JPH01246300A - 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 - Google Patents
活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
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Description
本発明は、活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプ
ターの精製方法に関するものである。
ターの精製方法に関するものである。
精製された心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター(
以下へNP)は、例えば次のような目的に利用される。 ■ ^NPレセプターの構造解析を行い、レセプターの
機能発現部位及びその機能発現に影響を及ぼすレセプタ
ーの他の部位の構造を解明し、その知見をもとに^NP
あるいは^NPと類似の生物学的活性を示す物質、又は
これらの示す生物学的活性を阻害する物質を天然より探
索又は人工的に合成すること。 ■ 構造解析の結果をもとに相補的DNAを調整し、細
菌及び動物細胞等の適当な発現系を用いて、^NPレセ
プターを大量に製造すること。 ■ へHPレセプターの免疫学的定量又は定性等に必要
な抗体の調整に用いること。 ■ 八NPとの特異的親和性を利用し、^NPの定量又
は定性等に用いること。 そして、^NPは主として心臓の心房で産生され、血流
にのって様々な標的器官に運ばれ、^NPレセプターを
介して各種の作用を発揮する。 これまでに確認された^NPの活性は、次の通りである
。 ■ 腎臓において糸球体細胞のろ過tll能を昂進し、
利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において尿細管に働き、利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において傍系球体細胞に働き、昇圧酵素レニン
の分泌を抑制する。 ■ 血管において平滑筋細胞に働き、血管を拡張させる
。 ■ 副腎皮質において働き、ナトリウム貯留ホルモンと
して知られているアルドステロンの分泌を抑制する。 ■ 脳下垂体において働き、抗利尿ホルモンとして知ら
れているバソプレッシンの分泌を抑制する。 ■ 脳内において働き、飲水行動を抑制する。 ■ この他、眼圧の調整、及び肺、卵巣、腸管、脈絡最
における水代謝に関与していると推定される。 又、へNPレセプターの働きは次の通りである。 免疫組織学的及びl−125でvA識した八HPを用い
たオートラジオグラフィー等によって、へNPレセプタ
ーは、肺、腎臓、副腎、血管及び中枢脳神経系等を構成
する細胞の細胞膜上に多く存在することが判った。 心房で産生され、血流によって運ばれた八NPはへHP
レセプターと特異的に結合する。八NPがへHPレセプ
ターに結合すると、その刺激が同じ細胞膜中にあってへ
HPレセプターと強く結合しているグアニレートシクラ
ーゼ(cGMP合成酵素)に伝えられる。 その結果、細胞中のe G M P濃度が上昇し、これ
がセカンドメツセンジャーとなって八NPの刺激を細胞
内に伝え、利尿及び血管拡張などの最終的な応答がひき
起こされる。 尚、細胞内に取り込まれた^NPと^NPレセプターは
ライソゾームに運ばれ分解される。 そして、^HPレセプターのように細胞膜に組み込まれ
た物質を精製する場合、目的の物質を人為的に細胞膜か
ら可溶化する必要がある。 しかし、可溶化の際に変性が起こり、目的物質が本来持
っている性質を消失してしまう。 従って、変性していないへHPレセプターを精製した場
合、細胞表層から単離されたへNPレセプター標品も、
細胞表層に存在するへNPレセプターと同様の特性を有
していることが保証されている必要がある。 ^HPレセプターの精製に関する最初の文献はTheJ
ournal of Biologieal C
hemistry Vol、262.5510−55
14(1987)であるが、この文献に開示されている
方法で単離精製されたへNPレセプターは八NPとの結
合能を失っていた。
以下へNP)は、例えば次のような目的に利用される。 ■ ^NPレセプターの構造解析を行い、レセプターの
機能発現部位及びその機能発現に影響を及ぼすレセプタ
ーの他の部位の構造を解明し、その知見をもとに^NP
あるいは^NPと類似の生物学的活性を示す物質、又は
これらの示す生物学的活性を阻害する物質を天然より探
索又は人工的に合成すること。 ■ 構造解析の結果をもとに相補的DNAを調整し、細
菌及び動物細胞等の適当な発現系を用いて、^NPレセ
プターを大量に製造すること。 ■ へHPレセプターの免疫学的定量又は定性等に必要
な抗体の調整に用いること。 ■ 八NPとの特異的親和性を利用し、^NPの定量又
は定性等に用いること。 そして、^NPは主として心臓の心房で産生され、血流
にのって様々な標的器官に運ばれ、^NPレセプターを
介して各種の作用を発揮する。 これまでに確認された^NPの活性は、次の通りである
。 ■ 腎臓において糸球体細胞のろ過tll能を昂進し、
利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において尿細管に働き、利尿作用を発揮する。 ■ 腎臓において傍系球体細胞に働き、昇圧酵素レニン
の分泌を抑制する。 ■ 血管において平滑筋細胞に働き、血管を拡張させる
。 ■ 副腎皮質において働き、ナトリウム貯留ホルモンと
して知られているアルドステロンの分泌を抑制する。 ■ 脳下垂体において働き、抗利尿ホルモンとして知ら
れているバソプレッシンの分泌を抑制する。 ■ 脳内において働き、飲水行動を抑制する。 ■ この他、眼圧の調整、及び肺、卵巣、腸管、脈絡最
における水代謝に関与していると推定される。 又、へNPレセプターの働きは次の通りである。 免疫組織学的及びl−125でvA識した八HPを用い
たオートラジオグラフィー等によって、へNPレセプタ
ーは、肺、腎臓、副腎、血管及び中枢脳神経系等を構成
する細胞の細胞膜上に多く存在することが判った。 心房で産生され、血流によって運ばれた八NPはへHP
レセプターと特異的に結合する。八NPがへHPレセプ
ターに結合すると、その刺激が同じ細胞膜中にあってへ
HPレセプターと強く結合しているグアニレートシクラ
ーゼ(cGMP合成酵素)に伝えられる。 その結果、細胞中のe G M P濃度が上昇し、これ
がセカンドメツセンジャーとなって八NPの刺激を細胞
内に伝え、利尿及び血管拡張などの最終的な応答がひき
起こされる。 尚、細胞内に取り込まれた^NPと^NPレセプターは
ライソゾームに運ばれ分解される。 そして、^HPレセプターのように細胞膜に組み込まれ
た物質を精製する場合、目的の物質を人為的に細胞膜か
ら可溶化する必要がある。 しかし、可溶化の際に変性が起こり、目的物質が本来持
っている性質を消失してしまう。 従って、変性していないへHPレセプターを精製した場
合、細胞表層から単離されたへNPレセプター標品も、
細胞表層に存在するへNPレセプターと同様の特性を有
していることが保証されている必要がある。 ^HPレセプターの精製に関する最初の文献はTheJ
ournal of Biologieal C
hemistry Vol、262.5510−55
14(1987)であるが、この文献に開示されている
方法で単離精製されたへNPレセプターは八NPとの結
合能を失っていた。
本発明者は、^HPレセプターの構造とi能に関する研
究を重ねた結果、前記Tbe Journal orB
iological Chemistryに開示された
精製方法によって得られたへHPレセプターの失活原因
は、精製の過程におけるアフィニティークロマトグラフ
ィーに用いた溶出液中の成分であるドデシル硫酸ナトリ
ウムにあることを見出した。 そこで、種々の溶出試薬について詳細な検討を行なった
結果、ドデシル硫酸ナトリウムを用いず、その代りに非
イオン性又は両性の界面活性剤を用いて行えば、へNP
レセプターとしての基本的な活性を保証された原品の特
異的な単離精製が可能であることを見出した。 すなわち、本発明は、八HPと^NPレセプターとが結
合した複合物を、錯化剤、一価の金属塩、非イオン性及
び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少なくとも一
種以上の界面活性剤を含むpH約6以下の溶液で処理し
、^HPに結合しているへHPレセプターを溶出する活
性なへNPレセプターの精製方法を提供するものである
。 尚、上記の活性なへNPレセプターの精製方法において
、界面活性剤の濃度は約0.1〜2%であることが望ま
しく、又、一価の金属塩の濃度は約0.1〜1モル/l
であることが望ましく、又、錯化剤の濃度は約1〜50
ミリモル/lであることが望ましい。 尚、一価の金属塩としては例えばNaCI、KCI等が
あり、又、錯化剤としては例えばエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム等がある。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、複合物は、動物の組織及び/又は動物の組織由来の細
胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ば
れる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で
処理して^NPレセプターを抽出し、その後^HPとの
反応により得られる。 特に、この複合物は、動物の組織及び/又は動物の組織
由来の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中
から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有す
る溶液で処理して^NPレセプターを抽出し、この抽出
物を塩析し、例えばこの抽出物に硫酸塩を添加して該硫
酸塩濃度が約25〜70%の範囲で沈澱するものを集め
、これと固定化へHPとの反応により得られたもの、あ
るいは動物の組織及び/又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
てへNPレセプターを抽出し、この抽出物を有機溶媒で
分画処理し、その後固定化へNPとの反応により得られ
たもの、さらには動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理してへNPレセプターを抽出し、この抽出物に
塩析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処
理を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い
、その後固定化へHPとの反応により得られたものが望
ましい。 尚、この塩析又は有機溶媒による分画を行う理由は、ア
フィニティークロマトグラフィーによる精製に先立ち、
^NPレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を除
き、精製の効率を上げる為である。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれ
る界面活性剤による^NPレセプターの抽出処理後、塩
析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処理
を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い、
その後固定化へNPとの反応を行なわせて複合物を得る
のが望ましいのは、塩析又は有機溶媒による分画によっ
てへHPレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を
除去し、アフィニティークロマトグラフィーによる精製
の効率を上げ、そして透析によって固定化へHPとへH
Pレセプターとの反応を妨げる硫酸塩又は有機溶媒を取
り除く為である。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、非イオン性又は両性の界面活性剤としては、例えばポ
リオキシエチレンエーテル、3−[(3−コラミドプロ
ピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルフォ
ネイト、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルア
ンモニオ]−2−ヒドロキシループロバンスルフォネイ
ト、ルブロールPX、オクチルフェノール−エチレンオ
キシドコンデンセイト、ポリオキシエチレンソルビタン
、n−オクチル−β−D−グルコシド等がある。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、動物は、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウシ、
ヒツジ、及びヤギの群の中から少なくとも一種以上のも
のを選ぶことができる。 又、上記の活性なへHPレセプターの精製方法において
、動物の組織は、動物の肺臓及び腎臓の群の中から少な
くとも一種以上のものを選ぶことができる。 又、上記の活性な^HPレセプターの精製方法において
、動物の組織由来の細胞は動物の血管内皮細胞を選ぶこ
とができる。 又、上記の活性な^HPレセプターの精製方法において
、動物の組織及び/又は動物の組織由来の細胞を非イオ
ン性及び両性の界面活性剤の中から選ばれる少なくとも
一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理してへNP
レセプターを抽出するに際して、該界面活性剤の濃度は
約0.1〜2%とすることが望ましい。 これは、へHPレセプターは脂質に富む細胞膜中に埋め
込まれた形態で存在しており、このへHPレセプターの
生物学的活性を保持したまま脂質とへHPレセプターの
結合を解き、かつ遊離したへMl’レセプターの自己凝
集を防ぐ為には、界面活性剤をこの範囲の濃度で用いる
ことが望ましい結果を呈したからである。 又、この抽出工程において、該界面活性剤含有溶液のp
iは約6〜8であることが望ましい。 これは、^NPレセプターの生物学的活性がpH約6〜
8で最も安定であったからによる。 尚、上記した本発明の精製法を用いて得られたへNPレ
セプターは、次のような特性を有していた。 ■ 構造; 主として分子量約7万のサブユニ・ソト
が2個、ジスルフィド結合でつながった二量体の$1蛋
白質(分子量約14万)であるが、単量体としても若干
(例えば3%以下)存在し、両者とも活性を有する。 又、N末端のアミノ酸配列の解析の結果は、レセプター
が2つの同じサブユニットから構成されていることを強
く示唆している。 ■ 活性; 第1図に示す如く、生理的条件下でへNP
レセプターが示す活性を確実に有する。 八HPとの結合の特異性は極めて高く、第2図に示すよ
うに^NP類似物質、例えばアトリオペプチン■に比べ
て約100倍である。 ■ 安定性; ^NPレセプターと八NPとの結合は、
第3図に示される如<、pH約6.5〜10において安
定に形成される。 ^NPレセプターは溶液の場合、第4図に示される如く
、4℃で10週間以上、又、室温で少なくとも5週間安
定である。 さらに、へNPレセプターを凍結乾燥しても活性は失わ
れない。
究を重ねた結果、前記Tbe Journal orB
iological Chemistryに開示された
精製方法によって得られたへHPレセプターの失活原因
は、精製の過程におけるアフィニティークロマトグラフ
ィーに用いた溶出液中の成分であるドデシル硫酸ナトリ
ウムにあることを見出した。 そこで、種々の溶出試薬について詳細な検討を行なった
結果、ドデシル硫酸ナトリウムを用いず、その代りに非
イオン性又は両性の界面活性剤を用いて行えば、へNP
レセプターとしての基本的な活性を保証された原品の特
異的な単離精製が可能であることを見出した。 すなわち、本発明は、八HPと^NPレセプターとが結
合した複合物を、錯化剤、一価の金属塩、非イオン性及
び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少なくとも一
種以上の界面活性剤を含むpH約6以下の溶液で処理し
、^HPに結合しているへHPレセプターを溶出する活
性なへNPレセプターの精製方法を提供するものである
。 尚、上記の活性なへNPレセプターの精製方法において
、界面活性剤の濃度は約0.1〜2%であることが望ま
しく、又、一価の金属塩の濃度は約0.1〜1モル/l
であることが望ましく、又、錯化剤の濃度は約1〜50
ミリモル/lであることが望ましい。 尚、一価の金属塩としては例えばNaCI、KCI等が
あり、又、錯化剤としては例えばエチレンジアミン四酢
酸ナトリウム等がある。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、複合物は、動物の組織及び/又は動物の組織由来の細
胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ば
れる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で
処理して^NPレセプターを抽出し、その後^HPとの
反応により得られる。 特に、この複合物は、動物の組織及び/又は動物の組織
由来の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中
から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有す
る溶液で処理して^NPレセプターを抽出し、この抽出
物を塩析し、例えばこの抽出物に硫酸塩を添加して該硫
酸塩濃度が約25〜70%の範囲で沈澱するものを集め
、これと固定化へHPとの反応により得られたもの、あ
るいは動物の組織及び/又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
てへNPレセプターを抽出し、この抽出物を有機溶媒で
分画処理し、その後固定化へNPとの反応により得られ
たもの、さらには動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理してへNPレセプターを抽出し、この抽出物に
塩析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処
理を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い
、その後固定化へHPとの反応により得られたものが望
ましい。 尚、この塩析又は有機溶媒による分画を行う理由は、ア
フィニティークロマトグラフィーによる精製に先立ち、
^NPレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を除
き、精製の効率を上げる為である。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれ
る界面活性剤による^NPレセプターの抽出処理後、塩
析又は有機溶媒による分画操作を加え、その後遠心処理
を施して夾雑物を除去した上清に対し透析処理を行い、
その後固定化へNPとの反応を行なわせて複合物を得る
のが望ましいのは、塩析又は有機溶媒による分画によっ
てへHPレセプターの活性を保持したまま夾雑蛋白質を
除去し、アフィニティークロマトグラフィーによる精製
の効率を上げ、そして透析によって固定化へHPとへH
Pレセプターとの反応を妨げる硫酸塩又は有機溶媒を取
り除く為である。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、非イオン性又は両性の界面活性剤としては、例えばポ
リオキシエチレンエーテル、3−[(3−コラミドプロ
ピル)−ジメチルアンモニオ]−1−プロパンスルフォ
ネイト、3−[(3−コラミドプロピル)−ジメチルア
ンモニオ]−2−ヒドロキシループロバンスルフォネイ
ト、ルブロールPX、オクチルフェノール−エチレンオ
キシドコンデンセイト、ポリオキシエチレンソルビタン
、n−オクチル−β−D−グルコシド等がある。 又、上記の活性な^NPレセプターの精製方法において
、動物は、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウシ、
ヒツジ、及びヤギの群の中から少なくとも一種以上のも
のを選ぶことができる。 又、上記の活性なへHPレセプターの精製方法において
、動物の組織は、動物の肺臓及び腎臓の群の中から少な
くとも一種以上のものを選ぶことができる。 又、上記の活性な^HPレセプターの精製方法において
、動物の組織由来の細胞は動物の血管内皮細胞を選ぶこ
とができる。 又、上記の活性な^HPレセプターの精製方法において
、動物の組織及び/又は動物の組織由来の細胞を非イオ
ン性及び両性の界面活性剤の中から選ばれる少なくとも
一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理してへNP
レセプターを抽出するに際して、該界面活性剤の濃度は
約0.1〜2%とすることが望ましい。 これは、へHPレセプターは脂質に富む細胞膜中に埋め
込まれた形態で存在しており、このへHPレセプターの
生物学的活性を保持したまま脂質とへHPレセプターの
結合を解き、かつ遊離したへMl’レセプターの自己凝
集を防ぐ為には、界面活性剤をこの範囲の濃度で用いる
ことが望ましい結果を呈したからである。 又、この抽出工程において、該界面活性剤含有溶液のp
iは約6〜8であることが望ましい。 これは、^NPレセプターの生物学的活性がpH約6〜
8で最も安定であったからによる。 尚、上記した本発明の精製法を用いて得られたへNPレ
セプターは、次のような特性を有していた。 ■ 構造; 主として分子量約7万のサブユニ・ソト
が2個、ジスルフィド結合でつながった二量体の$1蛋
白質(分子量約14万)であるが、単量体としても若干
(例えば3%以下)存在し、両者とも活性を有する。 又、N末端のアミノ酸配列の解析の結果は、レセプター
が2つの同じサブユニットから構成されていることを強
く示唆している。 ■ 活性; 第1図に示す如く、生理的条件下でへNP
レセプターが示す活性を確実に有する。 八HPとの結合の特異性は極めて高く、第2図に示すよ
うに^NP類似物質、例えばアトリオペプチン■に比べ
て約100倍である。 ■ 安定性; ^NPレセプターと八NPとの結合は、
第3図に示される如<、pH約6.5〜10において安
定に形成される。 ^NPレセプターは溶液の場合、第4図に示される如く
、4℃で10週間以上、又、室温で少なくとも5週間安
定である。 さらに、へNPレセプターを凍結乾燥しても活性は失わ
れない。
【実施例1】
[へNPレセプター■抽出画分の調製35倍溶液の1m
M炭酸ナトリウム溶液al18.3(5mMエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム(EDT^)、5μg/m1ロ
イペプチン、5μg/mlペプスタチン及び0.5Jフ
エニルメチルスルフオニルフルオロライド(+’MSF
)含有、以下ホモジナイズ溶液)中で、新鮮なウシ肺組
織1にgをワーリングブレンダーを用いて細切、懸濁し
た。 この懸濁液を5,0OOx Bで30分間遠心して得た
沈渣を同量のホモジナイズ溶液に懸濁し、再び5,0O
Oxgで30分間遠心した。 同様の操作を3回縁り返して得た沈渣を1、 II 7
、4の生理的リン酸lJ!街液(以下PBS>に10
糟HのEDT^、5μg/+elのロイペプチン、5μ
g/+slのペプスタン及び0.5mMのPMSFを含
有させた溶液に懸濁し。 5、OOOXgで30分間遠心した。 この沈渣を0.5%のトリトンX−100,5μ8/論
1のロイペプチン、5μg/mlのペプスタチン及び0
.5mMのPt4SFを含有する41のPBS中に1夜
懸濁した後、10.0OOx gで30分間遠心し、上
清を得た。 次に、この上清を一定の速度で撹拌しつつ、固形の硫酸
アンモニウムを濃度25%となるまでゆるやかに加えて
よく溶解し、さらに1時間撹拌を続けた後、10,0O
Oxgで30分間遠心し、上清を得た。 次いで、この上清に対し前記と同様に濃度70%となる
まで硫酸アンモニウムを加え、さらに1時間撹拌を続け
た後、10,0OOx gで30分間遠心し、沈渣を得
た。 以上の操作を5回繰り返し、5Kgのウシ肺組織(■抽
出画分として201)から得た沈渣を、約21のPBS
(さらに0.5%トリトンX−100,10mM ED
T^、0.5μ[1/IIIロイペプチン、0.5μg
/mlペプスタチン及び0.0511Mr’MsF含有
)に溶解し、同じP[1S40fに対し透析した後、0
.5μH/mlロイペプチン、0.5Mg/彌1ペプス
タチン及び0.5J PMSFを加え、35,000x
gで60分間遠心し、上清Z1を得た。 [へNPレセプターの精製] ゲルろ適用アクリルアミドゲルカラム(1,5X6e+
*)を前置した^NP固定化ゲルろ適用アクリルアミド
ゲルカラム(1,Ox 2.5cm)を0.2%トリト
ンX−1o。 を含むPBSで平衡化し、15〜25℃において351
/時間の流速で前記の操作により得たへNPレセプター
■抽出画分をカラム内に導入した。 前置カラムを除去後、へHP固定化カラムを次に示す溶
液各々1001ずつで洗滌した。 i ) PBS(サラ(CO,2% トリドア X−1
00,5,uB/mlOイベブチン、5μ[1/ II
Iペプスタチン及び0.5mHPMSF含有) ii ) 10mM 1lepes pH7,4(さら
に5翰M EDT^、0.5HNaCI及び0.5%ト
リトンX−100含有)iii ) 10+eM l1
epes pH7,4(さらに5mM EDT^及び0
.1%CII A P S含有) 次いで、0.1mM酢酸ナトリウムM、衝液pH5,0
(さらに5mMEDT^、0.5M NaC1及び0.
2%ルブロールPX含有)により、流速を1.5ml/
時間に減じて溶出を行ない、溶出液を3隋1ずつ分取し
た。 へNPレセプター画分は波長280nmの紫外線の吸収
により確認した。 又、へNPレセプター画分は限外ろ過により濃縮した。 以上の操作により得たへNPレセプターは120μgで
あり、そしてこれは活性なものであった。
M炭酸ナトリウム溶液al18.3(5mMエチレンジ
アミン四酢酸ナトリウム(EDT^)、5μg/m1ロ
イペプチン、5μg/mlペプスタチン及び0.5Jフ
エニルメチルスルフオニルフルオロライド(+’MSF
)含有、以下ホモジナイズ溶液)中で、新鮮なウシ肺組
織1にgをワーリングブレンダーを用いて細切、懸濁し
た。 この懸濁液を5,0OOx Bで30分間遠心して得た
沈渣を同量のホモジナイズ溶液に懸濁し、再び5,0O
Oxgで30分間遠心した。 同様の操作を3回縁り返して得た沈渣を1、 II 7
、4の生理的リン酸lJ!街液(以下PBS>に10
糟HのEDT^、5μg/+elのロイペプチン、5μ
g/+slのペプスタン及び0.5mMのPMSFを含
有させた溶液に懸濁し。 5、OOOXgで30分間遠心した。 この沈渣を0.5%のトリトンX−100,5μ8/論
1のロイペプチン、5μg/mlのペプスタチン及び0
.5mMのPt4SFを含有する41のPBS中に1夜
懸濁した後、10.0OOx gで30分間遠心し、上
清を得た。 次に、この上清を一定の速度で撹拌しつつ、固形の硫酸
アンモニウムを濃度25%となるまでゆるやかに加えて
よく溶解し、さらに1時間撹拌を続けた後、10,0O
Oxgで30分間遠心し、上清を得た。 次いで、この上清に対し前記と同様に濃度70%となる
まで硫酸アンモニウムを加え、さらに1時間撹拌を続け
た後、10,0OOx gで30分間遠心し、沈渣を得
た。 以上の操作を5回繰り返し、5Kgのウシ肺組織(■抽
出画分として201)から得た沈渣を、約21のPBS
(さらに0.5%トリトンX−100,10mM ED
T^、0.5μ[1/IIIロイペプチン、0.5μg
/mlペプスタチン及び0.0511Mr’MsF含有
)に溶解し、同じP[1S40fに対し透析した後、0
.5μH/mlロイペプチン、0.5Mg/彌1ペプス
タチン及び0.5J PMSFを加え、35,000x
gで60分間遠心し、上清Z1を得た。 [へNPレセプターの精製] ゲルろ適用アクリルアミドゲルカラム(1,5X6e+
*)を前置した^NP固定化ゲルろ適用アクリルアミド
ゲルカラム(1,Ox 2.5cm)を0.2%トリト
ンX−1o。 を含むPBSで平衡化し、15〜25℃において351
/時間の流速で前記の操作により得たへNPレセプター
■抽出画分をカラム内に導入した。 前置カラムを除去後、へHP固定化カラムを次に示す溶
液各々1001ずつで洗滌した。 i ) PBS(サラ(CO,2% トリドア X−1
00,5,uB/mlOイベブチン、5μ[1/ II
Iペプスタチン及び0.5mHPMSF含有) ii ) 10mM 1lepes pH7,4(さら
に5翰M EDT^、0.5HNaCI及び0.5%ト
リトンX−100含有)iii ) 10+eM l1
epes pH7,4(さらに5mM EDT^及び0
.1%CII A P S含有) 次いで、0.1mM酢酸ナトリウムM、衝液pH5,0
(さらに5mMEDT^、0.5M NaC1及び0.
2%ルブロールPX含有)により、流速を1.5ml/
時間に減じて溶出を行ない、溶出液を3隋1ずつ分取し
た。 へNPレセプター画分は波長280nmの紫外線の吸収
により確認した。 又、へNPレセプター画分は限外ろ過により濃縮した。 以上の操作により得たへNPレセプターは120μgで
あり、そしてこれは活性なものであった。
【実施例2】
実施例1において、[^HPレセプター■抽出画分の調
整]過程で行なった塩析処理の代りに、有機溶媒(例え
ばアセトン40%)による分画操作を行なう他は同様に
行ない、活性なへNPレセプターを得た。
整]過程で行なった塩析処理の代りに、有機溶媒(例え
ばアセトン40%)による分画操作を行なう他は同様に
行ない、活性なへNPレセプターを得た。
【実施例3】
実施例1において、PBSの代りにpH7,4の生理的
トリス塩酸Ii液(T[lS)を用いて同様に行ない、
活性なへHPレセプターを得た。
トリス塩酸Ii液(T[lS)を用いて同様に行ない、
活性なへHPレセプターを得た。
第1図〜第5図は、ANPレセプターの特性を示すグラ
フである。 図面の浄書 AN’P (pE?、/′ml) 第 1 1フ 1 100 10000
100000’)Ligand Conc
en=ratlon (pg///l1n1)第2図 H 第 3 図 2 4 5 B 10
:”t e e k 第 4 図 Lyophiltzing Times第 5
!♂ 手 続 補 正 書 昭和63年5月10日 特許庁長官膜 −1、事件の
表示 特願昭63−73209号 2、発明の名称 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製
方法3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社 サイチックリサーチ 4、代理人 発明の詳細な説明 7、補正の内容 (1)明細書第10ページ第5〜9行目[^NP・・・
いた、」を削除する。 手 続 補 正 書 昭和63年6月父日
フである。 図面の浄書 AN’P (pE?、/′ml) 第 1 1フ 1 100 10000
100000’)Ligand Conc
en=ratlon (pg///l1n1)第2図 H 第 3 図 2 4 5 B 10
:”t e e k 第 4 図 Lyophiltzing Times第 5
!♂ 手 続 補 正 書 昭和63年5月10日 特許庁長官膜 −1、事件の
表示 特願昭63−73209号 2、発明の名称 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製
方法3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 株式会社 サイチックリサーチ 4、代理人 発明の詳細な説明 7、補正の内容 (1)明細書第10ページ第5〜9行目[^NP・・・
いた、」を削除する。 手 続 補 正 書 昭和63年6月父日
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 (1)心房性ナトリウム利尿ペプチドと心房性ナトリウ
ム利尿ペプチドレセプターとが結合した複合物を、錯化
剤、一価の金属塩、非イオン性及び両性の界面活性剤の
群の中から選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を
含むpH約6以下の溶液で処理し、心房性ナトリウム利
尿ペプチドに結合している心房性ナトリウム利尿ペプチ
ドレセプターを溶出することを特徴とする活性な心房性
ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法。 (2)特許請求の範囲第1項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、界面
活性剤の濃度が約0.1〜2%であるもの(3)特許請
求の範囲第1項記載の活性な心房性ナトリウム利尿ペプ
チドレセプターの精製方法において、一価の金属塩の濃
度が約0.1〜1モル/lであるもの。 (4)特許請求の範囲第1項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、錯化
剤の濃度が約1〜50ミリモル/lであるもの。 (5)特許請求の範囲第1項記載の活性な心房性ナトリ
ウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、複合
物が、動物の組織及び/又は動物の組織由来の細胞を非
イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から選ばれる少
なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液で処理し
て心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターを抽出し、
固定化心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得
られたもの。 (6)特許請求の範囲第1項又は第5項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物を塩析し、固定化心房性ナトリウ
ム利尿ペプチドとの反応により得られたもの。 (7)特許請求の範囲第1項又は第5項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物に硫酸塩を添加して該硫酸塩濃度
が約25〜70%の範囲で沈澱するものを集め、これと
固定化心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得
られたもの。 (8)特許請求の範囲第1項又は第5項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物を有機溶媒で分画処理し、固定化
心房性ナトリウム利尿ペプチドとの反応により得られた
もの。 (9)特許請求の範囲第1項又は第5項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、複合物が、動物の組織及び/又は動物の組織由来
の細胞を非イオン性及び両性の界面活性剤の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶
液で処理して心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプター
を抽出し、この抽出物に塩析又は有機溶媒による分画操
作を加え、その後遠心処理を施して夾雑物を除去した上
清に対し透析処理を行い、固定化心房性ナトリウム利尿
ペプチドとの反応により得られたもの。 (10)特許請求の範囲第1項、第2項、第5項、第6
項、第7項、第8項、又は第9項記載の活性な心房性ナ
トリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法において、
界面活性剤が、ポリオキシエチレンエーテル、3−[(
3−コラミドプロピル)−ジメチルアンモニオ]−1−
プロパンスルフォネイト、3−[(3−コラミドプロピ
ル)−ジメチルアンモニオ]−2−ヒドロキシル−プロ
パンスルフォネイト、ルブロールPX、オクチルフェノ
ール−エチレンオキシドコンデンセイト、ポリオキシエ
チレンソルビタン、n−オクチル−β−D−グルコシド
の群の中から選ばれる少なくとも一種以上のもの。 (11)特許請求の範囲第5項〜第9項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物が、ブタ、ウサギ、サル、ラット、ウマ、ウ
シ、ヒツジ及びヤギの群の中から選ばれる少なくとも一
種以上のもの。 (12)特許請求の範囲第5項〜第9項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物の組織が、動物の肺臓及び腎臓の群の中から
選ばれる少なくとも一種以上のもの。 (13)特許請求の範囲第5項〜第9項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、動物の組織由来の細胞が動物の血管内皮細胞であ
るもの。 (14)特許請求の範囲第5項〜第9項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、非イオン性又は両性の界面活性剤の群の中から選
ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液
中の該界面活性剤の濃度が約0.1〜2%であるもの。 (15)特許請求の範囲第5項〜第9項記載の活性な心
房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法にお
いて、非イオン性又は両性の界面活性剤の群の中から選
ばれる少なくとも一種以上の界面活性剤を含有する溶液
のpHが約6〜8であるもの。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7320988A JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP7320988A JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01246300A true JPH01246300A (ja) | 1989-10-02 |
Family
ID=13511535
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP7320988A Pending JPH01246300A (ja) | 1988-03-29 | 1988-03-29 | 活性な心房性ナトリウム利尿ペプチドレセプターの精製方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH01246300A (ja) |
-
1988
- 1988-03-29 JP JP7320988A patent/JPH01246300A/ja active Pending
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY=1987 * |
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