JP2771188B2 - Polypeptides, DNA and uses thereof - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ラットカルシウムおよびリン脂質依存性蛋
白質リン酸化酵素（蛋白質リン酸化酵素ＣあるいはＣ−
キナーゼと略称することもある。）およびその製造のた
めの組み換えDNA技術に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a rat calcium and phospholipid-dependent protein kinase (protein kinase C or C-protein kinase).
Sometimes abbreviated as kinase. ) And recombinant DNA technology for its production.

従来の技術 生体の多彩な機能発揮や適応現象には、細胞の生長因
子、ホルモンあるいは神経伝達物質など多種類の生理活
性物質の関与が知られている。これらの細胞外シグナル
は、サイクリックAMP（cAMP）、サイクリックGMP（cGM
P）、ジアシールグリセロール（DG）、カルシウム（Ca
⁺⁺）などの細胞内伝達物質を通じて発揮される。特にDG
は細胞機能の活性化を引き起す多くのホルモンや神経伝
達物質によって細胞膜のイノシトール燐脂質が分解され
た結果生じることが判明している。このDGがカルシウム
の存在下にＣ−キナーゼを活生化し、この酵素による細
胞内各種蛋白質のリン酸化反応が種々の細胞機能の活性
化や細胞増殖をもたらすと考えられている。つまりＣ−
キナーゼは外界シグナルの主要な情報伝達機構の一つに
おいて重要な役割を担っている酵素である。ラット大脳
より精製された該酵素は等電点がpH5.6の酸性蛋白質で
あり、分子量は約77,000である。またこの酵素は疎水性
の部分と親水性の部分とからなる単一ペプチドからでき
ており、疎水性部分を介して細胞膜に結合し、親水性部
分に活性中心が存在する。Ｃ−キナーゼは通常不活性型
であり、カルシウムとフォスファチジールセリンおよび
DGの三者によって活性化される。またリン酸供与体はAT
Pであることがわかっている。2. Description of the Related Art Various biologically active substances such as cell growth factors, hormones and neurotransmitters are known to be involved in various functions and adaptation phenomena of living organisms. These extracellular signals include cyclic AMP (cAMP), cyclic GMP (cGM
P), diaseal glycerol (DG), calcium (Ca
⁺⁺ ) are exerted through intracellular mediators. Especially DG
Has been found to result from the degradation of inositol phospholipids in cell membranes by a number of hormones and neurotransmitters that cause activation of cell functions. It is thought that this DG activates C-kinase in the presence of calcium, and phosphorylation of various intracellular proteins by this enzyme leads to activation of various cell functions and cell proliferation. That is, C-
Kinases are enzymes that play an important role in one of the major signaling mechanisms of external signals. The enzyme purified from rat cerebrum is an acidic protein having an isoelectric point of pH 5.6 and a molecular weight of about 77,000. This enzyme is made of a single peptide consisting of a hydrophobic part and a hydrophilic part, binds to the cell membrane via the hydrophobic part, and has an active center in the hydrophilic part. C-kinases are usually inactive, with calcium and phosphatidylserine and
Activated by DG. The phosphate donor is AT
I know it is P.

このようにＣ−キナーゼは蛋白質リン酸化酵素の一つ
として蛋白質のリン酸化を通じて細胞外シグナルの細胞
内伝達を行うことから、細胞外シグナルの受容伝達機構
の研究には欠くことのできない酵素であり、その試薬と
しての価値は非常に高い。また、本酵素は発ガンプロモ
ーターであるフォルボールエステルにより直接活性化さ
れる。フォルボールエステルは発ガン過程の促進を引き
起こすだけではなく、細胞***や分化、酵素の誘導、脂
質の代謝昂進など多くの生物反応に深く関与しているこ
とが知られている。これらのことは細胞膜受容伝達機構
の異常が成因となる種々の病的細胞やガン細胞におい
て、Ｃ−キナーゼが重要な指標酵素となる可能性が高
く、Ｃ−キナーゼに対する抗体などが診断剤や検査薬と
して用いられることが考えられる。As described above, since C-kinase transmits intracellular signals of extracellular signals through phosphorylation of proteins as one of protein kinases, it is an enzyme which is indispensable for studying the transduction mechanism of extracellular signals. , Its value as a reagent is very high. In addition, this enzyme is directly activated by phorbol ester which is a carcinogenic promoter. Phorbol esters are known to not only promote the carcinogenic process but also to be deeply involved in many biological reactions such as cell division and differentiation, induction of enzymes, and increased metabolism of lipids. These facts suggest that C-kinase is likely to be an important indicator enzyme in various pathological cells and cancer cells that are caused by abnormalities in the cell membrane receptive transduction mechanism. It may be used as a medicine.

このようなＣキナーゼの遺伝子構造については、最近
の相補鎖DNA（cDNA）クローニングの結果より、少なく
とも４種類（α，βI,βII,γ）の分子構造が存在する
ことが明らかにされ、その塩基配列およびアミノ酸配列
が明らかにされている。α型、βＩ型、βII型およびγ
型については、特開昭62−157495号明細書および図面
を、またγ型については、セル（Cell）第46巻第491頁
（1986年）を参照されたい。Regarding the gene structure of such C kinase, recent results of complementary strand DNA (cDNA) cloning have revealed that there are at least four types of molecular structures (α, βI, βII, γ), The sequence and amino acid sequence have been elucidated. α-type, βI-type, βII-type and γ
For the type, see JP-A-62-157495 and the drawings, and for the γ-type, see Cell, Vol. 46, page 491 (1986).

しかしながら、それら以外にも他の亜型が存在する可
能性も示されており、Ｃキナーゼの酵素群としての実体
は完全に明らかにされていない。However, it has been shown that other subtypes may exist, and the substance of C kinase as a group of enzymes has not been completely elucidated.

発明が解決しようとする課題 上記のように、Ｃキナーゼには分子多様性が存在し、
その全体像は不明な点が多い。従って、試薬や検査薬と
して例えば、その分子亜型のそれぞれについて、それを
コードする遺伝子を同定し、その蛋白質を遺伝子組み換
え技術によって生産する方法が望まれていた。Problems to be Solved by the Invention As described above, C kinase has molecular diversity,
The whole picture is unclear. Therefore, for example, there has been a demand for a method of identifying a gene encoding each of its molecular subtypes as a reagent or a test agent, and producing the protein by a genetic recombination technique.

課題を解決するための手段 一般に、ヒトにより近い動物の蛋白質は、そのアミノ
酸配列においてヒトと非常に高い相同性があり、アミノ
酸の異なっている部分も、その大部分はコドンのone po
int mutationによって導びかれるものである。従って、
ラット等の動物のＣキナーゼ亜型のcDNAを得れば、ヒト
のそれを得ることは容易であると考えられる。そこで本
発明者等は、まずラットを材料として、Ｃキナーゼの新
しい亜型の遺伝子を検索することを試みた。その結果、
新たに３種のＣキナーゼのcDNAを分離することに成功し
た。Means for Solving the Problems In general, proteins of animals closer to humans have very high homology to humans in their amino acid sequences.
It is derived by int mutation. Therefore,
It is considered that obtaining cDNA of the C-kinase subtype of an animal such as a rat makes it easy to obtain that of a human. Therefore, the present inventors first attempted to search for a new subtype of C kinase using rat as a material. as a result,
The inventors succeeded in isolating cDNAs of three new C kinases.

本発明は（１）第１図に示されたアミノ酸配列を含有
するポリペプチドであるラットＣキナーゼ（δ）
（Ｉ）、（２）ラットＣキナーゼ（δ）をコードする第
１図で示された塩基配列を含有する組み換えDNA（I
I）、（３）DNA（II）を含有するベクターで形質転換さ
れな形質転換体および、（４）DNA（II）を含有するベ
クターで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養中にラットＣキナーゼ（δ）を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該酵素の製造法に関するも
のである。The present invention relates to (1) rat C kinase (δ) which is a polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG.
(I), (2) a recombinant DNA (I) containing the nucleotide sequence shown in FIG.
(I), (3) a transformant transformed with a vector containing DNA (II) and (4) a transformant transformed with a vector containing DNA (II) are cultured in a medium, and cultured. The present invention relates to a method for producing the enzyme, comprising producing and accumulating rat C kinase (δ) therein and collecting the same.

また本発明は、（５）第２図に示されたアミノ酸配列
を含有するポリペプチドであるラットＣキナーゼ（ε）
（III）、（６）ラットＣキナーゼ（ε）をコードする
第２図で示された塩基配列を含有する組み換えDNA（I
V）、（７）DNA（IV）を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体および、（８）DNA（IV）を含有するベ
クターで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養中にラットＣキナーゼ（ε）を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該酵素の製造法に関するも
のである。The present invention also relates to (5) rat C kinase (ε), which is a polypeptide having the amino acid sequence shown in FIG.
(III), (6) Recombinant DNA containing the nucleotide sequence shown in FIG. 2 encoding rat C kinase (ε) (I
V), (7) a transformant transformed with the vector containing the DNA (IV) and (8) a transformant transformed with the vector containing the DNA (IV) are cultured in a medium, and cultured. The present invention relates to a method for producing the enzyme, comprising producing and accumulating rat C kinase (ε) therein and collecting it.

更に、本発明は（９）第６図に示されたアミノ酸配列
を含有するポリペプチドであるラットＣキナーゼ（ζ）
（Ｖ）、（10）ラットＣキナーゼ（ζ）をコードする第
６図で示された塩基配列を含有する組み換えDNA（V
I）、（11）DNA（IV）を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体および、（12）DNA（IV）を含有するベ
クターで形質転換された形質転換体を培地に培養し、培
養中にラットＣキナーゼ（ζ）を生成蓄積せしめ、これ
を採取することを特徴とする該酵素の製造法に関するも
のである。Further, the present invention relates to (9) rat C kinase (ζ) which is a polypeptide containing the amino acid sequence shown in FIG.
(V), (10) Recombinant DNA containing the nucleotide sequence shown in FIG. 6 encoding rat C kinase (Ｃ) (V
(I), (11) a transformant transformed with a vector containing DNA (IV) and (12) a transformant transformed with a vector containing DNA (IV), and culturing in a medium. The present invention relates to a method for producing the enzyme, comprising producing and accumulating rat C kinase (ζ) therein and collecting the same.

本発明方法におけるラットＣ−キナーゼ蛋白質のポリ
ペプチドをコードする塩基配列を有するDNAを含有する
発現型ベクターは、例えば、 （イ）ラットＣ−キナーゼをコードするRNAを分離し、 （ロ）該RNAから単鎖の相補DNA（cDNA）を、次いで二重
鎖DNAを合成し、 （ハ）該相補DNAをプラスミドに組み込み、 （ニ）得られた組み換えプラスミドで宿主を形質転換
し、 （ホ）得られた形質転換体を培養後、形質転換体から適
当な方法、例えばラットcDNAをプローブとして用いたコ
ロニーハイブリダイゼーション法、により目的とするDN
Aを含有するプラスミドを単離し、 （ヘ）そのプラスミドから目的とするクローン化DNAを
切り出し、 （ト）該クローン化DNAをビークル中のプロモーターの
下流に連結する、ことにより製造することができる。The expression type vector containing a DNA having a nucleotide sequence encoding a rat C-kinase protein polypeptide in the method of the present invention includes, for example, (a) isolating RNA encoding rat C-kinase; (C) integrating the complementary DNA into a plasmid, (d) transforming a host with the obtained recombinant plasmid, (e) After culturing the obtained transformant, the desired DN is obtained from the transformant by an appropriate method, for example, a colony hybridization method using rat cDNA as a probe.
A plasmid containing A is isolated, (f) the cloned DNA of interest is cut out from the plasmid, and (g) the cloned DNA is ligated downstream of the promoter in the vehicle.

ラットＣ−キナーゼをコードするRNAは、種々のラッ
トＣ−キナーゼ産生細胞、例えばラット脳由来細胞から
得ることができる。RNA encoding rat C-kinase can be obtained from various rat C-kinase producing cells, such as cells derived from rat brain.

ラットＣ−キナーゼ産生細胞からRNAを調製する方法
としては、グアニジンチオシアネート法〔J.M..Chirgwi
nら、バイオケミストリー（Biochemistry），18,5294
（1979）〕などが挙げられる。As a method for preparing RNA from rat C-kinase-producing cells, a guanidine thiocyanate method [JM.
n et al., Biochemistry, 18 , 5294.
(1979)].

このようにして得られたRNAを鋳型とし、逆転写酵素
を用いて、例えばH.Okayamaらの方法〔モレキュラー・
アンド・セルラー・バイオロジー（Molecular and Cell
ular Biology）2,161（1982）および同誌3,280（198
3）〕に従いcDNAを合成し、得られたcDNAをプラスミド
に組み込む。Using the RNA thus obtained as a template and reverse transcriptase, for example, the method of H. Okayama et al.
And Cellular Biology (Molecular and Cell
ular Biology) 2, 161 (1982 ) and ibid 3, 280 (198
3)], and synthesize the obtained cDNA into a plasmid.

cDNAを組み込むプラスミドとしては、たとえば大腸菌
由来のpB R322〔ジーン（gene），2,95（1977）〕,pB R
325〔ジーン，4,121（1978）〕,pU C12〔ジーン，19,,2
59（1982）〕,pU C13〔ジーン，19,,259（1982）〕、枯
草菌由来のpU B110〔バイオケミカル・バイオフィジカ
ル・リサーチ・コミュニケーション（Biochemical and
Biophysical Research Communication），112,678（198
3）〕などが挙げられるが、その他のものであっても、
宿主内で複製保持されるものであれば、いずれをも用い
ることができる。Examples of plasmids for incorporating cDNA include, for example, pBR322 derived from Escherichia coli [gene, 2, 95 (1977)], pBR
325 [Gene, 4, 121 (1978)], pU C12 [Gene, 19 ,, 2
59 (1982)], pU C13 [Gene, 19, 259 (1982)], pU B110 derived from Bacillus subtilis [Biochemical and biophysical research communication (Biochemical and
Biophysical Research Communication), 112, 678 (198
3)], etc.
Any of those that can be replicated and maintained in the host can be used.

プラスミドに組み込む方法としては、たとえば、T.Ma
niatisら，モレキュラー・クローニング（Molecular Cl
oning）コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー（Cold Spring Harbor Laboratory），第239頁（198
2）に記載の方法などが挙げられる。As a method of integrating into a plasmid, for example, T.Ma
niatis et al., Molecular Cloning (Molecular Cl
oning) Cold Spring Harbor Laboratory, p. 239 (198
The method described in 2) is mentioned.

このようにして得られたプラスミドは、適当な宿主た
とえばエシェリキア（Escherichia）属菌，バチルス（B
acillus）属菌などに導入する。The plasmid thus obtained can be used in a suitable host such as a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus (B.
acillus).

上記エシェリキア属菌の例としては、エシェリキア・
コリ（Escherichia coli）K12DH1〔プロシージング・オ
ブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Pro
c.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）60,160（1968）〕,M103〔ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Re
search），9,309（1981）〕,J A221〔ジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular
Biology）〕，120,517（1978）〕,H B101〔ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー41,459（196
9）〕,C600〔ジェネティックス（Genetics），39,440
（1954）〕などが挙げられる。Examples of the genus Escherichia include Escherichia
Escherichia coli K12DH1 [Proceding of National Academy of Science (Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA) 60, 160 (1968)], M103 [Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Re
search), 9, 309 (1981)], J A221 [Journal of Molecular Biology (Journal of Molecular
Biology)], 120, 517 (1978)], HB101 [Journal of Molecular Biology 41, 459 (196
9)], C600 [Genetics, 39, 440
(1954)].

上記バチルス属菌としては、たとえばバチルス・サチ
ルス（Bacillus subtilis）M I144（ジーン，24,255（1
983）〕,207−21〔ジャーナル・オブ・バイオケミスト
リー（Journal of Biochemistry）95,87（1984）〕など
が挙げられる。Examples of the Bacillus genus include Bacillus subtilis MI144 (Gene, 24, 255 (1
983)], 207-21 [Journal of Biochemistry 95, 87 (1984)].

形質転換する方法としては、たとえばT.Maniatisら，
モレキュラー・クローニング（Molecular Cloning），
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Cold
Spring Harbor Laboratory），第249頁（1982）に記載
のカルシウムクロライド法あるいはカルシウムクロライ
ド／ルビジウムクロライド法などが挙げられる。Transformation methods include, for example, T. Maniatis et al.
Molecular cloning,
Cold Spring Harbor Laboratory (Cold)
Spring Harbor Laboratory), page 249 (1982), calcium chloride method or calcium chloride / rubidium chloride method.

このようにして得られた形質転換体中から自体公知の
方法、例えばコロニー・ハイブリダイゼーション法〔ジ
ーン，10,63（1980）〕およびDNA塩基配列決定法〔プロ
シージング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.）74,560（197
7），ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Aci
ds Research）9,309（1981）〕を用い、求めるクローン
を選出する。From the thus obtained transformants, methods known per se, such as the colony hybridization method [Gene, 10, 63 (1980)] and the DNA sequencing method [Proceeding of National Academy of・ Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 74, 560 (197
7), Nucleic Acids Research
ds Research) 9, 309 (1981)].

このようにして、クローン化されたラットＣ−キナー
ゼをコードする塩基配列を含有するDNAを有するベクタ
ーを保持する微生物が得られる。In this way, a microorganism carrying a vector having a DNA containing the cloned nucleotide sequence encoding rat C-kinase can be obtained.

次に、該微生物からプラスミドを単離する。 Next, a plasmid is isolated from the microorganism.

該単離法としては、アルカリ法〔H.C.Birmboimら、ヌ
クレイック・アシッズ・リサーチ，（Nucleic Acids Re
search），1,1513（1979）〕などが挙げられる。The isolation method includes an alkaline method [HC Birmboim et al., Nucleic Acids Research, (Nucleic Acids Re
search), 1, 1513 (1979)].

上記クローン化されたラットＣ−キナーゼをコードす
る塩基配列を含有するDNAを有するプラスミドはそのま
ま、または所望により制御酵素で切り出す。The plasmid having the DNA containing the cloned base sequence encoding rat C-kinase is cut out as it is or, if desired, with a control enzyme.

クローン化された遺伝子は、発現に適したビークル
（ベクター）中のプロモーターの下流に連結して発現型
ベクターを得ることができる。The cloned gene can be ligated downstream of a promoter in a vehicle (vector) suitable for expression to obtain an expression type vector.

ベクターとしては、上記の大腸菌由来のプラスミド
（例、pB R322,pB R325,pU C12,pU C13），枯草菌由来
プラスミド（例、pU B110,pT P5,pC194），酵母由来プ
ラスミド（例,pS H19,ps H15），あるいはλファージな
どのバクテリオファージおよびレトロウィルス、ワクシ
ニアウィルスなどの動物ウィルスなどが挙げられる。Examples of the vector include the above-mentioned Escherichia coli-derived plasmids (eg, pBR322, pBR325, pUC12, pUC13), Bacillus subtilis-derived plasmids (eg, pUB110, pTP5, pC194), and yeast-derived plasmids (eg, pSH19). , psH15), or bacteriophages such as λ phage and animal viruses such as retroviruses and vaccinia virus.

該遺伝子はその５′末端に翻訳開始コドンとしてのAT
Gを有し、また３′末端には翻訳終止コドンとしてのTA
A,TGAまたはTAGを有していてもよい。さらに該遺伝子を
発現させるにはその上流にプロモーターを接続する。本
発明で用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現
に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればい
かなるものでもよい。The gene has AT at its 5 'end as a translation initiation codon.
G and TA at the 3 'end as a translation stop codon
It may have A, TGA or TAG. In order to further express the gene, a promoter is connected upstream thereof. The promoter used in the present invention may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.

また、形質転換する際の宿主がエシェリキア属菌であ
る場合は、trpプロモーター,lacプロモーター,recAプロ
モーター，λPLプロモーター,lppプロモーターなどが、
宿主がバチルス属菌である場合は、SPO1プロモーター,S
PO2プロモーター,penPプロモーターなど、宿主が酵母で
ある場合は、PHO5プロモーター,PGKプロモーター,GAPプ
ロモーター,ADHプロモーターなどが好ましい。とりわけ
宿主がエシェリキア属菌でプロモーターがtrpプロモー
ターまたはλPLプロモーターであることが好ましい。When the host used for transformation is Escherichia, trp promoter, lac promoter, recA promoter, λPL promoter, lpp promoter, etc.
When the host is Bacillus, SPO1 promoter, S
When the host is yeast, such as a PO2 promoter or a penP promoter, a PHO5 promoter, a PGK promoter, a GAP promoter, an ADH promoter, etc. are preferred. It is particularly preferred that the host is Escherichia and the promoter is the trp promoter or the λPL promoter.

宿主が、動物細胞である場合には、SV40由来のプロモ
ーター、レトロウィルスのプロモーターなどが挙げら
れ、とりわけSV40由来のプロモーターが好ましい。When the host is an animal cell, SV40-derived promoters, retrovirus promoters and the like can be mentioned, and SV40-derived promoters are particularly preferable.

このようにして構築されたDNA（II），（IV）または
（VI）を含有するベクターを用いて、形質転換体を製造
する。Using the vector containing DNA (II), (IV) or (VI) thus constructed, a transformant is produced.

宿主としては、たとえばエシェリキア属菌、バチルス
属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。Examples of the host include Escherichia, Bacillus, yeast, animal cells and the like.

上記エシェリキア属菌、バチルス属菌の具体例として
は、前記したものと同様のものが挙げられる。Specific examples of the aforementioned Escherichia and Bacillus bacteria include those similar to those described above.

上記酵母としては、たとえばサッカロマイセスセレビ
シアエ（Saccaromyces cerevisiae）AH22R^-,NA87−11A,
DKD−5Dなどが挙げられる。Examples of the yeast include Saccharomyces cerevisiae AH22R ⁻ , NA87-11A,
DKD-5D and the like.

動物細胞としては、たとえばサル細胞COS−7,Vero,チ
ャイニーズハムスター細胞CHO,マウスＬ細胞，ヒトFL細
胞などが挙げられる。Examples of animal cells include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO, mouse L cells, human FL cells, and the like.

上記エシェリキア属菌を形質転換するには、たとえば
プロシージング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・
オブ・サイエンス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），69,211
0（1972）やジーン，17,107（1982）などに記載の方法
に従って行なわれる。In order to transform the above Escherichia, for example, proceeding of the National Academy
Science of Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69 , 211
0 (1972) and Gene, 17 , 107 (1982).

バチルス属菌を形質転換するには、たとえばモレキュ
ラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Molecu
lar ＆ General Genetics），168,111（1979）などに記
載の方法に従って行なわれる。To transform Bacillus sp., For example, Molecular and General Genetics (Molecu
lar & General Genetics), 168 , 111 (1979).

酵母を形質転換するには、たとえばプロシージング・
オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
（Proc.Natl.Acad.Sci.USA），75,1929（1978）に記載
の方法に従って行なわれる。To transform yeast, for example,
Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 , 1929 (1978).

動物細胞を形質転換するには、たとえばヴィロロジー
（Virology）52,456（1973）に記載の方法に従って行な
われる。Transformation of animal cells is performed, for example, according to the method described in Virology 52 , 456 (1973).

このようにして、DNA（II）、（IV）または（VI）を
含有するベクターで形質転換された形質転換体が得られ
る。Thus, a transformant transformed with the vector containing DNA (II), (IV) or (VI) is obtained.

宿主がエシェリキア属菌、バチルス属菌である形質転
換体を培養する際、培養に使用される培地としては液体
培地が適当であり、その中には該形質転換体の生育に必
要な炭素源、窒素源、無機物その他が含有せしめられ
る。炭素源としては、たとえばグルコース、デキストリ
ン、可溶性澱粉、ショ糖など、窒素源としては、たとえ
ばアンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカ
ー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイシ
ョ抽出液などの無機または有機物質、無機物としてはた
とえば塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化
マグネシウムなどが挙げられる。また、酵母、ビタミン
類、生長促進因子などを添加してもよい。When culturing a transformant whose host is a bacterium belonging to the genus Escherichia or Bacillus, a liquid medium is suitable as a medium used for the culturing, and a carbon source necessary for growth of the transformant is used therein. Nitrogen sources, inorganic substances, etc. are contained. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of nitrogen sources include ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, meat extract, soybean meal, potato extract, and the like. Alternatively, examples of the organic substance and the inorganic substance include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride. In addition, yeast, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.

培地のpHは約６〜８が望ましい。 The pH of the medium is preferably about 6-8.

エシェリキア属菌を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地〔Miller,ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス（Journal of Experiments in Mole
cular Genetics）,431−433,Cold Spring Harbor Labor
atory,New York 1972〕が好ましい。ここに必要により
プロモーターを効率よく働かせるために、たとえば３β
−インドリル アクリル酸のような薬剤を加えることが
できる。As a medium for culturing Escherichia, for example, an M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journal of Experiments in Molecule)
Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor Labor
atory, New York 1972]. Here, in order to make the promoter work efficiently if necessary, for example, 3β
A drug such as indolyl acrylic acid can be added;

宿主がエシェリキア属菌の場合、培養は通常約15〜43
℃で約３〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加え
ることもできる。When the host is Escherichia, the culture is usually about 15 to 43.
C. for about 3 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be added.

宿主がバチルス属菌の場合、培養は通常約30〜40℃で
約６〜24時間行ない、必要により通気や撹拌を加えるこ
ともできる。When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, the cultivation is usually carried out at about 30 to 40 ° C. for about 6 to 24 hours, and if necessary, aeration and stirring can be applied.

宿主が酵母である形質転換体を培養する際、培地とし
ては、たとえばバークホールダー（Burkholder）最小培
地〔Bostian,K.L.ら、「プロシージング・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Natl.Aca
d.Sci.USA）、77,4505（1980）〕が挙げられる。培地の
pHは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約20
℃〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気や撹拌
を加える。When culturing a transformant in which the host is yeast, for example, Burkholder's minimal medium [Bostian, KL et al., "Proceding of National Academy of Science (Proc. Natl. Aca.)"
d. Sci. USA), 77 , 4505 (1980)]. Medium
Preferably, the pH is adjusted to about 5-8. Culture is usually about 20
C. to 35.degree. C. for about 24 to 72 hours, with aeration and agitation as needed.

宿主が動物細胞である形質転換体を培養する際、培地
としては、たとえば約５〜20％の胎児牛血際を含むMEM
培地〔サイエンス（Science）122,501（1952）〕,DMEM
培地〔ヴィロロジー（Virology），８,396（1959）〕,R
PMI1640培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メ
ディカル・アソシエーション（The Jounal of the Amer
ican Medical Association）199,519（1967）〕,199培
地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサウエティ・フォー
・ザ・バイオロジカル・メディスン（Pro−ceeding of
the Society for the Biological Medicine）73,1（195
0）〕などが挙げられる。pHは約６〜８であるのが好ま
しい。培養は通常約30℃〜40℃で約15〜60時間行い、必
要に応じて通気や撹拌を加える。When culturing a transformant in which the host is an animal cell, the medium may be, for example, MEM containing about 5 to 20% of fetal bovine blood.
Medium [Science 122 , 501 (1952)], DMEM
Medium [Virology, 8 , 396 (1959)], R
PMI1640 medium [Journal of the American Medical Association (The Jounal of the Amer
ican Medical Association) 199 , 519 (1967)], 199 culture medium [Pro-ceeding of the sosawayi for the biological medicine (Pro-ceeding of
the Society for the Biological Medicine) 73 , 1 (195
0)]. Preferably, the pH is between about 6 and 8. The cultivation is usually performed at about 30 ° C. to 40 ° C. for about 15 to 60 hours, and aeration and stirring are added as necessary.

上記培養物からラットＣ−キナーゼ蛋白を分離精製す
るには、例えば下記の方法により行なうことができる。The rat C-kinase protein can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method.

ラットＣ−キナーゼ蛋白を培養菌体あるいは細胞から
抽出するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるい
は細胞を集め、これを塩酸グアニジンなどの蛋白変性剤
を含む緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／ま
たは凍結融解によって菌体あるいは細胞を破壊したの
ち、遠心分離によりラットＣ−キナーゼ蛋白を得る方法
などが適宜用い得る。When the rat C-kinase protein is extracted from cultured cells or cells, the cells or cells are collected by a known method after culture, suspended in a buffer containing a protein denaturing agent such as guanidine hydrochloride, and sonicated. After disrupting cells or cells by lysozyme and / or freeze-thawing, a method of obtaining rat C-kinase protein by centrifugation can be used as appropriate.

上記上澄液からラットＣ−キナーゼ蛋白を精製するに
は、自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行な
うことができる。これらの公知の分離、精製法として
は、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法、透
析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を
利用する方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷
電の差を利用する方法、アフィニティークロマトグラフ
ィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体
クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、
等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法など
が挙げられる。The rat C-kinase protein can be purified from the supernatant by appropriately combining known separation and purification methods. As these known separation and purification methods, methods utilizing solubility such as salting out and solvent precipitation, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, mainly molecular weight such as Method using difference in charge, method using charge difference such as ion exchange chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, use of difference in hydrophobicity such as reverse phase high performance liquid chromatography Method,
A method utilizing the difference between isoelectric points, such as isoelectric point electrophoresis, may be used.

本発明の遺伝子組み換え技術によって得られたラット
Ｃ−キナーゼ蛋白の一例として、例えば第１図、第２図
または第３図におけるアミノ酸配列で示されるポリペプ
チドを含有する蛋白質を挙げることができる。該ポリペ
プチドはそのＮ末端にMetを有していてもよい。An example of the rat C-kinase protein obtained by the gene recombination technique of the present invention is, for example, a protein containing a polypeptide represented by the amino acid sequence shown in FIG. 1, FIG. 2, or FIG. The polypeptide may have a Met at its N-terminus.

かくして生成するラットＣ−キナーゼの活性は公知の
蛋白質リン酸化などにより測定することができる。The activity of the thus produced rat C-kinase can be measured by known protein phosphorylation and the like.

本発明のDNAで遺伝子感染または形質転換した細胞で
は、本来わずかのラットＣ−キナーゼしか合成されな
い、あるいは全く合成されない各種細胞においても大量
のラットＣ−キナーゼを産生せしめることができ、ラッ
トＣ−キナーゼ生産を有利に導くことができる。Cells transfected or transformed with the DNA of the present invention can produce large amounts of rat C-kinase even in various cells in which only a small amount of rat C-kinase is originally synthesized or not synthesized at all. Production can be advantageously led.

本発明のラットＣ−キナーゼ蛋白をコードする遺伝子
を含有する発現型プラスミドは、これを各種細胞に導入
することにより該細胞にラットＣ−キナーゼを産生させ
ることができるため、ラットＣ−キナーゼを大量に取得
することができる。ここに製造されるラットＣ−キナー
ゼは、試薬としてまた抗体を調製しその抗体と共に診断
・検査薬として用いることができる。たとえば本発明の
Ｃ−キナーゼは、細胞膜受容伝達機構などの研究用試
薬、細胞膜受容伝達機構の異常が原因となる疾病（例：
腫瘍）に対する診断・検査薬、あるいはこれらの疾病に
対する予防・治療薬のスクリーニング用試薬として用い
ることができる。たとえば、１回の診断・検査に約0.00
1〜10μｇのＣ−キナーゼが用いられる。The expression type plasmid containing the gene encoding the rat C-kinase protein of the present invention can produce rat C-kinase in various cells by introducing the gene into the cells, so that rat C-kinase can be produced in a large amount. Can be obtained. The rat C-kinase produced here can be used as a reagent or as an antibody, and used together with the antibody as a diagnostic / testing agent. For example, the C-kinase of the present invention can be used as a research reagent for a cell membrane receptive transduction mechanism, a disease caused by an abnormality of the cell membrane receptive transduction mechanism (eg,
It can be used as a diagnostic / test agent for tumors) or as a screening reagent for preventive / therapeutic agents for these diseases. For example, about 0.00 per diagnosis / test
1-10 μg of C-kinase is used.

以上、ラットＣ−キナーゼのクローニング、形質転換
体の製造、形質転換体を用いたラットＣ−キナーゼ蛋白
の製造及びその有用性等について詳細に述べた。The cloning of rat C-kinase, production of a transformant, production of rat C-kinase protein using the transformant, its usefulness, and the like have been described above in detail.

本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commision on Bi
ochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分野に
おける慣用略号に基づくものであり、その例を下記す
る。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、
特に明示しなければＬ一体を示すものとする。In the specification and the drawings of the present invention, when bases, amino acids and the like are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Commision on Bi
This is based on an abbreviation by ochemical Nomenclature or an abbreviation commonly used in the art, and examples thereof are described below. When amino acids may have optical isomers,
Unless otherwise specified, L integration is shown.

DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシングアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム G:Gly:グリシン A:Ala:アラニン V:Val:バリン L:Leu:ロイシン I:Ile:イソロイシン S:Ser:セリン T:Thr:スチオニン C:Cys:システイン M:Met:メチオニン E:Glu:グルタミン酸 D:Asp:アスパラギン酸 K:Lys:リジン R:Arg:アルギニン H:His:ヒスチジン F:Phe:フェニールアラニン Y:Tyr:チロシン W:Trp:トリプトファン P:Pro:プロリン N:Asn:アスパラギン Q:Gln:グルタミン 実施例および発明の効果 以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。DNA: Deoxyribonucleic acid cDNA: Complementary deoxyribonucleic acid A: Adenine T: Thymine G: Guanine C: Cytosine RNA: Ribonucleic acid dATP: Deoxyadenosine triphosphate dTTP: Deoxythymidine triphosphate dGTP: Deoxynguanosine triphosphate dCTP: Deoxycytidine triphosphate ATP: adenosine triphosphate EDTA: ethylenediaminetetraacetic acid SDS: sodium dodecyl sulfate G: Gly: glycine A: Ala: alanine V: Val: valine L: Leu: leucine I: Ile: isoleucine S: Ser: Serine T: Thr: Sthionine C: Cys: Cysteine M: Met: Methionine E: Glu: Glutamic acid D: Asp: Aspartic acid K: Lys: Lysine R: Arg: Arginine H: His: Histidine F: Phe: Phenylalanine Y: Tyr: Tyrosine W: Trp: Tryptophan P: Pro: Proline N: Asn: Asparagine Q: Gln: Glutamine Examples and Effects of the Invention The present invention will be described more specifically with reference to the following Examples. It is not limited to these.

後述の実施例２（１）で得られた形質転換体エシェリ
ヒア・コリ（Escherichia coli）DH1/pTB801、E.coli D
H1/pTB803およびE.coli DH1/pTB804は昭和62年９月24日
から財団法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO14652,IF
O14653,IFO14654としてそれぞれ寄託され、またこれら
微生物は昭和62年10月３日に通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（FRI）に受託番号FERM P−9633,FERM
9634,FERM P−9635としてそれぞれ寄託されている。The transformants Escherichia coli DH1 / pTB801 and E. coli D obtained in Example 2 (1) described below.
H1 / pTB803 and E. coli DH1 / pTB804 were deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) under the accession number IFO14652, IF on September 24, 1987.
O14653 and IFO14654, respectively, and these microorganisms were deposited on October 3, 1987 at the Research Institute of Microorganisms and Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry of Japan under the accession number FERM P-9633, FERM.
9634, FERM P-9635.

後述の実施例３（２）で得られた形質転換体エシェリ
ヒア・コリDH1/pTB949は、昭和63年９月15日からIFOに
受託番号IFO14787として、昭和63年９月29日からFRIに
受託番号FERM P−10304として、それぞれ寄託されてい
る。The transformant Escherichia coli DH1 / pTB949 obtained in Example 3 (2) described below has been assigned to the IFO from September 15, 1988 as Accession No. IFO14787, and from September 29, 1988 to FRI as Accession No. They have been deposited as FERM P-10304.

実施例１ （１）ラット脳mRNA由来のcDNAライブラリーの作製 ラット脳よりRNAをグアニジンイソチオシアネート法
〔Chirgwimら、「バイオケミストリー（Biochemistr
y）」18,5294,1978〕を用いて抽出した。このRNAよりポ
リ（Ａ）RNAをオリゴdTセルロースカラムクロマトグラ
フィーにより精製した〔AvivとLeder,「プロシージング
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス（Proc.Natl.Acad.Sci.USA）69,1408（1972）〕。こ
のポリ（Ａ）RNAを鋳型としてcDNAライブラリーを、Wat
sonとJacksonの方法〔Watson.C.J.and Jackson,J.F.,DN
Aクローニング・ア・プラクティカル・アプローチ（DNA
Cloning A Practical Approach）IRL press,0xford,p7
9,1985〕に従って、λファージベクターλgt10（Huynh,
T.V.ら、DNAクローニング・ア・プラクティカル・アプ
ローチ,IRL press,0xford,p49,1985）を用いて作成し
た。10μｇのポリ（Ａ）RNAより出発して、約1.5×10⁶
個のクローンよりなる大腸菌C600,HflA（Huynh T,Vら、
同上）を宿主としたcDNAライブラリーを得ることができ
た。Example 1 (1) Preparation of cDNA library derived from rat brain mRNA RNA was prepared from rat brain by the guanidine isothiocyanate method [Chirgwim et al., "Biochemistry".
y) " 18 , 5294, 1978]. Poly (A) RNA was purified from this RNA by oligo dT cellulose column chromatography [Aviv and Leder, "Proceding of the National Academy of Sciences (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) 69 , 1408 (1972)] Using the poly (A) RNA as a template, a cDNA library was
Son and Jackson's method [Watson. CJand Jackson, JF, DN
A Cloning a Practical Approach (DNA
Cloning A Practical Approach) IRL press, 0xford, p7
9,1985], the λ phage vector λgt10 (Huynh,
TV et al., DNA cloning a practical approach, IRL press, 0xford, p49, 1985). Starting from 10 μg of poly (A) RNA, about 1.5 × 10 ⁶
E. coli C600, HflA (Huynh T, V et al.
As described above), a cDNA library was obtained using the host as a host.

（２）ラットＣキナーゼ亜型cDNAを含むファージの単離
のそのDNA塩素配列の決定 上記ファージcDNAライブラリーを大腸菌C600,HflAを
宿主として軟寒天プレート上に、約１×10⁵クローンず
つ、10枚まき、これを、２枚づつのニトロセルロースフ
ィルター（ミリポア社,HATFフィルター）上に移した
後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変性したファージDNAを
フィルター上に乾燥固定した。（Maniatisら、［モレキ
ュラー・クローニング（Molecular Cloning）」Cold Sp
ning Harbor Laboratory,p320,1982）。一方、既に公知
のラットＣキナーゼ（α）、（βII）および（γ）のcD
NAを含むプラスミドDNApTB653,pTB755およびpTB756より
制御酵素EcoR I切断によりcDNA部分を分取し、これを等
量づつ混合した後、ニックトランスレーション法により
³²P標識し、プローブとした。標識したプローブと、DNA
を固定した一組のフィルターを、標識プローブを含む、
５×SSPE（0.9MNaCl50mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.
4）,5mM EDTA）,50％ホルムアミド,5×Denhardt's,0.1
％SDS,100μg/ml変性サケ***DNA溶液10ml中で42℃,16
時間会合反応を行い、反応後、フィルターを２×SSC
（１×SSC＝0.15M NaCl,0.015Mクエン酸ナトリウム）,
0.1％SDS溶液中で室温で30分ずつ２回0.2×SSC,0.1％SD
S溶液中で、68℃で30分２回洗浄した。また、もう一組
のフィルターをプローブを含む20％のホルムアミド、５
×SSPE,5×Denhardt's,0.1％SDS,100μg/ml変性サケ精
子DNA溶液10ml中で42℃16時間行い、反応後、フィルタ
ーを２×SSC,0.1％SDS溶液で室温で30分３回、さらに55
℃で30分ずつ２回洗浄した〔T.Maniatisら，モレキュラ
ー クローニング（Molecular Cloning）Cold Spring H
arbor Laboratory,pp309,1982）〕。(2) Isolation of phage containing rat C-kinase subtype cDNA and determination of its DNA chlorine sequence The above-mentioned phage cDNA library was placed on a soft agar plate using Escherichia coli C600 and HflA as hosts, and about 1 × 10 ⁵ clones each were cloned. The sheets were transferred onto a nitrocellulose filter (HATF filter, Millipore Co., Ltd.), and the phage DNA exposed and denatured with a 0.5N NaOH solution was dried and fixed on the filter. (Maniatis et al., [Molecular Cloning] Cold Sp.
ning Harbor Laboratory, p320, 1982). On the other hand, the cD of rat C kinases (α), (βII) and (γ) already known
The cDNA portion was separated from the plasmid DNAs containing NA, pTB653, pTB755 and pTB756, by digestion with the control enzyme EcoRI and mixed in equal amounts, followed by nick translation.
^{It was} labeled with ³² P and used as a probe. Labeled probe and DNA
A set of filters immobilized with a labeled probe,
5 × SSPE (0.9 M NaCl 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.
4), 5mM EDTA), 50% formamide, 5 × Denhardt's, 0.1
% SDS, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA solution
After performing a time-association reaction, the filter is replaced with 2 × SSC
(1 × SSC = 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate),
0.2 × SSC, 0.1% SD twice in a 0.1% SDS solution at room temperature for 30 minutes each
Washed twice in S solution at 68 ° C. for 30 minutes. Another set of filters was added to a 20% formamide containing probe, 5%
× 10 × SSPE, 5 × Denhardt's, 0.1% SDS, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA solution in 10 ml at 42 ° C. for 16 hours. 55
Washed twice at 30 ° C. for 30 minutes each [T. Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring H
arbor Laboratory, pp309, 1982)].

洗浄した２組のフィルターよりラジオオートグラムを
とり、20％ホルムアミド溶液中で会合反応を行った場合
のみにプローブと反応するクローンを検索した。この結
果、３種類のラットＣキナーゼ亜型cDNAが得られ、これ
らをλCKRδ５（Ｃキナーゼδ）、λCKRε41（Ｃキナー
ゼε）λCKRζ３（Ｃキナーゼζ）と名付けた。さら
に、それぞれのcDNA部分の塩基配列をジデオキシヌクレ
チオド合成鎖停止法〔Messingら，「ヌクレイック・ア
シッズ・リサーチ（Nucleic Acids Reserch）」9,309,
（1981）〕によって決定した。Radioautograms were taken from the two sets of washed filters, and clones that reacted with the probe only when the association reaction was performed in a 20% formamide solution were searched. As a result, three rat C-kinase subtype cDNAs were obtained, which were named λCKRδ5 (C-kinase δ), λCKRε41 (C-kinase ε), and λCKRζ3 (C-kinaseζ). Furthermore, the nucleotide sequence of each cDNA portion was determined by the dideoxynucleotide synthesis chain termination method [Messing et al., "Nucleic Acids Research" 9,309,
(1981)].

第１図ないし第３図にラットＣキナーゼδ、εおよび
ζの塩基配列の一部を含む塩基配列、およびそれらから
予想されるアミノ酸配列を示した。それぞれの得られた
塩基配列により予想されるアミノ酸配列について、既知
のラットＣキナーゼα，βI,βII,γ型のそれと比較す
ると、極めて高い相同性が認められることから、新しく
得られたδ、ε、ζ型はいずれもＣキナーゼ亜型の一つ
であると考えられた。FIGS. 1 to 3 show the nucleotide sequences containing a part of the nucleotide sequence of rat C kinase δ, ε and ζ, and the amino acid sequence deduced therefrom. When the amino acid sequence predicted by each obtained nucleotide sequence is compared with that of the known rat C kinase α, βI, βII, and γ-type, extremely high homology is recognized. , Ζ were considered to be one of the C kinase subtypes.

実施例２ （１）ラットＣキナーゼδ、εおよびζ型cDNAの動物細
胞での発現用プラスミドの構築： λCKRδ5,λCKRε41およびλCKRζ３を制限酵素EcoR
Iで分解し、それぞれ約2.9kb、2.8kbおよび1.8kbのcDNA
部分を分離した。一方、公知の動物細胞発現用プラスミ
ドpTB652〔小野らサイエンス（Science），236,1116（1
987）〕をEcoR Iで分解し、これと上記cDNA断片をT4DNA
リガーゼで連結し動物細胞発現用プラスミドpTB801（δ
型）pTB803型（ε型）およびpTB804（ζ型の一部を含
む）を構築した。これらプラスミドを用い大腸菌形質転
換体E.coli.DH I/pTB801（IFO 14652,FERM P−9633）、
E.coliDH I/pTB803（IFO 14653,FERM P−9634）および
E.coli DH I/pTB804（IFO 14654,FERM P−9635）をそれ
ぞれ得た。Example 2 (1) Construction of Plasmids for Expression of Rat C Kinase δ, ε and ζ cDNAs in Animal Cells: λCKRδ5, λCKRε41 and λCKRζ3 were replaced with restriction enzymes EcoR
Digested with I, about 2.9 kb, 2.8 kb and 1.8 kb cDNA, respectively
Parts were separated. On the other hand, a known animal cell expression plasmid pTB652 [Ono et al. Science, 236 , 1116 (1
987)] was digested with EcoRI and this and the above cDNA fragment were digested with T4 DNA.
Ligase-ligated plasmid pTB801 (δ
Type) pTB803 type (ε type) and pTB804 (including a part of type ζ) were constructed. Using these plasmids, E. coli transformants E. coli DH I / pTB801 (IFO 14652, FERM P-9633),
E. coliDH I / pTB803 (IFO 14653, FERM P-9634) and
E. coli DH I / pTB804 (IFO 14654, FERM P-9635) was obtained.

（２）ラットＣキナーゼδおよびε型cDNAの動物細胞で
の発現： 上記発現用プラスミドpTB801またはpTB803をScience
236,1116（1987）に記載された方法により、サルCOS−
７細胞に感染させた後、細胞質分画を得た。この細胞質
分画を３倍量の20mM Tris HCl（pH7.5）0.5mM EGTA,10m
M2−メルカプトエタノール（緩衝液Ａ）で希釈した後、
TSKDEAE−5PWカラムにのせた。緩衝液Ａでカラムを洗浄
した後、０−0.6MのNaClを含む、緩衝液Ａの直線濃度勾
配法により、Ｃキナーゼ活性を溶出させた。第５図にこ
の時の溶出パターンを示した。第５図から、pTB801また
はpTB803感染細胞由来画分は、それぞれＣキナーゼ活性
を有していることが分かる。(2) Expression of rat C kinase δ and ε type cDNA in animal cells: The above expression plasmid pTB801 or pTB803 was used in Science.
236 , 1116 (1987).
After infecting 7 cells, a cytoplasmic fraction was obtained. This cytoplasmic fraction was mixed with 3 volumes of 20 mM Tris HCl (pH 7.5) 0.5 mM EGTA, 10 mM
After dilution with M2-mercaptoethanol (buffer A),
Loaded on TSKDEAE-5PW column. After washing the column with buffer A, C kinase activity was eluted by a linear gradient method of buffer A containing 0-0.6 M NaCl. FIG. 5 shows the elution pattern at this time. From FIG. 5, it can be seen that the fractions derived from the cells infected with pTB801 or pTB803 each have C kinase activity.

実施例３ （１）ラットＣキナーゼζcDNAを含むファージの単離と
そのDNA塩基配列の決定 実施例１（１）に記載したファージcDNAライブラリー
を大腸菌C600,HflAを宿主として軟寒天プレート上に、
約１×10⁵クローンずつ10枚まき、これをニトロセルロ
ースフィルター（ミリポア社、HATFフィルター）上に移
した後、0.5N NaOH溶液でとかし露出変性したファージD
NAをフィルター上に乾燥固定した。一方、実施例２
（１）に記載したラットＣキナーゼζcDNAの一部を含む
プラスミドpTB804より制限酵素EcoR IおよびCla I切断
により、約0.4kbのDNA断片を分取し、これをニックトラ
ンスレーション法により、³²P標識し、プローブとし
た。標識したプローブとDNAを固定したフイルターを、
標識プローブを含む、５×SSPE、50％ホルムアミド、５
×Denhardt's,0.1％SDS,100μg/ml変性サケ***DNA溶液
10ml中で42℃,16時間会合反応を行い、反応後、フイル
ターを２×SSC、0.1％SDS溶液中で室温で30分ずつ２
回、0.2×SSC,0.1％SDS溶液中で68℃、30分２回洗浄し
た。このフィルターよりオートラジオグラムをとり、プ
ローブと反応するクローンを検索した。この結果、λCK
RLζ５およびλCKRLζ８と名づけた２組のファージクロ
ーンを得た。それぞれのcDNA部分の塩基配列をジデオキ
シヌクレオチド鎖停止法によって決定した。第６図にラ
ットＣキナーゼζの塩基配列、および、それから推測さ
れるアミノ酸配列を示した。Example 3 (1) Isolation of phage containing rat C kinase ζ cDNA and determination of its DNA base sequence The phage cDNA library described in Example 1 (1) was placed on a soft agar plate using Escherichia coli C600 and HflA as hosts.
Phage D was exposed and denatured by transferring 10 pieces of about 1 × 10 ⁵ clones each onto a nitrocellulose filter (HATF filter, Millipore) and dissolving with 0.5N NaOH solution.
NA was dried and fixed on the filter. On the other hand, Example 2
From the plasmid pTB804 containing a part of the rat C kinase ζ cDNA described in (1), a DNA fragment of about 0.4 kb was collected by digestion with restriction enzymes EcoRI and ClaI, and this was labeled with ³² P by the nick translation method. And used as a probe. Filter the labeled probe and DNA immobilized,
5x SSPE, 50% formamide, 5 including labeling probe
× Denhardt's, 0.1% SDS, 100 μg / ml denatured salmon sperm DNA solution
The association reaction was performed at 42 ° C. for 16 hours in 10 ml, and after the reaction, the filter was placed in a 2 × SSC, 0.1% SDS solution at room temperature for 30 minutes each.
The plate was washed twice in a 0.2 × SSC, 0.1% SDS solution at 68 ° C. for 30 minutes. An autoradiogram was taken from this filter, and a clone that reacted with the probe was searched. As a result, λCK
Two sets of phage clones named RL # 5 and λCKRL # 8 were obtained. The nucleotide sequence of each cDNA portion was determined by the dideoxynucleotide chain termination method. FIG. 6 shows the nucleotide sequence of rat C kinase ζ and the amino acid sequence deduced therefrom.

（２）ラットＣキナーゼζcDNAの動物細胞での発現 上記ファージλCKRLζ8cDNAよりEcoR IおよびCla I消
化により0.85kb cDNA断片を、λCKRζ３よりEcoR Iおよ
びCla I消化により1.4kb cDNA断片をそれぞれ分取し
た。これらcDNA断片を混合した後、公知の動物細胞発現
用ベクタープラスミドpTB701〔小野ら，ジャーナル・オ
ブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Chem.）76
3,6927（1988）〕のEcoR I部位に挿入したプラスミドpT
B949を構築した。このプラスミドを用い大腸菌E.coli D
H1を形質転換し、形質転換体エシェリヒア・コリDH1/pT
B949（IFO14878,FERM P−10304）を得た。(2) Expression of rat C kinase ζ cDNA in animal cells A 0.85 kb cDNA fragment was collected from the phage λCKRLζ8 cDNA by EcoRI and ClaI digestion, and a 1.4 kb cDNA fragment was collected from λCKRζ3 by EcoRI and ClaI digestion. After mixing these cDNA fragments, the known animal cell expression vector plasmid pTB701 [Ono et al., Journal of Biological Chemistry (J. Biol. Chem.) 76]
3 , 6927 (1988)], plasmid pT inserted into the EcoRI site.
B949 was built. Using this plasmid, E. coli D
H1 was transformed and the transformant Escherichia coli DH1 / pT
B949 (IFO14878, FERM P-10304) was obtained.

ラットＣキナーゼζ型発現用プラスミドpTB949をジャ
ーナル オブ ザ バイオロジカル ケミストリー（J.
Biol.Chem.），263,6927（1988）に記載された方法によ
り、サルCOS−７細胞に感染させた後、細胞質分画を得
た。この細胞質分画を３倍量の20mM Tris−HCl（pH7.
5）、0.5mM EGATA,10mM2−メルカプトエタノール（緩衝
液Ａ）で希釈した後、TSK DEAE−5PWカラムにのせた。
緩衝液Ａでカラムを洗浄した後、０〜0.6M NaClを含む
緩衝液Ａの直線濃度勾配法によりＣキナーゼ活性画分を
溶出させた。第７図は、この時の溶出パターンを示し
た。Plasmid pTB949 for rat C kinase type II expression was transferred to Journal of the Biological Chemistry (J.
Biol. Chem.), 263 , 6927 (1988), after infecting monkey COS-7 cells, a cytoplasmic fraction was obtained. This cytoplasmic fraction was treated with 3 volumes of 20 mM Tris-HCl (pH 7.
5) After dilution with 0.5 mM EGATA, 10 mM 2-mercaptoethanol (buffer A), the mixture was loaded on a TSK DEAE-5PW column.
After washing the column with buffer A, the C kinase active fraction was eluted by the linear concentration gradient method of buffer A containing 0 to 0.6 M NaCl. FIG. 7 shows the elution pattern at this time.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図はラットＣキナーゼδの塩基配列と予想されるア
ミノ酸配列を示し、第２図はラットＣキナーゼεの塩基
配列と予想されるアミノ酸配列を示し、第３図はラット
Ｃキナーゼζの塩基配列の一部を含む塩基配列と予想さ
れるアミノ酸配列を示す。 第４図はラットＣキナーゼα，βI,βII,γ，δ，ε，
ζのＣ末端領域のアミノ酸配列を比較して示した図であ
る。 第５図は感染細胞または非感染細胞由来の細胞質画分の
TSK DEAE−5PWカラムクロマトグラフィーにおけるラッ
トＣキナーゼで活性の挙動を示している。ａ）非感染細
胞由来、ｂ）pTB801感染細胞由来、ｃ）pTB803感染細胞
由来、ｄ）ラット脳可溶性画分由来のものに関する。 第６図はラットＣキナーゼζの塩基配列と、それから推
測されるアミノ酸配列を示す。 第７図は、感染細胞または非感染細胞由来の細胞質分画
のTSK DEAE−5PWカラムクロマトグラフィーにおけるラ
ットＣキナーゼ活性の挙動を示している。ａ）pTB949感
染細胞由来、ｂ）非感染細胞由来のものを示す。FIG. 1 shows the predicted nucleotide sequence of rat C kinase δ, FIG. 2 shows the predicted nucleotide sequence of rat C kinase ε, and FIG. 3 shows the nucleotide sequence of rat C kinase ζ. This shows the predicted amino acid sequence including the base sequence containing a part of the sequence. FIG. 4 shows rat C kinase α, βI, βII, γ, δ, ε,
FIG. 4 is a diagram showing a comparison of amino acid sequences of the C-terminal region of ζ. FIG. 5 shows cytoplasmic fractions derived from infected or uninfected cells.
The activity behavior of rat C kinase in TSK DEAE-5PW column chromatography is shown. a) derived from uninfected cells, b) derived from pTB801 infected cells, c) derived from pTB803 infected cells, d) derived from rat brain soluble fraction. FIG. 6 shows the nucleotide sequence of rat C kinase ζ and the amino acid sequence deduced therefrom. FIG. 7 shows the behavior of rat C kinase activity in TSK DEAE-5PW column chromatography of a cytoplasmic fraction derived from infected or uninfected cells. a) pTB949-derived cells and b) non-infected cells.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｓｃｉｅｎｃｅ（1986），Ｖｏｌ. 233，ｐ．853−859 Ｓｃｉｅｎｃｅ（1986），Ｖｏｌ. 233，ｐ．859−866 Ｓｃｉｅｎｃｅ（1987．５．29），Ｖ ｏｌ．236，ｐ．1116−1120 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（1987．２），Ｖｏｌ．84, Ｐ．1065−1069 ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ. 226，ｐ．125−128 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．263，Ｎｏ．14，ｐ．6927− 6932 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References Science (1986), Vol. 233, p. 853-859 Science (1986), Vol. 233, p. 859-866 Science (1987.5.529), Vol. 236, p. 1116-1120 Proc. Natl. Acad. Sc i. USA (1987.2), Vol. 84, p. 1065-1069 FEBS Letters, Vol. 226, p. 125-128 The Journal of Biological Chemistry Vol. 263, no. 14, p. 6927− 6932

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】次の式： で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
るラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）。1. The following formula: Rat protein kinase C (δ), which is a polypeptide containing the amino acid sequence represented by 【請求項２】請求項１記載のラット蛋白質リン酸化酵素
Ｃ（δ）をコードする塩基配列を含有する組み換えDN
A。2. A recombinant DN comprising the nucleotide sequence encoding the rat protein kinase C (δ) according to claim 1.
A. 【請求項３】次の式： で表わされる塩基配列を含有する請求項２記載のDNA。3. The following formula: The DNA according to claim 2, which comprises a base sequence represented by the following formula: 【請求項４】請求項１記載のラット蛋白質リン酸化酵素
Ｃ（δ）をコードする塩基配列を含有するDNAを含有す
るベクターで形質転換された形質転換体。4. A transformant transformed with a vector containing a DNA containing the nucleotide sequence encoding rat protein kinase C (δ) according to claim 1. 【請求項５】請求項４記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中にラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（δ）を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素
の製造法。5. A method for producing an enzyme, comprising culturing the transformant according to claim 4 in a medium, producing and accumulating rat protein kinase C (δ) in the culture, and collecting the protein. Law. 【請求項６】次の式： で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
るラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）。6. The following formula: Rat protein kinase C (ε), which is a polypeptide containing the amino acid sequence represented by 【請求項７】請求項６記載のラット蛋白質リン酸化酵素
Ｃ（ε）をコードする塩基配列を含有する組み換えDN
A。7. A recombinant DN comprising a nucleotide sequence encoding the rat protein kinase C (ε) according to claim 6.
A. 【請求項８】次の式： で表わされる塩基配列を含有する請求項７記載のDNA。8. The following formula: The DNA according to claim 7, which comprises a base sequence represented by the following formula: 【請求項９】請求項６記載のラット蛋白質リン酸化酵素
Ｃ（ε）をコードする塩基配列を含有するDNAを含有す
るベクターで形質転換された形質転換体。9. A transformant transformed with a vector containing a DNA containing a nucleotide sequence encoding rat protein kinase C (ε) according to claim 6. 【請求項１０】請求項９記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中にラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ε）を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素
の製造法。10. A method for producing the enzyme, comprising culturing the transformant according to claim 9 in a medium, producing and accumulating rat protein kinase C (ε) in the culture, and collecting the protein. Law. 【請求項１１】次の式： で表わされるアミノ酸配列を含有するポリペプチドであ
るラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）。11. The following formula: Rat protein kinase C (ζ) which is a polypeptide containing the amino acid sequence represented by 【請求項１２】請求項11記載のラット蛋白質リン酸化酵
素Ｃ（ζ）をコードする塩基配列を含有する組み換えDN
A。12. A recombinant DN comprising a nucleotide sequence encoding the rat protein kinase C (ζ) according to claim 11.
A. 【請求項１３】次の式： で表わされる塩基配列を含有する請求項12記載のDNA。13. The following formula: 13. The DNA according to claim 12, comprising a base sequence represented by: 【請求項１４】請求項11記載のラット蛋白質リン酸化酵
素Ｃ（ζ）をコードする塩基配列を含有するDNAを含有
するベクターで形質転換された形質転換体。14. A transformant transformed with a vector containing a DNA containing a nucleotide sequence encoding the rat protein kinase C (ζ) according to claim 11. 【請求項１５】請求項14記載の形質転換体を培地に培養
し、培養物中のラット蛋白質リン酸化酵素Ｃ（ζ）を生
成蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする該酵素
の製造法。15. A method for producing the enzyme, comprising culturing the transformant according to claim 14 in a medium, producing and accumulating rat protein kinase C (ζ) in the culture, and collecting the protein. Law.