JPH01243989A - グルタミン合成酵素の遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はグルタミン合成＃累（Ｇｌｕｔａｍｉｎｅａｙ
ｎｔｈｅｔａｓｅ　）の遺伝情報ｔｉするＤＮＡ　、該
ＤＮＡを保持してなる形質転換体、該形質転換体により
該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめて得られるポリペプチ
ドおよびその製造法に関する。

〔従来の技術〕

グルタミン合成酵素は、Ｅ、　Ｃ，６，３，１，２゜系
統名をＬ−グルメメイト：アンモニアリガーゼ（ＡＤＰ
　−７オーミング）　（Ｌ　−Ｇｌｕｔａｍａｔｅ：　
ａｍｍｏｎｉａ　１ｉｑａｓｅ　（ＡＤＰ−ｆｏｒｍｉ
ｎｇ　）　　〕と称し、少なくとも下記反応式 ＡＴＰ　＋　Ｌ−グルタミン戚＋ＮＨ，□ＡＤＰ十無機
リン酸すＬ−グしタミン で示される反応を触媒する酵素でるる〔酵素ハンドブッ
ク、第７７５頁、１９８２年１２月１日、朝食書店発行
〕。

このグルタミン合成酵素は各種高等動物の脳や肝、マメ
の種子中に存在するほか、マイクロコツカス（Ｍｉｃｒ
ｏｃｏｃｃｕｓ　）属、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅｖ
ｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属、コリネバクテリウム（Ｃ
ｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属〔特開昭５７−３
３５９４号公報、同５９−１５５３２１号公報〕、メタ
ノバクテリウム （Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　）属（Ａｒｃｈ
、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、。

１９８６、１４４（４）、　３５０−３５４　）、バチ
Ａ／ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　）属（Ｊ、　Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ、　、　１９８５　。

９８（５）、１２１１−１２１９３に属する微生物によ
り生産されることが知られている。

グルタミン合成酵素は、その触媒する反応において前記
反応式の如（ＮＨ４イオンを利用することから、被検液
中に予め存在するかもしくは前駆体化合物から遊離され
たＮ山イオンを定量するか、またはそれらの鵬イオンを
消去せしめるに有用な酵素試薬である〔特開昭６１−５
６０９５号公報〕。例えば下記の反応の如くして沌ｔ　
イオンの定量もしくは消去、または尿素の定量もしくは
消去のための試薬として利用されている。

ウレアーゼ 尿素＋）１２０　　　　　　　２ＮＨ，十ＣＯ。

Ｎ）ｌ、　−）−Ｈ２Ｏ−一→　Ｎ丸　十　〇Ｈ−ＭＰ
＋無機リン酸＋Ｌすグルタミン ピルベートキナーゼ ＡＤＰ＋ホスホエノールピルビン酸 ＡＴＰ＋ピルビン酸 アセチルリン成子ＣＯｚ　＋　Ｈｏｏｚまたは すなわち、最終的にＨ２Ｏ２を生成せしめる反応系また
はＮＡＤＨ，を消費する反応系とすることにより定量が
できる。Ｈ２０！を生成せしめる反応系において、簡便
にはＨ２Ｏ２電極もしくはＨ，０，−’ペルオキシダー
ゼ発色法にて定量するか、または生成Ｈ２Ｏ２にさらに
カタラーゼを作用させて消費せしめてもよい。またＮＡ
ＤＨ，を消費する反応系においては、３４０〜３６０ｎ
ｍの吸収波長にて吸光度の減少址を定量するのが簡便で
ある。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら従来から報告されているグルタミン合成酵
素の生産菌は生産性が低く、また共存する他橿酵索の除
去が困難であり、有利なグルタミン合成酵素の生産方法
が望まれていた。またグルタミン合成酵素の詳細な化学
構造やその遺伝子特性については報告されていない。

〔課題を解決するための手段〕

そこで本発明者らはグルタミン合成酵素の生産性向上、
夾雑酵素の含量低減並びに製造コストの低減を図るべく
鋭意検討を試みたところ、遺伝子工学的手法を応用する
ことによってグルタミン合成酵素の遺伝子クローニング
に成功し、かつその−次構造を解析した。

さらにこの遺伝子を微生物に形質転換せしめ、該形質転
換体を培養することにより浸れたグルタミン合成酵素の
製造法を確立した。

本発明は上記の知見に基づいてなされたものであり、グ
ルタミン合成＃素を構成する一すペデチドのアミノ酸配
列をコードする塩基配列を含む）仏、該ＤＮＡ　ｆ、保
持する形質転換体、該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめて
得られる？リペデテド、およびその製造法を提供するも
のである。

本発明のＤＮＡは、例えば遺伝子組換え技術を利用し次
の如くして製造される。すなわち、グルタミン合成酵素
生産能を有するグルタミン合成酵素遺伝子の供与体であ
る微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製した後、超音
波、制限酵素など音用いて切断した該ＤＮＡと切断平滑
または接看末端部においてＤＮＡ　１７ガーゼなどによ
り結合閉環させ、斯くして得られた組換えＤＮＡベクタ
ーを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベクターのマ
ーカーとグルタミン合成酵素の活性とを指標としてスク
リーニングして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持
する微生物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベ
クターを分離精製し、次いで該組換エベクターからグル
タミン合成酵素遺伝情報を有する本発明窃払を採取する
ことにより製造される。

グルタミン合成酵素遺伝子の供与体である微生物として
は、グルタミン合成酵素産生能を有する微生物や各檀高
等動物の産生組域、例えばバチルス属に属するバチルス
・エスピー・［Ｈ１１３、バチルス・セレウス（Ｊ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、、　１９８５．９８（５）１２１１−
１２１９）、マイクロコツカス属に属するマイクロコツ
カスーグルタミカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ　ｇｌｕ
ｔａｍｉｃｕａ）ＡＴＣＣ１３０３２、同ＡＴｃＣ１３
０６０、同Ａ式℃１３０５９、　　ブレビバクテリウム
属に属するプレビバクテリク！−フラバム（Ｂｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ　）　Ａ：ｒＣＣ１４
０６７、ブレビバクテリウム−７７モニ７グネス（Ｂ、
　ａｒｒＸｎｏｎｉａｇｅｎｅａ　）ＡＴＣＣ６８７２
，同ＡＴｃｃ　６８７１、（％開昭５７−３３５９４号
公報、同５９−１５５３２１号公報）、メタノバクテリ
ウム属に属する生産菌や各種高等動物の肝または脳にお
ける産生組織（ＴｈｅＥｎｙ、ｙｍｅｓ　（２ｎｄ　ｅ
ｄ、）　６　、４４３−４６８（１９６２）、Ａｄｖ、
　ｇｎｚｙｍｏｌｏ、　３１　、１８３−２１８　（１
９６８）、　’ｆ’ｈｅ　Ｅｎｚｙｍｅｓ　（３ｒｄ　
ｅｄ、）１０．６９９−７５４（１９７４）　　〕等が
挙げられ、就中グルタミン合成酵素生産微生物が好まし
い。

また遺伝子組換え技術によりグルタミン合成酵素生産能
を付与せしめた形質転換微生物を、グルタミン合成酵素
遺伝子の供与体として利用してもよい。

遺伝子の供与体である微生物から由来するＤＮＡは次の
如くして採取される。即ち、供与微生物である上述した
ａ菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間通
気攪拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、
次いでこれを溶菌させることによってグルタミン合成酵
素遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌方
法としては、例えばリゾチームやＩ−グルカナーゼなど
の細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりｆロ
チアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなど
の界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊法
である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法と
の組み合せで行ってもよい。

このようにして得られた溶菌物からＤＮＡを分離、精製
するには、常法に従って、例えばフェノール抽出による
除蛋白処理、ゾロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理
、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合せ
ることにより行われる。

分離ｆｆ製された微生物ＤＮＡを切断するには、例えば
、超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができ
るが、得られるＤＮＡ　ｆｉ片とベクターとの結合を容
易ならしめるため、制限酵素、と９わけ特定ヌクレオチ
ド配列に作用する、例えば、ＥｃｏＲＩ　、　Ｈｉｎｄ
　ｍ　、　ＢａｍＨＩなどの■型制限酵素を用いる方法
が適している。

ベクターとしては、宿主微生物体内で自律的に増殖しう
るファージまたはシラスミドから遺伝子組換え用として
構築されたものが適している。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔ　）を宿主微生物とする
場合には、λｇｔ・λＣ２λｇｔ・λＢなどが使用でき
る。

また、シラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３
２５，ｐＡｃＹｃ１８４．ｐＵｃ１２゜ｐＵｃ１３．ｐ
Ｕｃ１８．ｐＵｃ１９などが、バチルス−ズブチル、ｘ
、　（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｉｓ）を宿主
微生物とする場合にはｐＵＢｌｌｏ、ｐｃｉ９４などが
使用でき、さらに、エシエリヒア・コリおよびサツカロ
マイセス・セレビシエなどのダラム陰・陽画性にまたが
る二種以上の宿主微生物体内で自律的に増殖可能なシャ
トルベクターを利用することもできる。このようなベク
ターを、先に述べたグルタミン合成酵素遺伝子供与体で
ある微生物ＤＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限
酵素で切断して、ベクター断片を得ることが好ましい。

微生物ＤＮＡ　ｖｆｒ片とベクター断片とを結合させる
方法は、公知のＤＮＡ　＋７ガーゼを用いる方法であれ
ばよく、例えば、微生物ＤＮＡ　＃ｒ片の接着末端とベ
クター断片の接着末端とのア二ＩＪングの後、適当なり
ＮＡリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター
断片との組換え■仏を作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡ　Ｉ
Ｊガーゼを利用し組換えＤＮＡｆ、作成することもでき
る。

宿主微生物としては、組換えＬＩＮＡが安定かつ自律的
に増殖可能で、且つ外来性ＬＩＮＡの形質が発現のでき
るものであればよく、例えば、宿主微生物がエシエリヒ
ア・コリの場合、エシエリヒア・コリＤＨＩ、エシエリ
ヒア・コリＨＢＩＯＩ、エシエリヒア・コリＷ３１１０
．　エシェリヒア・コ１Ｊｃ６００等が利用出来る。

宿主微生物に組換えα仏を移入する方法としては、例え
ば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合
には、カルシュラムイオンの存在下で組換えＤＮＡの移
入を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には、
コンピテントセル法またはり一ンーム組換えＩ）ＮＡの
プロトシラスト宿主細胞内への電気的な融合移入法など
を採用することができ、さらにマイクロインジェクショ
ン法を用いてもよい。

宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有無についての
選択は、目的ＤＮＡ断片を保持する組換えＤＮＡである
ベクターの薬剤耐性マーカーとグルタミン合成酵素とを
同時に発現し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬
剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、且つグルタ
ミン合成酵素を生成する微生物を選択すればよい。

このようにして−度選択されたグルタミン合成酵素遺伝
子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取り
出され、他の宿主微生物に移入することもできる。また
、グルタミン合成酵素遺伝子を保持する組換えＤＮＡか
ら制限酵素などにより切断してグルタミン合成酵素遺伝
子であるＤＮＡを切り出し、これと同様な方法により切
断して得られる他の開環ベクター末端とを結合させて新
規な特徴を有する組換えＤＮＡを作製して、他の宿主微
生物に移入することもできる。

また本質的にグルタミン合成酵素活性であるグルタミン
合成酵素ムティンのＤＮＡは、本発明のグルタミン合成
酵素遺伝子から遺伝子工学的手法により作製される人工
変異遺伝子を意味し、この人工変異遺伝子は部位特異的
塩基変換法および目的遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変
位ＤＮＡ　ＷＴ片でｆ換するなどの種々なる遺伝子工学
的方法を使用して得られ、斯くして取得された人工変異
遺伝子のうち特に優れた性質を有するグルタミン合成酵
素ムティン［）ＮＡについては、最終的には、このムテ
ィンＤＮＡをベクターに挿入せしめて組換えｆ）ＮＡを
作成し、これを宿主微生物に移入させることによって、
グルタミン合成酵素ムティンの製造が可能である。

かくして得られる本発明ＤＮＡの塩基配列は、５ｃｉｅ
ｎｃｅ　２１４　、１２０５−１２１０　（１９８１年
）に示されているジデオキシ法で解読し、決定すること
ができる。例えばグルタミン合成酵素遺伝子供与体とし
てバチルス属に属する菌を用い、宿主微生物としてエシ
エリヒア・コリを用いて得られたシラスミド中のグルタ
ミン合成酵素遺伝子の塩基配列は第２図（１）〜（２）
の遡りである。

！＠２図（１）〜（２）において、５′末端側たるＧＣ
Ａの上流コドンは、アミノ酸をコードするコドンであれ
ばいずれでもよく、更に、その５′末端側にアミノ酸を
コードするコドンを１個以上有してもよいが、好ましく
はＡＴＧまたはシグナルペゾチドに対応する？リデオキ
シリメ核酸を挙けることができる。また、３′末端側た
るＴＡＴの下流コドンは、翻訳終止コドンまたはアミノ
酸をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、
その３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以
上有していてもよいが、その場合には、この複数個のコ
ドンの３′末端にさらに翻訳終止コドンをＭすることが
好ましい。

また、本発明ＤＮＡを発現させることにより生産される
ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡの塩基配列から
予測決定できる。なお、該ペゾテドのＮ−末端部を構成
する部分アミノ酸配列は、以下の如くして決定できる。

すなわち、グルタミン合成酵素並生能を有するグルタミ
ン合成酵素遺伝子供与微生物を栄養培地で培養して一体
内にグルタミン合成酵素を産生蓄積せしめ、培養終了後
、得られた培養物全濾過または遠心分離などの手段によ
り菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて
ＥＤＴＡおよび／または適当な界面活性剤等を添加すれ
ば、グルタミン合成酵素が可溶化され、水溶液として分
離採取される。この様にして得られたグルタミン合成酵
素の水溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安
分画、グル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィーによυ処理して、高純度グルタミン
合成酵素が得られ、高純度グルタミン合成酵素を用いて
液相ゾロティン　シーケンサ−（ベック−ｒ７社ｇ：　
ＢＥＣＫＭＡＮ　　Ｓｙｓｔｅｍ８９０ＭＥ）によりグ
ルタミン合成酵素であるペプチドのＮ末端部を構成する
部分アミノ酸配列が決定される。また、少なくとも、該
部分アミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたグル
タミン合成酵素のＮ末端部分アミノ酸配列と一致するも
のであることを確認した。第２図（１）〜（２）で示す
塩基配列から、上記の如くして決定されたアミノ酸配列
は第１図（１）〜（２）の通りである。第１図（１）〜
伐）のアミノ酸配列において、Ｎ末端側で６るＡｌａの
上流にはさらに一個または複数個のアミノ酸残基金ゼし
ていてもよく、そのアミノ酸残基としてはＭｅ　ｔまた
はシグナルペプチドが挙げられる。またＣ床端のＴｙｒ
の下流には、さらに−個以上のアミノ酸残基をＭしてい
てもよい。

かくして得られる形質転換体は、栄養培地にて培養する
ことにより多量のグルタミン合成酵素活性を有するペプ
チドを安定に産生ずる。

形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生
理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多
くの場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気攪
拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、
微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得る
。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく
、例えばグルコース、シュクロース、ラクトース、マル
トース、フラクトース、糖蜜などが使用される。窒素源
としては利用可能な鼠素化合物であればよく、例えば−
１２７’）ン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分
解物などが使用される。その他、リン酸塩、炭酸塩、硫
酸塩、マグネシウム。

カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などのｆｊ
Ｘ類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応
じて使用される。

培養温度は菌が発育し、グルタミン合成酵素を生産する
範囲で適宜変更し得るが、エシエリヒア・コリの場合、
好ましくは２０〜４２℃程度である。Ｊｌ＠養時開時間
条件によって多少異なるが、グルタミン合成酵素が最高
収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了
すればよく、通常は１２〜４８時間程度である。培地…
は困が発育し、グルタミン合成酵素を生産する範囲で適
宜変更し得るが、特に好ましくはｐＨ６〜８程度である
。

培養物中のグルタミン合成酵素が培養液中に存在する場
合には、菌体を含む培養液そのままを採取し、利用する
こともできるが、−般には常法に従って、濾過、遠心分
離などにより培養液中のグルタミン合成＃素と微生物菌
体とを分離した後のグルタミン合成酵素溶液が使用され
る。グルタミン合成酵素が菌体内に存在する場合には、
得られた培養物を濾過または遠心分離などの手段により
、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的方法またはリ
ゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また必要に応じて
ＥＤＴＡ等のキレート剤および／または界面活性剤を添
加してグルタミン合成酵素を可溶化し水溶液として分離
採取する。

この様にして得られたグルタミン合成＃素含有溶液を、
例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸す）　Ｉ
Ｊウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例え
ばメタノール。

エタノール、アセトンなどによる分別沈澱法により沈澱
せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半
透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去す
ることができる。また吸着剤あるいはグル濾過剤などに
ょるグル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換ク
ロマトグラフィーによすｆｆ製シ、コれらの手段を用い
て得られるグルタミン合成酵素含有溶液は、減圧濃縮、
凍結乾燥等の処理にてより精製されたグルタミン合成酵
素を得ることができる。

斯くして得られるグルタミン合成酵素の活性測定法は次
の通シである。

０、２　Ｍ　）　Ｉ７７．塩酸緩衝液ＣｐＨ＆ｏ）　　
０．ｘ−２Ｍグルタミン酸ナトリウム　　　　　５０μ
１１Ｍ１酸アンモニウム　　　　　　　　　５０μＩＯ
，２Ｍ　ＭＩｇＣ：ｌｘ　　　　　　　　　　　　　　
５　Ｑ　μｊＯ，２Ｍ　ＡＴＰ　　　　　　　　　　　
　　　　エ０１゜０．１Ｍホスホエノールピルビン酸　
　　１０μ！ピルビン酸キナーゼ（ｓｏｏＬＪ／−）　
　　　１０μ！ピルビン酸オキシダーゼ（５００Ｕ／ｍ
）　　１０μＩＯ，ｌ　Ｍチアミンピロリン酸　　　　
　　　２μｌ００１Ｍ幻ちＰＯ４５０μｊ １ｍＭ　ＦＡＤ　　　　　　　　　　　　　　１０μｔ
Ｏ０３％４−アミノアンチピリン　　　　０．１−０．
２％フェノール　　　　　　　　　０．１１１ｉｔペル
オキシダーゼ（４５Ｕ／ｍ／）　　　　　　０．１ｍ蒸
留水　　　　　　０・３４８−を 上記の組成の反応液１．０−を試験管に分取し、３７℃
３分間予備加温した後酵素液５０μｊを加えて３７℃、
１０分間反応を行い、反応後、２１ｎｌの０．５％ドデ
シル硫酸ナトリウム溶液を加えて反応を停止し、反応で
生じた赤色を５００ｎｍの波長にて比色定食する。１分
間に１μｍｏｌｅのＡＤＰを生じる活性を１単位（財）
とした。

本明細書に記載のアミノ酸、−（グテド、核酸、核酸関
連物質、その他に関する略号に、それらの当該分野にお
ける慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記
する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

ＤＮＡ　：デオキシリボ核酸 ＲＮＡ　：リボ核酸 Ａ　：アデニン Ｔ　：テミン Ｇ　ニゲアニン Ｃ：シトシン Ａｌａ　：アラ二ン Ａｒｇ　：アルギニン Ａａｎ　：アスノｑラギン Ａｓｐ　：アスノＱラギン酸 Ｃｙｓ　ニジスティン Ｇｉｎ　：グルタミン Ｇｌｕ　：グルタミン酸 Ｇｌｙニゲリシン Ｈｉｓ：ヒスチジン １１ｅ　：インロイシン Ｌｅｕ　：ロイシン Ｌｙｓ　：リジン Ｍｅｔ＝メチオニン Ｐｈｅ　：フェニルアラニン Ｐｒｏ　：ゾロリン Ｓｅｒ　：セリン Ｔｈｒ　：スレオニン Ｔｒｐ　：　）リデトファン Ｔｙｒ　：チロシン ｖａｌ　：バリン 〔実施例〕 以下、実施例で本発明の詳細な説明するが、本発明は何
らこれらによって限定されるものではない。

実施例１　〔染色体ＤＮＡの分離〕 パｆｋスー：ｒ−スビーＥＨＩ　１３　（Ｂａｃｉｌｌ
ｕｓ　ｓｐ。

ＥＨ１１３）の染色体α０．を次の方法で分離した。同
菌株を１５０−の普通ブイヨン培地で３７℃−晩振盪培
養後遠心（入ｏｏｏ回転１０分）によｐ集菌した。１０
％サッカロース、５０　ｍＭ　トリス塩酸（ｐＨ＆０　
）５０ｍＭ　　ＥＤＴＡを含んだ溶ｇ５−に懸濁させ、
１−のリゾチーム溶液（１０ｑ／ｄ）を加えて３７０１
１５分間保温し、次いで１−の１０％５ＤＳ（ドデシル
硫酸ナトリウム）溶成を加えた。

この懸濁液に等量のクロロホルム−フェノール混ｇ（１
：　１）を加え、攪拌混合し、１０．０００ｒｐｍ３分
の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を分取した。この水
層に２倍量のエタノールを靜かに重層し、ガラス棒でゆ
つくシ攪拌しながらＤＮＡ　をガラス棒にまきつかせて
分離した。これを１０−のｌ　Ｑ　ｍＭ　）　ＩＪス塩
酸（ｐＨＩＩＬＯ）　、　１ｍＭ　ＥＤＴＡを含んだ溶
液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロロ
ホルム−フェノール混液で処理後、遠心により水層を分
取し、２倍量のエタノールを加えて上記の方法でもう一
度ＤＮＡを分離し、２！＋！７！のＴＥで溶解した。

実施例２　〔グルタミン合成酵素遺伝子を有するシラス
ミドｐＧＳ　２の作成〕 （１）実施例１でｃＩ１４製したＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓ
ｐ、の染色体ＤＮＡ　２μｇ（約０．５μｔ）とｌθ倍
濃度のＨｉｎｄ　ｍ切断用バッファー（ｌ　Ｑ　Ｑ　ｍ
Ｍ　）リス塩ｔｌｔ　（ｐ’　７．５　）　　、　７０
　ｍＭ　ＭｇＣｈ　、　０．６　ＭＮａＣｚ、　７０　
ｍＭメルカゾトエタノール）１μｇ。

Ｈｉｎｄ　ｍ　（宝酒造製１０　ｕｎｉｔ／ｌｔｌ　）
　１　ｐｉ　＋　　’水６μｇを混合し、３７℃１時間
切断した。別に、　ｐＢＲ３２２ＤＮＡ　　（宝酒造）
約０．３μ？を同様の方法を用いてに４ｉｎｄ　ｍで切
断し、さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡＰ
と略すことがある。全酒造製）０．６ｕｎｉｔｉ加え、
６５℃１時間処理した。これらのＨｉｎｄ　ｍで切断し
た２ｍの鳳溶液を混合し、その１／ｌＯ量の３Ｍ酢酸ナ
トリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロホルム−
フェノール混液で処理し、遠心分離により水層を分取し
た。この水層に２倍容のエタノールを加え、遠心でＤＮ
Ａを沈澱させたのち減圧乾燥した。水８９μｊで溶解後
、１０倍濃度のライダージョンバッファ （０，５Ｍ　ト’）　ス塩酸（ｐＨ７，６）　、　Ｏｏ
ｌ　Ｍ　ＮａＣ１２。

０．１Ｍゾチオスレイトール、ｌＱｍＭスペルミゾｙ　
、　ｌ　Ｑ　ｍＭＡＴＰ）　１０１ｔｌとＴＪＤＮＡリ
ガーゼ１μｌ（全酒造製３５０　ｕｎｉｔ）を加え混合
し４℃で一晩放置した。このＤＮＡ溶液ヲクロロホルム
ーフェノール処理シ、エタノール沈澱を集め減圧乾燥し
た後、１０μｊのＴＥで溶解した。

（ｉ）１００ｒＲｔのＢＨＩ培地（Ｂｒａｉｎ　Ｈｅａ
ｒｔＩｎｆｕｓｉｏｎ、　Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した
対数増殖期のエシエリヒア・コリＴ）１１６株〔国立遺
伝学研究所よプ分与を受けた、ストック番号ＭＥ８４５
９　、　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　ｌ　５３　。

１２４７、（１９８３）Ｊを遠心分離により集菌しく　
１０，０００ｒｐｍ２分間）４０艷の氷冷した３０ｍＭ
酢酸カリウム、１００　ｍＭ　ＲｂＣｚ　１１０　ｍＭ
　ＣａＣｊ２　、５０　ｍＭ　ＭｎＣｌ２　および１５
％グリセリンを含んだ溶液（＄　ｓ、　８　）で懸濁し
た。０℃で５分間放置後、遠心し上清をすて、さらに４
−のｌ　Ｑ　ｍＭ　ＭＯＰ　Ｓ緩衝液（ドータイト社製
）、７５　ｍＭ　Ｃａ（Ｊ２　ｓｌ　０　ｍＭ　ＲｂＣ
１および１５％グリセリンを含んだ溶ｇ（＄６．５）で
懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞とし
た。

（１）　　このエシエリヒア・コリ懸濁液２００μＥに
（１）で調製したＤＮＡ溶液ｌＯμｌを加え、３０分間
θ℃で放置した。ＢＨＩ培地ｌ−を加え、３７℃で９０
分間保温後、この１００μｌをアンピシリンとカナマイ
シン（各々２５μｔ／−）を含んだＢＨＩ寒天グレート
にまき、３７℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形
質転換体をチアミンを含むＭ９培地（組成はＮＨ４Ｃｌ
　１　ｆ　、Ｎａ１ＨＰＯ４６？、ＫＨ２ＰＯ４３ｆ　
、　　ＮａＣ１Ｏ，５ｔ　１１　ＭＭｇＳＯ４２−１２
０％グル：ｒ　−ス１０７　、　　Ｉ　Ｍ　ＣａＣＡ！
２０．１ｍ、１鳳ｇ／−塩酸チアミン１−１寒天１５？
、蒸留水１ｇ）のプレートにレゾリカし、３７℃でさら
に一晩培養した。約２０００コロニーの形質転換体を調
べたところ、チアミンを含むＭ９培地で生育した３コロ
ニーを得、このうちの１株をエシェリヒア・コリ（０ｓ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　）　ＤＨｌｐＧｓ　２株
［微生物受託番号　倣工研菌寄第９４９２号、ＦｆｌＲ
Ｍ　Ｐ−９４９２Ｊと命名した。

この菌を純粋分離後Ｂ）ＩＩ培地で３７℃−晩培養し、
グルタミン合成酵素の生産性を後述するグルタミン合成
酵素活性測定法によシ調べたところ、約３ｕ／−のグル
タミン合成酵素活性を有していた。

この菌株の保有していたシラスミドを実施例２と同様に
してシラスミドを分離し、グルタミン合成酵素遺伝子を
含み、ｐＡＣＹＣ１８４遺伝子を含むプラスミドをｐｃ
ｓ　２と命名した。

実施例３　〔シラスミドｐＧｓ　２　ＤＮＡの分離〕プ
ラスミドｐＧｓ　２を保Ｍするエシエリヒア・コリＤＨ
Ｉ　ｐＧ８２株をＩＡ！のＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社Ｊ
Ｒ）で振盪培養した。懸濁がＯＤ、・・〜１．０に増殖
したとき、クロラムフェニコール（最終濃度２００μ？
／−）を加え、さらに３７Ｃで１６時間以上振盪を続け
た。３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心により集菌し、リ
ゾチーム−８ＤＳ法とセシタムクロライドーエテゾウム
プＯマイト法（Ｍａｎｉｏｒｔｉａら：　ＭＯｌｅＣｕ
ｌｌＬｒＣｌｏｎｉｎｇ　ｐｐ　８６〜９４　Ｃｏ１ｄ
　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ（１９８２））に従いシ
ラスミドＤＮＡを調製した。

実施例４　〔シラスミドｐＧＳ　２のマツピングおよび
グルタミン合成酵素遺伝子 の塩基配列の決定〕 エシエリヒア・コリＤＨＩ　ｐＧＳ　２株から実施例３
で調製したシラスミドｐＧｓ　２　ＤＮＡについて制限
酵素ＥｃｏＲＩ　、　Ｘｂａｌ、　Ｓｐｈ　Ｉ、Ｂｇｌ
ｌＩ、ＮＣ０１１（イずれも全酒造製）、Ｎｄ　ｅ　Ｉ
　（ＢＲＬｇ　）による切断地図を作成した。その結果
を第３図に示した。グルタミン合成ｒ＃素遺伝子を含ん
だ」法の塩基配列をＭ１３ファーゾを用いたジデオキシ
法（５ｃｉｅｎｃｅ　２１４　１２０５−１２１０（１
９８１））を用いて決定した。グルタミン合成酵素の構
造遺伝子の塩基配列並びにアミノ酸配列を第１図〜第２
図に示した。

実［ＩＪ５　　（グルタミン合成酵素の製造］遺伝子組
換株（ＦＥＲＭ　Ｐ−９４９２）を２０１０Ｂ）ＩＩ培
地（Ｄｉｆｃｏ社製）で３７℃２０時間シャー７アーメ
ンターにより培養し、ｓｏｏ。

ｒｐｍ　Ｉ　ｏ分間の遠心で集菌した。生理食塩水２１
で洗浄、遠心後２１の１０　ｍＭ　＋７７酸バツフア（
ｍ　７．５　）で懸濁した。リゾチームを１属ｑ　／　
ｍｔ、トリトンＸ−１００を０．１％となるように加え
て３７℃３０分間保温し、ｓｏｏ。

ｒｐｍ　ｌ　０分の遠心により上消液を分離した。

この上清液Ｌ８Ｊについて硫安塩析（４０％〜６５％）
を行い、沈澱物を５００　Ｏｒｐｍ３０分の遠心により
集めた。この沈澱物を　　ｔ２５０−の１６ｍＭリン酸
バッファ（ｍ　７．５　）で溶解し、セファデックスＧ
−２５で脱塩処理をした。この後、ＤＥＡＥ−セファロ
ースＣＬ−６Ｂを用いてイオン交換クロマトを行い活性
画分を分取後脱塩し、凍結乾燥により粉末標品を得た。

この酵素標品を前述のグルタミン合成酵素活性測定法に
より測定した結果１９．２ｕ／Ｑの比活性を有していた
。

〔発明の効果〕 本発明のＤＮＡおよび形質転換体を用いることによって
、効率よく、高純度でグルタミン合成酵素を製造するこ
とが可能となった。また本発明によってグルタミン合成
酵素遺伝子が明らかとなった。

【図面の簡単な説明】

第１図（１）〜（２）は本発明のＤＮＡによって発現さ
れるグルタミン合成酵素のアミノ酸配列を示す図面であ
シ、第２図（１）〜（２）は、本発明のＤＮＡの塩基配
列を示す図面であジ、第３図はシラスミドＩ）ＧＳ　２
の制限酵素地図を示す。 以上 出・願人　東洋醸造株式会社 代理人　弁理士　有　賀　三　輌 、−」 ：゛−′−′−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、グルタミン合成酵素を構成するポリペプチドのアミ
   ノ酸配列をコードする塩基配列を含むＤＮＡ。 ２、グルタミン合成酵素を構成するポリペプチドのアミ
   ノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図（１）〜（２）で表わ
   されるものである請求項第１項記載のＤＮＡ。 ３、塩基配列が、５′末端側より第２図（１）〜（２）
   で表わされるものである請求項第１項記載のＤＮＡ。 ４、宿主にとつて外来性であるグルタミン合成酵素を構
   成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配
   列を含むＤＮＡを保持することを特徴とする形質転換体
   。 ５、グルタミン合成酵素を構成するポリペプチドのアミ
   ノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図（１）〜（２）で表わ
   されるものである請求項第４項記載の形質転換体。 ６、塩基配列が、５′末端側より第２図（１）〜（２）
   で表わされるものである請求項第４項記載の形質転換体
   。 ７、形質転換体が、エシエリヒア属に属する微生物であ
   る請求項第４項記載の形質転換体。 ８、エシエリヒア属に属する微生物がエシエリヒア・コ
   リである請求項第７項記載の形質転換体。 ９、エシエリヒア・コリがエシエリヒア・コリＤＨ１ｐ
   ＧＳ２〔微工研菌寄第９４９２号；ＦＥＲＭＰ−９４９
   ２〕株である請求項第８項記載の形質転換体。 １０、Ｎ末端側より第１図（１）〜（２）で表わされる
   アミノ酸配列を有するグルタミン合成酵素を構成するポ
   リペプチド。 １１、宿主にとつて外来性であるグルタミン合成酵素を
   構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基
   配列を含むＤＮＡを保持した形質転換体を培養して該Ｄ
   ＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からグルタミン
   合成酵素を構成するポリペプチドを採取することを特徴
   とするグルタミン合成酵素の製造法。 １２、グルタミン合成酵素を構成するポリペプチドのア
   ミノ酸配列が、Ｎ末端側より第１図（１）〜（２）で表
   わされるものである請求項第１１項記載の製造法。