JPH01250396A - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はポリペプチドの製造方法に関し、特にはＴｙｒ
とＳｅｒおよび／またはＴｈｒ残基を有するポリペプチ
ドのＴｙｒのＯＨ基を選択的に硫酸化する方法に関する
ものである。

（従来の技術） ポリペプチドは遺伝子操作の研究対象となるタンパク質
として近年大いに注目され、各種のポリペプチドが合成
されている。この合成法としては同相法と液相法が知ら
れているが、固相法は得られるペプチドの純度が低く、
最終工程での積装に多くの困難があるため工業的製法と
しては適当でない、一方、液相法にはステップワイズ法
とフラグメント縮合法があるが、前者は固相法と同様に
生成物のａＳが困難であるため、後者のフラグメント縮
合法が多く利用されている。フラグメント縮合法は合成
をフラグメントごとに分割できるので損失が少なくでき
、最終生成物の純度も高く、生成しやすい利点を持つ反
面、縮合反応においてＣ末端アミノ酸残基がラセミ化を
受けやすい欠点を伴うため、フラグメントの組合せをど
のように選ぶかが重要である。

これまで、ポリペプチドとしてヒトコレシストキニン（
ｈＣＣＫ−３３）をフラグメント縮合法で全合成する試
みがなされてきたが、いずれも成功していない、その理
由は保護基を有する複数個のフラグメントを順次アジド
縮合させる場合に、アミノ酸残基（ＳｅｒまたはＴｈｒ
）の存在下にＴｙｒ残基のみを選択的に硫酸化する試薬
がなく、かつ試薬による硫酸化は目的とするＴｙｒ−Ｏ
Ｈに起こらず、優先的に５ｅｒ−ＯＨまたはＴｈｒ−０
）１に起こるためである。

本発明者らはこの点について種々検討の結果、塩基性条
件下において脱保護可能なアミノ基およびＴｙｒ残基を
選択的に硫酸化できる試薬と方法を見出し本発明を完成
することができた。

（発明の構成） 本発明はＴｙｒとＳｅｒおよび／またはＴｈｒ残基を有
する出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性
条件下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、Ｓｅ
ｒおよび／またはＴｈｒ残基のＯＨ基をマスキングした
のち脱保護してＴｙｒ残基のＯＨ基を選択的に硫酸化す
ることを特徴とするポリペプチドの製造方法を要旨とす
るものである。

以下、本発明の詳細な説明するが、この説明において用
いたアミノ酸はグリシンを除きいずれもＬ型のものであ
り、アミノ酸の略号は英文３文字による一般の用法に従
い、その他の略号は次の通りである。

Ｂｚｌ　：ベンジル ＣＨＡ　ニジクロヘキシルアミン Ｃｈｐ　ニジクロヘプチル Ｃｌ２−Ｂｚｌ　：　２，６−ジクロロベンジルＤＣＨ
Ａ　ニジシクロヘキシルアミン ＤＭＦ　ニジメチルホルムアミド ＤＮＳＯニジメチルスルホキシド ＥＤＴ　：エタンジチオール Ｆｍｏｃ　：　９−フルオレニルメチルオキシカルボニ
ルＨＭＰＡ　：ヘキサメチルホスホアミドＭｔｓ　：メ
シチレンー２−スルホニルＮＭＭ　：　Ｎ−メチルモル
ホリン （０）：スルホキシド Ｓｕ　：　Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジルＴＥＡニト
リエチルアミン ＴＦＡニトリフルオロ酢酸 Ｔ）ＩＦ　：テトラヒドロフラン ＴＭＳＯＴｆ　：　トリメチルシリルトリフルオロメタ
ンスルホネート ｔＢｕＰｈ２Ｓｉ　：　ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシ
リルｔＢｕＭｅＳｉ　：　ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシ
リルＭｅ２Ｓｉニトリメチルシリル ２：ベンジルオキシカルボニル Ｚ（ＯＭｅ）　：　ｐ−メトキシベンジルオキシカルボ
ニル本発明の方法はＴｙｒとＳｅｒおよび／またはＴｈ
ｒ残基を有するポリペプチドを出発物質とするのであり
、ヒトコレシストキニン（ｈＣＣＫ−３３）の未硫酸化
形がこれに該当する。

したがって、以下フラグメント縮合法によるｈｃｃＸ−
３３の合成を例として本発明を説明する。

本発明の方法は次の３段階の工程からなる。すなわち、
第１段階は保護基を有するｈＣＣＫ−３３の合成、第２
段階は保護基の除去・脱離による硫酸化されていないｈ
ＣＣＫ−３３の取得、そして第３段階はＴｙｒ残基の選
択的硫酸化である。

第１段階においては第１図に示すように下記７個のポリ
ペプチドフラグメントを順次アジド法で縮合させること
によって保護基を有するｈＣＣＫ−３３が合成される。

（１）　Ｉｆ−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ａｒｇ　（Ｍｔ
ｓ）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ−Ｍｅｔ　（０）
−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓ
ｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ−Ｎ）ｌ。

（２）Ｚ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−１１
ｅ−５ｅｒ−ＮＨＮＨ。

（３）Ｚ（Ｏｉ４ｅ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−
Ｓｅｔ（Ｂｚｌ）−ＮＯＮ）ｌ。

（４）Ｚ（ＯＭｅ）−Ａｓｎ−Ｌａｕ−Ｇｉｎ−Ａｓｎ
−Ｌｅｕ−ＮＨＮＨ。

（５）Ｚ（ＯＭｅ）−３ａｒ（Ｂｚｌ）−１１ｓ−Ｖａ
ｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）−ＮＨＮＨ。

（６）　Ｚ　（ＯＭｓ）−Ｇｌｙ−Ａｒｇ　（Ｍｔｓ）
−Ｍｅｔ　（０）　−ＮＨＮＨ。

（７）Ｚ（ＯＭａ）−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ａｌａ−Ｐｒｏ−
５ｅｔ−ＮＨＮＨ。

この場合フラグメント（１）は第２図に示すように、最
初にＴｙｒ　（Ｃ１ｉ−Ｂｚｌ）を用い、　Ｓｕエステ
ル法によりＺ（ＯＭａ）−Ｔｙｒ（Ｃ１，−Ｂｚｌ）−
０Ｈを、Ｚ（ＯＭｅ）−Ｍａｔ（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
　（Ｍｔｓ）−Ｍａｔ　（０）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）
−Ｐｈｅ−ＮＨ，のＴＦＡ処理試料と縮合させることに
よって得られる。

第２図の方法で得られたＣ末端デカペプチドアミド（１
）（位置２４〜３３）から出発して各フラグメントを順
次縮合させる場合、　ＤＭＦ−ＤＭＳＯ−ＨＭＰＡ　（
１：１：１）を用いてフラグメントを溶解し、アシル成
分を１．５〜５当量用いて反応の完結に努めた。過剰の
アシル成分を用いたが、各反応は過アシル化することな
く、スムースに進行した０反応後過剰のアシル成分は再
沈殿法ないしはゲルろ過によって精製した。

酸加水分解の生成物中のアミノ酸組成比は第１表に示す
通りである。これによって保護されたｈＣＣＫ−３３を
合成するルートが確立できた。

第２段階として保護されたｈＣＣＫ−３３からすべての
保護基を除いて硫酸化されていないｈＣＣＫ−３３を得
た。保護基を除くに先立って、Ｍａｔ（０）残基をフェ
ニルチオトリメチルシランで処理してＮｅｔに還元し、
還元されたペプチドをＴＭＳＯＴｆ−チオアニソール／
　ＴＦＡで処理して、すべての保護基を除いた。

保護基を除去したペプチドを５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２
５を用いてゲルろ過し、重炭酸アンモニウム緩衝液を使
用してＣＭ−トリスアクリルＮ上でイオン交換クロマト
グラフィーを行った０合成された硫酸化されていないｈ
ＣＣに−３３の均質性を、６Ｎ塩酸による加水分解後の
アミノ酸分析と逆相系カラムを用いた１＋ＰＬＣによっ
て確かめた。

次に第３段階としてＴｙｒ残基を選択的に硫酸化するの
であるが、このためにＴｙｒ、　Ｓｅｒ、　Ｔｒｐ、　
Ｎｅｔ。

ｆｌｕｓおよびＬｙｓについて若干のモデル実験を行っ
た。

本発明者らはこのモデル実験から５ｅｒ−ＯＨがＴｙｒ
−〇（１より遥かに速い速度でシリル化されることを発
見した。ピリジン−５ｏＪＪ体で行う硫酸化の条件下２
４時間後の時点で、Ｓｅｔ（Ｍｅ２Ｓｉ）誘導体および
Ｓｅｔ（ｔＢｕＭｅｓｉ）誘導体は分解されるが、５ｅ
ｒ（ｔＢｕＰｈ２Ｓｉ）誘導体はそのままの形で残るこ
とがわかり、シリル化剤としてｔＢｕＰｈ２Ｓｉ塩化物
を選択するに至った。

ｔＢｕＰｈ２Ｓｉ塩化物によるＺ（ＯＭａ）−５ｅｒ−
０阿ｅのシリル化はイミダゾールの存在下で３０分以内
に定量的に進行した。一方、この条件でＴｙｒ−ＯＨは
一部シリル化されるのであるが、水冷下フェノール化合
物の添加によりこれを抑制できることが判った。フェノ
ール化合物として３種類を選んで試験を行ったが。

この中でフェノールが最も良い結果を与えた。

第３図に示されるように、フェノール（２０当量）の添
加はＴｙｒ−ＯＨのシリル化を４錦から３１％（４時間
後）に抑制する。　ｔＢｕＰｈ２Ｓｉ基はＤＭＦ中のＩ
Ｍのテトラブチルアンモニウムふっ化物（Ｂｕ４ＮＦ）
による簡単な処理（０℃、６０分）で分解されることが
知られているが、こ九に対してＴｙｒ（Ｓｏ、Ｈ）はこ
のハード塩基処理の下に安定であった。薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ）で検査したところ、シリル化および
脱シリル化の条件の下にＨｉｓ、　ＭｒｔおよびＴｒｐ
は不変に残っていた。これらのモデル実験から５ｅｔ−
ＯＨの存在下でのＴｙｒ−ＯＨの優先的硫酸化はｔＢｕ
Ｐｈ、ｓｉ基による５ｅｔ−ＯＨの水酸基の可逆的マス
キングによって行われると結論された。なお、Ｔｈｒは
ｈｃｃに一３３中には無い。

１９７０年にカルピノ（Ｃａｒｐｉｎｏ）とハン（Ｈａ
ｎ）により塩基で除去可能なアミノ保護基として紹介さ
れたＦｍｏｃ基は、ＤＭＦ中のＩＭのＢｕ、ＮＦによる
処理で。

ｔＢｕＰｈ２Ｓｉ基と共に分解されることがわかったの
で、本発明ではａ酸化に先立って二つのＬｙｓ残基（位
＝１．１１）のα−およびε−アミノ官能基をＦ脂ｏｃ
基でマスクした。　ＴＬＣで検査すると、ＴｙｒのＦａ
＋ｏｃ−ＯＳｕによる部分的アシル化はフェノールの添
加により効果的に抑制されていた。

最近になって、アセチル硫酸ピリジニウム（ＰＡＳ試薬
）がペンダ（Ｐｅｎｋａ）らによって硫酸化剤として紹
介された。この試薬はペンダらによりＤＭＦ−ピリジン
中で、シラン（にｕｒａｎｏ）らによりＴＦＡ中で、Ｓ
’ｅｒ−ＯＨをそれぞれアセチル基またはフェノキシア
セチル基でマスクした後、ブタＣＣＫ−３３の製造に使
用された。

Ｔｙｒ（Ｓｏ、Ｈ）の機工安定性および本発明の場合の
未硫酸化ｈＣＣＫ−３３中のマスクされていないＴｒｐ
残基の存在を考慮して、本発明では塩基性の条件下にＴ
ｙｒ残基を硫酸化した。　ＤＭＦ中のピリジンの存在の
下では、ピリジン−Ｓｏ、　９体はＰＡＳ試薬よりも容
易にＺ　（ＯＭｅ）−Ｔｙｒ−ＯＭｅを硫酸化した（第
４図）。

Ｚ　（ＯＭａ）−５ａｒ−ＯＭｅの硫酸化反応でも同様
の傾向が観察された。　ＴＬＣで検査すると、Ｈｉｓは
ピリジン−８Ｏ３錯体により部分的に硫酸化されていた
が（４時間後、３２％）水の添加により６０分以内に定
量的にＨｉｓが再生された。硫酸化の間のＭａｔの部分
的酸化およびＴｒｐの変化を抑制するにはＩＥＤＴの使
用が有効であった。第４回はＤＭＦ−ピリジン中でのピ
リジン−８０３錯体またはアセチル硫酸ピリジニウムに
よるＺ（ＯＭｅ）−Ｔｙｒ−ＯＭｅおよびＺ　（ＯＭｅ
）−９ａｒ−ＯＭｇの硫酸化を示すものである。

これらのモデル実験の後、第１図および第５図に示すよ
うに、前記未硫酸化形のｈＣＣＫ−３３に対し、次の反
応を逐次行わせて硫酸化ｈＣＣＸ−３３に添加させた。

： １）ＴＥＡの存在下にＦｍｏｃ−Ｏ５ｕで処理して、す
べてのアミノ官能基を保護した（０℃、２時間）。

Ｔｙｒ残基を保護するためにフェノールを加えた。

２）イミダゾールの存在下にｔＢｕＰｂ、５ｘ−Ｃ１で
処理して、４個の５ｅｔ−ＯＨ官能基を優先的に保護し
た（４℃、　１４時間、モデル実験より長い時間）、フ
ェノールを加えてＴｙｒ残基のシリル化を最小にした。

３）２０％のピリジンを含むＤＭＦ中のピリジン−８Ｏ
２錯体での処理によりＴｙｒ−ＯＨを硫酸化（２５℃、
２４時間）し、ＥＤＴを加えてＮｅｔとＴｒρを保護し
た。

４）ＤＭＦ中のＩＭのＢｕ４ＮＦで処理して、ｔＢｕＰ
ｈ２Ｓｉ保護基とＦｎ＋ｏｃ保護基を除去した（４℃、
１時間。

次いで２５℃、１時間）、　ＥＤＴを添加してＦ＋＊ｏ
ｃ基から由来するジベンゾフルペンをクエンチングさせ
た。

このようにして硫酸化されたｈＣＣＫ−３３の粗試料を
、０．２ＭのＮｉ１４８ＣＯ３緩衝液による傾斜溶離法
を用いてＣトドリスアクリルＳ上でイオン交換クロマト
グラフィーにかけ１次いで０．１ＭのＡｃ０ＮＨ４溶液
中のＭｅＣＮ　（３１％）を用いるアイソクラチックエ
ル−ジョン（ｉｓｏｃｒａｔｉｃ　ｅｌｕｔｉｏｎ）に
よるＡｓａｈｉｐａｋＯＤＰ−５０カラムでの１（ＰＬ
Ｃで精製した。前者の精製は過度に硫酸化されたｈＣＣ
Ｋと未硫、酸化ｈＣＣＫを除去するのに有効であった。

このＨＰＬＣカラムでは、ＹＭＣ−００５３０２カラム
より、所望の生成物の分離がより良好であった。総合収
率は未硫酸化ｈｃｃに−３３より計算して１５％であっ
た。収率は用いられたシリル化条件に全く依存するよう
に思われる。最適のシリル化条件は確認されていないが
シリル化を２５℃、３時間で行ったときの収率は１３％
であった。

このようにして得られた合成ｈＣＣＫ−３３の純度は分
析的ＨＰＬＣと酸加水分解後のアミノ酸分析によって確
かめられた。　ｒｙｒ（ＳＯｉ−）の存在はロイシン−
アミノペプチダーゼ（ＬＡＰ）消化によって確認された
。

合成ｈＣＣＫ−３３は並行して合成ｈＣＣに−８による
バイオアッセイにかけられ、活性が測定された。バイオ
アッセイはベンドパルビタールで麻酔された雑種犬（ｎ
　＝４）におけるすい臓毛細血管流とすい臓のタンパク
質放出で行われた。すい臓毛細血管の血液流はレーザー
ドツプラー潅流モニターで測定し、すい臓のタンパク質
の濃度はローリ（Ｌｏｖｒｙ）らの方法で測られた。

大腿静脈カテーテルを経て、合成ｈＣＣＫ−３３および
ＣＣＫ−８のＢｏ１ｕｓ注射（１，０，３，１２５，６
，２５，１２，５，２５，５０，１００，２００ピコモ
ル／ｋｇ・体重）が６０分の間隔を置いて与えられた。

すい臓血管流は合成ｈｃｃに−３３の投与により、用量
に従って増加した。

すい臓のタンパク質放出も合成ｈＣＣＫ−３３の投与に
より、用量に従って増加した。　３．１２５ピコモル／
眩の最小用量で増加効果がｌ１ｌＩ察された。最大の効
果は用量２００ピコモル／ｋｇでｌ１１５１された。す
い臓毛細血管血液流およびすい臓のタンパク質放出に対
する影響に関しては、モル量を基準として１合成ｈＣＣ
Ｋ−３３の活性が合成ＣＣＫ−８の活性の９２１であっ
た。ラットの生体標本における胃酸、ペプシン放出、す
い臓分泌から見ると、合成ｈＣＣＫ−３３はモル基準で
ＣＣＫ−８の約２ないし３倍強力であった。切離された
モルモットの胃組織からペプシノーゲン分泌の刺激にお
いては、モル基準で合成ｈＣＣＫ−３３はＣＣＫ−８と
同程度に有効であった０モル基準でＣＣＫ−８は全ブタ
ＣＣＫ−３３分子の２．５倍強力であった。従って、本
発明による合成ｈＣＣＫ−３３は天然のブタＣＣＫ−３
３の活性に匹敵するか、これより高い活性を持つものと
判断できる。前記犬アッセイ系では、未硫酸化ｈｃｃｌ
−３３の活性はＣＣＫ−８の活性（モル基準で１とする
）に対する比が０．０７４であったので、ＣＣＫの生体
活性にとって分子の硫酸部分が重要な役割をしているこ
とが確かめられた。

第６図は麻酔された犬における３種のＣＣＫ−ペプチド
に応答したすい臓のタンパク質放出の増加を示すもので
ある。

本発明によれば、ペンダおよびフラノらによって報告さ
れたブタＣＣＫ−３３の合成と異なり、ペプチドを強塩
基にさらすことなく、高度に活性なｈＣＣに一３３製品
を得ることができる。

（実施例） つぎに本発明の方法によるヒトコレシストキニンｈｃｃ
Ｋ−３３の合成について実施例を挙げてさらに具体的に
説明する。

なお、検値はシリカゲル（メルク社製キーゼルゲルＧ）
上の薄相クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて下記混合溶
媒を用いて測定したものである。

Ｒ，：ｎ−ＢｕＯＨ−ＡｃＯＨ−ＡｃＯＥＴ−Ｈ，Ｏ（
１：１：１：１）ニンヒドリン発色の強さは島津二波長
ＴＬＣスキャナー型Ｃ５−９００で測定した。　Ｆａｂ
−ＭＳスペクトルはＦＡＢイオン源とＪＥＯＬ　ＪＭ　
ＨＸ−１００：重収束質量分析計で得た。　ＬＡＰはシ
グマ社Ｌｏｔ　Ｎｏルー６００７で、　ＣＣＫ−８はタ
ンパク質研究所から購入し、ＨＰＬＣはＶａｔａｒｓ２
０４　ｍｏｄｅｌで行った。肝臓毛細管血液流はレーザ
ードツプラー権流モニター（米国ワシントン州シアトル
モデルパシフイソク社のモデルＬＤ５０００）を使用し
た。

「洗浄操作」は特記しない限り溶媒を蒸発した後、残滓
を５％クエン酸およびエーテルで処理し、得られた粉末
を５％クエン酸、５％ＮａＨＣＯ，，および水で洗い、
適当な溶媒から再結晶または沈殿させる操作を意味する （１）　　Ｚ（ＯＭｅ）−Ｔｙｒ（Ｃ１，−Ｂｚｌ）−
Ｍａｔ（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｍａｔ（０
）−Ａｇｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ−ＮＨ，（１）（位置
２７〜３３）の製法 ＴＦＡで処理したＺ　（ＯＭｅ）−Ｍｅｔ　（０）−Ｇ
ｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ）−Ｎｅｔ　（０）−Ａｓｐ　
（ＯＣｈｐ）−Ｐｈａ−ＮＨ，（４、５７ｇ、３．６３
ミリモル）を、ＴＥＡ（０，５１ａ　Ｑ、１当量）を含
むＤＭＦ（２５ｍΩ）中に溶解し、次いでＺ（Ｏｗｇ）
−Ｔｙｒ（Ｃ１２−Ｂｚｌ）−０Ｓｕ（２，６２ｇ、１
．２当量）及びＮＭＭ（０，４Ｏｎ＋　Ｑ、１当量）を
加え、混合物を一夜かきまぜた８生成物を、洗浄操作と
、次にＡｃ０Ｅｔを含むＤＮＦから沈殿させることによ
り精製した：収量５．２６　ｇ　（９２％）、Ｒ，１０
，６４，物理的定数と分析データは、保護された中間体
のそれらのものと共に、第２表に示されている。

（２）　　Ｚ（ＯＭｅ）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ
（Ｃ１，−Ｂｚｌ）−Ｍｅｔ（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　
（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−
Ｐｈｅ−ＮＨ，（１）　（位置２６〜３３）の製造 前記７個残基のペプチドアミドのＴＦＡで処理した試料
（４，９５ｇ、　３．１３ミリモル）を、　ＴＥＡ（０
，４３ｒｍｎ　。

１゛当量）を含むＤＭＦ（３０ｍ　Ｑ　）中に溶解し、
次にＴＩ（Ｆ（１５ｉ　Ｑ　）中のＺ（ＯＭｅ）−Ａｓ
ｐ（ＯＣｈｐ）−０Ｓｕ（ＤＣＨＡ塩２．７０　ｇ　。

１．５当量から調製〕とＮＭＭ（０，４１ｍ１２　、１
．２当量）を添加し、混合物を一夜かきまぜた。生成物
に洗浄操作を施し１次いでＡｃ０Ｅｔを含む［１ＭＦか
ら沈殿させて、精製した：収量５．２３　ｇ　（９０％
）、　Ｒ，、０，７５゜（３）　　Ｚ（ＯＭａ）−Ａｒ
ｇ（Ｍｔｓ）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ（Ｃ１，−
Ｂｚｌ）−Ｍｅｔ　（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ
）−Ｍａｔ　（０）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ−
ＮＨ。

〔１〕（位置２５〜３３）の製造 前記８個残基のペプチドアミドのＴＦＡで処理した試料
（４，７５ｇ、　２．６５ミリモル）を、ＴＥＡ（０，
３７ｍ　Ｑ　。

１当量）を含むＤＭＦ（３０ｍ　Ａ　）中に溶解し、次
いでＴＨＦ（２０ｒａ　Ｑ　）中の２（０阿ｅ）−Ａｒ
ｇ　（Ｎｔｓ）−０Ｓｕ　（ＣＨＡ塩３．２８　ｇ　。

２当量から調製）とＮＭＭ（０，３５ｍ１．１．２当量
）を加え。

混合物を一夜かきまぜた。生成物に洗浄操作を施して、
次いでＡｃ０Ｅｔを含むＤＭＦから沈殿させて精製した
：収量４．１５　ｇ　（７４％）、Ｒ，ＬＯ，７８゜（
４）　　Ｚ（ＯＭｅ）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ａｒｇ（
Ｍｔｓ）−Ａｓｐ（０（：ｈｐ）−Ｔｙｒ（ＣＩ、−Ｂ
ｚｌ）　−Ｍｅｔ　（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−（Ｍｔｓ
）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ−Ｈ
，（１）（位［２４〜３３）の製造前記９個残基のペプ
チドアミドのＴＥＡで処理した試料（４，１５ｇ、１．
９５ミリモル）をＴＥＡ（０，２７ｍ　Ｑ、１当量）を
含むＤＭＦ（４０＋＋＋　Ｑ　）中に溶解し、次いでＴ
ＩＩＦ（１５ｍ　Ｑ　）中のＺ（ＯＭｅ）−Ａｓｐ（Ｏ
Ｃｈｐ−ＯＳｕ（ＤＣＨＡ塩１．６８　ｇ　。

１゜５当量から調製とＮＭＭ（０，２６ｍ！、１．２当
量）を加え。

混合物を１８時閏かきまぜた。生成物に洗浄操作を施し
、次にＭｅＯＨを含むｆ）ＮＦから沈殿させて精製した
：収量３．５７　ｇ　（７８％）、Ｒ，１０，７０゜（
５）　　Ｚ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−１
１ｅ−５ｅｒ−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）
−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ（Ｃ１，−Ｂｚｌ）−Ｍ
ｅｔ（０）−Ｇｌｙ−丁ｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ（０）
−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈａ−ＮＨ，（位置２０〜３
３）の製造 ＤＭＦ　（４０履Ω）中のフラグメント（２）　（７，
９９ｇ、２当量）から調製したアジド体とＮＭＭ（０，
６１ｍ１２，１．２当量）とを、ＴＥＡ（０，６４履Ω
、１当りを含むＤＭＦ（３０ＩＩＩＱ）中のフラグメン
ト〔１〕のＴＦＡ処理試料（１０，７３ｇ、４．５８ミ
リモル）の水***液に加え、混合物を一夜かきまぜた。

生成物に洗浄操作を施した後、ＭｅＯＨを含むＤＭＦか
ら沈殿させて精製した：収量１１゜９９　ｇ　（８７％
）、ＲｆｌＯ，７３゜このものの物理恒数及び分析デー
タは、他の保護基を有するペプチドについての結果と共
に、第３表に示した。

（６）　　Ｚ（ＯＭｎ）−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ
−５ｅｒ（Ｂｚｌ）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ（Ｍｒｓ）−Ｉｌ
ｅ−５ａｒ−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ａｒｇ　（Ｍｔｓ
）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ（Ｃ１，−Ｂｚｌ）
−Ｍｅｔ（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｎｅｔ（
０）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈａ−ＮＨ，（位［１７
〜３３）の製造ＤＭＦ（１０ｍ　Ｑ　）中（７）７ラグ
メント（３）３．４６　ｇ　（１，５当量）から調製し
たアジド体とＮＭＭ（０，５２ｍ　Ｑ　、　１．２当量
）とを、ＴＥＡ（０，５５＋＊Ｑ　、　１当量）を含む
ＤＭＦ（３０ａ　ｍ　）中の前記１７個残基のペプチド
アミドのτＦＡ試料の氷***液に加え、混合物を一夜か
きまぜた。生成物に洗浄操作を施し、Ａｃ０Ｅｔを含む
ＤＭＦから沈殿させて精製した：収量Ｌ６４　ｇ　（６
３％′）、Ｒ，、０，７１゜（７）　　Ｚ（ＯＭａ）−
Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（Ｏ
Ｂｚｌ）−Ｐｒｏ−５ａｒ　（Ｂｚｌ）−Ｈｉｓ−Ａｒ
ｇ　（Ｍｔｓ）−ＩＩｓ−Ｓａｒ−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ
）−Ａｒｇ（Ｍｔ　ｓ　）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｔ
ｙｒ　（Ｃ１，−Ｂｚｌ）　−Ｍａｔ　（０）　−Ｇｌ
ｙ−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓｐ（ＯＣ
ｈｐ）−Ｐｈｅ−Ｎ）Ｉｓ　（位置１２〜３３）の製造 ＤＭＦ−ＤＭＳＯ−ＨＭＰＡ（１：１：１，９０ｍｆｉ
　）中のフラグメント（４）７．５７　ｇ　（４当量）
から調製したアジド体とＴＥＡ　（０，４１ｍ　ｍ　、
　１．２当量）とを、ＴＥＡ（０，３４ｍ１　、１当量
）を含むＤＭＦ（３０誼Ｑ　）中の前記１７個残基のア
ミドのＴＦ＾処理試料（８，５０ｇ、２．４３ミリモル
）の水***液に加え、混合物を４８時間かきまぜた。生
成物を５ｅｐｈａ−ｄｓｘ　ＬＨ−６０でゲルろ過し、
Ａｃ０Ｅｔを含むＤＭＦから沈殿させて精製した：収量
４．８４ｇ（４９％）。

Ｒｆ、０・７３・ （８）　　Ｚ（ＯＭｅ）−５ｅｔ（［３ｚｌ）−１１ｅ
−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（Ｚ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ａ
ｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−５ｅｒ
　（Ｂｚｌ）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｉ　１ａ−
Ｓｅｒ−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ　）−Ａｒｇ　（Ｍｔｓ）
−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ　）−Ｔｙｒ　（Ｃ１，−Ｂｚｌ
）−Ｍｅｔ　（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ）−Ｍ
ｅｔ　（０）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ−ＮＨｚ　
（位置８〜３３）の製造ＤＭＦ（２０ｇｍ　Ｑ　）中の
フラグメント〔５〕からｍ製したアジド体（２，１０ｇ
、４当量）とＴＥＡ（０，１０ｍΩ、１．２当量）を、
　ＴＥＡ（８６μＱ、１当量）を含むＤＭＦ（１０ｍ　
Ｑ　）中の前記２２個残基ペプチドアミドのＴＥＡ処理
試料（２，５３ｇ、０．６２ミリモル）の水***液に加
え、混合物を一夜かきまぜた。生成物を５ｅｐｈａｄｅ
ｘ　ＬＨ−６０でゲルろ過した後、　Ａｃ０Ｅｔを含む
ＤＭＦから沈殿させて精製した：収量１．９５　ｇ　（
６７％）、Ｒ７，０，６３゜（９）　　Ｚ（ＯＭｅ）−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ（０）−５ｅｒ（Ｂ
ｚｌ）−１１ｓ−Ｖａ　１−Ｌｙｓ　（Ｚ）−Ａ　５ｎ
−Ｌａｕ−Ｇ　ｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（ＯＢ
ｚｌ）−Ｐｒ。

−５ｅｒ　（Ｂｚｌ）−Ｈｉｓ−Ａ　ｒｇ　（Ｍ　ｔ　
ｓ）−１１ｅ−３ｅｒ−Ａ　ｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ａ　
ｒｇ（Ｍ　ｔ　５）−Ａ　ｓｐ　（ＯＣｈｐ　）−Ｔｙ
ｒ　（Ｃ１，−Ｂｚｌ　）−Ｍａｔ　（０）−Ｇ　ｌｙ
−Ｔｒｐ（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓｐ　（ＯＣ
ｈｐ）−Ｐｈｅ−Ｎｌ（、（位置５〜３３）の製造 ＤＭＦ（５ｍｆｌ）中のフラグメント〔６〕から調製し
たアジド体（０，９８ｇ、４当量）とＮＭＨＣＯ，１５
ｇｍ　Ｑ　、　４当量）とを、ＴＥＡ（４６μｆｌ、１
当量）を含むＤＭＦ（５ｍＱ）中の前記２６個残基のペ
プチドのＴＦＡ処理試料（１，５１ｇ、０．３３ミリモ
ル）の水***液に加え、混合物を一夜かきまぜた。生成
物に洗浄操作を施した後、ＭｅＯＨを含むＤＭＦから沈
殿させて精製した：収量１．４５ｇ（８６幻、Ｒｆｌｏ
、７７゜ （１０）　　Ｚ（ＯＭｇ）−ＬｙＳ（Ｚ）−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−５ａｒ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ（Ｍｔｓ）−Ｍｅｔ　（
０）−Ｓｅｔ　（Ｂｚ　ｌ　）−ｌｌ５−Ｖａ　１−Ｌ
ｙｓ　（Ｚ）−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａ　ｓｎ−Ｌ
ａｕ−Ａ　ｓｐ　（ＯＢｚｌ）−Ｐｒｏ−５ａｒ　（Ｂ
ｚｌ）−Ｈｉｓ−Ａｒｇ　（Ｍｔｓ）　−１１ｅ−５ａ
　ｒ−Ａ　ｓｐ　（ＯＣｈｐ　）−Ａ　ｒｇ　（Ｍｔ　
ｓ　）−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ　（Ｃ１゜−Ｂ
ｚｌ）−Ｍｅｔ　（０）−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍｔｓ）
−Ｍａｔ　（０）　−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）　＋Ｐｈｅ
−Ｎ）１．　（保厩されたｈＣＣＫ−３３）の製造ＤＭ
Ｆ（５＋ｏｎ）中のフラグメント〔７〕から調製したア
ジド体（０，８１ｇ、５当量）とＮＭＭ　（３８μΩ、
５当量）とを、ＴＥＡ　（３２μＱ、１当量）を含むＤ
ＭＦ（５履Ｑ）中の前記２９個残基のペプチドアミドの
ＴＦＡ処理試料（１，２０ｍｇ、０．２３ミリモル）の
水***液に加え、混合物を２４時間かきまぜた。生成物
を５ｅｐｈａｄｓｘ　ＬＨ−６０でゲルろ過し、次いで
Ａｃ０Ｅｔを含むＤＭＦから沈殿させて精製した：収量
７．６ｇ、　Ｒｆ、　０．７７゜（１１）　　）ｌ−Ｌ
ｙｓ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−３ｅｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｍｅ
ｔ−５ｅｒ−１１ｅ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−５ｓｒ−
Ｈｉｓ−Ａｒｇ−１１ａ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａ
ｓｐ−丁ｙｒ−Ｍａｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓ
ｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ，（ｈＣＣＫ−３３の遊離形）ＤＭＦ
（３＋ａＱ）中の保護されたｈｃｃに−３３（３１７＋
ｇ、５４．７マイクロモル）をフェニルチオトリメチル
シラン（３００μＱ、３０当量）で室温において６０分
間処理した後、留去により溶媒を除去し、Ａｃ０Ｅｔを
加えて粉末を得た：収量２８９ｍｇ（８９％）、　Ｒ，
ｔＯ，７２゜ｍ−クレゾール（２４４７！　Ｑ　、１３
０当量）とＥＤＴ（３８μｍ　。

２３当量）の存在下に、保護されたｈＣＣＫ−３３の還
元形（１００ｍｇ、　１７．４マイクロモル）をＴＦＡ
（５厘Ａ）中のＩＮのＴＭＳＯＴｆ−チオアニソニルで
水浴中２．５時間処理した後、乾燥エーテルを加えた。

得られた粉末を氷冷したＭｅＯＨ−Ｈ，Ｏ（１ｒｓ　Ｑ
　−２ｒａ　Ｑ　）中に溶解し、２−メルカプトエタノ
ール（２００μＱ）とＩＭのＮＨ４Ｆ（６００μＱ、３
６当量）とを加えた。溶液のｐＨをＴＥＡにより８．０
に調整した後、３０分後にｌＮＡｃＯＨで６．０に調整
した。遠心分ｍにより多少の不溶物を除いた後。

溶液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−２５（３，３Ｘ　１０５
ｃｍ）のカラムに加えＩＮのＡｃ０）ｌで溶離した。フ
ロントメインビークに相当するフラクション（各８．０
ｍｇ、管番号３０〜４４．２８０止の紫外線（ＵＶ）吸
収の測定により監視）を集め、凍結乾燥により溶媒を除
去して粉末を得た：収量６４．２ｍｇ（９５，４％）。

次に、粗粉末をＣトドリスアクリルＭ（２，ＯＸ４．２
ｃｍ）によるイオン交換クロマトグラフィーにかけ。

ｐＨ７，９のＩＭのＮＨ，ＨＣＯ，緩衝液＜２５０ｒａ
　Ｑ　）を含む混合フラスコを通しｐＨ７，９の０．２
ＭのＮＨ４ＨＣＯ３緩衝液（２５０ｍ　Ｑ　）の形成す
る線形傾斜で溶離した。メインピークに相当するフラク
ション（各８．２ａ＋ｆｉ、管番号２４〜３１．２ｇ０
ｎＩ＋＋のＵＶで監視）を集め、凍結乾燥で溶媒を除い
て羽毛状の粉末を得た：２０．１＋＊ｇ（３１，１％）
。

次の精製は５ｙｎｃｈｒｏｐａｋ　ＲＰＰカラム（４，
ＯＸ　２５ｃｍ）上の逆相１（ＰＬＣで行い、０．１％
ＴＦＡ水溶液中のＭｅＣＮの傾斜（３０分間に２５％か
ら３５幻をもって１．０ｍ＋ｆ／分の流速で溶離した。

メインピーク（第７ａ図、保持時間３７分、２８０ｎｍ
のＵＶで検出）に相当する溶離液を集め、凍結乾燥で溶
媒を除去して羽毛状の粉末を得た：収量１０．６ｍｇ　
（５３％）、〔α〕♂’−６５．７″（Ｃ＝Ｏ，ｌ、　
０．５Ｎ　Ａｃ０Ｈ）。

精製したペプチドは）ＩＰＬＣにかけ（第７ｂ図、保持
時間２７分）、ＹＭＣムＭ−３０２−ＯＤＳカラム（４
Ｘ　１５０ｍｍ）から、１％ＴＦＡ中のＭａＣＮの線形
傾斜（３０分間に４０〜４５％）により１．０ｍ１２７
分の流速で溶離したとき、唯１個のピークしか示さなか
った。

ＦＡＢ−ＭＳｓ／ｇ　：　３ｇ６４．４（Ｍ　＋　Ｈ）
”　（Ｃｚｓｖ　Ｈｚ＊＊　Ｎ５ｚＯ，！Ｓ３としての
計算値：３８６４．９）。

６Ｎの塩酸加水分解物中のアミノ酸の割合は第１表に示
したが、ＬＡＰ消化物中のアミノ酸の割合は次の通りで
ある（括弧内の数字は理論値を示す）。

Ａｓｐ　３．６２（４）、　Ｓｅｔ　４．５３（４）、
　Ｐｒｏ　１．６６（２）、　ｃｘｙ２．１３（２）、
Ａｌａ　１．１ｇ（１）、Ｖａｌ　１．１０（１）、Ｎ
ｅｔ　２．７０（３）、　Ｉｌｇ　２．２８（２）、Ｌ
ｅｕ　２．４４（２）、Ｔｙｒ　１．１２（１）、Ｐｈ
ｓ　１．００（１）、Ｌｙｓ　２．１４（２）、）ｌｉ
ｓ　１．０８（１）、　ＴｒｐＯ，９９（１）、Ａｒｇ
　３．２４（３）、Ａｓｎ及びＧｌｎは定量しなかった
（Ｐｈａの回収率７７％）。

第７図は未硫酸化ｈＣＣに−３３のＨＰＬＣＭ製の様子
を示す。

至五土夾監 １）　　ＬｙｓのＦ＋ｍｏｃｃＡｉ及びその脱保設：Ｈ
ａ　Ｏ−ＤＭＦ　（１：　９．２　ｒｍ　４ｍ　）中の
Ｈ−Ｌｙｓ−ＯＨ（１４、６ｍｇ。

０．１ミリモル）を、ＴＥＡ（５９μΩ、４当量）の存
在下にＦｍｏｃ−ＯＳｕ（１４１ｍｇ、　４当量）で６
０分間水浴中で処理した。その間に出発物質とモノＦｍ
ｏｃ誘導体（Ｒ，□０．４２）はＴＬＣでは消失し、新
たにニンヒドリン反応に陰性なスポット（Ｒｆｌｏ、６
６）が検出された。溶媒を蒸発した後、生成物を＾ｃＯ
Ｅｔまたは他の有機溶媒に溶解し、有機物相を５％クエ
ン酸、５％ＮａＨＣＯ，，およびＨ，０−ＮａＣ１で洗
い、Ｎａ、ＳＯ２上で乾燥し濃縮した。残留物を適当な
溶媒から再結晶または沈殿させて単離した。このように
して単離したジＦｍｏｃ誘導体をＤＭＦ（１ｍｍ）に溶
解し、溶液をＥＤＴ（３９μｊｌ　、　１０当量）の存
在下に、Ｔ）ＩＦ中（７）ＬＭのＢｕ４ＮＦ（１ｍｆｆ
ｉ、１０当量）で２５℃において６０分間処理した。そ
の間にＲ，１０，６６の化合物は完全にＨ−Ｌｙｓ−Ｏ
ｌｌ（Ｒ，、出発点）に転化した。

フェノールの不存在又は存在の下にＤＭＦ（２ｍｍ）中
でＺ　（ＯＭａ）−Ｔｙｒ−ＯＭｅを、同様にＦｍｏｃ
−ＯＳｕ　（４当量）とＴＥＡ（４当量）を６０分間冷
浴中で処理した。　ＴＬＣスキャナーで調べると、　Ｚ
（ＯＭａ）−Ｔｙｒ（Ｆｍｏｃ）−ＯＮｅ（Ｒ，、０，
９８）の形成はそれぞれ７．８％及び０％であった。こ
れによってフェノールの添加はＴｙｒの変性の抑制に有
効であることが判明した。同様に、２（ＯＭａ）−Ｈｉ
ｓ−ＯＭａ（０，１ミリモル）をＦｍｏｃ−ＯＳｕとＴ
ＥＡで処理したとき、Ｚ（ＯＭｅ）−Ｈｉｓ（Ｆｍｏｃ
）−ＯＭａの形成はほとんど認められなかった。

ピリジン−８０３錯体（１０当量）を含むＤＭＦ−ピリ
ジン（８：２．２ｍｍ）中のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏ
ｃ）−０Ｈ（０，１ミリモル）を２５℃で１８時間保っ
た。ＴＬＣでは何の変化もａ奈されなかった。

２）　　５ｓｒ−ＯＨの優先的ｔＢｕＰｈ、シリル化：
最初に、シリル化Ｚ　（ＯＭａ）−５ｅｒ−ＯＭａ誘導
体の安定性をピリジン−８Ｏ□錯体による処理で検査し
た。

［）ＭＦ（ＩＩ＋１り中のＺ　（ＯＭｇ）、−３ａｒ−
ＯＭｅ　（各１４ｍｇ、　０．０５ミリモル）を、イミ
ダゾール（２０当量）の存在の下に、水溶中６０分間Ｒ
−Ｃ１（ＲはＭｅ２Ｓｉ、　ｔＢｕＭａ、ＳＬ、又はｔ
ＢｕＰｈ、ＳＬ、各１０当量）で処理した。溶媒を留去
し、Ｆｉ渣をｎ−へキサンで洗った。各生成物（各６８
マイクロモル、Ｒ＝Ｍａ２Ｓｉのもの：　Ｒｆｌｏ、９
７、Ｒ＝　ｔＢｕＭｅ２Ｓｉのもの：　Ｒｆ、　０．９
９）を含むＤＭＦ−ピリジン（８：２，１ｍｍ）に溶が
し、ピリジン−ＳＯ，錯体（９４ｎ＋ｇ、　１０当ｇｋ
＞を加えた。各溶液を２５℃に保ち。

定期的にＴＬＣスキャナーで検査した。

Ｍａ２Ｓｉ化合物は３０分以内に完全に脱シリル化され
、ｔＢｕＭａ、ｓｉｉ合物は２４時間内で約１５％が脱
シリル化された。しかしｔＢｕＰｈ２Ｓｉ化合物は２４
時間後でも変化しないで残った。

次に、　Ｔｒｙ−ＯＨの存在下での５ａｒ−ＯＨの優先
的なｔＢｕＰｈ、シリル化を検査した。　Ｚ（ＯＭａ）
−５ａｒ−ＯＭｅ（０゜０５ミリモル）、Ｚ（ＯＭａ）
−Ｔｙｒ−ＯＭｅ（０，０５ミリモル）及びイミダゾー
ル（２０当量）の混合物のＤＭＦ（１＋＋ｊｌ）に溶解
したものを、フェノール化合物（各２０当量のフェノー
ル、ｍ−クレゾールとｐ−メチルチオフェノール）の不
存在又は存在の下に、４℃で４時間、ｔＢｕＰｈ、５ｉ
−ＣＩ（２０当量）で処理した。各生成物をＴＬＣスキ
ャナーで定量した。この結果を第３図に示した。

反応を２５℃で４時間行ったとき、Ｚ（ＯＭｅ）−Ｔｙ
ｓ−ＯＭｅはフェノールの不存在下で７５％がシリル化
され、フェノールの存在下で４４％がシリル化された。

３）　　Ｚ（ＯＭａ）−Ｓａｒ（ｔ−ＢｕＰｈ２Ｓｉ）
−ＯＭａのｔＢｕＰｈ２Ｓｉ基肌脱保護 ＤＭＦ（１ｍＱ）中のＺ　（ＯＭｅ）　−５ｅｔ　（ｔ
−ＢｕＰｈ、　Ｓｉ）−ＯＭａ　（３６ｍｇ、６８マイ
クロモル）を、ＥＤＴ（２０μΩ）の存在下に。

ＤＭＦ中のＩＭのＢｕ４ＮＦ（１ｒｍ　Ｑ　、　１５当
量）で２５℃、　６０分間処理した。その間に出発物質
（Ｒ，、０，９９）は完全に消失し、Ｚ（ＯＭｅ）−５
ｅｔ−ＯＮｇに相当するスポット（ＲｆＬｏ、９１）が
検出された。

４）　　Ｔｙｒ−ＯＨの硫酸化： ２０％のピリジンを含むＤＭＦ（１＋ｍｉ）中のＺ（Ｏ
Ｍａ）−Ｓｅｒ−ＯＭｅとＺ（ＯＭｅ）−Ｔｙｒ−ＯＭ
ｅ（各０．０５ミリモル）を２５℃においてそれぞれピ
リジン−８ｃ１錯体（５当量）又はＰＡＳ（１０当量）
で処理して、溶液を定期的にτＬＣスキャナーで検査し
た。その結果を第４図に示した。

Ｚ（ＯＭｅ）−Ｔｒｐ−ＯＨ，Ｚ（ＯＭｅ）−Ｍｅｔ−
ＯＨ，及びＺ（ＯＭａ）−）１ｉｓ−ＯＭｅ（各０．０
５ミリモル）を、同様にピリジン−ＳＯ，錯体又はＰＡ
Ｓで４時間処理した。前二者は変化しないで残ったが、
Ｚ　（ＯＮｓ）−Ｈｉｓ−ＯＭｅはピリジン−５ｏ３＠
＝−ニドで３２％、ＰＡＳで１８％が硫酸化された。こ
れに水を加えると（ｐＨ６，０）、硫酸化Ｈｉｓ化合物
（Ｒ，０，２１）が６０分以内に分解し、出発物質（Ｒ
，ＬＯ，６ｇ）が再生された。

５）未硫酸化ｈＣＣＫ−３３の硫酸化ｈＣＣＫ−３３へ
の転化：Ｆｍｏｃ−Ｏ３ｕ（７９ｍｇ、　３０当量）を
、ＴＥＡＣ３３ｐ　Ｑ、３０当量）を含むＤＭＦ−Ｈ２
Ｏ（９００−１００μＱ）中の未硫酸化ｈｃｃＫ−３３
（３０ｎ＋ｇ、　７．８マイクロモル）とフェノール（
２２Ｂ。

３０当量）の水***液中に加え、混合物を水浴中で２時
間かきまぜた。乾燥エーテルを加え、得られた粉末をＤ
ＭＦからエーテルで再沈殿した。このようにして得られ
たＦｍｏｃ誘導体（ＲｆｉＯ，６６）を、イミダゾール
（６，３ｉ１ｇ、１２０当量）及びフェノール（８８ｍ
ｇ、１２０当量）と共に、　ＤＭＦ（２ｍＱ）中に溶解
した後。

ｔＢｕＰｈ、５ｉ−Ｃ１（２１６ｐ　Ｑ、１２０当１Ｊ
ｋ）を加え、溶液を４℃で１４時間かきまぜた。エーテ
ルを加え、得られた粉末をＤＭＦからエーテルで再沈殿
した。生成物（Ｒｆ、０．７７）を５ｅｐｈａｄｅｘ　
ＬＨ−２０（４Ｘ４７ｃｍ）でゲルろ過しＤＭＦで溶離
して精製した。所望のフラクション（各９．２ｍＱ、背
番号２１〜２９，２８０ｎｍのＵＶ吸収で監視、他の精
製の場合も同じ）を−緒にし、溶媒を蒸発によって除い
た。

残渣を２０％のピリジンを含むＤＭＦ（１ｍＱ）に溶解
した後、ＥＤＴ（２２μ２．３０当量）とピリジン−Ｓ
Ｏ，錯体（１２４ｍｇ、　１００当量）を加え、混合物
を２５℃で２４時間かきまぜた。前記したように、溶液
を５ｅｐｈａｄａｘＬＨ−２０のカラム（４Ｘ４７ｃｍ
）に加えＤＭＦで溶離した。

所望のフラクション（背番号２０〜２４）を合わせ、溶
液を濃縮した（約１＋＋＋ｆｌに）、この溶液をＥＤＴ
（２２μ悲、３０当量）の存在下に、ＤＭＦ（１，Ｏｍ
　Ｑ　）中のＩＮのＢｕ４ＮＦ（Ｌ、Ｏｎ＋　Ｑ　）で
水浴中６０分間１次いで室温で６０分間処理した。氷で
冷却しつつＩＭのＮＨ，ＨＣＯ。

（４ｒａ　ｆｌ　）を加え、少量の不溶物質を遠心分離
で除いた。上澄液を５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−１０のカラ
ム（２，４Ｘ４９ｃｍ）に加え、ＬＭのＮＨ４ＨＣＯ，
緩衝液（ｐＨ８，２）で溶離した。フロントメインビー
クに相当するフラクション（各７．８ｍＱ、背番号１１
〜１７）を合わせ、凍結乾燥を繰返して塩と共に溶媒を
除いて色粉末を得た：収量１９．２ｍｇ（６３，９％）
。

次に粗試料を、　ＣＭ−トリスアクリルＭ（１，６Ｘ４
．５ｃｍ）によるイオン交換クロマジグラフイーにかけ
、０．０ｉＭのＮＨ，）ＩｃＯ，緩衝液（ＰＨ７，８，
３００ｍ　Ｑ　）を含む混合フラスコを通る０、２Ｍの
ＮＨ，ＨＣＯ，緩衝液（ＰＨ８，４゜５００ｍ　Ｑ　）
で形成されるグラジェントで傾斜溶離した。第二のピー
ク（第８ａ［ｌ）に相当するフラクション（各７．８１
１１１２、背番号２１〜２９）を合すせ、溶媒と塩を凍
結乾燥を繰返して除き粉末を得た：収ｆニア、５履ｇ（
３９，１％、総合収率２５．０％）。

ここに得られた生成物を、Ａｓａｈｉｐａｋ　００５−
５０のカラム（１０Ｘ　２５０＋＋＋＋ｍ）によるＨＰ
ＬＣを行い、毎分２ｍｆｆ１の流速の０．ＩＮＡＣＯＮ
Ｈ４（Ｐ　Ｈ６，５）中の３１％ＭｅＣＮ溶液によるア
イソクラチックエル−ジョンで、さらに精製した。所望
の溶出液（第８ｂ図、保持時間４２分）を集め、溶媒を
凍結乾燥で除いて白色のふわふわした粉末を得た：収量
４．１ａｇ（６１％、未硫酸化ｈＣＣＫ−３３を基準と
する総合収率１５％）、シリル化を２５℃で３時間行っ
たときは、同様の精製後の収率は１３％であった。〔α
〕も１−７２．７＠（Ｃ＝０．１．　Ｈ，０）、Ｒｆ！
０．４２．　Ａｓａｈｉ　Ｐａｋ　ＯＤＰ−５０（４Ｘ
１５０ｍａ＋）から０．ＩＮのＡｃ０ＮＨ，（ｐＨ７，
８）中のＭｅＣＮの傾斜（３０分間に２０〜４０％）を
用い１ｍ０７分の流速で溶離した場合（第８ｃ図）のＨ
ＰＬＣの保持時間は１４分であった。６ＮＨＣ１加水分
解生成物中のアミノ酸組成は第１表に示したが、ＬＡＰ
消化物中のアミノ酸組成（括弧の中の数字は理論値）は
次の通りであった。　Ａｓｐ　３．４９（４）、５ｅｒ
４．２２（４）、　Ｐｒｏ　１．５０（２）、Ｇｌｙ　
２．１２（２）、Ａｌａ　１．１３（１）、Ｖａｌ　　
１．１４（１）、Ｍｅｔ　　２．９２（３）、Ｉｌｅ　
　１．９６（２）。

Ｌａｕ　　２．０７（２）、Ｔｙｒ（Ｓｏ、Ｈ）０．９
１（１）、Ｐｈｅ　１．００（１）、Ｌｙｓ　２．００
（２）、Ｈｉｓ　Ｏ，９２（１）、　Ｔｒｐ　Ｏ，９６
（１）、　Ａｒｇ２．８７（３）、　ＡｓｎとＧｉｎは
検出されなかった（Ｐｈａの回収率８１％）、　Ａｓｐ
−Ｐｒｏ結合は用いられたＬＡＰの作用に抵抗した。

【図面の簡単な説明】

第１図は保護基を有するヒトコレシストキニン（ｈＣＣ
Ｋ−３３）を合成する説明図、第２図は保護基を有する
Ｃ末端デカペプチドアミドを合成する説明図、第３図は
ＳｅｒおよびＴｙｒのｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリ
ル化を示すグラフ、第４図はＤＭＦ−ピリジン中でのピ
リジン−３ｏ、　錯体又はアセチル硫酸ピリジニウムに
よるＺ　（ＯＭｅ）−Ｔｙｒ−ＯＭｅおよびＺ　（ＯＭ
ｅ）−３ａｒ−ＯＭｅの硫酸化を示すグラフ、第５図は
末硫酸化ｈｃＣＫ−３３を硫酸化ｈＣＣＫ−３３に転化
する説明図、第６図は継電された犬におけるＣＣＫ−ペ
プチドに応答したすい臓のタンパク質放出増を示すグラ
フ、第７図は末硫酸化ｈＣＣＫ−３３のＨＰＬＣ精製に
おけるイオン交換クロマトグラフィーのチャート、第８
図は硫酸化ｈＣＣＫ−３３のＣＭおよびＨＰＬＣ′＃ｌ
製におけるイオン交換クロマトグラフィーのチャートで
ある。 硫酸昨匹肚翌 望、Ｈ ２（ＯＭｓ）　−Ａｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ａｒｇ　（Ｍ
ｔｓ）　−Ａ　ｓｐ　（ＯＣｈｐ）−Ｔｙｒ　（Ｃ１，
−Ｂｚｌ）−Ｍｅｔ　（０）　−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ　（Ｍ
ｔｓ）−Ｍｅｔ　（０）−Ａｓｐ（ＯＣｈｐ）−Ｐｈｅ
−ＮＨ。 図面の浄書（内容に変更なり、） 第３図 ＢｕＰｈ２Ｓｉ−５ｅｒ　　　ＢｕＰｈ２Ｓｉ−Ｔｙｒ
なし　　　−〇−−・− フェノール　　−〇−＋ ｍ・クレゾール−６−−去− ｔ−ＢｕＰｈ２Ｓｉ化度 時間 芽　４　図 二：Ｚ　　　　ｔ；、ｒ−ｓｏ３ン＋＝＞３　　Ｚ（ｃ
ｍ−５ｅｒ−ｕｓｅ　　９吋＜７２＝＝　　　　　＝−
ｓｏ、　　）＋＝、に！　　　ｚｃｏｍ）−ｒｙｒ−ｒ
ｙｅ　　ｓｌｓ’ｉｒａ’ｊイｂＦｒｎｏｃ−（２Ｌｙ
ｓ（Ｆｍｏｃ））ｈｃｃＸ−３３Ｆｍｏｃ−（２Ｌｙｓ
（Ｆｍｏｃ）−４Ｓｅｒ（ｔＢｕＰｈ、５ｉ））ｈＣＣ
Ｋ−３３Ｆ＋＋＋ｏｅ−（２Ｌｙｓ　（Ｆｍｏｃ）−４
Ｓｅｒ　（ｔＢｕＰｈ、　Ｓｉ　）−Ｔｙｒ　（Ｓｏ、
　Ｈ）　）　ｈＣＣＫ−３３通信北遅々ヒ垣 埠　Ｇ　匡 一１１ヌｔｔ （情令／＋ｏ治） １９毛ｉ（こ（ピコモｌし／ｋａ） 纂７図 自） ａ）シンクロバックＲＰ−Ｐでの ＣＭ精製試料 ｂ）ＹＭＣＡＭ−３０２０ＤＳでの ＨＰＬＣ絹製試料 昭和６３年７月６日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＴｙｒとＳｅｒおよび／またはＴｈｒ残基を有する
   出発物質としてのポリペプチドのアミノ基を塩基性条件
   下において脱離可能なアミノ保護基で保護し、Ｓｅｒお
   よび／またはＴｈｒのＯＨ基をマスキングした後、脱保
   護してＴｙｒのＯＨ基を選択的に硫酸化することを特徴
   とするポリペプチドの製造方法。 ２、出発物質としてのポリペプチドが、式 【遺伝子配列があります】 で表わされるヒトコレシストキニン（ｈＣＣＫ−３３）
   の未硫酸化形である請求項１記載のポリペプチドの製造
   方法。 ３、脱離可能なアミノ保護基が、９−フルオレニルメチ
   ルオキシカーボニル基（Ｆｍｏｃ）である請求項１記載
   のポリペプチドの製造方法。 ４、Ｓｅｒおよび／またはＴｈｒのＯＨ基を、ターシャ
   リブチルジフェニルシリル基（ｔＢｕＰｈ＿２Ｓｉ）で
   マスキングする請求項１記載のポリペプチドの製造方法
   。 ５、脱保護が、トリメチルシリルトリフルオロメタンス
   ルホネート（ＴＭＳＯＴｆ）含有試薬で行われる請求項
   １記載のポリペプチドの製造方法。