXVFAUCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000002644 phorbol ester Substances 0.000 description 2
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000009822 protein phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M rubidium chloride Chemical compound [Cl-].[Rb+] FGDZQCVHDSGLHJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 2'‐deoxycytidine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]propyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)C(C)CN(CC(O)=O)CC(O)=O XNCSCQSQSGDGES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 3-(1h-indol-2-yl)prop-2-enoic acid Chemical compound C1=CC=C2NC(C=CC(=O)O)=CC2=C1 SXOUIMVOMIGLHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 9,10-dioxoanthracene-1-sulfonic acid Chemical group O=C1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C=CC=C2S(=O)(=O)O JAJIPIAHCFBEPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 1
- 101800000263 Acidic protein Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102100034613 Annexin A2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000668 Annexin A2 Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100029172 Choline-phosphate cytidylyltransferase A Human genes 0.000 description 1
- 101710100763 Choline-phosphate cytidylyltransferase A Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N Deoxycytidine Natural products O=C1N=C(N)C=CN1C1OC(CO)C(O)C1 CKTSBUTUHBMZGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 101100310856 Drosophila melanogaster spri gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 101001134456 Homo sapiens Pancreatic triacylglycerol lipase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 241000714177 Murine leukemia virus Species 0.000 description 1
- 101100448410 Mus musculus Gkn1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 101710132631 Protein C1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000315 Protein Kinase C Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710203837 Replication-associated protein Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061456 Solanum tuberosum Species 0.000 description 1
- 235000002595 Solanum tuberosum Nutrition 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N Tegafur Chemical compound O=C1NC(=O)C(F)=CN1C1OCCC1 WFWLQNSHRPWKFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N [[(2r,3s,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] dihydroxyphosphoryl hydrogen phosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)O[32P](O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KNYAHOBESA-N 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004720 cerebrum Anatomy 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000005520 electrodynamics Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- DANUORFCFTYTSZ-UHFFFAOYSA-N epinigericin Natural products O1C2(C(CC(C)(O2)C2OC(C)(CC2)C2C(CC(O2)C2C(CC(C)C(O)(CO)O2)C)C)C)C(C)C(OC)CC1CC1CCC(C)C(C(C)C(O)=O)O1 DANUORFCFTYTSZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 230000003176 fibrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 description 1
- -1 inositol phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000007169 ligase reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N molecular hydrogen;sodium Chemical compound [Na].[H][H] XONPDZSGENTBNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 101150019841 penP gene Proteins 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N phorbol 13-acetate 12-myristate Chemical compound C([C@]1(O)C(=O)C(C)=C[C@H]1[C@@]1(O)[C@H](C)[C@H]2OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)C(CO)=C[C@H]1[C@H]1[C@]2(OC(C)=O)C1(C)C PHEDXBVPIONUQT-RGYGYFBISA-N 0.000 description 1
- 150000004633 phorbol derivatives Chemical class 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 108010005709 protein kinase C kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940102127 rubidium chloride Drugs 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。(57) [Summary] This bulletin contains application data before electronic filing, so abstract data is not recorded.
Description
【発明の詳細な説明】
席−災瓦」秤肚分更
本発明は、カルシウムおよびリン脂質依存性蛋白質リン
酸化酵素（蛋白質リン酸化酵素ＣあるいはＣ−キナーゼ
と略称することもある。）およびその製造のための組み
換えＤＮＡ技術に関し、中でもラットＣ−キナーゼおよ
びヒトＣ−キナーゼに関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present invention relates to a calcium- and phospholipid-dependent protein kinase (sometimes abbreviated as protein kinase C or C-kinase) and its Recombinant DNA technology for the production, inter alia, of rat C-kinase and human C-kinase.
従米豊挟先
生体の多彩な機能発揮や適応現象には、細胞の生長因子
、ホルモンあるいは神経伝達物質など多種類の生理活性
物質の関与が知られている。これらの細胞外シグナルは
、サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）、サイクリックＧ
Ｍ Ｐ （ｃ Ｇ Ｍ Ｐ ） 、シアシールグリセロ
ール（ＤＧ）、カルシウム（Ｃａ＋＋）などの細胞内伝
達物質を通じて発揮される。It is known that many types of physiologically active substances, such as cell growth factors, hormones, and neurotransmitters, are involved in the body's various functions and adaptation phenomena. These extracellular signals include cyclic AMP (cAMP), cyclic G
It is exerted through intracellular transmitters such as M P (c G M P ), cyacylglycerol (DG), and calcium (Ca++).
特にＤＧは細胞機能の活性化を引き起す多くのホルモン
や神経伝達物質によって細胞膜のイノシトール燐脂質が
分解された結果生じることが判明している。このＤＧが
カルシウムの存在下にＣ−キナーゼを活性化し、この酵
素による細胞内各種蛋白質のリン酸化反応が種々の細胞
機能の活性化や細胞増殖をもたらすと考えられている。In particular, DG has been found to be produced as a result of the decomposition of inositol phospholipids in cell membranes by many hormones and neurotransmitters that cause activation of cell functions. It is thought that this DG activates C-kinase in the presence of calcium, and the phosphorylation reaction of various intracellular proteins by this enzyme leads to the activation of various cellular functions and cell proliferation.
っまりＣ−キナーゼは外界シグナルの主要な情報伝達機
構の一つにおいて重要な役割を担っている酵素である。C-kinase is an enzyme that plays an important role in one of the major information transduction mechanisms for external signals.
ラット大脳より精製された該酵素は等電点がＰＨ５，６
の酸性蛋白質であり１分子量は約７７゜０００である。The enzyme purified from rat cerebrum has an isoelectric point of PH5.6.
It is an acidic protein with a molecular weight of approximately 77°000.
またこの酵素は疎水性の部分と親水性の部分とからなる
単一ペプチドからできており、疎水性部分を介して細胞
膜に結合し、親水性部分に活性中心が存在する。Ｃ−キ
ナーゼは通常不活性型であり、カルシウムとフォスファ
チジールセリンおよびＤＧの王者によって活性化される
。This enzyme is made of a single peptide consisting of a hydrophobic part and a hydrophilic part, and binds to the cell membrane through the hydrophobic part, with the active center located in the hydrophilic part. C-kinase is normally inactive and activated by calcium and phosphatidylserine and DG king.
またリン酸供与体はＡＴＰであることがわかっている。It is also known that the phosphate donor is ATP.
このようにＣ−キナーゼは蛋白質リン酸化酵素の一つと
して蛋白質のリン酸化を通じて細胞外シグナルの細胞内
伝達を行うことから、細胞外シグナルの受容伝達機構の
研究には欠くことのできない酵素であり、その試薬とし
ての価値は非常に高い。また、本酵素は発ガンプロモー
ターであるフォルボールエステルにより直接活性化され
る。フォルボールエステルは発ガン過程の促進を引き起
こすだけではなく、細胞***や分化、酵素の誘導、脂質
の代謝昂進など多くの生物反応に深く関与していること
が知られている。これらのことは細胞膜受容伝達機構の
異常が成因となる種々の病的細胞やガン細胞において、
Ｃ−キナーゼが重要な指標酵素となる可能性が高く、Ｃ
−キナーゼに対する抗体などが診断剤や検査薬として用
いられることが考えられる。これらの目的のためには十
分な量のヒトＣ−キナーゼの供給が必要となる。しかし
、天然に存在するヒトＣ−キナーゼは微量であり、また
これをヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極
めて困難なため、未だにヒトＣ−キナーゼのアミノ酸配
列や遺伝子の塩基配列は決定されていない。In this way, C-kinase, as one of the protein phosphorylating enzymes, transmits extracellular signals into cells through protein phosphorylation, and therefore is an indispensable enzyme for research on the reception and transmission mechanism of extracellular signals. , its value as a reagent is extremely high. Furthermore, this enzyme is directly activated by phorbol ester, which is an oncogenic promoter. It is known that phorbol esters not only promote the carcinogenic process, but also are deeply involved in many biological reactions such as cell division and differentiation, enzyme induction, and lipid metabolism acceleration. These things occur in various pathological cells and cancer cells caused by abnormalities in cell membrane receptor and transmission mechanisms.
C-kinase is likely to be an important indicator enzyme;
- Antibodies against kinases may be used as diagnostic agents or testing agents. For these purposes it is necessary to supply sufficient amounts of human C-kinase. However, only a small amount of naturally occurring human C-kinase exists, and attempts to obtain it from human tissues are extremely difficult due to various constraints, so the amino acid sequence and gene nucleotide sequence of human C-kinase have not yet been determined. Not yet.
一方、材料が比較的容易に得られる動物１１１来のＣ−
キナーゼは、例えばラット脳から既に精製されているが
、この場合もアミノ酸配列や遺伝子の塩基配列が決定さ
れていないし、またラットＣ−キナーゼについても大量
生産は非常に難かしいのである。On the other hand, C-
Kinase has already been purified, for example, from rat brain, but the amino acid sequence and gene base sequence have not been determined in this case, and mass production of rat C-kinase is also extremely difficult.
発明が解゛ しようとす４匝見１遵よ
上記のようにヒトＣ−キナーゼやラットＣ−キナーゼの
性質、アミノ酸配列および遺伝子については不明の点が
多い。従って試薬や検査薬として例えばそれをコードす
る遺伝子を同定し、その蛋白質を遺伝子組み換え技術に
よって生産する方法が望まれていた。As mentioned above, there are many unknown points regarding the properties, amino acid sequences, and genes of human C-kinase and rat C-kinase. Therefore, there has been a desire for a method of identifying the gene encoding the reagent or test agent, and producing the protein by genetic recombination technology.
毀延点を解決するための手段
一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質はそのアミノ酸配
列において非常に高い相同性があり、アミノ酸の異なっ
ている部分もその大部分はコドンのｏｎｅ ｐｏｉｎｔ
ｍｕｔａｔｉｏｎによって導びかれるものである。そ
こで１本発明者等はまず材料の入手が容易なラット脳由
来のＣ−キナーゼを精製し、得られるアミノ酸配列を決
定するとともに、それをもとにクローニングされたラッ
トＣ−キナーゼ遺伝子のり、ＮＡ配列を解明した。この
ラットＣ−キナーゼ遺伝子のＤＮＡ配列については後述
の実施例１．２，４及び５に具体的に述べているとおり
であり、その塩基配列および該塩基配列より予測される
アミノ酸配列は第２図、第８図および第１３図に示して
いる。Means to resolve the gap In general, proteins from animals that are closer to humans have very high homology in their amino acid sequences, and most of the differences in amino acids are just one point codon.
It is guided by mutation. Therefore, the present inventors first purified rat brain-derived C-kinase, which is an easily available material, determined the resulting amino acid sequence, and based on this, cloned the rat C-kinase gene, NA. The sequence was solved. The DNA sequence of this rat C-kinase gene is as specifically described in Examples 1.2, 4 and 5 below, and the base sequence and the amino acid sequence predicted from the base sequence are shown in Figure 2. , shown in FIGS. 8 and 13.
そしてこのクローニングされたラントＣ−キナーゼ遺伝
子のＤＮＡ配列は、コドンの縮重により多数のＤＮＡ配
列が可能となるものの、その一部はヒトＣ−キナーゼ遺
伝子のＤＮＡ配列に極めて良く似ているものと推定され
ろ。そこで本発明者らはこのような考えに基づいて、−
たんラットＣ−キナーゼ遺伝子をクローニングし、この
ｃＤＮＡＩＤＮＡプローブとして用いてヒトＣ−キナー
ゼ遺伝子をヒト細胞よりクローニングした。該遺伝子を
含む組み換えＤＮＡを構築し、該ＤＮＡで形質転換され
た形質転換体を培養するとヒトＣ−キナーゼが生産され
る。本発明者らは、これらの知見に基づき、さらに研究
した結果１本発明を完成した。The DNA sequence of this cloned runt C-kinase gene is said to be extremely similar to the DNA sequence of the human C-kinase gene, although a large number of DNA sequences are possible due to the degeneracy of codons. Be estimated. Therefore, based on this idea, the present inventors -
The protein rat C-kinase gene was cloned, and this cDNA was used as an DNA probe to clone the human C-kinase gene from human cells. When a recombinant DNA containing the gene is constructed and a transformant transformed with the DNA is cultured, human C-kinase is produced. Based on these findings, the present inventors conducted further research and completed the present invention.
本発明は、（１）アミノ酸配列：
Ｔｙｒ−８ｅｒ−ＡＱａ−ＧＱｙ−ＧＱ、ｙ−Ａｓｐ−
Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｈｉ ｓ−Ｉ Ｑｅ−Ｈｉ
５−８Ｏｒ−Ａｓｐ−ＶａＱ−Ｐｈｅ−３ｅｒ−ＧＱｕ
−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−／’１ａ−Ｉ Ｑ ｅ−Ｐｈｅ−Ｔ
ｙ ｒ−８ｅ ｒ−ＡＱ ａ −Ｃｙ ５−Ｖａ Ｑ−
ＶａＱ−Ｌｅｕ−ＧＱｙ−Ｌｅｕ−ＧＱｎ−Ｐｈｅ−Ｌ
ｅｕ−Ｈｉ ５−ＧＱ ｕ−Ｈｉ ５−Ｌｙ ｓ−Ｉ
Ｑ ｏ−Ｖａ Ｑ−Ｔｙ ｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ
−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅ ｕ−、Ｌｅ
ｕ−Ｌｅ ｕ−Ａｓ ｐ−Ｔｈ ｒ −Ｇ Ｑ ｕ
−Ｇ Ｑ ｙ−Ｔｙｒ−ＶａＱ−Ｌｙｓ−ＩＱｅ−ＡＱ
ａ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＧＱ ｙ−Ｌｅ ｕ−Ｃｙ ５−
Ｌｙ ５−Ｇ（ｌ ｕ −Ｇ Ｑ ｙ−Ｍｅ ｔ−ＧＱ
ｙ−Ｔｙｒ−ＧＱｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−８ｅｒ
−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−ＧＱｙ−Ｔｈｒを含有する
ポリペプチドであるヒ１−Ｃ−キナーゼ（夏）；同一の
活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは上記ア
ミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性を有す
るポリペプチド。The present invention provides (1) amino acid sequence: Tyr-8er-AQa-GQy-GQ, y-Asp-
Leu-Met-Leu-Hi s-I Qe-Hi
5-8Or-Asp-VaQ-Phe-3er-GQu
-Pro-Arg-/'1a-I Q e-Phe-T
y r-8e r-AQ a -Cy 5-Va Q-
VaQ-Leu-GQy-Leu-GQn-Phe-L
eu-Hi 5-GQ u-Hi 5-Ly s-I
Q o-Va Q-Tyr-Arg-Asp-Leu
-Lys-Leu-Asp-Asn-Leu-, Le
u-Le u-As p-Th r -G Q u
-G Q y-Tyr-VaQ-Lys-IQe-AQ
a-Asp-Phe-GQ y-Le u-Cy 5-
Ly 5-G(lu-G Q y-Me t-GQ
y-Tyr-GQy-Asp-Arg-Thr-8er
-Human 1-C-kinase (Summer), which is a polypeptide containing Thr-Phe-Cys-GQy-Thr; a part of the above polypeptide having the same activity; or the above amino acid sequence is partially transformed, and a polypeptide having the same activity.
（２）ヒトＣ−キナーゼをコードする塩基配列を含有す
る組み換えＤＮＡ（１１）、
（３）ＤＮＡ（ｎ）を含有するベクターで形質転換され
た形質転換体、および
（４）ＤＮＡ（ｎ）を含有するベクターで形質転換され
た形質転換体を培地に培養し、培養物中にヒトＣ−キナ
ーゼを生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
る該酵素の製造法である。(2) a recombinant DNA (11) containing a nucleotide sequence encoding human C-kinase; (3) a transformant transformed with a vector containing DNA (n); and (4) a transformant containing DNA (n). This is a method for producing the enzyme, which comprises culturing a transformant transformed with a vector containing the enzyme in a medium, producing and accumulating human C-kinase in the culture, and collecting the human C-kinase.
更に本発明は（５）第８図もしくは第１３図で示される
アミノ酸配列からなるポリペプチドであるラットＣ−キ
ナーゼ、同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；
もしくは上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同
一の活性を有するポリペプチド、
（６）ラットＣ−キナーゼをコードする塩基配列を含有
する組み換えＤＮＡ（ＩＶ）、
（７）上記（６）のＤＮＡ （ＩＶ）を含有するベクタ
ーで形質転換された形質転換体、および
（８）上記（７）の形質転換体を培地に培養し、培養物
中にラットＣ−キナーゼを生成蓄積せしめ、これを採取
することを特徴とする該酵素の製造法である。Furthermore, the present invention provides (5) rat C-kinase, which is a polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in FIG. 8 or FIG. 13, and a portion of the above polypeptide having the same activity;
or a polypeptide in which the above amino acid sequence is partially converted and has the same activity; (6) a recombinant DNA (IV) containing a base sequence encoding rat C-kinase; (7) the DNA of (6) above. A transformant transformed with a vector containing (IV) and (8) the transformant of (7) above are cultured in a medium to produce and accumulate rat C-kinase in the culture, which is collected. This is a method for producing the enzyme.
上記ヒトＣ−キナーゼをコードする塩基配列を含有する
組み換えＤＮＡ（ＩＩ）としては、たとえば塩基配列：
Ａ Ｇ Ｔ Ａ ＣＴ ＣＧ Ｇ ＣＣＧ Ｇ Ｔ Ｇ
Ｇ Ｇ Ｇ Ａ ＣＣＴ Ｇ Ａ Ｔ ＧＣＴＧＣＡ
ＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＧＡＣＧＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＧ
ＣＣＣＣＧＴＧＣＣＡＴＣＴＴＴＴＡＴＴＣＣＧＣＣＴ
Ｇ ＣＧ Ｔ Ｇ Ｇ Ｔ Ｇ ＣＴ Ｇ Ｇ Ｇ
ＣＣＴ Ａ ＣＡ Ｇ Ｔ Ｔ ＴＣ”ｒ’ｌ’ＣＡＣ
ＧＡＡＣＡＣＡＡＧＡＴＣＧＴＣＴΔＣＡ ＧＧＧＡＣ
ＣＴＧＡＡＧＴＴＧＧＡＣＡＡＴＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧ
ＡＣＡＣＣＧＡＧＧＯＣＴＡＣＧＴＣＡＡＧＡＴＣＧ
ＣＡ ＯＡ ＣＴ Ｔ Ｔ Ｇ Ｇ ＣＣ，Ｔ ＣＴ
Ｇ ＣＡ Ａ Ｇ Ｇ Ａ Ｇ Ｇ ＧＯＡＴＧＧＧＣ
ＴＡＴＧＧＧＯＡＣＣＧＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＴＴＣＴ
ＧＴＧＧＯＡＣＣＧ （Ｉｌｌ）を含有する塩基配
列が好ましい。The recombinant DNA (II) containing the base sequence encoding the human C-kinase includes, for example, the base sequence: A G T A CT CG G CCG G T G
G G G A CCT G A T GCTGCA
CATCCACAGCGACGTGTTCTCTGAG
CCCCGTGCCATCTTTTTATTCCGCCT
G CG T G G T G CT G G G
CCT A CA G T T TC"r'l'CAC
GAACACAAGATCGTCTΔCA GGGAC
CTGAAGTTGGACAATTTGCTCCTG
ACACCGAGGOCTACGTCAAGATCG
CA OA CT T T GG CC, T CT
G CA A G G A G G GOATGGGC
TATGGGOACCGGACCAGCAGATTCT
A base sequence containing GTGGOACCG (Ill) is preferred.
本発明のＤＮＡ、形質転換体および本発明の製造法にお
けるヒトＣ−キナーゼとしては、上記アミノ酸配列で示
されるヒトＣ−キナーゼ（Ｉ）をその一部として含む。The human C-kinase in the DNA, transformant, and production method of the present invention includes human C-kinase (I) shown by the above amino acid sequence as a part thereof.
またラットＣ−キナーゼをコードする塩基配列を含有す
る組み換えＤＮＡとしては、たとえば第８図もしくは第
１３図に示される塩基配列を含有するものが好ましい。The recombinant DNA containing the nucleotide sequence encoding rat C-kinase is preferably one containing the nucleotide sequence shown in FIG. 8 or FIG. 13, for example.
ラットＣ−キナーゼとしては、第８図のアミノ酸配列に
おいて、第１〜２２４番目のアミノ酸残基からなるポリ
ペプチド、該第１〜２２４番目のアミノ酸残基にさらに
第２２５〜６２１ ｍ目のアミノ酸残基が付加したポリ
ペプチド、該第１〜６２１番目のアミノ酸残基にさらに
ＡｓｎＰｈｅＡｓｐＬｙｓＧｌｕＰｈｅＴｈｒ−Ａｒｇ
ＧｌｎＰｒｏＶａｌＧｌｕＬｅｕＴｈｒ−ＰｒｏＴｈｒ
ＡｓｐＬｙｓＬｅｕＰｈｅＩ Ｌｅ−ＭｅｔＡｓｎＬｅ
ｕＡｓｐＧｌｎＡｓｎＧｌｕ−ＰｈｅＡｌａＧｌｙＰｈ
ｅＳｅｒＴｙｒＴｈｒ−ＡｓｎＰｒｏＧｌｕＰｈｅＶａ
ｌＩｌｅＡｓｎ−Ｖａｌで示されるアミノ酸残基が付加
したもの。Rat C-kinase is a polypeptide consisting of amino acid residues 1 to 224 in the amino acid sequence shown in FIG. A polypeptide to which a group is added, AsnPheAspLysGluPheThr-Arg
GlnProValGluLeuThr-ProThr
AspLysLeuPheI Le-MetAsnLe
uAspGlnAsnGlu-PheAlaGlyPh
eSerTyrThr-AsnProGluPheVa
An amino acid residue shown as lIleAsn-Val is added.
該第１〜６２１番目のアミノ酸残基にさらにＣｙｓＧｌ
ｙＡｒｇＡｓｎＡｌａＧｌｕＡｓｎ−ＰｈｅＡｓｐＡｒ
ｇＰｈｅＰｈｅＴｈｒＡｒｇ−ＨｉｓＰｒｏＰｒｏＶａ
ｌＬｅｕＴｈｒＰｒｏ−ＰｒｏＡｓｐＧｌｎＧｌｕＶａ
ｌＩｌｅＡｒｇ−ＡｓｎＩｌｓＡｓｐＧｌｎＳｅｒＧｌ
ｕＰｈｅ−ＧｌｕＧｌｙＰｈｅＳｅｒＰｈｅＶａ １Ａ
ｓｎ−５ａｒＧｌｕＰｈａＬｅｕＬｙｓＰｒｏＧｌｕ−
で示されるアミノ酸残基が付加したもの；同一の活性を
有する、これらポリペプチドの一部；もしくは上記アミ
ノ酸配列が部分的に変換され、がっ同一の活性を有する
ポリペプチドが挙げられる。CysGl is further added to the 1st to 621st amino acid residues.
yArgAsnAlaGluAsn-PheAspAr
gPhePheThrArg-HisProProVa
lLeuThrPro-ProAspGlnGluVa
lIleArg-AsnIlsAspGlnSerGl
uPhe-GluGlyPheSerPheVa 1A
sn-5arGluPhaLeuLysProGlu-
A part of these polypeptides having the same activity; or a polypeptide in which the above amino acid sequence is partially converted, but has the same activity.
本発明方法におけるヒトＣ−キナーゼ蛋白質のポリペプ
チドをコードする塩基配列を有するＤＮＡを含有する発
現型ベクターは、例えば、（イ）ヒトＣ−キナーゼをコ
ードするＲＮＡを分踵し、
（ロ）該ＲＮＡから単鎖の相補ＤＮＡ （ｃＤＮＡ）を
１次いで二重鎖ＤＮＡを合成し。In the method of the present invention, an expression vector containing a DNA having a base sequence encoding a polypeptide of human C-kinase protein can be prepared by, for example, (a) dissecting RNA encoding human C-kinase; First, single-stranded complementary DNA (cDNA) is synthesized from RNA, and then double-stranded DNA is synthesized.
（ハ）該相補ＤＮＡをプラスミドに組み込み、（ニ）得
られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換し、
（ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばラットｃＤＮＡをプローブとして用い
たコロニーハイブリダイゼーション法、により目的とす
るＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、
（へ）そのプラスミドから目的とするクローン化ＤＮＡ
を切り出し、
（ト）該クローン化ＤＮＡをビークル中のプロモーター
の下流に連結する。ことにより製造することができる。(c) Incorporate the complementary DNA into a plasmid, (d) transform a host with the obtained recombinant plasmid, (e) culture the obtained transformant, and then transform the transformant by an appropriate method, for example, rat cDNA. A plasmid containing the desired DNA is isolated by the colony hybridization method using as a probe, and (to) the desired cloned DNA is extracted from the plasmid.
(g) The cloned DNA is ligated downstream of the promoter in the vehicle. It can be manufactured by
ヒトＣ−キナーゼをコードするＲＮＡは、種々のヒトＣ
−キナーゼ産生細胞、例えばヒト脳由来細胞あるいはヒ
ト線維非細胞から得ることができる。該ヒト線維非細胞
としてはＷＩ３８ （ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−７５）ある
いはＩＭＲ９０（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１８６）などが
あげられる。上記細胞ＷＩ３８あるいはＩＭＲ９０は、
ジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（
ＴｈｅＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）発行のカタログ・オブ・セル・
ラインズ・アンド・ハイブリドーマズ（Ｃａｔａｌｏｇ
ｕｅ ｏｆ Ｃｅ１ｌ Ｌｉｎｅｓ ＆ ｔ！ｙｂｒｉ
ｄｏ＋ｍａｓ）５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ、１９８５に掲
載されている。RNA encoding human C-kinase has been derived from various human C-kinases.
- Can be obtained from kinase-producing cells, such as human brain-derived cells or human fibrotic non-cells. Examples of the human fibrous non-cells include WI38 (ATCC number CCL-75) and IMR90 (ATCC number CCL-186). The above cell WI38 or IMR90 is
The American Type Culture Collection (
The American Type Culture
Catalog of Cells published by Co11ection)
Lines and Hybridomas (Catalog
ue of Ce1l Lines & t! ybri
do+mas) 5th edition, 1985.
ヒトＣ−キナーゼ産生細胞からＲＮＡを調製する方法と
しては、グアニジンチオシアネート法（Ｊ、Ｍ、 、Ｃ
ｈｉｒｇｖｉｎら、バイオケミストリー（Ｒ、ｉ ｏ
−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、１８．５２９４（１９７９）
）などが挙げられる。As a method for preparing RNA from human C-kinase producing cells, the guanidine thiocyanate method (J, M, , C
Hirgvin et al., Biochemistry (R,io
-chemistry), 18.5294 (1979)
), etc.
このようにして得られたＲＮＡを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて１例えば）（、Ｑ ｋａｙａｍａらの方法〔モ
レキュラー・アンド・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌ
ｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅ１ｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏ
ｇｙ） ２１６１（１９８２）および同誌３ ２８０（
１９８３））に従いｃＤＮＡを合成し、得られたｃＤＮ
Ａをプラスミドに組み込む・
ｃＤＮＡを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸
菌由来のｐＢ Ｒ３２２（ジーン（ｇｅｎｅ）、２，９
５（１９７７））、ｐＢ Ｒ３２５（ジーン、４１２１
（１９７ｇ）） 、ｐＵ Ｃ１２〔ジーン、昆、２５
９（１９８２））、ｐＵ Ｃ１３（ジーン、月採２５９
（１９８２））、枯草菌由来のｐＵ８１１０（バイオケ
ミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーヨ
ン（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ
’１ｃａｌ Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣｏａ＋ｍｕｎｉｃａｔ
ｉｏｎ）、１１２，６７８（１９８３））などが挙げら
れるが、その他のものであっても、宿主内で複製保持さ
れるものであれば、いずれをも用いることができる。Using the RNA obtained in this way as a template and using reverse transcriptase (for example), the method of Q Kayama et al. [Molecular and Cellular Biology (Mol.
ecular and Ce1lular Biolo
gy) 2161 (1982) and the same magazine 3 280 (
cDNA was synthesized according to (1983)), and the obtained cDNA
Incorporating A into a plasmid. As a plasmid for incorporating cDNA, for example, pB R322 (gene) derived from Escherichia coli, 2,9
5 (1977)), pB R325 (Gene, 4121
(197g)), pU C12 [Gene, Kon, 25
9 (1982)), pU C13 (Gene, Monthly Collection 259)
(1982)), pU8110 from Bacillus subtilis (Biochemical and Biophysical Research Communication
'1cal Re5earchCoa+municat
ion), 112, 678 (1983)), but any other species can be used as long as it can be replicated and maintained within the host.
プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、Ｔ、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）コールド・スプリン
グ・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
１ｌａｒｂｏｒ Ｌａ−ｂｏｒａｔｏｒｙ） ｅ第２
３９頁（１９８２）に記載の方法などが挙げられる。As a method for incorporating into a plasmid, for example, T, M
Aniatis et al., Molecular Cloning (Mo
regular Cloning) Cold Spring Harbor Laboratory
1 labor laboratory) e2nd
Examples include the method described on page 39 (1982).
」；記ｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドとしては、ヒ
ト正常２倍体開胸＋ｍＲＮＡより合成したｃＤＮＡをｐ
ＣＤベクター（Ｏｋｙａｍａら、モレキュラー・セル・
バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅ１ｌ Ｂｉｏ
ｌｏｇｙ）、３．２８０（１９８３）参照〕に組み込ん
で作成した大腸菌ｘ１７７６を宿主としたｃ Ｄ Ｎ
Ａライブラリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ
ｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｉ（ｕ
ｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ。”; The cDNA synthesized from human normal diploid thoracotomy + mRNA was used as the plasmid into which the cDNA was integrated.
CD vector (Okyama et al., Molecular Cell
Biology (Molecular Cell Bio
cDN using Escherichia coli x1776 as host
A Library (National Institute
e of Child Health and I(u
man Development.
Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｕ、Ｓ、Ａ、の岡山博士より分与を
受けることができる。）を用いて得られたプラスミドで
もよい。It can be distributed by Dr. Okayama of Bethesda, U.S.A. ) may also be used.
このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主たと
えばエシェリキア（１！、５ｃｈｅｒＬｃｈｉａ）属菌
。The plasmid thus obtained can be used in a suitable host, such as a bacterium of the genus Escherichia (1!, 5cherLchia).
バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属菌などに導入する。It is introduced into bacteria of the genus Bacillus.
上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ） Ｋ １２１
） ＩＩ Ｉ（プロシージング・オブ・ナショナル・ア
カデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）６０゜１６０
（１９６８）） 、 Ｍ １０３（ヌクレイツク・アシ
ッズ・リサーチ、（Ｎｕｃｌｅ、Ｌｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒ
ｅ５ｓａｒｃｈ）、９，３０９（１９８１））。Examples of the Escherichia genus bacteria include Escherichia coli K 121
) II I (Procedure of the National Academy of Sciences)
Acad, Sci, U, S, A,)60°160
(1968)), M 103 (Nucle, Lc Ac1ds Research, (Nucle, Lc Ac1ds R
e5search), 9, 309 (1981)).
ＪＡ２２１（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオ
ロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ））、１２０゜５１７（１９７８））、
ＨＢＩＯＩ（ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー４１，４５９（１９６９）］、 Ｃ６００（ジ
ェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ） 、現し４４０（
１９５４））などが挙げられる。JA221 (Journal of Molecular Biology)
Biology)), 120°517 (1978)),
HBIOI (Journal of Molecular Biology 41, 459 (1969)), C600 (Genetics), Presentation 440 (
1954)).
上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチル
ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔＬｌｉｓ）Ｍ１１１
４（ジーン。Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtLlis M111.
4 (Jean.
４４．２５５（１９８３））、２０７−２１（ジャーナ
ル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
ｎｉｏｃｈｅｍ、１ｓｔｒｙ）９５．８７（１９８４
））などが挙げられる。44.255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry)
niochem, 1stry) 95.87 (1984
)) etc.
形質転換する方法としては、たとえばＴ’、Ｍａｎｉａ
ｃｔｓら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏ １ｅｃ
ｕ １．ａｒＣｌｏｎｉｎｇ）、コールド・スプリング
・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、第２４９頁（
１９８２）に記載のカルシウムクロライド法あるいはカ
ルシウムクロライド／ルビジウムクロライド法などが挙
げられろ。Examples of transformation methods include T', Mania
cts et al., Molecular Cloning (Mo 1ec
u1. arCloning), Cold Spring Harbor Laboratory (Cold Spring
Harbor Laboratory), page 249 (
For example, the calcium chloride method or the calcium chloride/rubidium chloride method described in 1982) may be used.
このようにして得られた形質転換体中から自体公知の方
法、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法〔ジー
ン、Ｕ扉６３（１９８０））およびＤＮＡ塩基配列決定
法〔プロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ。The thus obtained transformants were subjected to methods known per se, such as colony hybridization method [Gene, Udoor 63 (1980)] and DNA base sequencing method [Procedure of the National Academy of Sciences].
of Science (Proc. Natl.
Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、）Ｌ！、５６０（
１９７７）、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ（Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ ｌセｃｓｅａｒｃｈ）９゜３
０９（１９８１））を用い、求めるクローンを選出する
。Acad, Sci, U, S, A,)L! , 560(
1977), Nucleitsk Acids Research (Nu
cleic Ac1ds lSecsearch)9゜3
09 (1981)) to select the desired clone.
このようにして、クローン化されたヒトＣ−キナーゼを
コードする塩基配列を含有するＤＮＡを有するベクター
を保持する微生物が得られる。In this way, a microorganism carrying a vector having DNA containing the cloned base sequence encoding human C-kinase is obtained.
後述の実施例３（１）で得られた堕妨虹力立罰９旦に１
２ＤＨ１／ＰＴＢ６３７が保持するプラスミドｐＴＢ６
３７は、ヒトＣ−キナーゼ（１）をコードする塩基配列
を含有するＤＮＡを有する。1 on the 9th day of the fallen rainbow power punishment obtained in Example 3 (1) described below.
Plasmid pTB6 carried by 2DH1/PTB637
No. 37 has DNA containing a base sequence encoding human C-kinase (1).
該ＤＮＡ中の、ヒトＣ−キナーゼ（１）をコードする塩
基配列は、ＤＮＡの一部分であると考えられる。該ＤＮ
Ａの制限酵素切断位置を第３図に示す。第３図に示すよ
うに該ＤＮＡは全長約１．２ｋｂｐであり、制限酵素Ｐ
ｓｔｌあるいはＢ ａ ｍＨＩにより断片に切断される
。The base sequence encoding human C-kinase (1) in the DNA is considered to be a part of the DNA. The DN
The restriction enzyme cleavage position of A is shown in FIG. As shown in Figure 3, the total length of the DNA is approximately 1.2 kbp, and the restriction enzyme P
It is cut into fragments by stl or B a mHI.
次に、該微生物からプラスミドを単離する。Next, a plasmid is isolated from the microorganism.
該単離法としては、アルカリ法（Ｈ，Ｃ，Ｂｉｒｍｂｏ
ｉｍら、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、 （Ｎｕ
ｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、１．１５
１３（１９７９）３などが挙げられる。The isolation method includes an alkaline method (H, C, Birmbo
im et al., Nucleitsk Acids Research, (Nu
cleic Acids Research), 1.15
13 (1979) 3, etc.
上記クローン化されたヒトＣ−キナーゼをコードする塩
基配列を含有するＤＮＡを有するプラスミドはそのまま
、または所望により制限酵素で切り出す。The cloned plasmid containing the DNA containing the base sequence encoding human C-kinase can be used as is, or if desired, excised with restriction enzymes.
クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル（ベ
クター）中のプロモーターの下流に連結して発現型ベク
ターを得ることができる。The cloned gene can be ligated downstream of a promoter in a vehicle (vector) suitable for expression to obtain an expression vector.
ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド（例
、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵｃ１２、ｐＵｃ１
３） 、枯草菌由来プラスミド（例。Vectors include the above E. coli-derived plasmids (e.g., pBR322, pBR325, pUc12, pUc1
3), Bacillus subtilis-derived plasmids (e.g.
ｐＵＢｌｌｏ、ｐＴＰ５．ｐｃ１９４）、酵母由来プラ
スミド（例、ｐｓＨ１９，ｐｓＨ１５）＝あるいはλフ
ァージなどのバクテリオファージおよびレトロウィルス
、ワクシニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げら
れる。pUBllo, pTP5. pc194), yeast-derived plasmids (eg, psH19, psH15), bacteriophages such as λ phage, and animal viruses such as retroviruses and vaccinia virus.
該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのＡＴ
Ｇを有し、また３″末端には翻訳終止コドンとしてのＴ
ＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。さらに
該遺伝子を発現させるにはその上流にプロモーターを接
続する。本発明で用いられるプロモーターとしては、遺
伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーター
であればいかなるものでもよい。The gene has AT at its 5' end as a translation initiation codon.
G, and T at the 3″ end as a translation stop codon.
It may have AA, TGA or TAG. Furthermore, in order to express the gene, a promoter is connected upstream thereof. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is suitable for the host used for gene expression.
また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌である
場合は、ｔｒｐプロモーター、Ｑａｃプロモーター、ｒ
ｅｃＡプロモーター、λＰＬプロモーターｅ ＱｐＰプ
ロモーターなどが、宿主がバチルス属菌である場合は、
５ＰＯＬプロモーター。In addition, when the host for transformation is a bacterium of the genus Escherichia, trp promoter, Qac promoter, r
ecA promoter, λPL promoter e QpP promoter, etc., when the host is Bacillus,
5POL promoter.
５ＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなど、宿
主が酵母である場合は、ＰＨ０５プロモーター、ＰＧＫ
プロモーター、ＧＡＰプロモーター。5PO2 promoter, penP promoter, etc. If the host is yeast, PH05 promoter, PGK
promoter, GAP promoter.
ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。とりわけ宿主がエ
シェリキア属菌でプロモーターがｔｒｐプロモーターま
たはλＰＬプロモーターであることが好ましい。ADH promoter etc. are preferred. In particular, it is preferable that the host is a bacterium of the genus Escherichia and that the promoter is a trp promoter or a λPL promoter.
宿主が動物細胞である場合には、ＳＶ４０由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げられ
、とりわけＳＶ４０由来のプロモーターが好ましい。When the host is an animal cell, examples include SV40-derived promoters and retrovirus promoters, with SV40-derived promoters being particularly preferred.
このようにして構築されたＤＮＡ（ＩＩ）を含有するベ
クターを用いて、形質転換体を製造する。A transformant is produced using the vector containing DNA (II) constructed in this way.
宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス属
菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。Examples of the host include bacteria of the genus Escherichia, bacteria of the genus Bacillus, yeast, and animal cells.
上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例としては
、前記したものと同様のものが挙げられる。Specific examples of the Escherichia genus bacteria and Bacillus genus bacteria include those mentioned above.
上記酵母としては、たとえばサツ力ロマイセスセレビシ
アエ（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅ） Ａ Ｈ２２Ｒ−、ＮΔ８７−１１Ａ、ＤＫＤ−
５Ｄなどが挙げられる。Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae.
ae) A H22R-, NΔ87-11A, DKD-
Examples include 5D.
動物軸ｌ―としては、たとえばサル細胞ＣＯ５−７、Ｖ
ｅｒｏ、チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ。As animal axes, for example, monkey cells CO5-7, V
ero, Chinese hamster cell CHO.
マウスＬ細胞、ヒトＰＬ細胞などが挙げられる。Examples include mouse L cells and human PL cells.
上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえばプ
ロシージング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ。To transform the above Escherichia bacteria, for example,
Science (Proc, Natl, ^cad, sci.
ＵＳＡ）、聾、２１１０（１９７２）やジーン、 １７
．１０７（１９８２）などに記載の方法に従って行なわ
れる。USA), Deaf, 2110 (1972) and Gene, 17
．． 107 (1982) and others.
バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネテイックス（阿ｏｉｅ
ｃｕｌａｒ ＆ ＧｅｎｅｒａＩ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）
、１６８，１１１（１９７９）などに記載の方法に従
って行なわれる。To transform Bacillus bacteria, for example, Molecular and General Genetics (Aoie
cular & GeneraI Genetics)
, 168, 111 (1979).
酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・オ
ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒ
ｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）、７５．
１９２９（１９７８）に記載の方法に従って行なわれる
。To transform yeast, for example, the Proceedings of the National Academy of Sciences (Pr.
oc, Natl, Acad, Sci, USA), 75.
1929 (1978).
動物細胞を形質転換するには、たとえばヴイロロジー（
Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）昇、４５６（１９７３）に記載の方
法に従って行なわれる。To transform animal cells, for example, virology (
It is carried out according to the method described in J. Virology) Noboru, 456 (1973).
このようにして、ＤＮＡ（ＩＩ）を含有するベクターで
形質転換された形質転°換体が得られる。In this way, a transformant transformed with the vector containing DNA (II) is obtained.
その−例としては、たとえば後述の実施例３（１）で得
られたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ １２
Ｄ Ｈ１／ ｐＴＢ６３７が挙げられ、該微生物は、昭
和６１年（１９８６年）６月１３日に財団法人発酵研究
所（ＩＦＯ）の受託番号ＩＦＯ１４５１０として寄託さ
れ、また１本微生物は、昭和６１年６月２０日に通商産
業省工業技術院微生物工業技術研究所（ＦＲＩ）に受託
番号ＦＥＲＭ Ｐ−８８１５として寄託され、該寄託
はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて、受託番
号ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７１として同研究所（ＦＲＩ）
に保管されている。For example, Escherichia coli K 12 obtained in Example 3 (1) described below
D H1/pTB637 was deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) on June 13, 1986 under accession number IFO14510; It was deposited with the Microbial Research Institute (FRI), Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry on August 20th, under the accession number FERM P-8815, and the deposit was changed to a deposit under the Budapest Treaty, and the same was deposited under the accession number FERM BP-1371. Research Institute (FRI)
is stored in.
宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培養に使用される培地としては液体培
地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必要
な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられる。When culturing a transformant whose host is a bacterium of the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as the culture medium, which contains a carbon source necessary for the growth of the transformant, Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained.
炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリン、
可溶性澱粉。Examples of carbon sources include glucose, dextrin,
Soluble starch.
ショ糖など、窒素源としては、たとえばアンモニウム塩
類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カ
ゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無
機または有機物質、無機物としてはたとえば塩化カルシ
ウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなど
が挙げられる。Nitrogen sources such as sucrose include inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and inorganic substances such as calcium chloride and phosphoric acid. Examples include sodium dihydrogen and magnesium chloride.
また、酵母、ビタミン類、生長促進因子゛などを添加し
てもよい。Further, yeast, vitamins, growth promoting factors, etc. may be added.
培地のｐ Ｈは約６〜８が望ましい。The pH of the medium is preferably about 6 to 8.
エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例えば
グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地（Ｍｉｌｌｅｒ
、ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキ
ュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆＥｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｇｅ
ｎａｔｉｃｓ）、４３１−４３３゜Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 Ｎｅ
ｗ Ｗｏｒｋ １９７２）が好ましい、ここに必要によ
りプロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３
β−インドリルアクリル酸のような薬剤を加えることが
できる。As a medium for culturing Escherichia bacteria, for example, M9 medium (Miller) containing glucose and casamino acids is used.
, Journal of Experiments in Molecular Genetics
Periments in Molecular Ge
natics), 431-433゜Cold Spri
ng ) Labor Laboratory, Ne
w Work 1972) is preferable, and if necessary, in order to make the promoter work efficiently, for example, 3
Agents such as β-indolyl acrylic acid can be added.
宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約１５〜４
３℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を
加えることもできる。When the host is Escherichia, the culture is usually about 15-4
The reaction is carried out at 3° C. for about 3 to 24 hours, and aeration and stirring can be added if necessary.
宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約３０〜４０℃
で約６〜２４時間行ない、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。When the host is Bacillus, culture is usually carried out at approximately 30-40°C.
This is carried out for about 6 to 24 hours, and aeration and stirring can be added if necessary.
宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地として
は、たとえばパークホールダ−（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ
）最小培地（Ｒｏｓｔｉａｎ、に、Ｌ、ら、［プロシー
ジング・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ
）７７．４５０５（１９８０） ）が挙げられる。培地
のｐＨは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常
約２０℃〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。When culturing a transformant whose host is yeast, examples of medium include, for example, Burkholder.
) minimal medium (Rostian, L., et al. [Procedure of National Academy of Sciences (Proc. Natl., Acad, Sci., USA)
) 77.4505 (1980)). Preferably, the pH of the medium is adjusted to about 5-8. Cultivation is usually carried out at about 20° C. to 35° C. for about 24 to 72 hours, with aeration and stirring added as necessary.
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地と
しては、たとえば約５〜２０％の胎児生血際を含むＭＥ
Ｍ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１２２゜５０１
（１９５２））、 Ｄ Ｍ Ｅ Ｍ培地〔ヴイロロジ−
（Ｖｉｒｏ−１ｏｇｙ）、８，３９６（１９５９））
、 ＲＰ Ｍ Ｉ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・
ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈ
ｅ Ｊｏｕｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ ＡｍｅｒｉｃａｎＭ
ｅｄｉｃａｌ Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ） １９９，５
１９（１９６７））、 １９９培地〔プロシージング・
オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル
・メディスン（Ｐｒｏ−ｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ
５ｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌＭｅｄｉａｉｎｓ）７３．１ （１９５０）３など
が挙げられる。ｐＨは約６〜８であるのが好ましい。培
養は通常約３０℃〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing a transformant whose host is an animal cell, the medium may be, for example, ME containing about 5 to 20% live fetal blood.
M medium [Science 122゜501
(1952)), DMEM medium [virology
(Viro-1ogy), 8,396 (1959))
, RP MI 1640 medium [Journal of
The American Medical Association (Th
e Journal of the AmericanM
(edical association) 199,5
19 (1967)), 199 Medium [Processing
Pro-ceeding of the Society for the Biological Medicine
5ociety for the Biologic
alMediains) 73.1 (1950) 3. Preferably the pH is about 6-8. Cultivation is usually carried out at about 30°C to 40°C for about 15 to 60 hours, with aeration and stirring added as necessary.
上記培養物からヒトＣ−キナーゼ蛋白を分離精製するに
は１例えば下記の方法により行なうことができる。The separation and purification of human C-kinase protein from the above culture can be carried out, for example, by the following method.
ヒトＣ−キナーゼ蛋白を培養菌体あるいは細胞から抽出
するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細
胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤を含
む緩衝液に懸濁し、超音波。To extract human C-kinase protein from cultured bacterial cells or cells, after culturing, the bacterial cells or cells are collected by a known method, suspended in a buffer containing a protein denaturing agent such as guanidine hydrochloride, and subjected to ultrasonication. .
リゾチームおよび（または凍結融解）によって菌体ある
いは細胞を破壊したのち、遠心分離によりヒトＣ−キナ
ーゼ蛋白を得る方法などが適宜用い９シ）る。After disrupting bacterial bodies or cells with lysozyme (or freezing and thawing), human C-kinase protein can be obtained by centrifugation, as appropriate.
上記上澄液からヒトＣ−キナーゼ蛋白を精製するには、
自体公知の分離・′！ａ製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離。To purify human C-kinase protein from the above supernatant,
Separation that is known per se! It can be carried out by appropriately combining the manufacturing methods a. These known separations.
精製法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用
する方法、透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、および５
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気応動法などの主とし
て分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィーなどの荷電の差を利用する方法、アフィニティー
クロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法
、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を
利用する方法５等電点電気泳動法などの等重点の差を利
用する方法などが挙げられる。Purification methods include methods that utilize solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and
Methods that mainly utilize differences in molecular weight such as DS-polyacrylamide gel electrodynamic method, methods that utilize differences in charge such as ion exchange chromatography, methods that utilize specific affinity such as affinity chromatography, and reversed phase high speed Examples include methods that utilize differences in hydrophobicity such as liquid chromatography, and methods that utilize differences in isocenters such as isoelectric focusing.
本発明の遺伝子組み換え技術によって得られたヒトＣ−
キナーゼ蛋白の一例として、例えば第１図におけるアミ
ノ酸配列で示されるポリペプチドを含有する蛋白質を挙
げることができる。該ポリペプチドはそのＮ末端にＭｅ
ｔを有していてもよい。Human C- obtained by the genetic recombination technology of the present invention
An example of a kinase protein is a protein containing the polypeptide shown by the amino acid sequence shown in FIG. The polypeptide has Me at its N-terminus.
It may have t.
かくして生成するヒトＣ−キナーゼの活性は公知の蛋白
質リン酸化などによりａｌｌ定することができる。The activity of the human C-kinase thus produced can be determined by known protein phosphorylation.
本発明のＤＮＡで遺伝子感染または形質転換した細胞で
は１本来わずかのヒトＣ−キナーゼしが合成されない、
あるいは全く合成されない各種細胞においても大量のヒ
トＣ−キナーゼを産生せしめることができ、ヒトＣ−キ
ナーゼ生産を有利に導くことができる。In cells genetically infected or transformed with the DNA of the present invention, only a small amount of human C-kinase is synthesized.
Alternatively, it is possible to produce a large amount of human C-kinase even in various cells in which it is not synthesized at all, and to advantageously guide the production of human C-kinase.
本発明のヒトＣ−キナーゼ蛋白をコードする遺伝子を含
有する発現型プラスミドは、これを各種細胞に導入する
ことにより該細胞にヒトＣ−キナーゼを産生させること
ができるため、ヒトＣ−キナーゼを大量に取得すること
ができる。ここに製造されるヒトＣ−キナーゼは、試薬
としてまた抗体を調製しその抗体と共に診断・検査薬と
して用いることができる。たとえば本発明のＣ−キナー
ゼは、細胞膜受容伝達機構などの研究用試薬、細胞膜受
容伝達機構の異常が原因となる疾病（例：腫瘍）に対す
る診断・検査薬、あるいはこれらの疾病に対する予防・
治療薬のスクリーニング用試薬として用いることができ
る。たとえば、１回の診断・検査に約０．００１〜１０
μｇのＣ−キナーゼが用いられる。The expression plasmid containing the gene encoding the human C-kinase protein of the present invention can be introduced into various cells to cause the cells to produce human C-kinase. can be obtained. The human C-kinase produced herein can be used as a reagent or as a diagnostic/testing agent in the preparation of antibodies. For example, the C-kinase of the present invention can be used as a research reagent for the cell membrane receptor/transmission mechanism, a diagnostic/test agent for diseases (e.g. tumors) caused by abnormalities in the cell membrane receptor/transmission mechanism, or a preventive/test agent for these diseases.
It can be used as a screening reagent for therapeutic drugs. For example, about 0.001 to 10 per diagnosis/examination
μg of C-kinase is used.
以上、ヒトＣ−キナーゼのクローニング、形質転換体の
製造、形質転換体を用いたヒトＣ−キナーゼ蛋白の製造
及びその有用性等について詳細に述べたが、これらはラ
ットＣ−キナーゼにおいても同様に適用される。Above, we have described in detail the cloning of human C-kinase, the production of transformants, the production of human C-kinase protein using transformants, and its usefulness, but these also apply to rat C-kinase. Applicable.
本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸など
を略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵ Ｂ Ｃｏ
ｍｍ１ｓｉｏｎ ｏｎ Ｉ３ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ
Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ′による略号あるいは当
該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を
下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場
合は、特に明示しなければＬ一体を示すものとする。In the specification and drawings of the present invention, when bases, amino acids, etc. are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Co
mm1sion on I3iochemical
It is based on the abbreviations based on Nomenclature' or common abbreviations in the field, examples of which are given below. In addition, when an amino acid can have optical isomers, unless otherwise specified, the L-isomer is assumed to be indicated.
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ニゲアニン
Ｃ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｄＡＴＰ：デオキシアデノシン三リン酸ｄＴＴＰ：デオ
キシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ：デオキシグアノシン三リン酸ｄＣＴＰ：デオ
キシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ニドデシル硫酸ナトリウム
Ｇ１ｙ ニゲリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
ＩＩｓ ：インロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ニジスティン
Ｍｅｔ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニールアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐニトリブトファン
Ｐｒｏ ニブロリン
Ａｓｎ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
および 日の 果
以下の実施例により本発明をより具体的に説明するが１
本発明はこれらに限定されるものではない。DNA: Deoxyribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G Nigeanine C: Cytosine RNA: Ribonucleic acid dATP: Deoxyadenosine triphosphate dTTP: Deoxythymidine triphosphate dGTP: Deoxyguanosine triphosphate dCTP: Deoxycytidine ATP triphosphate: Adenosine triphosphate EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS Sodium nidodecyl sulfate G1y Nigericin Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine IIs: Inleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys Nidistine Met: Methionine Glu: Glutamate Asp: Asparagine Acid Lys: Lysine Arg: Arginine His: Histidine Phe: Phenylalanine Tyr: Tyrosine Trp Nitributophane Pro Nibroline Asn: Asparagine Gln: Glutamine and Sun The present invention will be explained more specifically by the following examples.
The present invention is not limited to these.
なお、実施例２で得られた形質転換体Ｅ、ｃ。In addition, transformants E and c obtained in Example 2.
１ｉ Ｋ１２ＤＨ１／ｐＴＢ６３８は昭和６１年（１
９８６年）６月２０日にＩＦＯに受託番号ＩＦＯ１４５
１４として寄託され、本形質転換体は昭和６１年６月２
８日にＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−８８２９とし
て寄託され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切
換えられて、受託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７２とし
てＦＲＩに保管されている。1i K12DH1/pTB638 was introduced in 1986 (1
Accession number IFO145 to IFO on June 20, 1986)
14, and this transformant was deposited on June 2, 1986.
On the 8th, it was deposited with FRI under the accession number FERM P-8829, and the deposit was changed to a deposit under the Budapest Treaty and is kept at FRI under the accession number FERM BP-1372.
また、実施例４で得られた形質転換体Ｅ、ｃ。In addition, transformants E and c obtained in Example 4.
１ｉ Ｋ１２ＤＨ１／ｐＴＢ６５２は昭和６１年８７
１２９日にＩＦＯに受託番号ＩＦＯ１４５３９として寄
託され、また本形質転換体は昭和６１年９月５日にＦＲ
Ｉに受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−８９５８として寄託され
、該寄託はブダペスト条約に基づく寄託に切換えられて
、受託番号ＦＥＲＭＢＰ−１３７３としてＦＲＩに保管
されている。1i K12DH1/pTB652 was released in 1987.
The transformant was deposited at IFO on September 5, 1988 with accession number IFO14539, and this transformant was deposited with the FR on September 5, 1986.
The deposit was deposited with FRI under accession number FERM P-8958, which has been converted to a deposit under the Budapest Treaty, and is deposited with FRI under accession number FERMBP-1373.
実施例４で得られた形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２ＤＨ
１／ｐＴＢ６５３は昭和６１年８月２９日にＩＦＯに受
託番号ＩＦＯ１４５４０として寄託され、本形質転換体
は昭和６１年９月５日にＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ
Ｐ−８９５９として寄託され、該寄託はブダペスト条約
に基づく寄託に切換えられて、受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１３７４としてＦＲＩに保管されている。Transformant E obtained in Example 4, coli K12DH
1/pTB653 was deposited with IFO on August 29, 1985 under accession number IFO14540, and this transformant was deposited with FRI on September 5, 1986 under accession number FERM.
P-8959, and the deposit has been converted to a deposit under the Budapest Treaty and has accession number FERM B.
It is stored at FRI as P-1374.
実施例５で得られた形質転換体Ｅ、ｃｏｌｉＤＨＩ／ｐ
ＴＢ７５５は昭和６２年５月２１日にＩＦＯに受託番号
ＩＦ０ １４６１２として寄託され、本形質転換体は昭
和６２年５月２９日にＦＲＩに受託番号ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−１３８２としてブダペスト条約に基づいて寄託され
た。Transformant E obtained in Example 5, coliDHI/p
TB755 was deposited with IFO on May 21, 1985 under accession number IF0 14612, and this transformant was deposited with FRI on May 29, 1988 under accession number FERM B.
Deposited under the Budapest Treaty as P-1382.
実施例１
（１）ラット−Ｃキナーゼのアミノ酸配列の決定ラット
−Ｃキナーゼは吉川らの方法〔ジャーナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミストリイ（Ｊ。Example 1 (1) Determination of the amino acid sequence of rat-C kinase Rat-C kinase was determined by the method of Yoshikawa et al. [Journal of Biological Chemistry (J.
Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２５７．１３３４１ （１９
８２））に従ってラット脳より抽出精製した。２４０匹
のラット脳より。Biol, Chem, ) 257.13341 (19
Extracted and purified from rat brain according to 82)). From 240 rat brains.
２．０■の精製Ｃ−キナーゼ標品を得た。この標品１．
９■を６Ｍ尿素を含む５０ ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−）１ｃ
ｌ（ｐＨ９，０）溶液１．９ｍ（ｌにとかし、リジルエ
ンドペプチダーゼを２５μＱ ／ ｍ Ｑに添加して３
７’Ｃ２１時間消化した。生成したペプチドを逆相ＨＰ
Ｌ Ｃ（Ｍｉｃｒｏ ｐａｋ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃ１
８−１０，０，４Ｘ３０Ｑ１カラム）にかけアセトニト
リルのグラジェント溶出により分画、分取した。分画さ
れた約５０のペプチドのうちの４種類（ペプチドＮｏ、
２４．３７゜４９．５１）についてそのアミノ酸配列を
気相プロテインシークエンサー（モデル４７０Ａ、Ａｐ
ｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、 Ｉｎｃ、）を用
いた自動エドマン分解法により決定した。エドマン分解
により生じたアミノ酸のチオヒダントイン化物はＭｉｃ
ｒｏ ｐａｋ ＳＰＣ１８−３カラム（Ｖａｒｉａｎ
Ａｓ５ｏｃｉａｔｅｓ、 Ｉｎｃ）を用いたＨＰＬＣに
より分析した。得られた４種類のペプチドのアミノ酸配
列を第１図に示した。A purified C-kinase preparation of 2.0 μm was obtained. This specimen 1.
50 mM Tris-) 1c containing 9■6M urea
(pH 9,0) solution was dissolved in 1.9 m (l) and lysyl endopeptidase was added to 25 μQ/m Q.
7'C was digested for 21 hours. The generated peptide is subjected to reverse phase HP
L C (Micro pak Protein C1
8-10,0,4X30Q1 column) and fractionated by acetonitrile gradient elution. Four of the approximately 50 fractionated peptides (peptide No.
24.37°49.51), its amino acid sequence was analyzed using a gas phase protein sequencer (model 470A, Ap
plied Biosystems, Inc.) using the automated Edman decomposition method. The thiohydantoinated amino acid produced by Edman degradation is Mic.
ro pak SPC18-3 column (Varian
Analyzed by HPLC using As5ociates, Inc). The amino acid sequences of the four types of peptides obtained are shown in FIG.
実施例２
（１）ラットＪＱ ｍ ＲＮ Ａ由来のｃＤＮＡライブ
ラリーの作製
ラット脳よりＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート法
（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ＋ら、Ｂｉｏｃｈｅｎ＋１ｓｔｒｙ
１８．５２９４゜１９７８）を用いて抽出した。この
ＲＮＡよりポリ（Ａ）ＲＮＡをオリゴｄＴセルロースカ
ラムクロマトグラフィーにより精製した（ＡｖｉｖとＬ
ｅｄｅｒ 、 ｒプロシージング・オブ・ナショナル・
アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、
Ａｅａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ） ６９．１４０８ （１９
７２）〕。Example 2 (1) Preparation of cDNA library derived from rat JQ m RNA RNA was extracted from rat brain using the guanidine isothiocyanate method (Chirgwin et al., Biochen
18.5294°1978). Poly(A) RNA was purified from this RNA by oligo dT cellulose column chromatography (Aviv and L
eder, rProceeding of National
Academy of Science (Proc, Natl.
Aead, Sci, USA) 69.1408 (19
72)].
このポリ（Ａ）ＲＮＡを紡型としてｃＤＮＡライブラリ
ーをＯｋａｙａｍａとＢｅ ｒｇの方法（Ｏｋａｙａｍ
ａ ＆ Ｂｅｒｇ、「モレキュラーアンドセルラー・バ
イオロジー（Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、）Ｊ ２，
１６１，１９８２゜同誌、３，２８０．１９８３］ ニ
従ってｐＣＤｖ１ベクター、ｐＬ１リンカ−を用いて作
製した。環状化したＣＤＮＡを含むベクターｐｌａｓｍ
ｉｄは大腸菌ＤＨ−１に感染させ、５μｇのポリ（Ａ）
ＲＮＡより出発して約５ Ｘ １０’個のクローンより
なる大腸菌ＤＨ−１を宿主としたｃＤＮＡライブラリー
を得ることができた。Using this poly(A) RNA as a spindle, a cDNA library was prepared using the method of Okayama and Berg (Okayama et al.
a & Berg, “Molecular and Cellular Biology (Mo1.Ce11.Biol,) J 2,
161, 1982, 3, 280.1983] Therefore, it was constructed using pCDv1 vector and pL1 linker. Vector plasm containing circularized CDNA
id was infected with E. coli DH-1 and infected with 5 μg of poly(A).
Starting from RNA, we were able to obtain a cDNA library using E. coli DH-1 as a host, consisting of approximately 5 x 10' clones.
（２）ラット−〇キナーゼｃＤＮＡを含むプラスミドの
単離とその塩基配列の決定
上記大腸菌ＤＨＩを用いたラットｃＤＮＡライブラリー
をニトロセルロースフィルター（ミリボア社、ＨＡＴＦ
フィルター）上に約３ Ｘ １０’クローン／フイルタ
ーとなるように１０枚まき、このフィルターをマスター
フィルターとしている各２枚ずつを１組としたレプリカ
フィルター計２０枚を作製した。このレプリカフィルタ
ー上の大腸菌を０．５ＮＮ ａ ＯＨ溶液でとかし露出
変性したプラスミドＤＮＡをフィルター上に乾燥固定し
た（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、 ＆ Ｈｏｇｎｅｓｓ、
Ｄ、Ｓ、 ｒプロシージング・オブ・ナショナル・アカ
デミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ
ａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７２，３９６１（１９７５））
。(2) Isolation of plasmid containing rat-○ kinase cDNA and determination of its base sequence
A total of 20 replica filters were prepared, with each set of 2 replica filters using this filter as a master filter. The E. coli on this replica filter was dissolved in a 0.5N NaOH solution, and the denatured plasmid DNA was dried and fixed on the filter (Grunstein, M. & Hogness,
D, S, rProceeding of the National Academy of Sciences (Proc., Natl., Ac.
ad, Sci, USA) 72, 3961 (1975))
.
一方、実施例１の（１）で決定したペプチドのアミノ酸
配列より、その配列に対応する塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを化学合成した。即ち、ペプチドＮｏ、２
４の７−１２のアミノ酸配列（Ｔｙｒ−Ｉｆｆｉｅ−Ａ
ｓｐ−Ｔｒｐ−ＧＱｕ−Ｌｙｓ）ペプチドＮｏ、５１の
３−８のアミノ酸配列（Ａ ｓ ｐ−Ｔ ｒ ｐ−Ｔ
ｒ ｐ−Ａ Ｑ ａ−Ｐ ｈ ｅ−Ｇ Ｑ ｙ）■
さらにペプチドＮｏ、５１の２４−２９のアミノ酸配列
（Ｇ Ｑ ｕ−Ａ ｓ ｐ−Ｇ Ｑ ｕ−Ａ ｓ ｐ−
Ｇ Ｑ ｕ−（プローブＮｏ、３）を合成してラットＣ
キナーゼｃＤＮＡのスクリーニングプローブとした。On the other hand, from the amino acid sequence of the peptide determined in Example 1 (1), an oligonucleotide having a base sequence corresponding to the sequence was chemically synthesized. That is, peptide No. 2
Amino acid sequence 7-12 of Tyr-Iffie-A
sp-Trp-GQu-Lys) Peptide No. 51 3-8 amino acid sequence (A sp-Trp-T
r p-A Q a-P h e-G Q y) ■ Furthermore, the amino acid sequence of 24-29 of peptide No. 51 (G Q u-A sp-G Q u-A sp-
G Q u- (probe No. 3) was synthesized and rat C
It was used as a screening probe for kinase cDNA.
これらオリゴヌクレオチドプローブの５１末端をＴ４ポ
リヌクレオチドキナーゼ、〔γ−３２Ｐ〕ＡＴＰを用い
て”Ｐで標識した。The 51 ends of these oligonucleotide probes were labeled with "P" using T4 polynucleotide kinase, [gamma-32P]ATP.
標識したプローブＮｏ、２とプローブＮｏ、３をＤＮＡ
を固定したレプリカフィルターに別々に会合させた。会
合反応は１０μＣｉの標識プローブを含む５ＸＳＳＣ（
０，１５Ｍ ＮａＣＱ、 ０．０１５Ｍ Ｓｏｄｉｕｍ
ｃｉｔｒａｔｅ）、 ５ ＸＤａｎｈａｒｄｔ’ｓ、
０．１％ＳＤＳ。Labeled probe No. 2 and probe No. 3 are DNA
were separately associated with immobilized replica filters. The association reaction was carried out in 5X SSC containing 10 μCi of labeled probe (
0.15M NaCQ, 0.015M Sodium
citrate), 5 XDanhardt's,
0.1% SDS.
１１００ｐ／ｍＱ変性サケ***ＤＮＡ溶液１０ｍＱ中で
４２℃１６時間行い、反応後、フィルターを６ＸＳＳＣ
，Ｏ，１％ＳＤＳ溶液で室沢で３０分ずつ３回、さらに
プローブＮ００２を用いた場合では４７℃、プローブＮ
ｏ、３では４３℃で６０分ずつ２回洗浄した（Ｔ、 Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、「モレキュラークローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ）ｌａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ｐ
３０９．１９８２）洗浄したフィルターよりラジオオー
トグラムをとり、二種類のプローブの両方に対して反応
する菌株を１組２枚のレプリカフィルターのラジオオー
トグラムを重ね合わせることにより探した。この方法に
より３ Ｘ Ｉ Ｏ’ｃｏｌｏｎｉｅｓより、二種類の
プローブの両方に対して反応する１株Ｅ 、ｃｏｌｉ
Ｋ １２ Ｄ Ｈ１／ｐＴＢ６３８（ＩＦＯ１４５１４
，ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７２）を得た。The reaction was carried out in 10 mQ of 1100p/mQ denatured salmon sperm DNA solution at 42°C for 16 hours, and after the reaction, the filter was placed in 6XSSC.
, O, 1% SDS solution three times for 30 minutes each at Murosawa, and when probe N002 was used, at 47°C and probe N
Washed twice at 43°C for 60 minutes each (T, M
Aniatis et al., “Molecular Cloning (Mo
(regular Cloning) Co1d Spr
ing) Labor Laboratory, p
309.1982) Radioautograms were taken from the washed filters, and strains that reacted to both of the two types of probes were searched for by overlapping the radioautograms of two replica filters. By this method, one strain of E. coli that reacted to both of the two types of probes was obtained from 3 X I O'colonies.
K 12 D H1/pTB638 (IFO14514
, FERM BP-1372) was obtained.
この菌株よりプラスミドＤＮＡ （Ｐ ＴＢ ６３８）
をアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏ
ｌｙ、ＪＪヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃ Ａｃ１ｄｓＲｅｓ−）＝Ｊｌ、１５１３−（１９
７９））によって抽出精製した。Plasmid DNA from this strain (P TB 638)
using the alkaline method (Birnboim, H, C, & Do
ly, JJ Nucleic Acids Research (Nucle)
ic Ac1dsRes-)=Jl, 1513-(19
79)).
ＤＮＡを制限酷素ＢａｍＨＩ（宝酒造製）で切断し、ア
ガロースゲル電気泳動で分画した後、ＤＮＡ断片をアガ
ロースゲル中よりニトロセルロースフィルター（ニスア
ンドニス社、ＢＡ８５）上に移した〔サザンブロツテイ
ング法、Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓら、［モレキュラー ク
ローニング（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ） Ｃ
ｏ１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ、 ｐｐ３８２、１９８２］。このフィルターを
前記三種のオリゴヌクレオチドプローブ（プローブＮｏ
、１．２．３）と会合させると、プラスミドＤＮＡ断片
は三種のプローブのいずれとも反応した。The DNA was cut with the restriction compound BamHI (manufactured by Takara Shuzo), fractionated by agarose gel electrophoresis, and the DNA fragments were transferred from the agarose gel onto a nitrocellulose filter (Nis & Nis Co., Ltd., BA85) [Southern blotting method] , T., Maniatis et al. [Molecular Cloning C
o1d Spring Harbor Laborat
ory, pp382, 1982]. This filter was attached to the three oligonucleotide probes (probe No.
, 1.2.3), the plasmid DNA fragments reacted with all three probes.
このプラスミドＤＮＡのｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデ
オキシヌクレオチド合成鎖停止法（Ｊ。The base sequence of the cDNA portion of this plasmid DNA was extracted using the dideoxynucleotide synthetic chain termination method (J.
Ｍｅｓｓｉｎｇら「ヌクレイツク アシッズ リサーチ
（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅｓ、）Ｊ９．３０
９．（１９８１））によって決定した。その塩基配列お
よび塩基配列より予測されるアミノ酸配列を第２図に示
した。Messing et al. “Nucleic Acids Res,” J9.30
9. (1981)). The nucleotide sequence and the amino acid sequence predicted from the nucleotide sequence are shown in FIG.
この配列で、実施例１の（１）で決定したペプチドＮｏ
、２４のアミノ酸配列はＮｏ、４４５−４８０の塩基配
列にまたペプチドＮｏ、５１のアミノ酸配列はＮｏ、２
２．０−３１２の塩基配列に正しく対応していることが
わかる。従って、このプラスミドｐＴＢ６３８がラット
ＣキナーゼＣＤＮＡであることが確認された。また、こ
のｃ Ｄ Ｎ Ａはポリ（Ａ）構造を含んでいることか
ら、Ｃ−キナーゼのＣ末端側コード部分と、ｍＲＮＡの
３′末端側非翻訳部分の構造を保持していることがわか
った。なお、ラットのＣ−キナーゼとしては第２図に示
したアミノ酸配列をその一部として含む。With this sequence, the peptide No. determined in Example 1 (1)
, the amino acid sequence of 24 is No, the base sequence of 445-480 is also peptide No, the amino acid sequence of 51 is No, 2
It can be seen that it correctly corresponds to the base sequence of 2.0-312. Therefore, this plasmid pTB638 was confirmed to be rat C kinase CDNA. Furthermore, since this cDNA contains a poly(A) structure, it has been found that it retains the structure of the C-terminal coding part of C-kinase and the 3'-terminal untranslated part of mRNA. Ta. Incidentally, the rat C-kinase includes the amino acid sequence shown in FIG. 2 as a part thereof.
実施例３
（１）ヒトＣ−キナーゼｃＤＮＡを含有するプラスミド
の単離
ヒト***由来初代培養細胞ｍＲＮＡより合成したｃＤＮ
ＡをｐＣＤベクター（Ｏｋａｙａｍａら、「モレキュラ
ーアンドセルラーバイオロジー（Ｍｏｌ。Example 3 (1) Isolation of plasmid containing human C-kinase cDNA cDNA synthesized from human foreskin-derived primary culture cell mRNA
A into a pCD vector (Okayama et al., "Molecular and Cellular Biology (Mol.
Ｃａ１１．Ｂｉｏｌ、）Ｊ ３，２８０．（１９８３）
参照〕に組み込んで作成した大腸菌ｘ１７７６を宿主と
したｃＤＮＡライブラリーをＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｌｄｌｌｅａｌｔｈ ａｎ
ｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｅｖｅｌｏｐａ＋ｅｎｔ、 Ｂｅｔ
ｈｅｓｄａ、Ｕ’、Ｓ、Ａ。Ca11. Biol, ) J 3,280. (1983)
A cDNA library created by integrating E. coli
Titute of Childlleath an
d Human Developer+ent, Bet
hesda, U', S, A.
の岡山博士より分与を受けた。このｃＤＮＡライブラリ
ーよりアルカリ法（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ、 １１．ｃ、＆
ＤｏＩｙ。Received a grant from Dr. Okayama. From this cDNA library, the alkaline method (Birnboim, 11.c, &
DoIy.
Ｊ、「ヌクレイツク アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌａｉ
ｃＡｃｉｄｓ Ｒａ５−）−Ｊ１＊１５１３−（１９７
９））でプラスミドＤＮＡを抽出し、このＤＮＡを大腸
菌ＤＨＩに感染させ、約２ Ｘ １０’個のｃｌｏｎｅ
よりなる大腸菌ＤＨＩを宿主としたｃＤＮＡライブラリ
ーを作成した。J, “Nuclai
cAcids Ra5-)-J1*1513-(197
9)) Extract plasmid DNA, infect E. coli DHI with this DNA, and create approximately 2 x 10' clones.
A cDNA library was constructed using E. coli DHI as a host.
上記大腸菌ＤＨＩを用いたｃＤＮＡライブラリーをニト
ロセルロースフィルター（ミリボア社、ＨＡＴＦフィル
ター）上に約５ Ｘ １０’クローン／フイルターとな
るように１２枚まき、このフィルターをマスターフィル
ターとしてレプリカフィルターを作製した。このレプリ
カフィルター上の大腸菌を０．５ＮＮａＯＨ溶液でとか
し露出変性したプラスミドＤＮＡをフィルター上に乾燥
固定した（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ、Ｍ、 ＆ Ｈｏｇｎｅ
ｓｓ、０．Ｓ、 ｒプロシージング・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ）７２．３９６１（１９７
５） ）。The above cDNA library using E. coli DHI was spread on 12 nitrocellulose filters (Millivore, HATF filter) at approximately 5 x 10' clones/filter, and this filter was used as a master filter to prepare a replica filter. E. coli on this replica filter was dissolved in a 0.5N NaOH solution, and the denatured plasmid DNA was dried and fixed on the filter (Grunstein, M. & Hogne et al.
ss, 0. S, rProceeding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl.
, Acad, Sci, USA) 72.3961 (197
5) ).
一方、実施例２の（２）で単離したプラスミドｐＴＢ６
３８を制限酵素ＰｓｔＩで切断して得られる約０．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片を〔α−３２Ｐ〕αＡＴＰ、ＤＮＡポリ
メラーゼＩを用いて）２ｐｅＡ識した〔ニックトランス
レーション法、Ｐ、１．Ｒｉｇｂｙらｒジャーナル・オ
ブ・モレキュラー−バイオロジー（Ｊ。On the other hand, plasmid pTB6 isolated in Example 2 (2)
Approximately 0.7k obtained by cutting 38 with the restriction enzyme PstI
The DNA fragment of b was identified as 2peA using [α-32P]αATP and DNA polymerase I [nick translation method, P, 1. Rigby et al. Journal of Molecular Biology (J.
Ｍｏ１．Ｒｉｏｌ、Ｊ１１３，２３７（１９７？））。Mo1. Riol, J113, 237 (197?)).
この標ＦａＤＮＡ断片をプローブとしてＤＮＡを固定し
たレプリカフィルターと会合させた。会合反応は５μＣ
ｉのプローブを含む２０％ホルムアミド、５ Ｘ Ｓ
Ｓ Ｐ Ｅ 、 ５ ＸＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、 ０
．１％ＳＤＳ、１００μｇ／ｍＱ変性サケ***ＤＮＡ溶
液１０ｍａ中で４２℃１６時間行い１反応後、フィルタ
ーを２ＸＳＳＣ，０，１％ＳＯ３溶液で室温で３０分３
回、さらに５０℃で３０分ずつ２回洗浄した（Ｔ、 Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、「モレキュラークローニング（Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ） Ｃｏ１ｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、 ｐｐ３
０９．１９８２） 、洗浄したフィルターよりラジオオ
ートグラムをとり、プローブと反応する菌株Ｅ、ｃｏｌ
ｉ Ｋ１２ＤＨ１／ｐ’ｌ”Ｂ６３７（ＩＦＯ１４５
１０，ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７１）を得た。This target FaDNA fragment was used as a probe to associate with a replica filter on which DNA was immobilized. Association reaction is 5μC
20% formamide, 5X S containing i probe
S P E , 5 XDenhardt's, 0
．． After 1 reaction in 10ma of 1% SDS, 100μg/mQ denatured salmon sperm DNA solution at 42℃ for 16 hours, filter was incubated in 2XSSC, 0.1% SO3 solution for 30 minutes at room temperature.
Washed twice at 50°C for 30 minutes each (T, M
Aniatis et al., “Molecular Cloning (Mo
(regular Cloning) Co1d Spr
ing Harbor Laboratory, pp3
09.1982), a radioautogram was taken from the washed filter, and bacterial strain E, col that reacted with the probe was collected.
i K12DH1/p'l"B637 (IFO145
10, FERM BP-1371) was obtained.
（２）ｃＤＮＡの塩基配列の決定
上記（１）で得た菌株Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ１２ＤＨ１／
ｐＴＢ６３７（ＩＦＯ１４５１０，ＦＥＲＭＢＰ−１３
７１）よりプラスミドＤＮＡ （ｐＴＢ ６３７）をア
ルカリ法〔口ｉｒｎｂｏｉｍ、 Ｈ，Ｃ，＆ Ｄｏｌｙ
＋Ｊ−’ヌクレイツク アシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅ
ｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、）、Ｊｌ、１５１３．（１９
７９））によって抽出精製した。このプラスミドに含ま
れるｃＤＮＡ部分は全長約１．２Ｋｂｐであり、その簡
単な制限酵素地図を第３図に示した。(2) Determination of cDNA base sequence Bacterial strain E obtained in (1) above, coli K12DH1/
pTB637 (IFO14510, FERMBP-13
71), plasmid DNA (pTB 637) was obtained by the alkaline method [Irnboim, H, C, & Doly.
+J-'Nucleitsuku Acid Research (Nucle)
icAcids Res, ), Jl, 1513. (19
79)). The cDNA portion contained in this plasmid has a total length of approximately 1.2 Kbp, and a simple restriction enzyme map thereof is shown in FIG.
このｃ Ｄ Ｎ Ａ部分の塩基配列の一部をジデオキシ
ヌクレオチド合成鎖停止法（Ｍｅｓｓｉｎｇ Ｊ、ら「
ヌクレイックアシッズリサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ
１ｄｓＲｅｓ、）＝Ｊ ９．３０９． （１９８１））
によって決定した。決定された塩基配列およびその配列
より推測されるアミノ酸配列を第４図に示した。A part of the base sequence of this cDNA portion was subjected to the dideoxynucleotide synthetic chain termination method (Messing J. et al.
Nucleic Acids Research
1dsRes, ) = J 9.309. (1981))
It was decided by. The determined base sequence and the amino acid sequence deduced from the sequence are shown in FIG.
推測されたアミノ酸配列は、実施例２の（２）で示した
ラットＣキナーゼｃＤＮＡより推測されるアミノ酸配列
に高い相同性を示しており、プラスミドｐＴＢ６３７に
含まれるｃＤＮＡがヒトＣ−キナーゼｏＤＮＡであるこ
とを示している（第５図及び第６図参照）、なお、第５
図は、第２図を基に第４図の第２６番目のアミノ酸（Ａ
Ｑａ）から重ね合わせ、アミノ酸の相同性をみたもので
あり、囲みが同一アミノ酸を示す、また第６図は、第４
図を基に、第４図の第２６番目のアミノ酸（ＡＱａ）の
先頭のコドンＧに第２図の先頭のコドンを重ね合わせ、
塩基配列の相同性をみたものであり、囲みが同一塩基を
示す。The deduced amino acid sequence shows high homology to the amino acid sequence deduced from the rat C-kinase cDNA shown in Example 2 (2), and the cDNA contained in plasmid pTB637 is human C-kinase oDNA. (See Figures 5 and 6).
The figure is based on Figure 2 and shows the 26th amino acid (A) in Figure 4.
Figure 6 shows the homology of amino acids by superimposing them from Qa), and the boxes indicate the same amino acids.
Based on the diagram, superimpose the first codon in Figure 2 on the first codon G of the 26th amino acid (AQa) in Figure 4,
This shows the homology of the base sequences, and the boxes indicate the same bases.
実施例４
（１）ラット脳ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーの
作製
ラット脳より、ＲＮＡをグアニジンイソチオシアネート
法（Ｃｈｉｒｇｗｉｍら、「バイオケミストリー（Ｂｉ
ｏｃｈｅｓ＋１ｓｔｒｙ）Ｊｅ１８，５２９４，１９７
ｇ）を用いて抽出した。このＲＮＡよりポリ（Ａ） Ｒ
Ｎ ＡをオリゴｄＴセルロースカラムクロマトグラフィ
ーにより精製した（ ＡｖｉｖとＬａｄｅｒ、 ｒプロ
シージング・オブ・ナシＪナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。Example 4 (1) Preparation of cDNA library derived from rat brain mRNA RNA was extracted from rat brain using the guanidine isothiocyanate method (Chirgwim et al.
oches+1stry)Je18,5294,197
g). From this RNA, poly(A) R
NA was purified by oligo-dT cellulose column chromatography (Aviv and Lader, Proc. Natl.
Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、υ、Ｓ、Ａ）６９，１４０８．（１
９７２） ）、このポリ（Ａ）ＲＮＡ＆ｕ型としてｃＤ
ＮＡライブラリーを、ＷａｔｓｏｎとＪａｃｋｓｏｎの
方法（Ｖａｔｓｏｎ、Ｃ，Ｊ、ａｎｄ Ｊａｃｋｓｏｎ
。Acad, Sci, υ, S, A) 69,1408. (1
972) ), this poly(A)RNA&u type as cD
The NA library was prepared using the method of Watson and Jackson (Vatson, C.J., and Jackson).
.
Ｊ、Ｆ、、ＤＮＡクローニング・ア・プラクティカル・
アプローチ（Ｄ Ｎ Ａ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ）ＩＲＬ ｐｒｅｓｓ
、０ｘｆｏｒｄ、ｐ７９．１９８５）に従って、λファ
ージベクターλｇｔｌｏ（Ｈｕｙｎｈ、Ｔ、Ｖ、ら、Ｄ
ＮＡクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ、
ＩＲＬｐｒｅｓｓ、０ｘｆｏｒｄ、ｐ４９，１９８５
）を用いて作成した。 ｌｏμｇのポリ（＾）ＲＮＡよ
り出発して、約１．５ Ｘ １０＠個のクローンよりな
る大腸菌Ｃ６００，Ｈｆ ＱＡ （Ｈｕｙｎｈ Ｔ、Ｖ
ら、同上）を宿主としたｃ Ｄ Ｎ Ａライブラリーを
得ることができた。J.F., DNA Cloning A Practical
Approach (D N A Cloning A Pra
(ctical approach) IRL press
, Oxford, p79.1985) and the λ phage vector λgtlo (Huynh, T, V, et al., D
NA Cloning A Practical Approach,
IRLpress, Oxford, p49, 1985
). Starting from lo μg of poly(^)RNA, E. coli C600, Hf QA (Huynh T, V
We were able to obtain a cDNA library using the host gene as described above.
（２）ラットＣキナーゼｃＤＮＡを含むファージの単離
とそのＤＮＡ塩基配列の決定
上記ファージｃＤＮＡライブラリーを大腸菌Ｃ６００、
ＨｆＱＡを宿主として、軟寒天プレート上に、約ｔｘｔ
ｏ’クローンずつ、１０枚まき、これを、ニトロセルロ
ースフィルター（ミリボア社。(2) Isolation of phage containing rat C kinase cDNA and determination of its DNA base sequence The above phage cDNA library was transferred to Escherichia coli C600,
Approximately txt on a soft agar plate with HfQA as a host.
Sow 10 sheets of each o' clone and filter them through a nitrocellulose filter (Millibore).
１１ＡＴＦフイルター）上に移した後、０，５Ｎ Ｎ
ａ ＯＨ溶液でとかし露出変性したファージＤＮＡをフ
ィルター上に乾燥固定したｅ （Ｍａｎｉａｔｉｓら
、［モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌａｃｕｌｌｅ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）ＪＣｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｅｐ３２０．１
０８２） 。 −方、実施例２の（２）で得られたＥ、
ｃｏｌｉ、に１２．ＤＨＩ／ｐＴＢ６３８ （ＩＦＯ１
４５１４゜ＦＥＲＭ ＢＩ’−１３７２）を制限酵素
Ｐｓｔ Ｉで切断して得られる０、７にｂのＤＮＡ断片
をニックトランスレーション法（Ｍａｉｎａｔｉｓら、
同上ｐ１０９）により３２ｐ標識し、プローブとした。11ATF filter), then 0.5N N
a The phage DNA that had been exposed and denatured by OH solution was dried and fixed on the filter e (Maniatis et al. [Molecular Cloning
r Cloning) JCold Spring
Harbor Laboratoryep320.1
082). -, E obtained in Example 2 (2),
coli, 12. DHI/pTB638 (IFO1
4514°FERM BI'-1372) with the restriction enzyme Pst I, the DNA fragment of 0, 7 and b was obtained by nick translation method (Mainatis et al.
It was labeled with 32p using p109) and used as a probe.
標識したプローブと、ＤＮＡを固定したフィルターを、
標識プローブを含む、５ＸＳＳＰＥ （０，９ＭＮ ａ
ＣＱ ５０＋ｗＭＩＪン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７
゜４ Ｌ ５ ｍＭ ＥＤＴＡ）、５０％ホルムアミド
、 ５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ、 ０．１％ＳＯ８，
１００μｇ／ｍ Ｑ変性サケ***ＤＮＡ溶液１０ｍＱ中
で４２℃、 １６時間、会合反応を行い、反応後、フィ
ルターを２ Ｘ５ＳＣ（Ｉ Ｘ５ＳＣ＝０．１５ＭＮ
ａ ＣＱ 、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）、０．
１％ＳＯＳ溶液中で室温で３０分ずつ２回、ｌＸ５ＳＣ
，０，１％５ｔ）Ｓ溶液中で、６８℃で３０分ずつ２回
洗浄した。洗浄したフィルターを乾燥させた後、ラジオ
オートグラムをとり、プローブと反応するクローンを検
索した。この方法により得られたクローンλＣＫＲ１０
７よりＤａｖｉｓらの方法（Ｄａｖｉｓら、「アドバン
スト・バクチリアル・ジェネテイクス（Ａｄｖａｎｃｅ
ｄ ＢａｃｔｅｒｉａｌＧｅｎｅｔｉｅｓ）Ｊ、 Ｃｏ
１ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ １９８０）によりファージＤＮＡを抽出し、これ
より制限酵素Ｂｇｌ ＩＩとＥｃｏＲＩの切断により、
約０．５にｂのＤＮＡ断片を切り出し、上記と同様の方
法により３２Ｐ標識し、再び、上記と同様の方法により
会合反応を行い、プローブと反応するクローンの検索を
行った８以上の検索の結果得られた数種類のクローンの
ｃＤＮＡ部分の塩基配列をジデオキシヌクレチオド合成
鎖停止法（Ｍｅｓｓｉｎｇら、「ヌクレイツク・アシッ
ズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃ１ｄｓ Ｒｅ５ｃ
ｒｃｈ）Ｊ旦、３０９． （１９８１））によって決定
した。A labeled probe and a filter with immobilized DNA are
5XSSPE (0,9MN a
CQ 50+wMIJ sodium phosphate buffer (pH 7
4 L 5 mM EDTA), 50% formamide, 5X Denhardt's, 0.1% SO8,
The association reaction was carried out in 10 mQ of a 100 μg/m Q denatured salmon sperm DNA solution at 42°C for 16 hours. After the reaction, the filter was washed with 2×5SC (I
aCQ, 0.015M sodium citrate), 0.
lX5SC in 1% SOS solution twice for 30 min each at room temperature.
, 0.1% 5t) S solution at 68° C. twice for 30 minutes each. After drying the washed filter, a radioautogram was taken to search for clones that reacted with the probe. Clone λCKR10 obtained by this method
7, the method of Davis et al. (Davis et al., “Advanced Bacterial Genetics”
d Bacterial Geneties) J, Co
1d Spring Harbor Laborato
ry 1980), and the phage DNA was digested with restriction enzymes Bgl II and EcoRI.
A DNA fragment of approximately 0.5 b was excised, 32P-labeled using the same method as above, and an association reaction was performed again using the same method as above to search for clones that reacted with the probe. The nucleotide sequences of the cDNA portions of several of the resulting clones were analyzed using the dideoxynucleotide synthetic chain termination method (Messing et al., Nucleic Acids Research (Nucleic Acids Re5c)).
rch) Jdan, 309. (1981)).
この結果、得られたファージクローンのｅＤＮＡ部分を
組み合わせることにより、ラット脳Ｃキナーゼのコード
領域全体をカバーすることができた。As a result, by combining the eDNA portions of the obtained phage clones, it was possible to cover the entire coding region of rat brain C kinase.
塩基配列より予想されるアミノ酸配列を調べることによ
り、ラットｖＪＣキナーゼには、Ｃ末端部分のみ異なる
アミノ酸残基数６７１ （Ｉ型（β−１）〕および６７
３［ｎ型（β−２）］の少くとも２種類の分子型が存在
することが判明した。By examining the amino acid sequence predicted from the base sequence, we found that rat vJC kinase has 671 amino acid residues (type I (β-1)) and 67 amino acid residues that differ only in the C-terminal region.
It was found that there are at least two molecular types of 3 [n-type (β-2)].
第７図に得られたクローンの重なりの様子、第８図に全
塩基配列および、これより予想されるアミノ酸配列を示
した。FIG. 7 shows the overlap of the obtained clones, and FIG. 8 shows the entire base sequence and the amino acid sequence predicted from this.
（３）ラット脳Ｃキナーゼの動物細胞発現用プラスミド
の構築
第７図に示した、ファージクローンλＣＫＲ１５２ＤＮ
Ａを制限酵素ＩＥｃｏＲＩで部分分解し、１．４にｂの
ＣＤＮＡを分離した。このＤＮＡを、特開昭６１−６３
２８２号公報に記載のプラスミドｐＴＢ１０６のインタ
ーロイキン−２遺伝子領域の５′末端側のＰｓｔｌ切断
部位及び３′末端側のＢａｍＨＩ切断部位をｔ！ｃｏＲ
Ｉに変換しインターロイキン−２遺伝子領域を除去した
プラスミドｐＴ８３８９を制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し
５′末端のリン酸基をアルカリ性ホスファターゼ処理に
より除去したものと混合し、 Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作
用させて、プラスミドＰＴＢ６４８を構築した。さらに
、このプラスミドｐＴＢ６４８をＥｃｏＲＩで部分分解
し、ｃＤＮＡの５′末端側９３７ｂｐを含む４．Ｏｋｂ
のＤＮＡを分離し、５′末端のリン酸基を除去した。こ
のＤＮＡを、第７図に示したファージクローンλＣＫＲ
１０７を制限酵素ＥｃｏＲ１で部分分解し１分離した２
、５ｋｂのｃ Ｄ Ｎ Ａまたは、ファージクローンλ
ＣＫＲ１０８をｆ！ｃｏＲＩで分解し、分離した２、３
ｋｂのｃＤＮＡと混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを作用
させて、ラット脳Ｃキナーゼのコード領域全体をカバー
する動物細胞形質転換用プラスミドｐＴＢ６５１及びｐ
ＴＢ６５０を構築した。(3) Construction of plasmid for expression of rat brain C kinase in animal cells Phage clone λCKR152DN shown in Figure 7
A was partially digested with the restriction enzyme IEcoRI, and the cDNA of b was isolated at 1.4. This DNA was published in Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-63
The Pstl cleavage site on the 5' end side and the BamHI cleavage site on the 3' end side of the interleukin-2 gene region of plasmid pTB106 described in Publication No. 282 are t! coR
Plasmid pT8389, which had been converted to I and had the interleukin-2 gene region removed, was cut with the restriction enzyme EcoRI and the 5'-terminal phosphate group was removed by alkaline phosphatase treatment. was built. Furthermore, this plasmid pTB648 was partially digested with EcoRI, and 4. Okb
The DNA was isolated and the 5'-end phosphate group was removed. This DNA was transformed into the phage clone λCKR shown in FIG.
107 was partially digested with restriction enzyme EcoR1 and separated into 2
, 5kb cDNA or phage clone λ
CKR108 f! Digested with coRI and isolated 2,3
kb cDNA and treated with T4 DNA ligase to create plasmids pTB651 and pTB651 for animal cell transformation, which cover the entire coding region of rat brain C kinase.
TB650 was constructed.
別に、動物細胞用インターロイキン−２遺伝子発現ベク
ターｐＴ Ｂ １０６（特開昭６１−６３２８２号公報
〕を制限酵素Ｈｇ１ＡＩで切断し、インターロイキン−
２遺伝子リ一ダー配列を含む１．Ｏｋｂ ＤＮＡ断片を
分離した。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ反応により付着末
端を平滑化し、ＥｃｏＲＩリンカ−ＣＣＧＧＡＡＴＴＣ
ＧＧＯをＴ４ＤＮＡリガーゼにより付加したのち、Ｅｃ
ｏＲＩおよびＨｉｎｄ ０１で完全消化をおこなって５
Ｖ４０ＤＮＡ由来の配列（プロモーターおよびスプライ
ス部位）と、ＩＬ−２遺伝子リ一ダー配列からなる０、
６４ｋｂＤＮＡ断片を分離した。また、前記ＰＴＢ１０
６を別にＢａｍ１口およびｌｌｉｎｄｍで切断し、プラ
スミドρＢＲ３２２に由来するＤＮＡの大腸菌での複製
のためのＤ Ｎ Ａ Ｐｉｔ製開始部位と、アンピシリ
ン耐性遺伝子を含む配列および５Ｖ４０ＤＮＡ由来のポ
リＡ付加部位を含む２．６ｋｂＤ Ｎ Ａ断片を分離し
た。一方、ヒト表皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）合成遺伝子
がクローニングされたプラスミドｐＴＢ３６１［特開昭
６１−８８８８１号公報］号公報上トＥＧＦをコードす
る０、１８ｋｂ ＥｃｏＲＩ −Ｂｆｌｍｌｌ Ｉ Ｄ
ＮＡ断片を製造した。これら３種のＤＮＡ断片を、’ｒ
４ＤＮＡリガーゼ反応により結合させ、プラスミドｐＴ
Ｂ４０６を構築した。上記で得られたプラスミドｐＴＢ
４０６を、ＳＶ４０プロモーター上流に存在するＣ１ａ
！およびＨｉｎ旧■で切断し、ｐＴＢ３１４（特開昭
６１−６３２８２号公報〕から分離精製した二−ベルソ
ンマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭｕＬＶ）ＬＴＲ領域を
含む１．１ｋｂＣ１ａ Ｉ −Ｈｉｎｄｍ Ｄ Ｎ Ａ
断片を挿入して、プラスミドｐＴＢ５０５を構築した。Separately, interleukin-2 gene expression vector pT B 106 for animal cells (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-63282) was cut with restriction enzyme Hg1AI, and interleukin-2
1. Contains two gene leader sequences. The Okb DNA fragment was isolated. The sticky ends were blunted by T4 DNA polymerase reaction and EcoRI linker-CCGGAATTC
After adding GGO with T4 DNA ligase, Ec
Complete digestion with oRI and Hind 01
0 consisting of a V40 DNA-derived sequence (promoter and splice site) and an IL-2 gene leader sequence;
A 64kb DNA fragment was isolated. In addition, the PTB10
6 was separately cut with Bam1 and llindm to contain a DNA Pit initiation site for replication of DNA derived from plasmid ρBR322 in E. coli, a sequence containing the ampicillin resistance gene, and a polyA addition site derived from 5V40 DNA. A 2.6 kb DNA fragment was isolated. On the other hand, plasmid pTB361 [Japanese Unexamined Patent Publication No. 1988-88881], in which the human epidermal growth factor (EGF) synthetic gene was cloned, contains a 0.18 kb EcoRI-Bflmll I D encoding EGF.
NA fragments were produced. These three types of DNA fragments were
4 DNA ligase reaction, plasmid pT
B406 was constructed. Plasmid pTB obtained above
406, C1a located upstream of the SV40 promoter
! and a 1.1 kb C1a I-Hindm DNA containing the LTR region of A-Belson murine leukemia virus (A-MuLV), which was separated and purified from pTB314 (Japanese Unexamined Patent Publication No. 61-63282) after being cut with Hin and old ■.
The fragment was inserted to construct plasmid pTB505.
さらに、プラスミドｐＴＢ５０５を制限酵素Ｃ１ａ Ｉ
およびＢａｍＨｌで切断し、１．５ｋｂのＭｕＬＶ−Ｌ
ＴＲを含むＤＮＡを分離した。このＤＮＡをプラスミド
ｐＴＢ６５０またはプラスミドｐＴＢ６５１のＣ１ａＩ
・ＢａｍＨＩＤＮＡ断片と混合し、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼを作用させることにより、 Ｍ ｕ Ｌ Ｖ −Ｌ
Ｔ Ｒを上流にもつ動物細胞形質転換用プラスミドｐＴ
Ｂ６５２及びプラスミドｐＴＢ６５３をそれぞれ構築し
た（第９図）。Furthermore, plasmid pTB505 was digested with restriction enzyme C1a I.
and BamHl, 1.5 kb MuLV-L
DNA containing TR was isolated. This DNA was added to C1aI of plasmid pTB650 or plasmid pTB651.
・By mixing with BamHI DNA fragment and acting on T4 DNA ligase, M u L V-L
Plasmid pT for animal cell transformation with TR upstream
B652 and plasmid pTB653 were each constructed (Figure 9).
（４）上記（２）で得られたプラスミドｐＴＢ６５２ま
たはプラスミドｐＴＢ６５３を用い、大腸菌（Ｅ、ｃｏ
ｌｉ）Ｋ１２ＤＨ１を［プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミ−・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、Ｕ、ｓ、Ａ、）Ｊ、並、２１
１０（１９７２）に記載の方法に従って形質転換し、形
質転換体［Ｅ、ｃｏｌｉ Ｋ １２０）１１ ／ｐ Ｔ
Ｂ６５２（ＩＦＯ１４５３９，ＦＥＲＭ ＢＰ−１３７
３）およびＥ、ｃｏｌｉ Ｋ１２Ｄ Ｈ１／ｐＴ Ｂ
６５３（Ｉ Ｆ Ｏ１４５４０、ＦＥＲＭ ＲＰ−１３
７４）をそれぞれ得た。(4) Using plasmid pTB652 or plasmid pTB653 obtained in (2) above, Escherichia coli (E, co
li) K12DH1 [Procedure of National Academy of Sciences (Proc., Na.
tl, Acad, Sci, U, s, A,) J, average, 21
10 (1972), and transformants [E, coli K 120) 11 /p T
B652 (IFO14539, FERM BP-137
3) and E. coli K12D H1/pT B
653 (IFO14540, FERM RP-13
74) were obtained, respectively.
（５）ラット脳Ｃキナーゼｃ Ｄ Ｎ Ａの動物細胞で
の発！！Ａ：
サルＣ０９−７細胞〔「セル（Ｃｅ１１）Ｊ、２７，２
７９−２８８（１９８１）］を５％胎５％胎清を含むＤ
ＭＥＭ培地で単層培養（ファルコン径１００ ｍｍプラ
スチックデイシュ５枚）した後、同培地で培地交換した
。交換の４時間後に公知の方法（Ｇｒａｈａ＋ｍら、「
ヴイロロジ−（ＶｉｒｏｌｏｇｙＪ、５２．４５６（１
９７３））に従いデイシュ１枚当りプラスミドｐＴＢ６
５２またはｐＴＢ６５３のＤＮＡ３０μｇを含むカルシ
ウムホスフェートゲルを調製し細胞に添加し、ｐ ＴＢ
６５２感染細胞またはｐＴＢ６５３感染細胞をそれぞれ
得た。さらにその４時間後グリセロール処理して５％胎
児牛血清を含む培地で上記ｐ ＴＢ６５２感染ＣＯ３−
７細胞またはＴＢ６５３感染ＣＯ３−７細胞の培養を続
けた。７０〜７２時間後に培養上清をすて、細胞を１．
５ａｌｌの０．２５Ｍシヨ糖、 ２０ｍ阿 ＴｒｉｓＩ
Ｉｃ Ｑ （ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、２０μｇ／ｍ Ｑリューペプチン緩衝液
中に懸濁させテフロンホモジナイザーで細胞をホモジナ
イズした。このホモジネートをベックマン１００．２０
−ターを用いて５５０００ｒｐＩ、６０分間遠心するこ
とにより、細胞質分画を得た。ｐＴｌ］６５２Ｔｌ側胞
またはｐＴ１１６５３感染細胞のそれぞれより得たこの
分画について、公知の方法［に１−ｋｋａｖａら、［ジ
ャーナル・オブバイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、［
１Ｌｏ１．Ｃｈｅｍ、）Ｊ、２５７．１３３４１（１９
８２）］に従ってＣキナーゼ活性を測定し、タンパク量
１１１ｇ当りの活性値を測定した。第１表に示したよう
に、ｐＴＢ６５２感染ＣＯ３−７細胞またはｐＴＢ６５
３感染ＣＯ３−７細胞の細胞質分画には、対照実験とし
て用いた非感染細胞の細胞質分画にくらべて、約３程度
度のＣキナーゼ活性が検出された。(5) Development of rat brain C kinase c DNA in animal cells! ! A: Monkey C09-7 cells [Cell (Ce11) J, 27,2
79-288 (1981)] containing 5% fetal serum.
After monolayer culture in MEM medium (5 plastic dishes with a Falcon diameter of 100 mm), the medium was replaced with the same medium. After 4 hours of exchange, the known method (Graha+m et al., "
Virology (VirologyJ, 52.456 (1
Plasmid pTB6 per dish according to 973))
A calcium phosphate gel containing 30 μg of pTB653 or pTB653 DNA was prepared and added to the cells.
652-infected cells or pTB653-infected cells were obtained, respectively. After 4 hours, the above pTB652-infected CO3-
7 cells or TB653-infected CO3-7 cells were continued to be cultured. After 70 to 72 hours, the culture supernatant was discarded and the cells were washed with 1.
5all of 0.25M sucrose, 20mA TrisI
Ic Q (pH 7,5), 10mM EGTA, 2m
Cells were suspended in MEDTA, 20 μg/m Q leupeptin buffer and homogenized using a Teflon homogenizer. This homogenate was mixed with Beckman 100.20
A cytoplasmic fraction was obtained by centrifugation at 55,000 rpI for 60 minutes using a -tar. pTl]652Tl lateral vesicles or pT11653 infected cells, respectively, using known methods [1-kkava et al., [Journal of Biological Chemistry (J.
1Lo1. Chem, ) J, 257.13341 (19
82)], and the activity value per 111 g of protein was measured. As shown in Table 1, pTB652-infected CO3-7 cells or pTB65
Approximately 3 degrees of C kinase activity was detected in the cytoplasmic fraction of 3-infected CO3-7 cells compared to the cytoplasmic fraction of uninfected cells used as a control experiment.
第１表 プラスミドｐＴＢ６５２ 、またはｐ Ｔ
１１６５３ＤＮＡのトランスフェクションによるラッ
ト脳Ｃキナーゼの産生
感染させたプラ 感染細胞細胞質分画中のＣキナスミド
ＤＮＡ −ゼ活性（ｐｍｏｌｅ／ｌｌ１ｉｎ／ｍｇ
）ｐＴ８６５２ ６８．８２ｐＴＢ６５
３ ７８．３０非感染
２５．４６
（６）感染細胞より得られたＣキナーゼの解析：上記の
方法で得られた細胞質分画を、それぞれ６倍量の０．５
ｍＭ ＥＧＴＡ、 ０．５ｍＭ ＥＤＴＡ １０ｍＭ
２−メルカプトエタノールを含む２０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐ Ｈ７，５） （緩衝液Ａ）で希釈した後。Table 1 Plasmid pTB652 or pT
Production of rat brain C-kinase by transfection of 11653 DNA. C-kinasmid DNA-ase activity (pmole/llin/mg
)pT8652 68.82pTB65
3 78.30 non-infectious
25.46 (6) Analysis of C kinase obtained from infected cells: The cytoplasmic fraction obtained by the above method was diluted with 6 times the amount of 0.5
mM EGTA, 0.5mM EDTA 10mM
After dilution with 20mM Tris-HCl buffer (pH 7,5) containing 2-mercaptoethanol (buffer A).
ファルマシアＦＰＬＣ−Ｍｏｎｏ Ｑカラム（０，５Ｘ
５０．ファルマシアＨＲ５１５）にのせた。緩衝液へで
カラムを洗った後、２０ｍ ＱのＯ−０，６Ｍ ＮａＣ
ａを含む緩衝液Ａの直線濃度勾配により、Ｃキナーゼ活
性を溶出した。第１０図に示すように、ｐＴＢ６５２感
染細胞およびｐＴＢ６５３感染細胞由来の検体において
は、非感染細胞由来のそれに比べ、明らかに多量の酵素
活性が検出された。Pharmacia FPLC-Mono Q column (0,5X
50. Pharmacia HR515). After washing the column with buffer, 20 mQ of O-0,6M NaC
C kinase activity was eluted by a linear gradient of buffer A containing a. As shown in FIG. 10, a clearly higher amount of enzyme activity was detected in the samples derived from pTB652-infected cells and pTB653-infected cells compared to that from uninfected cells.
Ｍｏｎｏ Ｑカラムより溶出された活性画分（各３０ｕ
ｇ）をＬａｅｍｍｌｉの方法（Ｌａｅｍｍｌｉ、 Ｕ、
に、 （１９７０）「ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）Ｊ
２２７６８０−６８５３により８．５％ＳＤＳポリアク
リルアミドゲル電気泳動した後、Ｔｏｗｂｉｎらの方法
（Ｔｏｗｂｉｎ Ｈ，ら（１９７９） ｒプロシージン
グ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエ
ンスＪ （Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃｃｉｄ、Ｓｃｉ
、Ｕ、Ｓ、Ａ、）互、４３５０−４３５４）により、ニ
トロセルロースフィルターに移した。これを４℃で１５
０ｎ＋Ｍ ＮａＣＱ 。Active fraction eluted from Mono Q column (30u each
g) by Laemmli's method (Laemmli, U,
(1970) “Nature J.
227680-6853, followed by 8.5% SDS polyacrylamide gel electrophoresis using the method of Towbin et al. , Accid, Sci
, U, S, A,), 4350-4354) and transferred to a nitrocellulose filter. This at 4℃ for 15
0n+M NaCQ.
５％カゼイン、２０％正常ウマ血清を含むｉｏ＋ｍＭト
リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）中で一装置き、次に、１
５０ ｔａＭ ＮａＣＱ 、 １％カゼインおよび抗Ｃ
キナーゼ抗体（Ｐ、 Ｊ Ｐａｒｋｅｒ博士より分与、
Ｃｏｕｓｓｅｎｓ Ｌ、Ｓ。One device was placed in IO+mM Tris-HCl buffer (pH 7,5) containing 5% casein, 20% normal horse serum, then 1
50 taM NaCQ, 1% casein and anti-C
Kinase antibody (kindly provided by Dr. P and J Parker,
Coussens L, S.
（１９８６） ｒサイエンスＪ （５ｃｉｅｎｃｅ）２
３３，８５９−８６６）を含む１０１１Ｍトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，５）中にて、室温で１時間放置した。０
．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０，１５０！ＩＩＭＮａＣＱを
含むｉｏ＋ａＭトリス塩酸ｌ１ＩＷｉ液−（ｐＨ７，５
）中でフィルターを洗った後、１％カゼイン、１５０ｍ
Ｍ ＮａＣＱ 、 ０．１ ｐ Ｃｉ／ｍ Ｑ ”’
Ｉプロティン八を含むトリス塩酸緩衝液中にて、室温で
１．５時間放置した。フィルターを上記と同様にして洗
った後、Ｘ線フィルムに抗体と反応したタンパクバンド
を露光させた。第１．１図に示すように、感染細胞由来
の検体では、ラット脳より精製したＣキナーゼと同じ位
置に、明らかに抗体と反応するタンパクバンドが検出さ
れた。(1986) rScience J (5science) 2
33,859-866) in 1011M Tris-HCl buffer (pH 7.5), and left at room temperature for 1 hour. 0
．． 05% Tween 20,150! io+aM Tris-HCl IWi solution containing IIMNaCQ (pH 7,5
) After washing the filter in 1% casein, 150 m
M NaCQ , 0.1 p Ci/m Q"'
The mixture was left in a Tris-HCl buffer containing Protein I for 1.5 hours at room temperature. After washing the filter in the same manner as above, the protein band that had reacted with the antibody was exposed to X-ray film. As shown in Figure 1.1, in the sample derived from infected cells, a protein band that clearly reacted with the antibody was detected at the same position as C kinase purified from rat brain.
（７）感染細胞より得られたＣキナーゼの精ｆＭ：ｐＴ
Ｂ６５２の５′非翻訳領域を短くしたｐＴＢ７０７ （
５５塩基対の５′−非翻訳領域をもつ）およびｐ Ｔ
Ｂ ６５３の５′非翻訳領域を短くしたｐ Ｔ Ｂ ７
０８（５５塩基対の５′−非翻訳領域をもつ）を感染さ
せたＣＯ３−７細胞ｌこおいても、上記と同様の結果が
得られた。(7) C-kinase sperm fM obtained from infected cells: pT
pTB707, which shortens the 5' untranslated region of B652 (
with a 55 base pair 5'-untranslated region) and pT
pT B 7 with a shortened 5' untranslated region of B 653
Similar results were obtained in CO3-7 cells infected with 08 (having a 5'-untranslated region of 55 base pairs).
そこでｐ Ｔ Ｂ ７０７およびｐＴＢ７０８感染ＣＯ
３−７細胞（各１００ｍｍシャーレ５０枚分）より上記
と同様の方法にて、細胞質画分を得た後、 Ｍｏｎｏ
Ｑカラム（Ｉ Ｘ １０ ａｍ ＊フアルマシアＨＲ１
０／ １０）により活性画分を分取し、さらにヒドロキ
シルアパタイトカラムにより部分精製したｅ Ｍｏｎｏ
Ｑカラムの活性画分を等址の０．５＋＋Ｍ Ｅ Ｇ
Ｔ Ａ 、 ０．５ｍＭ Ｅ Ｄ Ｔ Ａ１０％ グリ
セロール、１０＋ａＭメルカプトエタノールを含む２０
ｍ Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）（緩衝液Ｂ
）で希釈した後、ハイトロキシルアパタイトカラム（０
，７８Ｘ １０ｃｍ 、に０ＫＥＮ Ｔｙｐｅ Ｓ）を
用いて、フアルマシアＦＰＬＣシステムにより、２０−
２８０ｍＭリン酸カリウムを含む緩衝液Ｂの直線濃度勾
配により、Ｃキナーゼ活性を溶出させた。第１２図に示
すように、ラット脳より精製したＣキナーゼは３つのピ
ーク（第１２図のＤの左よりピーク１，２゜３）に分か
れるのに対して、非感染細胞由来の検体ではピーク３の
みの活性しか観察されなかった。Therefore pTB707 and pTB708 infected CO
After obtaining the cytoplasmic fraction from 3-7 cells (50 100 mm petri dishes each) in the same manner as above,
Q column (I X 10 am *Pharmacia HR1
0/10) and then partially purified using a hydroxylapatite column.
The active fraction of the Q column is equal to 0.5++ M E G
TA, 0.5mM EDT A20 containing 10% glycerol, 10+aM mercaptoethanol
m M potassium phosphate buffer (pH 7,5) (buffer B
) and then diluted with hytroxylapatite column (0
, 78 x 10 cm, 0KEN Type S) using a Pharmacia FPLC system.
C kinase activity was eluted with a linear gradient of buffer B containing 280 mM potassium phosphate. As shown in Figure 12, C-kinase purified from rat brain is divided into three peaks (peaks 1 and 2°3 from the left of D in Figure 12), whereas samples derived from uninfected cells have three peaks. Only 3 activities were observed.
一方、感染細胞由来の検体では、ピーク２およびピーク
３に対応する活性が観察された。このことより感染細胞
においてはピーク２に対応するＣキナーゼ活性がプラス
ミドＤＮＡを感染させることにより発現されたと考えら
れる。On the other hand, activities corresponding to peaks 2 and 3 were observed in samples derived from infected cells. This suggests that C kinase activity corresponding to peak 2 was expressed in infected cells by infection with plasmid DNA.
実施例５
（１）ラットＣキナーゼ■型（α型）ｃＤＮＡを含むフ
ァージの単離とそのＤＮＡ塩基配列の決定実施例４（１
）で得られたラット脳ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラ
リーを大腸菌Ｃ６００、ＩＩｆｌＡを宿主として、軟寒
天プレート上に、約ｌＸｌ０’クローンずっ１０枚まき
、これをニトロセルロースフィルター（ミリボア社、Ｈ
ＡＴＦフィルター）上に移した後、０．５Ｎ ＮａＯＨ
溶液でとかし露出変性したファージＤＮＡをフィルター
上に乾燥固定した。一方、既に公知（Ｐａｒｋｅｒら、
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） ２３３．８５３−８５
９ （１９８６） ）のウシＣキナーゼαのアミノ酸配
列（アミノ酸Ｎｏ、１６２−１７０）に対応する塩基配
列を有するオリゴペプチド（” ＴＣＣＧＴＧＡＣＣＴ
ＣＧＧＣＣＴＴＣＡＧＧＴＡＧＡＴ” ）を化学合成し
、この５′末端をＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ、〔γ
−３２Ｐ〕ＡＴＰを用いて３２ｐで標識してラットＣキ
ナーゼ■型（α型）のスクリーニングプローブとした。Example 5 (1) Isolation of phage containing rat C kinase ■ type (α type) cDNA and determination of its DNA base sequence Example 4 (1)
), using E. coli C600 and IIflA as hosts, approximately 10 clones of approximately 1X10' were spread on a soft agar plate, and filtered through a nitrocellulose filter (Millivore, H
ATF filter), then 0.5N NaOH
The phage DNA that had been dissolved and exposed and denatured in a solution was dried and fixed on a filter. On the other hand, it is already known (Parker et al.
Science 233.853-85
An oligopeptide ("TCCGTGACCT") having a base sequence corresponding to the amino acid sequence (amino acid number, 162-170) of bovine C-kinase α (1986))
CGGCCTTCAGGTAGAT") was chemically synthesized, and its 5' end was linked to T4 polynucleotide kinase, [γ
The probe was labeled with 32p using -32P]ATP to provide a screening probe for rat C kinase type II (α type).
標識したプローブと、ＤＮＡを固定したフィルターを標
識゛プローブを含む、５ＸＳＳＰＥ （０，９Ｍ Ｎａ
ＣＱ ５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液ｐ Ｈ７。5XSSPE (0.9M Na
CQ 50mM sodium phosphate buffer pH7.
４）、 ５ ＸＤｅｎｈａｒｄｔｓ、 ０．１％Ｓ Ｄ
Ｓ 、 １００μｇ／ｍＱ変性サケ***ＤＮＡ溶液１
０ｍ Ｑ中で４２℃、１６時間会合反応を行い、反応後
、フィルターを６×ＳＳＣ（Ｉ Ｘ Ｓ Ｓ Ｃ＝０．
１５Ｍ ＮａＣＱ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウム）
０．１％ＳＤＳ溶液中で室温で３０分ずつ２回、さらに
同溶液で６０℃で３０分間ずつ２回洗浄した。洗浄した
フィルターを乾燥させた後、ラジオオートグラムをとり
、プローブと反応するクローンを検索した。この方法に
より得られたクローン λＣＫＲα５のｃＤＮＡ部分の
塩基配列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法によっ
て決定した。4), 5×Denhardts, 0.1% S.D.
S, 100 μg/mQ denatured salmon sperm DNA solution 1
The association reaction was carried out at 42° C. for 16 hours in 0 m
15M NaCQ, 0.015M sodium citrate)
It was washed twice in a 0.1% SDS solution at room temperature for 30 minutes each and then twice in the same solution at 60° C. for 30 minutes each. After drying the washed filter, a radioautogram was taken to search for clones that reacted with the probe. The base sequence of the cDNA portion of clone λCKRα5 obtained by this method was determined by the dideoxynucleotide synthetic chain termination method.
第１３図にラットＣキナーゼ■型（ｑ型）のアミノ酸コ
ード領域の塩基配列、およびこれより予想されるアミノ
酸配列を示した。FIG. 13 shows the base sequence of the amino acid coding region of rat C kinase ■ type (q type) and the amino acid sequence predicted from this.
（２）ラットＣキナーゼ■型（α型）ｃＤＮＡの動物細
胞での発現
λＣＫＲα５を制限酵素ＥｃｏＲＩで分解し、約３．ｌ
ＫｂのｃＤＮＡ部分を分離した。一方、実施例４（３）
で得られたｐＴＢ６５２をＥｃｏＲｌで分解し、ｃＤＮ
Ａ部分を除いた約４．３にｂのＤＮＡ断片を分離した。(2) Expression of rat C kinase ■ type (α type) cDNA in animal cells λCKRα5 was digested with the restriction enzyme EcoRI. l
The cDNA part of Kb was isolated. On the other hand, Example 4 (3)
The pTB652 obtained was digested with EcoRl, and the cDNA
A DNA fragment of approximately 4.3 and b was separated from the portion A.
これら２つのＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで連結し
、動物細胞発現用プラスミド ｐＴｒ３７５５を構築し
た。このｐ Ｔ Ｂ ７５５より大腸菌形質転換体Ｅ、
ｃｏｉｌ ＤＨＩ／ ｐ ＴＢ７５５ （Ｉ ＦＯ１
４６１２、ＦＥＲＭ ＢＰ−１３８２）を得た。このプ
ラスミド ｐＴＢ７５５を実施例４（５）に示した方法
により、サルＣ０８７細胞に感染させた後、細胞質分画
を得た。この細胞質分画を実施例４（７）に示した方法
により、Ｍｏｎｏ Ｑカラム、および、ハイトロキシル
アパタイトカラムクロマトグラフィーを行い、発現され
たラットＣキナーゼ■型（α型）のカラムクロマトグラ
フィー上での挙動を調べた（第 １４図）。These two DNA fragments were ligated using T4 DNA ligase to construct a plasmid pTr3755 for animal cell expression. From this pT B 755, E. coli transformant E,
coil DHI/ p TB755 (I FO1
4612, FERM BP-1382). After infecting monkey C087 cells with this plasmid pTB755 by the method shown in Example 4 (5), a cytoplasmic fraction was obtained. This cytosolic fraction was subjected to Mono Q column and hytroxylapatite column chromatography according to the method shown in Example 4 (7), and the expressed rat C kinase ■ type (α type) was subjected to column chromatography. The behavior was investigated (Fig. 14).
第１図は実施例１の（１）でラットＣ−キナーゼから得
られた４種類のペプチド分画分のアミノ酸配列を示す図
である。
第２図はラットＣ−キナーゼｃ Ｄ Ｎ Ａ部分の塩基
配列および該塩基配列より予測されるアミノ酸配列を示
した図である。
第３図はヒトＣ−キナーゼｃＤＮＡ部分の簡単な制限酵
素図である。
第４図はヒトＣ−キナーゼｃＤＮＡの一部の塩基配列お
よびその配列より推測されるアミノ酸配列を示した図で
ある。
第５図及び第６図はラットＣ−キナーゼｃＤＮＡ部分の
塩基配列および該塩基配列より予測されるアミノ酸配列
（第２図）とヒトＣ−キナーゼＣＤＮＡの一部の塩基配
列およびその配列より推測されるアミノ酸配列（第４図
）との相同関係を示す図である。
第７図は実施例４で得られた２つの型のラットＩＥｉＣ
−キナーゼクローンの重なりの様子を示す図である。
第８図はラット脳Ｃキナーゼ■型（β−１）及び■型（
β−２）のｃＤＮＡの金塩〕ル配列および、これより予
想されるアミノ酸配列を示す。四角で囲った部分は、ｎ
型（β−２）のアミノ酸配列第６２２〜６７３番目に相
当する部分を示す。
第９図はラット脳Ｃキナーゼの動物発現用プラスミドの
構築を示す。
第１θ図は感染細胞または非感染細胞由来の細胞質画分
のＭｏｎｏ Ｑカラムクロマトグラフィーにおける、Ｃ
キナーゼ活性の挙動を示している。
Ａ：ｐＴＢ６５２感染細胞由来、Ｂ ： ｐ Ｔ １３
６５３感染細胞由来、Ｃ：非感染細胞由来
第１１図は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動で
分画した抗体タンパクの抗Ｃキナーゼ抗体を反応させた
後のオートラジオグラ１１を示している。
ａ：ラット脳より精製したＣキナーゼ、ｂ：非感染細胞
由来、ｃ：ｐＴＢ６５２感染細胞由来、ｄ：ｐＴＢ６５
３感染細胞由来
第１２図は感染細胞または非感染細胞由来の細胞質画分
のＭｏｎｏ Ｑカラム上での活性画分をハイトロキシル
アパタイトカラムクロマトグラフィーした時のＣキナー
ゼ活性の挙動を示している。
Ａ：ｐＴＢ７０７感染細胞由来、Ｂ：ｐＴＢ７０８感染
細胞由来、Ｃ：非感染細胞由来、Ｄ：ラット脳Ｃキナー
ゼ
第１３図はラットＣキナーゼ■型（α型）のタンパクコ
ード領域の塩基配列および、それより推測されるアミノ
酸配列を示す。
第１４図は、感染細胞または非感染細胞由来の細胞質両
分のＭｏｎｏ Ｑカラム上での活性画分をハイトロキシ
ルアパタイトカラムクロマトグラフィーした時のＣキナ
ーゼ活性の挙動を示している。
Ａ：ラット脳山来Ｃキナーゼ、Ｂ：ｐＴＢ７５５感染細
胞由来〔Ｃキナーゼ夏１型（α型）発現細胞由来）、Ｃ
：ｐＴＢ７０７感染細胞由来〔ＣキナーゼＩ型（β−１
）発現細胞由来〕、Ｄ：ｐＴＢ７５６感染細胞由来〔Ｃ
キナーゼγ型発現細胞由来。
（Ｋｎｏｐｆらセル（Ｃｅｌｌ） ４６．４９１−５０
２ （１９８６））、Ｅ：非感染細胞由来。FIG. 1 is a diagram showing the amino acid sequences of four types of peptide fractions obtained from rat C-kinase in Example 1 (1). FIG. 2 shows the base sequence of the rat C-kinase cDNA portion and the amino acid sequence predicted from the base sequence. FIG. 3 is a simple restriction diagram of the human C-kinase cDNA portion. FIG. 4 shows a partial base sequence of human C-kinase cDNA and an amino acid sequence deduced from the sequence. Figures 5 and 6 show the base sequence of the rat C-kinase cDNA portion, the amino acid sequence predicted from the base sequence (Figure 2), the base sequence of a portion of the human C-kinase cDNA, and the predicted amino acid sequence based on the sequence. FIG. 4 is a diagram showing homology with the amino acid sequence (FIG. 4). Figure 7 shows two types of rat IEiC obtained in Example 4.
- It is a diagram showing the state of overlapping of kinase clones. Figure 8 shows rat brain C kinase type ■ (β-1) and type ■ (
The gold salt sequence of β-2) cDNA and the amino acid sequence predicted from this are shown. The part surrounded by a square is n
The portion corresponding to the 622nd to 673rd amino acid sequence of type (β-2) is shown. Figure 9 shows the construction of a plasmid for animal expression of rat brain C kinase. Figure 1θ shows the C
The behavior of kinase activity is shown. A: pTB652 infected cell origin, B: pT13
653-infected cell origin, C: non-infected cell origin Figure 11 shows an autoradiogram 11 after the antibody protein fractionated by SDS polyacrylamide gel electrophoresis was reacted with an anti-C kinase antibody. a: C kinase purified from rat brain, b: derived from uninfected cells, c: derived from pTB652 infected cells, d: pTB65
FIG. 12 shows the behavior of C kinase activity when the active fraction of the cytoplasmic fraction from infected cells or uninfected cells was subjected to hytroxylapatite column chromatography on a Mono Q column. A: derived from pTB707 infected cells, B: derived from pTB708 infected cells, C: derived from uninfected cells, D: rat brain C kinase. Figure 13 shows the nucleotide sequence of the protein coding region of rat C kinase ■ type (α type) and its The deduced amino acid sequence is shown below. FIG. 14 shows the behavior of C kinase activity when active fractions of both cytoplasm from infected cells and non-infected cells were subjected to hytroxylapatite column chromatography on a Mono Q column. A: rat brain mountain C kinase, B: derived from pTB755 infected cells [derived from cells expressing C kinase summer type 1 (α type)], C
: Derived from pTB707 infected cells [C kinase type I (β-1
) derived from expressing cells], D: derived from pTB756 infected cells [C
Derived from cells expressing kinase γ type. (Knopf et al. Cell 46.491-50
2 (1986)), E: derived from uninfected cells.
Claims (11)
Ｃ； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
を有するポリペプチド。(1) Amino acid sequence: [There is a gene sequence. ] Human protein kinase C, which is a polypeptide containing human protein kinase C; a part of the above polypeptide having the same activity; or a polypeptide in which the above amino acid sequence is partially converted and having the same activity.
を含有する組み換えＤＮＡ。(2) Recombinant DNA containing a base sequence encoding human protein kinase C.
Ｃ；同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もし
くは上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の
活性を有するポリペプチドである特許請求の範囲第２項
記載のＤＮＡ。(3) Human protein kinase C has the following amino acid sequence: [There is a gene sequence. ] Human protein kinase C which is a polypeptide containing; a part of the above polypeptide having the same activity; or a patent claim which is a polypeptide in which the above amino acid sequence is partially converted and has the same activity. DNA according to range 2.
ＤＮＡ。(4) Base sequence: [There is a gene sequence. ] The DNA according to claim 2, which is a base sequence containing the following.
を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質転換された
形質転換体。(5) A transformant transformed with a vector containing DNA containing a base sequence encoding human protein kinase C.
を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質転換された
形質転換体を培地に培養し、培養物中にヒト蛋白質リン
酸化酵素Ｃを生成蓄積せしめ、これを採取することを特
徴とする該酵素の製造法。(6) A transformant transformed with a vector containing a DNA containing a base sequence encoding human protein kinase C is cultured in a medium, and human protein kinase C is produced and accumulated in the culture. , a method for producing the enzyme, which comprises collecting the enzyme.
含有するポリペプチドであるラット蛋白質リン酸化酵素
Ｃ； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
を有するポリペプチド。(7) Rat protein kinase C, which is a polypeptide containing the amino acid sequence shown in FIG. 8 or FIG. 13; a part of the above polypeptide having the same activity; or the above amino acid sequence is partially converted and have the same activity.
列を含有する組み換えＤＮＡ。(8) Recombinant DNA containing a base sequence encoding rat protein kinase C.
３図で示されるアミノ酸配列を含有するポリペプチド； 同一の活性を有する上記ポリペプチドの一部；もしくは 上記アミノ酸配列が部分的に変換され、かつ同一の活性
を有するポリペプチドである特許請求の範囲第８項記載
のＤＮＡ。(9) Rat protein kinase C is shown in Figure 8 or 1.
A polypeptide containing the amino acid sequence shown in Figure 3; a part of the above polypeptide having the same activity; or a polypeptide in which the above amino acid sequence is partially converted and having the same activity. DNA according to item 8.
配列を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体。(10) A transformant transformed with a vector containing DNA containing a base sequence encoding rat protein kinase C.
配列を含有するＤＮＡを含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体を培地に培養し、培養物中にヒト蛋白質
リン酸化酵素Ｃを生成蓄積せしめ、これを採取すること
を特徴とする該酵素の製造法。(11) A transformant transformed with a vector containing DNA containing a base sequence encoding rat protein kinase C is cultured in a medium, and human protein kinase C is produced and accumulated in the culture. , a method for producing the enzyme, which comprises collecting the enzyme.
Applications Claiming Priority (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP14938586 | 1986-06-27 | ||
| JP61-149385 | 1986-06-27 | ||
| JP21794486 | 1986-09-18 | ||
| JP61-217944 | 1986-09-18 | ||
| JP61-281870 | 1986-11-28 | ||
| JP28187086 | 1986-11-28 | ||
| JP4016087 | 1987-02-25 | ||
| JP62-40160 | 1987-05-25 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8258449A Division JP2739895B2 (en) | 1986-06-27 | 1996-09-30 | Polypeptides, DNA and uses thereof |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS642572A JPS642572A (en) | 1989-01-06 |
| JPH012572A true JPH012572A (en) | 1989-01-06 |
| JP2593476B2 JP2593476B2 (en) | 1997-03-26 |
Family
ID=27460860
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62157495A Expired - Lifetime JP2593476B2 (en) | 1986-06-27 | 1987-06-26 | DNA and transformants |
| JP13710298A Expired - Lifetime JP3146352B2 (en) | 1986-06-27 | 1998-05-19 | DNA and its uses |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13710298A Expired - Lifetime JP3146352B2 (en) | 1986-06-27 | 1998-05-19 | DNA and its uses |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5219748A (en) |
| EP (2) | EP0251244B1 (en) |
| JP (2) | JP2593476B2 (en) |
| AT (2) | ATE347592T1 (en) |
| CA (1) | CA1341288C (en) |
| DE (2) | DE3752391T2 (en) |
| ES (1) | ES2093600T3 (en) |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988001303A1 (en) * | 1986-08-13 | 1988-02-25 | Genetics Institute, Inc. | Protein kinase c enzymes |
| EP0358325A1 (en) * | 1988-08-10 | 1990-03-14 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Production of protein kinase C by yeast |
| JPH0536077U (en) * | 1991-10-22 | 1993-05-18 | 蔡 憲堂 | Air pump with noise prevention means |
| US5459036A (en) | 1993-03-19 | 1995-10-17 | Max-Planck-Gesellschaft Zur Forderung Der Wissenschaften E.V. | Extracellular signal-regulated kinase, sequences, and methods of production and use |
| ATE265537T1 (en) * | 1996-03-19 | 2004-05-15 | Millennium Pharm Inc | KINASE FOR SITE-SPECIFIC PHOSPHORYLATION OF I-KAPPA-B-ALPHA |
| BR9708390A (en) * | 1996-03-28 | 2000-01-04 | Trustees O Boston University | Method for identifying a substance that alters the pigmentation in vertebrate epidermal melanocytes, a substance that inhibits, intensifies or modulates tyrosinase phosphorization mediated by c-beta kinase protein, use of an agent that modulates or inhibits phosphorization of a serine residue or of threonine mediated by the protein c-beta kinase, use in a peptide that specifically interferes with the phosphorization of residues of serine / threonine mediated by the protein c-beta kinase, use of a DNA or peptide construct to manufacture a drug to decrease pigmentation on the hair, hair, wool or hair of vertebrates and use of a substance that modulates tyrosinase phosphorization mediated by the protein c-beta kinase. |
| US6271211B1 (en) | 1997-02-13 | 2001-08-07 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Gene therapy for regulating penile smooth muscle tone |
| US7030096B1 (en) * | 1997-02-13 | 2006-04-18 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Method of enhancing relaxation of penile smooth muscle by introduction of DNA encoding maxi-K potassium channel protein |
| US6239117B1 (en) | 1997-02-13 | 2001-05-29 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Gene therapy for regulating bladder smooth muscle tone |
| US6150338A (en) * | 1997-02-13 | 2000-11-21 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | Gene therapy for alleviating erectile dysfunction |
| CN1311309A (en) * | 2000-03-02 | 2001-09-05 | 上海博德基因开发有限公司 | New polypeptide-human signal conductive protein kinase 17 and polynucleotide for coding such polypeptide |
| EP3723782A1 (en) * | 2017-12-14 | 2020-10-21 | Université de Strasbourg | Peptides for treatment and prevention of nonalcoholic fatty liver disease and fibrosis |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1988001303A1 (en) * | 1986-08-13 | 1988-02-25 | Genetics Institute, Inc. | Protein kinase c enzymes |
-
1987
- 1987-06-26 EP EP87109223A patent/EP0251244B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 AT AT95112109T patent/ATE347592T1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-26 EP EP95112109A patent/EP0686695B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 CA CA000540667A patent/CA1341288C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-26 DE DE3752391T patent/DE3752391T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 AT AT87109223T patent/ATE142256T1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-06-26 JP JP62157495A patent/JP2593476B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 ES ES87109223T patent/ES2093600T3/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-26 DE DE3751893T patent/DE3751893T2/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-08 US US07/654,404 patent/US5219748A/en not_active Expired - Lifetime
-
1998
- 1998-05-19 JP JP13710298A patent/JP3146352B2/en not_active Expired - Lifetime
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Su et al. | APC binds to the novel protein EB1 | |
| Zalcman et al. | RhoGDI-3 is a new GDP dissociation inhibitor (GDI): identification of a non-cytosolic GDI protein interacting with the small GTP-binding proteins RhoB and RhoG | |
| Duronio et al. | Protein N-myristoylation in Escherichia coli: reconstitution of a eukaryotic protein modification in bacteria. | |
| KR910000460B1 (en) | Gene for human colony stimulating factor | |
| Puopolo et al. | A single gene encodes the catalytic “A” subunit of the bovine vacuolar H (+)-ATPase. | |
| JPH012572A (en) | DNA and transformants | |
| BG63284B2 (en) | Proteins connecting tumor necrosis factor | |
| Madsen et al. | Psoriasis upregulated phorbolin-1 shares structural but not functional similarity to the mRNA-editing protein apobec-1 | |
| WO2001019999A1 (en) | A GENE ENCODING A NOVEL THREONYL-tRNA SYNTHETASE, ITS USES AND THE PREPARING METHODS | |
| JP2593476B2 (en) | DNA and transformants | |
| JAGADISH et al. | Insulin-responsive tissues contain the core complex protein SNAP-25 (synaptosomal-associated protein 25) A and B isoforms in addition to syntaxin 4 and synaptobrevins 1 and 2 | |
| WO1997010252A1 (en) | Dna encoding an sh2-inositol phosphatase, an shc-binding protein | |
| US5324651A (en) | DNA encoding rat and human protein kinase C | |
| EP0379342B1 (en) | New FK-506 cytosolic binding protein | |
| JP2739895B2 (en) | Polypeptides, DNA and uses thereof | |
| JP2844455B2 (en) | Polypeptides, DNA and uses thereof | |
| EP0631624A1 (en) | Receptor complexes with b29 (ig-beta or ig-gamma) and their uses | |
| JP2771188B2 (en) | Polypeptides, DNA and uses thereof | |
| CN112552388B (en) | Scolopendra mutilans polypeptide toxins rpTx-1, rpTx-2 and rpTx-3 as well as coding gene and application thereof | |
| JP3366358B2 (en) | DNA encoding human calcineurin Aα isoform protein and use thereof | |
| EP0258489A1 (en) | Human low affinity FC epsilon-receptor, the isolation and purification thereof | |
| DE3878296T2 (en) | RECOMBINANT HUMAN GLUTATHION PEROXIDASE, METHOD FOR PRODUCING THE ENZYME AND DNA CODING THEREFORE. | |
| Collart et al. | I. BIOLOGICAL ROLE OF IMP DEHYDROGENASE | |
| JPS6152293A (en) | Novel dna and use thereof | |
| JPH02138983A (en) | Production of c-kinase with yeast |