JPH01203324A - 骨吸収およびコラーゲナーゼ放出の阻害方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １１至Ｕ 本発明は、哺乳類動物の歯周疾患に勾【プる歯槽骨吸収
を制御する方法に関する。

発明の背景 ベンゾ−Ｃ−７エナンスリジンアルカロイドはケシ科（
Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｓｅ　）　、ケマンソウ科（Ｆ
ｕｉａｒｉａｃｅａｅ　）およびメギ科（Ｂｅｒｂｅｒ
ｉｄａｃｅａｅ　）の植物から抽出することができる。

これらの科に属する植物としてはｓａｎｇｕｔｎａｒｔ
ａ　ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ。

Ｈａｃｌｅａｙａ　ｃｏｒｄａｔａ、　Ｂｏｃｃｏｎｉ
ａ　ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ。

Ｃａｒｙｄａｌｉｓ　　５ｅｖｃｔｃｏｚｉｉ、　Ｃ，
１ｅｄｅｂｏｕｎｉ、Ａｒｇｅｉｏｎｅｎｏｘｉｃａｎ
ｕｓおよびＣｈｃｌｉｄｏｎｌｕｉ　ｎａｊｕｓ等を挙
げることができる。これらの植物から得られる最も重要
なベンゾ−ｃ−フエナンスリジンアルカロイドの中には
、サンギナリン、キリルピン、マカルビン、アロクリプ
トビン、プロトビン、ホモキリドネン、サンギラチン、
サンギルビンおよびキレリスリンがある。

これらのアルカロイドで最もよく知られているものは、
北米原産の多年生草本Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉａｃａｎａ
ｄｅｎｓｉｓ植物（ほかに１ラツドルート、テターウオ
ート、レッドルート、パクーン等の名でも知られている
）から抽出されるサンギナリンである。

サンギナリア属の植物およびそのジュースは、有史前か
ら有史時代を通じて様々な目的で使用されてきた。とく
にこの植物は民間薬として使われてきた。この植物は一
般に、全体を、乾燥しないで（生のままンまたは乾燥し
て用いられてきて、通常の方法では、乾燥した植物を粉
末化し、担体とＵ合している。この民間薬は、喘息、気
管支炎、赤痢、自前のような状態、ならびに他の一連の
重要な病気に試みられてきた。

純粋な化学物質、サンギナリン、キレリスリン、プロト
ビン、キレルピン、ベルベリン、キリルチン、サンギラ
チン、マカルビン、サンギルビンおよびアロクリプトビ
ンは、サンギナリア属以外の植物から単離することがで
きる。これらは稀ではあるが、化学薬品販売店から入手
できる場合もある。これらのアルカロイドの半綽品は市
販されていて、一般にサンギナリン硝酸塩およびサンギ
ルビン硫ＩＭ［と呼ばれている。この塩は、サンギナリ
ア属植物の混合アルカロイド、主としてサンギナリン、
キレリスリンおよびプロトビンの塩である。純粋なベン
ゾフェナンスリジンアルカロイドの使用に関する文献は
ほとんど見当らないが、このような化合物を含む植物は
広い範囲の病気に使われてきた。

アルカロイドサンギナリンは溶液は、ある種の抗かびお
よび抗原虫作用を示す。サンギナリンは、乳化液として
、かび感染症に局所的に適用される。

サンギナリンの抗細菌活性は付加したラジカルによって
変動することが明らかにされていて、サンギナリンの様
々な塩にある程度の活性が認められて０１゛る。塩Ｗ１
塩および硫酸塩は、ある濃度である極のｌｌｉｌ％：活
性をもつことが明らかにされている。

サンギナリン硝酸塩は、各種の細菌に対しである種の静
菌活性をもつことが報告されている。

口内洗浄剤、とくにねり歯磨の成分としてｓａｎｇｕｒ
ｎａｒｒａ　ＣａｎａｄｅｎＳＩＳの抽出液の使用が米
国特許第４，１４５，４１２号にｔｍ示されている。

抽出液は、微細に切断または粉砕したブラッドルートを
有機溶媒、たとえばメタノール、酸性化メタノール、酸
性化エタノール、酸性化メタノール水溶液、酸性化エタ
ノール水溶液およびそれらの混合物で処理して製造でき
る。

ブラッドルートを数寄の溶媒と完全に攪拌し、長期間（
たとえば２４時間またはそれ以上、温度的６０℃で）溶
媒中に保持する。ひとつの方法によれば、この溶液を濾
過し、溶媒を蒸発させる。

ついで残留物を溶解しくたとえばクロロホルム中に）、
濃塩酸を加え、濾過し、ついで乾燥する。

乾燥抽出物を温グリセリン（６５℃）に取り、担体と混
合してもよい。他の方法によれば、植物を溶媒で抽出し
たのち、（２）抽出物を溶媒に可溶性の酸塩で沈殿さゼ
、（ハ）沈殿した塩を水に再溶解し、（へ）酸を加えて
沈殿を形成させ、ゆ沈殿を集めることができる。

抽出液は優れた呼気洗浄剤、組ＩＩＩ調節剤および歯洗
浄剤である。

サンギナリア植物の抽出液の一成分であるサンギナリン
は抗歯垢剤としても使用されてきて、歯垢形成の予防お
よび制御に有効なことが示されてきた。

一方、進行した歯周疾患、すなわち組織の破壊、高レベ
ルのコラーゲナーぜ活性、およびｍ槽骨吸収を特徴とす
る疾患では、これらの状態を！ＩＪｍおよび逆転するの
に有効な手段が必要になる。

歯周疾患は、合衆国において、すべての歯の喪失の原因
の５０％以上を占め、Ｉ界中で口内の健康の第一の脅威
となっているものの、その予防および治療にはわずかな
進歩しかムく、この疾患の基本的な病因さえ十分理解さ
れていない。研究者達は、歯周疾患の発生の一次的外因
として、口内フロラ中のある種の微生物およびその代謝
物質が関与していることは疑いなとしている。

最近の歯周疾患の研究では、これらの細菌性物質と各種
の自己防御機構との間の相互作用の性質が注目され始め
ている。細菌毒素と抗原が宿主の免疫系を活性化し、組
織破壊と歯槽骨の吸収を生じる。この両者が歯周疾患の
特徴である（１゜２）。

また、最近の研究は、侵襲性の多形核好中球やマクロフ
ァージのみでな（、さらに固有な結合組繊細胞たとえば
センイ芽細胞、骨芽細胞等がもつと重要に関与して放出
される各種プロテアーゼおよびプロトグリカナーゼが、
結合組織の破壊および歯槽骨の吸収を仲介することが証
明されてきた（３．４）。

細菌性抗原に直面すると、宿主の免疫系の炎症および非
炎症性細胞は様々なリンホカインおよびサイト力インた
とえばインターロイキンを産生ずることによって反応し
、これが破骨細胞活性化因子（ＯＡＦ）と分子的に同一
であることが明らかにされた（５）。これらの可溶性メ
デイエータ−は、宿主細胞による分解酵素の急速な合成
を誘発し、したがって、炎症応答の調節に主要な役割を
果たしているものと思われる（６）。

歯周疾患の最初の表出は、宿主免疫系の六進反応と表現
することができる。免疫不全疾患を有する患者の臨床研
究では、これらの患者が、年齢のマツチした対照に比較
して、歯周症状のレベルが有意に低いことが明瞭に示さ
れている。すなわら、自己防御機構の過敏性反応として
の歯周疾患の特徴が、宿主細胞による宿主組織の破壊を
招くものとして、最近、多くの研究者の注意をひいてい
るのである。

しかしながら、歯周疾患の予防手段には、主として、細
菌性歯垢の物理的または化学的な絶滅がもっばら考慮さ
れてきた。

骨吸収は、破骨細胞ならび各種の他の細胞が関与する動
的かつ複雑な連鎖的事象であることを示唆する重大な証
拠が集まりつつある（７〜９）。

生体骨の細胞仲介吸収時には、解剖学的吸収に必要な無
機および有機両マトリックスの破壊が同時に起こるもの
と考えられるが、この過程の分子レベルでの詳細は解明
されていない。コラーゲンは骨マトリックスの主要な有
機成分であり、コラ−ゲナーゼは生理的条件下にコラー
ゲンの分解に主としてかかわる酵素である。この特異的
な天然プロテアーゼが、様々な生理学的および病理学的
組織における結合組織の分解に携ってきたのである。

本発明の目的は、ある特定量のサンギナリンおよびその
プソイドエタノラートを経口投与することにより、進行
した歯周疾患における歯槽骨の吸収を制御し、コラ−ゲ
ナーゼの活性レベルを制限する手段を提供することにあ
る。

発明の要約 本発明によれば、サンギナリンおよびそのプソイドエタ
ノラートを、進行した歯周疾患の侵襲を制御するのに有
効なレベル使用する。

発明の詳１［１１，を記述 以下の実施例は、サンギナリンおよびそのプソイドエタ
ノラートの、」ラーゲナーゼ合成との関連での骨吸収に
対する作用を示すものである。

例１゜ ５日齢のマウス頭蓋冠培養物を用い、 ＨａｔＳｕｌＯｔＯら（Ａｒｃｈ、　０ｒａｌ　Ｂｉｏ
ｌ、、　２４　：　４０３−４０５　（１９７９）の記
載した方法に従って骨培養物を調製した。

ヘパリン（１０ＬＩ／ｍｅ）を含むかあるいは含まない
１０％熱不活性化ウマ血清を補充した改良ブイヨン培養
基からなるメジウムを使用した。骨吸収は副甲状腺ホル
モンで刺激した（ＰＴＨ，ＩＵ／Ｉｄ）。高度に精製し
たサンギナリンおよびプソイドエタノラート（サンギナ
リンをエタノールに溶解し、ｐＨをＮａＯＨまたはＮＨ
４ＯＨで上行させることにより固体を沈殿させて製造）
をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、培養メ
ジウムに加えた（０．１％Ｖ／Ｖ）。対照には同層のＤ
ＭＳＯを加えた。メジウムを２日ごとに新しいものにか
え、４〜６日間インキュベーションを続けた。

骨吸収は、所定の間隔でメジウム中のカルシウム濃度を
測定することにより定量した。総力ルシウム濃度は、ｃ
ｏｗｅｎら（Ｂｉｏｃｌ＋ｅＯ１，Ｉｎｔ、、　１１　
：　２７３−２８０．１９８５）の記載のようにしてＣ
０ｒｎｉｎｌＪ　９４０型カルシウムアナライザーを用
い、蛍光滴定によって測定した。骨吸収はメジウム中の
カルシウム８１度（η／ｄ）またはＰＴＨＩ発値の百分
率で表した。

コラ−ゲナーゼは、頭蓋冠培養物（ヘパリン含有＞（１
０）の収穫メジウムサンプルから、第１図に示すように
メジウムをヘパリン−セファロースゲルの多重小力ラム
に通して単離した。コラ−ゲナーゼインヒビターを含む
大部分の血清成分は、コラ−ゲナーゼの定ＦＡ　６１に
このアフィニティークロマトグラフィー過程で除去した
。

単離されたコラ−ゲナーゼは完全に潜伏型（酵素的に不
活性）であり、定ｔｌｉ前に１１１０１／オのｐ−アミ
ノフェニル水銀アセデート（ｐ−ＡＰＭＡ）で活性化し
た。標準定量条件も第１図に示す。

ＤＭＳＯに溶解したサンギナリンおよびそのブソイドエ
タノラートを、Ｓ、　５ａｋａｌＯｔＯら（Ａｒｃｈ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　８ｉｏｐｈｙｓ、、１８８　：　４
３８−４４９．１９７８）の記載に従って調製した高純
度マウス骨］ラーゲナーゼ（活性型）を用い、コラーゲ
ナーゼ定檜法で試験した。

骨吸収（ＰＴＨによる刺激）および移植骨からのコラ−
ゲナーゼ放出に関してのマウス頭蓋冠に対するサンギナ
リンの作用を試験するために、培養期間中のメジウム中
のカルシウム濃度およびコラ−ゲナーゼレベルの変化を
分析した。第２図は、培養２．４および６日に、ＰＴＨ
処置群が高レベルの骨吸収を示した。サンギナリン２０
μｍｏ１７１で処置したＰ　Ｔ　Ｈおよび対照両群がサ
ンギナリンで処置しない対照群より低値を示し、これは
２０μｍｏ１／１のサンギナリンがＰ　Ｔ　Ｈ刺激骨吸
収を完全に阻害することを示している。第３図には、第
２図に示したと同じ培養実験において、移植骨より放出
されたコラ−ゲナーゼの活性レベルを示す。

全ＰＴＨ群が、培養期間を通じてコラ−ゲナーピ活性の
高レベルを示したが、ＤＭＳＯを含むＰＴＨ群ではＤＭ
ＳＯを含まないＰＴＨ群よりわずかに高く、２０μｌ１
０１／１のサンギナリンで処置したＰＴＨ群は各種対照
群よりも低い値さえ示し、これはサンギナリンが移植骨
からのコラ−ゲナーゼの放出を遮断することを示唆して
いる。

メジウム中のコラ−ゲナーゼのレベルは、一般に、培養
群内での骨吸収の程度によく相関する（第２図および第
３図）。５μ１１０１／１のサンギナリンプソイドエタ
ノラートも完全に骨吸収を阻害しく第４図）、移植骨か
らのコラ−ゲナーゼ放出を遮断した。第４図には様々な
濃度でのＰＴＨ刺激骨吸収に対するサンギナリンおよび
そのプソイドエタノラードの作用を示す。サンギナリン
およびそのブソイドエタノラートの有効濃度範囲は、そ
れぞれ約１〜２０μｒ＊ｏ１／１および０．２〜５μｍ
００１／１である。

サンギナリンエタノラートは、この培養系においてはサ
ンギナリンよりも約５〜１０倍強力であるように思われ
る。

コラ−ゲナーゼの定量により、サンギナリンのコラ−ゲ
ナーゼ活性に対する直接作用も試験した。

第５図は、サンギナリンもサンギナリンブソイドエノラ
ート型も１１１１マウス骨コラ−ゲナーゼの活性型を阻
害することを示したが、培養系（第４図）におけるより
も１０〜１００倍の濃度を要した。

サンギナリンプソイドエタノラートは、低濃度ではサン
ギナリンより強い阻害性を示したが、この作用は高濃度
では逆転した。サンギナリンブソイドエノラートをコラ
ーゲナーゼ定同混合物（ｐＨ７，５）に添加した場合、
色はオレンジ色に変化し、エタノラードは急速にサンギ
ナリンに変換したことが認められた。

サンギナリンはマウス頭蓋冠に作用し、コラ−ゲナーゼ
放出および骨吸収の両者を阻害することが明らかであり
、結果は、移植骨によって分泌されるコラーゲナーぜの
、骨吸収時における骨マトリックスコラーゲンの細胞外
性分解における役割を示している。

サンギナリンプソイドエタノラートは、骨吸収に関して
（第４図）、サンギナリンより約５〜１０倍強力であっ
て、エタルレートがその親油性により膜をより容易に透
過することを示している。

コラ−ゲナーゼ活性の直接阻害にはサンギナリンはより
高い濃度を必要とした（第５図）。

本研究においては、骨吸収を阻害するために必要な好ま
いサンギナリンブソイドエタル−トの騒は５μｒａｏｌ
／　１　（１，７５μｇ／ｄ）であるが、副甲状腺ホル
モン刺激による骨吸収およびコラ−ゲナーゼ放出を阻害
するには約０．２〜約１０μｌｌ０１／１の範囲が有効
であることがわかった。

サンギナリン自体の場合は、副甲状腺ホルモン刺激によ
る骨吸収およびコラ−ゲナーゼ放出を阻害する好ましい
騒は約１０μｍ０７／ｉである。しかしながら本発明の
関係では約１〜２０μｔｏｏｌ／ｌの範囲で作用するこ
とが明らかにされた。

以上の詳細な説明は、本発明を単に例示するものであっ
て、本発明の精神から逸脱することなく本発明の範囲内
で多くの改変が可能なことを理解すべきである。

髪」巳ξ菖 （１）　　Ｓｃｈｌｕｇｅｒ　Ｓ、　Ｙｕｏｃｅｌｉｓ
　ＨＡ、　Ｐａｇｅ　ＲＣ：Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ　
Ｄｉｓｅａｓｅ、　Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ、　　Ｌ
ｅａ　＆ＦＯｂｉｌｌｌｅｒ　　、　　１９７７゜（２
ｉ　Ｐａｇｐ　ＲＣ，５ｃｈｒｏｅｄｅｒ　ＩＩＥ　：
　Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｉｔｉｓｉｎ　　Ｍａｎ　　ａｎ
ｄ　　０ｔｈｅｒ　　ＡｎｉＩＩｌａｌｓ、　　Ｂａ５
ａｌ、５ｗ１ｔｚｅｒ−ｌａｎｄ、　　Ｋａｒｇｅｒ、
　　１９８２゜ｆ３１　５ｅｌｌｅｒｓ　　Ａ、　　Ｒ
ｅｙｎｏｌｄｓ　ＪＪ、　　Ｈｅ１ｋｌｅ　ＨＣ：Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ、　　　Ｊ、、１７１：　　４９３，１９７
８（４１１１ｅａｔｈ　Ｊにほか：　Ｂｉｏｃｈｉｓ　
Ｂｉｏｐｈｙｏ　Ａｃｔａ８００：３０１　−．１９８
４ （５）　　Ｄｅｗｈｉｒｓｔ　ＦＥほか：　Ｊ、　Ｉｎ
＋＋ａｕｎｏ１．、１３５：２５６２−２５６８．１９
８５ ！６）　　Ｈｕｒｐｈｙ　Ｇ、　　Ｒｅｙｎｏｌｄｓ　
ＪＪ：　　ＢｉｏＥｓｓａｙｓ　２：５５−６０．１９
８５゜ （７）　　　Ｒｏｄａｎ　　Ｇ八、　　Ｒｏｄａｎ　　
ＳＲ：　　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　　ｏｆ　　ｔｈｅＯ
ｓｔｅｒｏｂｌａｓｔｉｃ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　
Ｉｎ　Ｐｅｃｋ　Ｈａ　（ｅｄ）：Ｂｏｎｅａｎｄ　Ｍ
ｉｎｅｒａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　　Ａｎｎｕａｌ
　　２．　　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｅｌｓｅｒｖｅｒ　　、１９８４　　ｐｐ　　２４４−
２８５（８１Ｂａｒｏｎ、　Ｒ，Ｖｉｇｎｅｒｙ　Ａ、
　Ｈｏｒｏｗｉｔｚ　Ｈ：Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ、　
　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ａｎｄ　　ｔｈｅ　　ｒｅｇ
ｕｌａｔｉｏｎｏｆ　　ｂｏｎｅ　　ｒｅｓｏｄｅｌｉ
ｎａ、　　Ｉｎ　　Ｐｅｃｋ　１１Ａ（ｅｄ、）：　Ｂ
ｏｎｅａｎｄ　　　Ｍｉｎｅｒａｌ　　Ｒｅ５ｅａｒｃ
ｈ、Ａｎｎｕａｌ　　２　　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　　１９８４　　ｐｐ１７５−２４
３（９１Ｃｈａｍｂｅｒｓ　ＴＪ：　　Ｔｈｅ　ｐａｔ
ｈｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　　ｔｈｅｏｓｔｅｏｃｌａ
ｓｊ、　　Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｐａｔｈｏｌ、、３８：　　
２４１−２５２．１９ＱＩ　　Ｓ、　Ｓａｋａｍｏｔｏ
ほか：　Ｉｎ　Ｐｅｃｋ　Ｉｔ４＾（ｅｄ、）：Ｂｏｎ
ｅ　ａｎｄ　Ｍｉｎｅｒａｌ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ａｎ
ｎｕａｌ　４　Ａｍｓｔｅｒｄａｍ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、　　　１９８６゜

【図面の簡単な説明】

第１図は、コラ−ゲナーゼの単離から定量までの操作を
示す工程図である。第２図は、骨吸収に対する本発明の
効果を示す実験結果であって、前培養後の培地中のカル
シウム濃を示す。第３図は、コラ−ゲナーゼ活性に対す
る本発明の効果を示す実験結果であって、培養摸の培地
中のコラ−ゲナーゼ活性を示す。第４図は、サンギナリ
ンおよびサンギナリンエタノラートの濃度とＰＴＨ刺激
骨吸収に対する作用を示す図である。第５図は、各種濃
度におけるサンギナリンおよびサンギナリンエエタノラ
ートの作用を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）歯周疾患を有する哺乳類動物の骨吸収およびコラ
   ーゲナーゼ放出を阻止する方法において、上記哺乳類動
   物に骨吸収阻害およびコラーゲナーゼ放出阻害量のベン
   ゾ−ｃ−フエナンスリジンアルカロイド化合物を投与す
   ることを特徴とする方法
2. （２）ベンゾ−ｃ−フエナンスリジンアルカロイド化合
   物は、サンギナリン、サンギナリンプソイドエタノラー
   トおよびその混合物からなる群より選ばれる特許請求の
   範囲第１項に記載の方法
3. （３）サンギナリン約１〜約２０μｍｏｌ／Ｌ量を投与
   する特許請求の範囲第２項に記載の方法
4. （４）サンギナリンプソイドエタノラート約０．２〜約
   ２０μｍｏｌ／Ｌ量を投与する特許請求の範囲第２項に
   記載の方法
5. （５）サンギナリン２０μｍｏｌ／Ｌ量を投与する特許
   請求の範囲第３項に記載の方法
6. （６）サンギナリンプソイドエタノラート５μｍｏｌ／
   Ｌ量を投与する特許請求の範囲第４項に記載の方法