JPH01160498A - 酵素の定量法およびそれに用いる装置 - Google Patents
酵素の定量法およびそれに用いる装置Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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- G01N33/521—Single-layer analytical elements
- G01N33/523—Single-layer analytical elements the element being adapted for a specific analyte
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- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、一般に反応生成物を生成する酵素触媒反応を
利用した、試料中の酵素分析対象物の定量方法および該
方法に用いる装置に関する。さらに詳しくは、本発明は
、酵素分析対象物がクロマトグラフ媒体上の反応部位に
固定化され、該分析対象物酵素触媒反応の基質および補
助因子ならびに該反応の反応生成物がクロマトグラフ溶
媒移動により該部位へ、または該部位から移動する、酵
素の定量方法に関する。
利用した、試料中の酵素分析対象物の定量方法および該
方法に用いる装置に関する。さらに詳しくは、本発明は
、酵素分析対象物がクロマトグラフ媒体上の反応部位に
固定化され、該分析対象物酵素触媒反応の基質および補
助因子ならびに該反応の反応生成物がクロマトグラフ溶
媒移動により該部位へ、または該部位から移動する、酵
素の定量方法に関する。
（従来の技術および発明が解決しようとする課題）試料
中の酵素分析対象物を検出する方法として技術分野で知
られたものには、一般に、分析しようとする試料を、そ
の反応が該酵素分析対象物により触媒される基質および
補助因子の混合物と接触させることが含まれる。試料中
に存在する酵素分析対象物の決定は、酵素分析対象物に
より触媒された反応の結果としての反応生成物の生成速
度または反応物（基質または補助因子）の消失速度を観
察することにより行うことかできる。酵素の存在を示す
ために反応生成物の生成速度を利用する場合には、生成
物は視覚によりまたは分光光度計により決定することが
できる。別法として、反応生成物が視覚または分光光度
計により容易に検出できない場合には、さらに引き続き
１またはそれ以上の反応に供し、容易に検出可能な反応
生成物を生成させることにより検出することができる。
中の酵素分析対象物を検出する方法として技術分野で知
られたものには、一般に、分析しようとする試料を、そ
の反応が該酵素分析対象物により触媒される基質および
補助因子の混合物と接触させることが含まれる。試料中
に存在する酵素分析対象物の決定は、酵素分析対象物に
より触媒された反応の結果としての反応生成物の生成速
度または反応物（基質または補助因子）の消失速度を観
察することにより行うことかできる。酵素の存在を示す
ために反応生成物の生成速度を利用する場合には、生成
物は視覚によりまたは分光光度計により決定することが
できる。別法として、反応生成物が視覚または分光光度
計により容易に検出できない場合には、さらに引き続き
１またはそれ以上の反応に供し、容易に検出可能な反応
生成物を生成させることにより検出することができる。
そのような反応には、染料前駆体物質の活性化がしばし
ば含まれる。酵素の存在を示すために反応物の消失速度
を利用する場合には、反応物は視覚または分光光度計に
より検出可能でなければならない。一般に利用される反
応物は補助因子のニコチンアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤＨ）であり、これは分光光度計で（３４０ｎｍにお
いて）または蛍光測定法により（４１０ｎｍにおいて）
検出することができる。この補助因子は多くの酵素触媒
反応においてＮＡＤ’に酸化されるが、ＮＡＤ’は特徴
的な分光学的または蛍光的シグナルを放出しない。
ば含まれる。酵素の存在を示すために反応物の消失速度
を利用する場合には、反応物は視覚または分光光度計に
より検出可能でなければならない。一般に利用される反
応物は補助因子のニコチンアデニンジヌクレオチド（Ｎ
ＡＤＨ）であり、これは分光光度計で（３４０ｎｍにお
いて）または蛍光測定法により（４１０ｎｍにおいて）
検出することができる。この補助因子は多くの酵素触媒
反応においてＮＡＤ’に酸化されるが、ＮＡＤ’は特徴
的な分光学的または蛍光的シグナルを放出しない。
従って、多くの酵素分析対象物触媒反応はＮＡＤＨの消
失を追跡することにより追跡される。
失を追跡することにより追跡される。
たとえばアラニンアミノトランスフェラーゼ（以下、Ａ
ＬＴという）酵素を検出するための方法が知られている
。この酵素の血中レベルの上昇は肝炎と関連している。
ＬＴという）酵素を検出するための方法が知られている
。この酵素の血中レベルの上昇は肝炎と関連している。
本発明と関連するものとしては、マレ−（Ｍｕｒｒａｙ
）のＭｅｔｈｏｄｓ Ｌｎ Ｃ１１ｎｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１０６２〜１０６５頁、ペス（Ｐ ｅｓｃ
ｅ）＆ワプラン（Ｗａｐｌａｎ）編、モスビー・パブリ
ッシング（Ｍｏｓｂｙ Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ、 ＋ ）、セントルイス、ＭＯ（１９８７）の開
示が挙げられる。ＡＬＴはＬ−アラニンのα−ケトゲル
タール酸とのアミノ基転位反応を触媒してピルビン酸と
Ｌ−グルタミン酸を生成する。ＡＬＴを検出するために
広く用いられている手順の一つによれば、血清をＬ−ア
ラニンおよびα−ケトゲルタール酸とともにインキュベ
ートし、一定の測定された長さの時間の後に反応を停止
させ、新しく生成したピルビン酸をジニトロフェニルヒ
ドラジン（ＤＮＰＨ）と反応させて対応するヒドラゾン
を得る。ついで反応混合物をアルカリ化して、ヒドラゾ
ンのアニオン形により青色を生じさせる。比色分析手順
は、ピルビン酸によりＡＬＴがフィードバック阻害され
る結果として一次性が制限されるという欠点を有する。
）のＭｅｔｈｏｄｓ Ｌｎ Ｃ１１ｎｉｃａｌＣｈｅｍ
ｉｓｔｒｙ、１０６２〜１０６５頁、ペス（Ｐ ｅｓｃ
ｅ）＆ワプラン（Ｗａｐｌａｎ）編、モスビー・パブリ
ッシング（Ｍｏｓｂｙ Ｐ ｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｃｏ、 ＋ ）、セントルイス、ＭＯ（１９８７）の開
示が挙げられる。ＡＬＴはＬ−アラニンのα−ケトゲル
タール酸とのアミノ基転位反応を触媒してピルビン酸と
Ｌ−グルタミン酸を生成する。ＡＬＴを検出するために
広く用いられている手順の一つによれば、血清をＬ−ア
ラニンおよびα−ケトゲルタール酸とともにインキュベ
ートし、一定の測定された長さの時間の後に反応を停止
させ、新しく生成したピルビン酸をジニトロフェニルヒ
ドラジン（ＤＮＰＨ）と反応させて対応するヒドラゾン
を得る。ついで反応混合物をアルカリ化して、ヒドラゾ
ンのアニオン形により青色を生じさせる。比色分析手順
は、ピルビン酸によりＡＬＴがフィードバック阻害され
る結果として一次性が制限されるという欠点を有する。
他の手順によれば、ＮＡＤＨが乳酸デヒドロゲナーゼと
ともに反応媒体中に入れられる。乳酸デヒドロゲナーゼ
はピルビン酸の乳酸への変換を触媒し、それと同時に還
元型ＮＡＤＨが酸化ＮＡＤ”に酸化される。ＮＡＤＨの
消失は、分光光度計によりまたは蛍光的に追跡する。
ともに反応媒体中に入れられる。乳酸デヒドロゲナーゼ
はピルビン酸の乳酸への変換を触媒し、それと同時に還
元型ＮＡＤＨが酸化ＮＡＤ”に酸化される。ＮＡＤＨの
消失は、分光光度計によりまたは蛍光的に追跡する。
同様の方法が、アスパラギン酸アミノトランスフェラー
ゼ（以下、ＡＳＴという）酵素の検出についても知られ
ている。ＡＳＴの血中レベルの上昇は、急性心筋梗塞、
急性膵炎、ウィルス肝炎、毒性肝炎および急性（肝）硬
変と関連している。ＡＳＴは、アスパラギン酸およびα
−ケトゲルタール酸のオキザロ酢酸およびグルタミン酸
へのアミノ基転位反応を触媒する。この酵素を検出する
ための方法には、試験しようとする試料をアスパラギン
酸、α−ケトゲルタール酸および２，４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンを含有する溶液とともにインキュベート
し、オキザロ酢酸のＡＳＴ触媒反応生成が２，４−ジニ
トロフェニルヒドラゾン誘導体（５２０ｎｍで光を吸収
する）の生成と共役するようにすることが含まれる。従
って、試料流体中に存在するＡＳＴは色シグナルにより
示すことができ、この色シグナルは分光光度計で測定す
るかまたは色チャートと比較することができるのでＡＳ
Ｔの存在を半定量的に示すことが可能となる。
ゼ（以下、ＡＳＴという）酵素の検出についても知られ
ている。ＡＳＴの血中レベルの上昇は、急性心筋梗塞、
急性膵炎、ウィルス肝炎、毒性肝炎および急性（肝）硬
変と関連している。ＡＳＴは、アスパラギン酸およびα
−ケトゲルタール酸のオキザロ酢酸およびグルタミン酸
へのアミノ基転位反応を触媒する。この酵素を検出する
ための方法には、試験しようとする試料をアスパラギン
酸、α−ケトゲルタール酸および２，４−ジニトロフェ
ニルヒドラジンを含有する溶液とともにインキュベート
し、オキザロ酢酸のＡＳＴ触媒反応生成が２，４−ジニ
トロフェニルヒドラゾン誘導体（５２０ｎｍで光を吸収
する）の生成と共役するようにすることが含まれる。従
って、試料流体中に存在するＡＳＴは色シグナルにより
示すことができ、この色シグナルは分光光度計で測定す
るかまたは色チャートと比較することができるのでＡＳ
Ｔの存在を半定量的に示すことが可能となる。
２．４−ジニトロフェニルヒドラゾン染料前駆体の代わ
りにアゾツエン（ａｚｏｚｅｎｅ）染料を用いた同様の
手順が知られており、該アゾツエン染料はオキザロ酢酸
と反応することができる。ＡＳＴのさらに池の検出方法
も知られており、その方法には、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ
”とともにリンゴ酸デヒドロゲナーセを利用した反応に
おいて、オキザロ酢酸のリンゴ酸への変換が含まれてい
る。そのような分析的反応は試験管やマイクロタイター
ウェルのような反応容器中で行うこともできるが、吸収
浸漬ストリップ上で行うこともてきる。
りにアゾツエン（ａｚｏｚｅｎｅ）染料を用いた同様の
手順が知られており、該アゾツエン染料はオキザロ酢酸
と反応することができる。ＡＳＴのさらに池の検出方法
も知られており、その方法には、ＮＡＤＨおよびＮＡＤ
”とともにリンゴ酸デヒドロゲナーセを利用した反応に
おいて、オキザロ酢酸のリンゴ酸への変換が含まれてい
る。そのような分析的反応は試験管やマイクロタイター
ウェルのような反応容器中で行うこともできるが、吸収
浸漬ストリップ上で行うこともてきる。
本発明に関連するものとしてフォージオン（Ｆ。
ｒｇｉｏｎｅ）の米国特許筒３．８７５．０１４号明細
書の開示があり、これには上記反応に従ってアスパラギ
ン酸、α−ケトゲルタール酸およびジアゾニウム塩を利
用した血清中のＡＳＴ濃度の決定のための試験インジケ
ーターが開示されている。このインジケーターは一対の
多孔質ストリップからなり、各ストリップはオキザロ酢
酸に対して選択透過性の接着剤により互いに接着されて
いる。第一のストリップは基質のし一アスパラギン酸お
よびα−ケトゲルタール酸を含んでおり、第二のストリ
ップは乾燥ジアゾニウム塩を含んでいる。インジケータ
ーを血清と接触させると、もし血清がＡＳＴを含んでい
るならば基質の反応が触媒されてオキザロ酢酸が生成す
ることになる。こうして生成したオキザロ酢酸は第二の
ストリップの方へ拡散していき、ジアゾニウム塩との色
反応を活性化する。
書の開示があり、これには上記反応に従ってアスパラギ
ン酸、α−ケトゲルタール酸およびジアゾニウム塩を利
用した血清中のＡＳＴ濃度の決定のための試験インジケ
ーターが開示されている。このインジケーターは一対の
多孔質ストリップからなり、各ストリップはオキザロ酢
酸に対して選択透過性の接着剤により互いに接着されて
いる。第一のストリップは基質のし一アスパラギン酸お
よびα−ケトゲルタール酸を含んでおり、第二のストリ
ップは乾燥ジアゾニウム塩を含んでいる。インジケータ
ーを血清と接触させると、もし血清がＡＳＴを含んでい
るならば基質の反応が触媒されてオキザロ酢酸が生成す
ることになる。こうして生成したオキザロ酢酸は第二の
ストリップの方へ拡散していき、ジアゾニウム塩との色
反応を活性化する。
酵素分析対象物の定量検出のための種々のアッセイ法は
、しかしながら、酵素触媒反応の反応動力学的性質によ
り正確さが制限される傾向にある。
、しかしながら、酵素触媒反応の反応動力学的性質によ
り正確さが制限される傾向にある。
一般にそのようなアッセイでは、未知の量の酵素を含有
する試料を該酵素に対する基質と接触させ、所定期間に
わたる反応で生成した生成物の量を決定する。反応生成
物の量は反応の平均速度を示すものであり、また反応の
平均速度はそれ自身試料中の酵素の量と関係付けられる
。しかし、存在する酵素の量を決定するのに反応の平均
速度を利用することは、典型的な反応条件下ではそのよ
うな反応は一般に一定の反応速度を示さないという事実
により制限されることになる。一定容積の基質／補助因
子溶液中で行なわれる酵素触媒反応は数多くの始動（ｓ
ｔａｒｔｕｐ）および濃度の影響を受け、これらは反応
速度に影響する。一般に酵素触媒反応は、「定常状態」
に達するまでの低い始動速度で特徴付けられる。反応が
進行し酵素基質／補助因子グループの１種が消費されそ
の濃度が減少するにつれて、反応速度は低下するであろ
う。反応速度はまた、反応生成物か蓄積することによる
フィードバック阻害の結果としても低下するであろう。
する試料を該酵素に対する基質と接触させ、所定期間に
わたる反応で生成した生成物の量を決定する。反応生成
物の量は反応の平均速度を示すものであり、また反応の
平均速度はそれ自身試料中の酵素の量と関係付けられる
。しかし、存在する酵素の量を決定するのに反応の平均
速度を利用することは、典型的な反応条件下ではそのよ
うな反応は一般に一定の反応速度を示さないという事実
により制限されることになる。一定容積の基質／補助因
子溶液中で行なわれる酵素触媒反応は数多くの始動（ｓ
ｔａｒｔｕｐ）および濃度の影響を受け、これらは反応
速度に影響する。一般に酵素触媒反応は、「定常状態」
に達するまでの低い始動速度で特徴付けられる。反応が
進行し酵素基質／補助因子グループの１種が消費されそ
の濃度が減少するにつれて、反応速度は低下するであろ
う。反応速度はまた、反応生成物か蓄積することによる
フィードバック阻害の結果としても低下するであろう。
分析対象物酵素触媒反応が反応条件の変化によって、ま
たは阻害剤の添加によって停止する場合には、反応の停
止は全く即時には行なわれないので、このことがまた平
均反応動力学の決定に不確かさをもたらす。従って、分
析対象物酵素触媒反応の真の定常状態反応動力学は、限
られた期間での評価により示された平均反応速度とは有
為に異なるものである。それゆえ平均反応速度の決定に
基つく酵素濃度の決定は、定常状態反応動力学か平均反
応速度と異なる程度に不正確になるであろう。
たは阻害剤の添加によって停止する場合には、反応の停
止は全く即時には行なわれないので、このことがまた平
均反応動力学の決定に不確かさをもたらす。従って、分
析対象物酵素触媒反応の真の定常状態反応動力学は、限
られた期間での評価により示された平均反応速度とは有
為に異なるものである。それゆえ平均反応速度の決定に
基つく酵素濃度の決定は、定常状態反応動力学か平均反
応速度と異なる程度に不正確になるであろう。
従って、一定の反応の定常状態における反応動力学、好
ましくは任意の時間での即時反応動力学を評価し得るア
ッセイ法を提供することが望まれている。
ましくは任意の時間での即時反応動力学を評価し得るア
ッセイ法を提供することが望まれている。
（課題を解決するための手段）
本発明は、調節量の基質／補助因子グループの分析対象
物酵素触媒反応の速度を決定することによる、試料中に
存在する酵素分析対象物の定量方法に関する。さらに詳
しくは、酵素分析対象物の存在は基質／補助因子グルー
プの１種の触媒反応により決定され、本発明の方法は、 （ａ）分析しようとする一定量の試料中に存在する酵素
分析対象物をクロマトグラフ媒体上の反応部位に固定化
し、 （ｂ）基質／補助因子グループの１種を含有する溶液に
該クロマトグラフ媒体を接触させ、その際、少なくとも
１種の反応生成物を生じさせるための該基質／補助因子
グループの１種の反応は、存在する酵素の量に関連した
速度で該酵素分析対象物により触媒され、 （ｃ）該溶液を該反応部位に移動させ、該酵素の存在下
で該基質／補助因子グループの１種を反応させて該反応
生成物を生成させ、 （ｄ）該溶液および該反応生成物を該反応部位から該反
応部位の下流に位置する検出領域に移動させ、ついて （ｅ）（ｉ）基質／補助因子グループの１種の消失速度
かまたは（ｉ ｉ）該反応生成物の生成速度を測定する
ことを特徴とする。
物酵素触媒反応の速度を決定することによる、試料中に
存在する酵素分析対象物の定量方法に関する。さらに詳
しくは、酵素分析対象物の存在は基質／補助因子グルー
プの１種の触媒反応により決定され、本発明の方法は、 （ａ）分析しようとする一定量の試料中に存在する酵素
分析対象物をクロマトグラフ媒体上の反応部位に固定化
し、 （ｂ）基質／補助因子グループの１種を含有する溶液に
該クロマトグラフ媒体を接触させ、その際、少なくとも
１種の反応生成物を生じさせるための該基質／補助因子
グループの１種の反応は、存在する酵素の量に関連した
速度で該酵素分析対象物により触媒され、 （ｃ）該溶液を該反応部位に移動させ、該酵素の存在下
で該基質／補助因子グループの１種を反応させて該反応
生成物を生成させ、 （ｄ）該溶液および該反応生成物を該反応部位から該反
応部位の下流に位置する検出領域に移動させ、ついて （ｅ）（ｉ）基質／補助因子グループの１種の消失速度
かまたは（ｉ ｉ）該反応生成物の生成速度を測定する
ことを特徴とする。
反応生成物の生成速度は、該反応生成物をさらにｌまた
はそれ以上の反応に供し、（ｉ）該ｌまたはそれ以上の
反応における反応物の消失速度かまたは（ｉｉ）該１ま
たはそれ以上の反応における生成物の生成速度を測定す
ることにより決定する。
はそれ以上の反応に供し、（ｉ）該ｌまたはそれ以上の
反応における反応物の消失速度かまたは（ｉｉ）該１ま
たはそれ以上の反応における生成物の生成速度を測定す
ることにより決定する。
反応物の消失速度または生成物の生成速度は、検出領域
中の選択された部位での反応物または生成物の濃度を測
定することにより決定することができる。本発明の方法
は、定常状態および非定常状態の両方の酵素反応動力学
を決定するのに用いることができる。本発明はさらに、
本発明の方法を行うだめのキットをも提供する。
中の選択された部位での反応物または生成物の濃度を測
定することにより決定することができる。本発明の方法
は、定常状態および非定常状態の両方の酵素反応動力学
を決定するのに用いることができる。本発明はさらに、
本発明の方法を行うだめのキットをも提供する。
（発明の構成および効果）
本発明は、試料中に存在する酵素を定量するための新規
な方法を提供するものであり、その場合、酵素の存在は
基質／補助因子グループの１種の酵素触媒反応により決
定される。本発明の方法は、限られた期間における分析
対象物酵素の平均速度を測定することにより酵素分析対
象物の濃度を決定する従来のアッセイ法の制限を除くも
のである。
な方法を提供するものであり、その場合、酵素の存在は
基質／補助因子グループの１種の酵素触媒反応により決
定される。本発明の方法は、限られた期間における分析
対象物酵素の平均速度を測定することにより酵素分析対
象物の濃度を決定する従来のアッセイ法の制限を除くも
のである。
本発明はまた、意味のある結果を得−るためにアッセイ
試薬とともに試料をインキュベートする時間と計らなけ
ればならなかった従来のアッセイ法の制限を除くもので
ある。分析対象物含有試料を一定容量の基質／補助因子
含有溶液と接触させ、反６物および生成物の濃度を酵素
触媒反応の経時的に変化させる代わりに、本発明では試
料溶液中の存在する酵素を反応部位に固定化し、新鮮な
基質／補助因子含有溶液を該反応部位に連続的に送り込
む。さらに、反応生成物および未反応の基質／補助因子
物質を含有する溶液は該反応部位からクロマトグラフ媒
体に沿って移動させ、反応生成物および反応物が該反応
部位において本質的に一定のままであるようにする。未
反応の基質／補助因子グループおよび反応の反応生成物
を含有する溶液の移動は、結合させた酵素の量、酵素の
位置の幾何図形的配列および溶液の流速により決定され
るように、クロマトグラフの長さのどの位置に存在する
反応生成物および／または基質／補助因子グループの１
種の濃度も特定の時間おける反応速度を示し得るような
ものにする。
試薬とともに試料をインキュベートする時間と計らなけ
ればならなかった従来のアッセイ法の制限を除くもので
ある。分析対象物含有試料を一定容量の基質／補助因子
含有溶液と接触させ、反６物および生成物の濃度を酵素
触媒反応の経時的に変化させる代わりに、本発明では試
料溶液中の存在する酵素を反応部位に固定化し、新鮮な
基質／補助因子含有溶液を該反応部位に連続的に送り込
む。さらに、反応生成物および未反応の基質／補助因子
物質を含有する溶液は該反応部位からクロマトグラフ媒
体に沿って移動させ、反応生成物および反応物が該反応
部位において本質的に一定のままであるようにする。未
反応の基質／補助因子グループおよび反応の反応生成物
を含有する溶液の移動は、結合させた酵素の量、酵素の
位置の幾何図形的配列および溶液の流速により決定され
るように、クロマトグラフの長さのどの位置に存在する
反応生成物および／または基質／補助因子グループの１
種の濃度も特定の時間おける反応速度を示し得るような
ものにする。
本発明の実施形態に従って、クロマトグラフ媒体が好ま
しくはストリップの形態で提供される。
しくはストリップの形態で提供される。
分析しようとする一定量の試料をクロマトグラフ媒体と
反応部位で接触させると試料中に存在する酵素は該部位
に固定化される。ついでクロマトグラフ媒体を、基質／
補助因子グループの１種を含む特定の反応システムに対
して選択されたｐＨおよびイオン状態を有するクロマト
グラフ的に可動の溶液と接触させる。上記反応システム
の基質／補助因子グループの１種は、分析対象物酵素に
より触媒された反応において消費され反応生成物を生成
する。基質／補助因子グループの１種を含有する溶液は
、クロマトグラフ媒体上を反応部位まで移動していき、
そこで酵素基質および補助因子は分析対象物酵素により
触媒された反応中で消費され、１またはそれ以上の反応
生成物を生成する。
反応部位で接触させると試料中に存在する酵素は該部位
に固定化される。ついでクロマトグラフ媒体を、基質／
補助因子グループの１種を含む特定の反応システムに対
して選択されたｐＨおよびイオン状態を有するクロマト
グラフ的に可動の溶液と接触させる。上記反応システム
の基質／補助因子グループの１種は、分析対象物酵素に
より触媒された反応において消費され反応生成物を生成
する。基質／補助因子グループの１種を含有する溶液は
、クロマトグラフ媒体上を反応部位まで移動していき、
そこで酵素基質および補助因子は分析対象物酵素により
触媒された反応中で消費され、１またはそれ以上の反応
生成物を生成する。
ついでこれらの反応生成物は、反応部位に移動した一定
量の流体中に存在する基質／補助因子グループの未反応
成分とともに、移動が停止するまで該反応部位からクロ
マトグラフ媒体に沿って検出領域を通って移動する。そ
のような移動は、溶媒がクロマトグラフ媒体の第一の末
端から除かれるか、または物質がクロマトグラフ媒体の
第二の末端に達したときなどのようにクロマトグラフ媒
体が飽和したときに停止する。
量の流体中に存在する基質／補助因子グループの未反応
成分とともに、移動が停止するまで該反応部位からクロ
マトグラフ媒体に沿って検出領域を通って移動する。そ
のような移動は、溶媒がクロマトグラフ媒体の第一の末
端から除かれるか、または物質がクロマトグラフ媒体の
第二の末端に達したときなどのようにクロマトグラフ媒
体が飽和したときに停止する。
反応部位への未反応溶液および反応部位からの反応溶液
の流れが一定であるため、基質、補助因子および反応生
成物の濃度は該反応部位において実質的に一定である。
の流れが一定であるため、基質、補助因子および反応生
成物の濃度は該反応部位において実質的に一定である。
酵素基質および補助因子の濃度が変化することによる動
力学的影響が回避されるように、分析対象物酵素触媒反
応のフィードバック阻害も回避されるであろう。始動効
果の結果として初期の速度を除いては、反応部位におけ
る酵素触媒反応の速度は一般に実質的に一定であるであ
ろう。基質／補助因子過剰の適当な条件下では、定常状
態における反応速度は分析対象物酵素の濃度と直接関係
付けられるであろう。反応部位から流れ出る溶液中の基
質、補助因子および反応生成物の濃度は、該反応部位に
おける酵素触媒反応の反応速度と直接関係付けられるで
あろう。
力学的影響が回避されるように、分析対象物酵素触媒反
応のフィードバック阻害も回避されるであろう。始動効
果の結果として初期の速度を除いては、反応部位におけ
る酵素触媒反応の速度は一般に実質的に一定であるであ
ろう。基質／補助因子過剰の適当な条件下では、定常状
態における反応速度は分析対象物酵素の濃度と直接関係
付けられるであろう。反応部位から流れ出る溶液中の基
質、補助因子および反応生成物の濃度は、該反応部位に
おける酵素触媒反応の反応速度と直接関係付けられるで
あろう。
従って、反応部位の下流のクロマトグラフ行路に沿った
反応生成物、酵素基質および補助因子の濃度は、ある期
間にわたる該反応部位での酵素触媒反応の反応速度の経
時的な記録を提供することになる。従って、本発明は酵
素の未知濃度を決定するのに有用であるばかりでなく、
より一般的に酵素の動力学を研究するのにも有用である
。
反応生成物、酵素基質および補助因子の濃度は、ある期
間にわたる該反応部位での酵素触媒反応の反応速度の経
時的な記録を提供することになる。従って、本発明は酵
素の未知濃度を決定するのに有用であるばかりでなく、
より一般的に酵素の動力学を研究するのにも有用である
。
従って、検出領域に沿った反応生成物、酵素基質および
補助因子よりなる群から選ばれた１種のｌ農度を決定す
ることは、調節された反応条件下で試料中に存在する酵
素分析対象物の濃度を示すことになるであろう。一般に
、検出領域の全領域、または反応生成物および基質／補
助因子グループの１種の濃度が非定常状態反応の動力学
を示す第二の末端に近い小領域を除く検出領域の全領域
に沿った部位を、基質および補助因子の定常状態反応の
間に生成された生成物および消費された反応物の濃度を
決定する分析のために選択する。にもかかわらず、始動
や反応系の他の異常な反応動力学を、そのような反応動
力学に対応する検出領域に沿った部位に存在する生成物
の量を測定することにより分析することもできる。
補助因子よりなる群から選ばれた１種のｌ農度を決定す
ることは、調節された反応条件下で試料中に存在する酵
素分析対象物の濃度を示すことになるであろう。一般に
、検出領域の全領域、または反応生成物および基質／補
助因子グループの１種の濃度が非定常状態反応の動力学
を示す第二の末端に近い小領域を除く検出領域の全領域
に沿った部位を、基質および補助因子の定常状態反応の
間に生成された生成物および消費された反応物の濃度を
決定する分析のために選択する。にもかかわらず、始動
や反応系の他の異常な反応動力学を、そのような反応動
力学に対応する検出領域に沿った部位に存在する生成物
の量を測定することにより分析することもできる。
分析対象物酵素触媒反面の反応生成物か視覚または分光
測光では容易に検出できない場合がしばしばある。その
ような場合には、さらに１またはそれ以上の反応を分析
対象物酵素触媒反応のあとに行って、視覚または分光測
光により容易に検出可能な反応生成物または反応物を生
成または消費することが望ましい。基質／補助因子含有
溶液中にさらに別の試薬を用いることもできる。そのよ
うな試薬は、追加した反応において分析対象物酵素触媒
反応の反応生成物と反応して検出可能な反応物を消費す
るかまたは検出可能な反応生成物を生成する。追加した
反応は、第一の反応の１またはそれ以上の反応生成物が
第二の反応における反応物であるという点で連続的なも
のである。一般に、一対の追加反応を行うための反応溶
液は、第一の反応の反応生成物を除いて第二の反応のた
めのすべての反応物を含んでいる。従って、第一の反応
を触媒する分析対象物酵素が存在しないときは、第二の
反応によって反応物が消費されることも反応生成物が生
成することもないであろう。追加反応は、基質／補助因
子含有溶液中に存在する反応物が、反応部位に存在する
上記条件下での分析対象物酵素触媒反応の１またはそれ
以上の反応生成物と容易に反応を完了することができる
ようなものであるのが好ましい。さらに、追加した第二
の反応の反応速度は速度制限的なものでないのが好まし
い。
測光では容易に検出できない場合がしばしばある。その
ような場合には、さらに１またはそれ以上の反応を分析
対象物酵素触媒反応のあとに行って、視覚または分光測
光により容易に検出可能な反応生成物または反応物を生
成または消費することが望ましい。基質／補助因子含有
溶液中にさらに別の試薬を用いることもできる。そのよ
うな試薬は、追加した反応において分析対象物酵素触媒
反応の反応生成物と反応して検出可能な反応物を消費す
るかまたは検出可能な反応生成物を生成する。追加した
反応は、第一の反応の１またはそれ以上の反応生成物が
第二の反応における反応物であるという点で連続的なも
のである。一般に、一対の追加反応を行うための反応溶
液は、第一の反応の反応生成物を除いて第二の反応のた
めのすべての反応物を含んでいる。従って、第一の反応
を触媒する分析対象物酵素が存在しないときは、第二の
反応によって反応物が消費されることも反応生成物が生
成することもないであろう。追加反応は、基質／補助因
子含有溶液中に存在する反応物が、反応部位に存在する
上記条件下での分析対象物酵素触媒反応の１またはそれ
以上の反応生成物と容易に反応を完了することができる
ようなものであるのが好ましい。さらに、追加した第二
の反応の反応速度は速度制限的なものでないのが好まし
い。
追加した反応が分析対象物酵素触媒反応の反応生成物の
存在下で自然に進行する場合には、第二の反応は反応部
位または反応部位のわずかに下流で起こり得るし起こる
であろう。従って、この反応で生成された検出可能な反
応生成物、またはこの反応で消費された検出可能な反応
物の濃度は、反応部位の下流域で測定することができる
。
存在下で自然に進行する場合には、第二の反応は反応部
位または反応部位のわずかに下流で起こり得るし起こる
であろう。従って、この反応で生成された検出可能な反
応生成物、またはこの反応で消費された検出可能な反応
物の濃度は、反応部位の下流域で測定することができる
。
しかしながら、追加した反応が分析対象物酵素触媒反応
の反応生成物の存在下で自然に進行しない場合がある。
の反応生成物の存在下で自然に進行しない場合がある。
そのような場合には、追加の反応か完了まで進行するよ
う反応を触媒する必要かある。そのような追加の反応シ
ステムを利用するために、本発明は、分析対象物酵素を
固定化した第一の反応部位に位置するか、好ましくはそ
の下流に位置する第二の反応部位に酵素または他の触媒
を固定化したアッセイ装置を提供する。本発明の一実施
態様に従って、基質／補助因子の１種および追加反応の
反応物を含有する溶液は第一の反応部位に移動し、そこ
で分析対象物酵素は基質／補助因子の１種の反応を触媒
して１またはそれ以上の反応生成物を生成する。これら
の反応生成物は、未反応の基質／補助因子グループの１
種および追加反応の反応物とともに、第一の反応部位か
または第一の反応部位の下流に位置する第二の反応部位
で追加反応のための触媒と接触する。ついで触媒は分析
対象物酵素触媒反応の反応生成物の反応を触媒し、その
反応において視覚または分光測光的に検出可能な反応物
が消費されるかまたは同様に検出可能な反応生成物が生
成される。反応条件ならびに反応物の量および同定は、
分析対象物酵素触媒反応の反応生成物が完全に消費され
るように選択する。
う反応を触媒する必要かある。そのような追加の反応シ
ステムを利用するために、本発明は、分析対象物酵素を
固定化した第一の反応部位に位置するか、好ましくはそ
の下流に位置する第二の反応部位に酵素または他の触媒
を固定化したアッセイ装置を提供する。本発明の一実施
態様に従って、基質／補助因子の１種および追加反応の
反応物を含有する溶液は第一の反応部位に移動し、そこ
で分析対象物酵素は基質／補助因子の１種の反応を触媒
して１またはそれ以上の反応生成物を生成する。これら
の反応生成物は、未反応の基質／補助因子グループの１
種および追加反応の反応物とともに、第一の反応部位か
または第一の反応部位の下流に位置する第二の反応部位
で追加反応のための触媒と接触する。ついで触媒は分析
対象物酵素触媒反応の反応生成物の反応を触媒し、その
反応において視覚または分光測光的に検出可能な反応物
が消費されるかまたは同様に検出可能な反応生成物が生
成される。反応条件ならびに反応物の量および同定は、
分析対象物酵素触媒反応の反応生成物が完全に消費され
るように選択する。
分析対象物酵素触媒反応の反応生成物の反応が定量的で
完全なものであるときは、その第一の反第二の反応部位
の下流に移動した検出可能な反応物または反応生成物の
量により決定することかできる。追加反応の反応速度は
分析対象物酵素触媒反応の反応速度に対応するので、分
析対象物酵素触媒反応の動力学、従って分析対象物酵素
の濃度は追加反応を観察することによって決定すること
ができる。
完全なものであるときは、その第一の反第二の反応部位
の下流に移動した検出可能な反応物または反応生成物の
量により決定することかできる。追加反応の反応速度は
分析対象物酵素触媒反応の反応速度に対応するので、分
析対象物酵素触媒反応の動力学、従って分析対象物酵素
の濃度は追加反応を観察することによって決定すること
ができる。
単一反応部位装置
第１ａ図、第１ｂ図および第１ｃ図には、試料中に存在
する酵素の定量のための単一反応部位試験装置１０を示
しである。本装置は、不活性な支持ストリップ１２に付
着させた一定の長さのクロマトグラフ媒体１１からなる
。クロマトグラフ媒体１１は、クロマトグラフ移動が開
始される第一の末端１３およびクロマトグラフ移動が終
了する第二の末端１４を有している。クロマトグラフ媒
体１１は、クロマトグラフ物質の第一の末端１３の方へ
配列した反応部位１５および該反応部位１５とクロマト
グラフ物質の第二の末端１１１との間によび他の図にお
いて注意すべきは、第二の末端１４の近くにある破線は
、この図形と反応部位１５とのあいだに広範な距離が存
在し、このことによ・て基質／補助因子物質および反応
生成物のクロマトグラフ移動が反応部位１５のはるか遠
方にまで達するようにしていることを示していることで
ある。
する酵素の定量のための単一反応部位試験装置１０を示
しである。本装置は、不活性な支持ストリップ１２に付
着させた一定の長さのクロマトグラフ媒体１１からなる
。クロマトグラフ媒体１１は、クロマトグラフ移動が開
始される第一の末端１３およびクロマトグラフ移動が終
了する第二の末端１４を有している。クロマトグラフ媒
体１１は、クロマトグラフ物質の第一の末端１３の方へ
配列した反応部位１５および該反応部位１５とクロマト
グラフ物質の第二の末端１１１との間によび他の図にお
いて注意すべきは、第二の末端１４の近くにある破線は
、この図形と反応部位１５とのあいだに広範な距離が存
在し、このことによ・て基質／補助因子物質および反応
生成物のクロマトグラフ移動が反応部位１５のはるか遠
方にまで達するようにしていることを示していることで
ある。
第１ａ図、第１ｂ図および第１ｃ図の装置１０を使用す
る手順に従って、酵素の存在について分析しようとする
物質の液体試料を反応部位１５に加える。ついで装置」
０の第一の末端１３を、その反応が該分析対象物酵素に
より触媒される基質／補助因子グループの１種からなる
溶液１８を含む容器１７中の内容物と接触させる。つい
で基質／補助因子含有溶液はクロマトグラフ媒体１１の
長さ方向を反応部位１５まで進行してゆき、そこで分析
対象物酵素は基質／補助因子グループの１種の反応を触
媒する働きをして■またはそれ以上の反応生成物を生成
する。基質／補助因子グループの未反応成分および分析
対象物酵素触媒反応の反応生成物からなる溶液は、反応
部位がらクロマトグラフ媒体の第二の末端１４の方へ向
かって検出〕 領域１６の方へおよび検出領域１４を
通って移動する。反応生成物および基質／補助因子グル
ープの１種を含む溶液のクロマトグラフ移動は、溶液の
フロントが第二の末端１４に達するかまたはその量の溶
液が使い果たされるまで続く。ついで検出領域を評価し
て、（ｉ）基質／補助因子グループおよび（ｉｉ）反応
生成物よりなる群から選ばれた１種の濃度を検出する。
る手順に従って、酵素の存在について分析しようとする
物質の液体試料を反応部位１５に加える。ついで装置」
０の第一の末端１３を、その反応が該分析対象物酵素に
より触媒される基質／補助因子グループの１種からなる
溶液１８を含む容器１７中の内容物と接触させる。つい
で基質／補助因子含有溶液はクロマトグラフ媒体１１の
長さ方向を反応部位１５まで進行してゆき、そこで分析
対象物酵素は基質／補助因子グループの１種の反応を触
媒する働きをして■またはそれ以上の反応生成物を生成
する。基質／補助因子グループの未反応成分および分析
対象物酵素触媒反応の反応生成物からなる溶液は、反応
部位がらクロマトグラフ媒体の第二の末端１４の方へ向
かって検出〕 領域１６の方へおよび検出領域１４を
通って移動する。反応生成物および基質／補助因子グル
ープの１種を含む溶液のクロマトグラフ移動は、溶液の
フロントが第二の末端１４に達するかまたはその量の溶
液が使い果たされるまで続く。ついで検出領域を評価し
て、（ｉ）基質／補助因子グループおよび（ｉｉ）反応
生成物よりなる群から選ばれた１種の濃度を検出する。
第２ａ〜２ｄ図は、第１ａ図に示した装置の正平面図で
ある。第２ａ図は、反応部位１５にある量の分析対象物
含有試料を含浸させた装置１ｏを示している。装置は基
質／補助因子グループの１種を含有する溶液１８と接触
しており、溶液はクロマトグラフ媒体ｌｌの第一の末端
１３から移動をしつつあり、溶媒のフロント１９は第一
の末端■３と反応部位１５との間にある。第２ｂ図では
、溶媒のフロント１９は反応部位１５を通りすぎており
、反応部位１５の下流には基質／補助因子グループの１
種の分析対象物酵素触媒反応の始動相のあいだに生成し
た検出可能な反応生成物が多量に含まれている。第２ｃ
図では、溶媒のフロント１９はさらにクロマトグラフス
トリップの第二の末端Ｉ４の方へ進行している。同時に
反応部位１５で起こっていた分析対象物酵素触媒反応は
始動相を過ぎて、検出可能な反応生成物が一層多量に生
成することから示されるように定常状態速度で進行して
いる。反応の始動の動力学から定常状態の動力学への移
行は徐々に行なわれ特定の時間に行なわれるように正確
に設計できるものではないが、そのような始動の動力学
と定常状態の動力学とのあいだの境界は定常状態反応の
フロンｌ−２０で示される。第２ｄ図においては、溶媒
フロント１９はクロマトグラフ媒体の第二の末端１４に
達しており、クロマトグラフ移動は終わっている。
ある。第２ａ図は、反応部位１５にある量の分析対象物
含有試料を含浸させた装置１ｏを示している。装置は基
質／補助因子グループの１種を含有する溶液１８と接触
しており、溶液はクロマトグラフ媒体ｌｌの第一の末端
１３から移動をしつつあり、溶媒のフロント１９は第一
の末端■３と反応部位１５との間にある。第２ｂ図では
、溶媒のフロント１９は反応部位１５を通りすぎており
、反応部位１５の下流には基質／補助因子グループの１
種の分析対象物酵素触媒反応の始動相のあいだに生成し
た検出可能な反応生成物が多量に含まれている。第２ｃ
図では、溶媒のフロント１９はさらにクロマトグラフス
トリップの第二の末端Ｉ４の方へ進行している。同時に
反応部位１５で起こっていた分析対象物酵素触媒反応は
始動相を過ぎて、検出可能な反応生成物が一層多量に生
成することから示されるように定常状態速度で進行して
いる。反応の始動の動力学から定常状態の動力学への移
行は徐々に行なわれ特定の時間に行なわれるように正確
に設計できるものではないが、そのような始動の動力学
と定常状態の動力学とのあいだの境界は定常状態反応の
フロンｌ−２０で示される。第２ｄ図においては、溶媒
フロント１９はクロマトグラフ媒体の第二の末端１４に
達しており、クロマトグラフ移動は終わっている。
この時点で定常状態反応フロント２０は検出領域Ｉ６を
通過して検出領域１６の向こう側へ移動しており、分析
対象物触媒反応の定常状態速度、従って存在する分析対
象物酵素の量は存在する反応生成物の濃度を測定するこ
とにより評価することができる。
通過して検出領域１６の向こう側へ移動しており、分析
対象物触媒反応の定常状態速度、従って存在する分析対
象物酵素の量は存在する反応生成物の濃度を測定するこ
とにより評価することができる。
２反応部位装置
第３ａ図および第３ｂ図には、試料中の分析対象物酵素
の濃度を測定するための２反応部位試験装置３０が示し
である。該装置は、不活性な固体支持体３２に付着させ
たクロマトグラフ媒体３１からなる。クロマトグラフ媒
体３１は、クロマトグラフ移動が開始される第一の末端
３３およびクロマトグラフ移動が終了する第二の末端３
４を有している。クロマトグラフ媒体は、第一の反応を
触媒することのできる分析対象物酵素を含有する試料物
質を接触させ乾燥させる第一の反応部位３５、および第
二の反応において分析対象物酵素触媒反応の生成物の１
種またはそれ以上の反応を触媒する酵素が固定化されて
いる第二の末端３６からなる。クロマトグラフ媒体３１
はさらに検出領域３７を含んでおり、ここで反応物およ
び第二の反応部位３６で生成した反応生成物よりなる群
から選ばれた１種が検出される。
の濃度を測定するための２反応部位試験装置３０が示し
である。該装置は、不活性な固体支持体３２に付着させ
たクロマトグラフ媒体３１からなる。クロマトグラフ媒
体３１は、クロマトグラフ移動が開始される第一の末端
３３およびクロマトグラフ移動が終了する第二の末端３
４を有している。クロマトグラフ媒体は、第一の反応を
触媒することのできる分析対象物酵素を含有する試料物
質を接触させ乾燥させる第一の反応部位３５、および第
二の反応において分析対象物酵素触媒反応の生成物の１
種またはそれ以上の反応を触媒する酵素が固定化されて
いる第二の末端３６からなる。クロマトグラフ媒体３１
はさらに検出領域３７を含んでおり、ここで反応物およ
び第二の反応部位３６で生成した反応生成物よりなる群
から選ばれた１種が検出される。
第３ａ図および第３ｂ図の装置３０を使用する手順に従
って、酵素の存在について分析しようとする物質の液体
試料を反応部位３５に加える。ついで装置３０の第一の
末端３３を、その反応が該分析対象物酵素により触媒さ
れる基質／補助因子グループの１種からなりまた分析対
象物酵素触媒反応の反応生成物との反応のための試薬を
も含有する溶液３９を含む容器３８中の内容物と接触さ
せる。ついで基質／補助因子含有溶液はクロマトグラフ
媒体３１の長さ方向を第一の反応部位３５まで進行して
ゆき、そこで分析対象物酵素は基質／補助因子グループ
の１種の反応を触媒する働きをしてｌまたはそれ以上の
反応生成物を生成する。
って、酵素の存在について分析しようとする物質の液体
試料を反応部位３５に加える。ついで装置３０の第一の
末端３３を、その反応が該分析対象物酵素により触媒さ
れる基質／補助因子グループの１種からなりまた分析対
象物酵素触媒反応の反応生成物との反応のための試薬を
も含有する溶液３９を含む容器３８中の内容物と接触さ
せる。ついで基質／補助因子含有溶液はクロマトグラフ
媒体３１の長さ方向を第一の反応部位３５まで進行して
ゆき、そこで分析対象物酵素は基質／補助因子グループ
の１種の反応を触媒する働きをしてｌまたはそれ以上の
反応生成物を生成する。
基質／補助因子グループの未消費成分、分析対象物酵素
触媒反応の反応生成物および分析対象物酵素触媒反応の
反応生成物との反応のための試薬を含む溶液は、第一の
反応部位から第二の反応部位３６へ移動していく。つい
で第二の反応部位３６に固定化された触媒は、分析対象
物酵素触媒反応の第一の反応生成物の反応を触媒し、■
またはそれ以上の反応生成物を生成する。第二の反応生
成物は、基質／補助因子グループの未反応成分および分
析対象物酵素触媒反応の反応生成物との反応のための試
薬とともに、第二の反応部位３６からクロマトグラフ媒
体３１の第二の末端３４に向がって検出領域３７の方へ
および検出領域３７を通って移動する。溶液のクロマト
グラフ移動は、溶液のフロントが第二の末端３４に達す
るかまたはその量の基質／補助因子溶液が使い果たされ
るまで続（。検出領域を評価して、（ｉ）第二の反応の
反応生成物および（ｉｉ）第二の反応の反応生成物より
なる群から選ばれた１種の量を検出する。
触媒反応の反応生成物および分析対象物酵素触媒反応の
反応生成物との反応のための試薬を含む溶液は、第一の
反応部位から第二の反応部位３６へ移動していく。つい
で第二の反応部位３６に固定化された触媒は、分析対象
物酵素触媒反応の第一の反応生成物の反応を触媒し、■
またはそれ以上の反応生成物を生成する。第二の反応生
成物は、基質／補助因子グループの未反応成分および分
析対象物酵素触媒反応の反応生成物との反応のための試
薬とともに、第二の反応部位３６からクロマトグラフ媒
体３１の第二の末端３４に向がって検出領域３７の方へ
および検出領域３７を通って移動する。溶液のクロマト
グラフ移動は、溶液のフロントが第二の末端３４に達す
るかまたはその量の基質／補助因子溶液が使い果たされ
るまで続（。検出領域を評価して、（ｉ）第二の反応の
反応生成物および（ｉｉ）第二の反応の反応生成物より
なる群から選ばれた１種の量を検出する。
クロマトグラフ媒体
本発明に有用なりロマトグラフ媒体には、言葉の最も厳
格な意味に従って移動速度の差異の結果として物質の分
離に有用なりロマトグラフ媒体のみならず、一般に本発
明に用いる種々の試薬および反応生成物の溶媒移動に有
用な物質もまた含まれる。適当なりロマトグラフ媒体に
は、毛管現象を有し、基質、補助因子および反応生成物
の溶媒移動を行うことのできる基体物質が含まれる。本
発明に用いるクロマトグラフ媒体はストリップの形態で
あるのが好ましいか、当業者には明らかなように種々の
大きさおよび形に作ることができる。
格な意味に従って移動速度の差異の結果として物質の分
離に有用なりロマトグラフ媒体のみならず、一般に本発
明に用いる種々の試薬および反応生成物の溶媒移動に有
用な物質もまた含まれる。適当なりロマトグラフ媒体に
は、毛管現象を有し、基質、補助因子および反応生成物
の溶媒移動を行うことのできる基体物質が含まれる。本
発明に用いるクロマトグラフ媒体はストリップの形態で
あるのが好ましいか、当業者には明らかなように種々の
大きさおよび形に作ることができる。
ペーパークロマトグラフィーに用いられる織繊維物質や
不織繊維物質のような広範囲のクロマトグラフ媒体か本
発明に用いるのに適している。特に微多孔質または微顆
粒薄層クロマトグラフィー基体物質を使用することは本
発明のアッセイのスピードと解析力を改善するので特に
好ましい。他の適当な媒体としては、逆相高速薄層クロ
マトグラフ媒体や硫酸処理媒体などの化学的に修飾した
物質か挙げられる。そのような物質では、それが望まれ
る場合に反応物および反応生成物の分離能が向上してい
る。微多孔質ニトロセルロース物質が特に好ましく、Ｔ
ｙｐｅ ５ＳＷＰ（ミリポア・コーポレーション、ベ
ツドフォード、マサチューセノツ）で示される孔径が３
μＭの微多孔質ニトロセルロース物質が最も好ましい。
不織繊維物質のような広範囲のクロマトグラフ媒体か本
発明に用いるのに適している。特に微多孔質または微顆
粒薄層クロマトグラフィー基体物質を使用することは本
発明のアッセイのスピードと解析力を改善するので特に
好ましい。他の適当な媒体としては、逆相高速薄層クロ
マトグラフ媒体や硫酸処理媒体などの化学的に修飾した
物質か挙げられる。そのような物質では、それが望まれ
る場合に反応物および反応生成物の分離能が向上してい
る。微多孔質ニトロセルロース物質が特に好ましく、Ｔ
ｙｐｅ ５ＳＷＰ（ミリポア・コーポレーション、ベ
ツドフォード、マサチューセノツ）で示される孔径が３
μＭの微多孔質ニトロセルロース物質が最も好ましい。
これらの物質は、好ましくは不活性で、一般に基質、補
助因子または反応生成物のいずれとも反応してはならな
い。
助因子または反応生成物のいずれとも反応してはならな
い。
装置のクロマトグラフ媒体は化学的に不活性であること
か好ましいので、分析対象物または第二の反応の触媒反
応に用いる触媒を溶媒移動に対して固定化するのが望ま
しい反応部位において活性化しなければならないかもし
れない。試薬を固定化させるためには、試薬の特定の化
学的性質に従って種々の方法が必要とされるであろう。
か好ましいので、分析対象物または第二の反応の触媒反
応に用いる触媒を溶媒移動に対して固定化するのが望ま
しい反応部位において活性化しなければならないかもし
れない。試薬を固定化させるためには、試薬の特定の化
学的性質に従って種々の方法が必要とされるであろう。
一般に媒体カニトロセルロースまたは混成ニトロセルロ
ースエステルである場合には、酵素を固定化するのに特
別の化学的結合を必要としない。分析対象物酵素を含有
する試料をクロマトグラフ媒体に加え、室温で１０〜１
５分後に乾燥させてよい。試料中に存在する酵素は溶媒
移動に対して反応部位に固定化され、一般に酵素活性を
完全にまたは実質的に保持しているであろう。アッセイ
に一対の反応を利用し、そのうち第二の反応が触媒され
る場合には、第二の反応のために触媒を第二の反応部位
に固定化することが必要である。第二の反応の触媒を酵
素とし、分析対象物酵素が第一の反応部位に固定化する
のと同じ手順で触媒を該部位に固定化するようにするの
が好ましい。
ースエステルである場合には、酵素を固定化するのに特
別の化学的結合を必要としない。分析対象物酵素を含有
する試料をクロマトグラフ媒体に加え、室温で１０〜１
５分後に乾燥させてよい。試料中に存在する酵素は溶媒
移動に対して反応部位に固定化され、一般に酵素活性を
完全にまたは実質的に保持しているであろう。アッセイ
に一対の反応を利用し、そのうち第二の反応が触媒され
る場合には、第二の反応のために触媒を第二の反応部位
に固定化することが必要である。第二の反応の触媒を酵
素とし、分析対象物酵素が第一の反応部位に固定化する
のと同じ手順で触媒を該部位に固定化するようにするの
が好ましい。
醪索
本発明は、一般に酵素の定量検出に利用することができ
る。本発明のアッセイにより分析するのに特に適してい
ると思われる酵素としては、アラニンアミノトランスフ
エラーセ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（Ｌｏ）り、酸ホ
スファターゼ、アルドラーセ、アルカリホスファターゼ
、α−ナフチル酪酸エステラーセ、α−１トリプシン、
アミラーセ、アンキオテンンン変換酵素、セルロブラス
ミン、クロロ酢酸エステラーゼ、タレアチンキナーセ、
コリンエステラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジ
ルトランスフェラーゼ、γグルタミルトランスフェラー
ゼ、ヘモグロビン（オキシダーゼとして）、リパーゼ、
リゾチーム、２′、５°−アデニレートホスホジェステ
ラーゼ、２’、５°−アデニレートシンテターゼ、５′
ヌクレオチターゼ、レニン、トリプシンおよび池の多く
の酵素が挙げられる。本発明によりアッセイすることか
できる酵素は、選択した酵素か適当なりロマトグラフ媒
体上に固定化することができないか、またはそのように
して結合させたときに実質的にす−・ての酵素活性を失
うような範囲で制限されるだけである。ある酵素が第一
の反応部位に固定化されたときに活性の幾らかを失うと
いうことは本発明の有用性を損なうものではない。なぜ
なら、そのような失活は充分当業者の能力の範囲内でア
ッセイの結果を評価するときに説明することができるか
らである。本発明の方法に従って分析することかできる
酵素含有試料としては、種々の生物学的物質が挙げられ
、血液、血清、血漿、尿、だ液、大便、涙、のどの綿棒
で集めた標本、傷浸出液、汗、細胞、細胞溶解液、細胞
上澄み液、細菌および細菌培地などが含まれるがこれら
に限られるものではない。
る。本発明のアッセイにより分析するのに特に適してい
ると思われる酵素としては、アラニンアミノトランスフ
エラーセ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフ
ェラーゼ（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（Ｌｏ）り、酸ホ
スファターゼ、アルドラーセ、アルカリホスファターゼ
、α−ナフチル酪酸エステラーセ、α−１トリプシン、
アミラーセ、アンキオテンンン変換酵素、セルロブラス
ミン、クロロ酢酸エステラーゼ、タレアチンキナーセ、
コリンエステラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジ
ルトランスフェラーゼ、γグルタミルトランスフェラー
ゼ、ヘモグロビン（オキシダーゼとして）、リパーゼ、
リゾチーム、２′、５°−アデニレートホスホジェステ
ラーゼ、２’、５°−アデニレートシンテターゼ、５′
ヌクレオチターゼ、レニン、トリプシンおよび池の多く
の酵素が挙げられる。本発明によりアッセイすることか
できる酵素は、選択した酵素か適当なりロマトグラフ媒
体上に固定化することができないか、またはそのように
して結合させたときに実質的にす−・ての酵素活性を失
うような範囲で制限されるだけである。ある酵素が第一
の反応部位に固定化されたときに活性の幾らかを失うと
いうことは本発明の有用性を損なうものではない。なぜ
なら、そのような失活は充分当業者の能力の範囲内でア
ッセイの結果を評価するときに説明することができるか
らである。本発明の方法に従って分析することかできる
酵素含有試料としては、種々の生物学的物質が挙げられ
、血液、血清、血漿、尿、だ液、大便、涙、のどの綿棒
で集めた標本、傷浸出液、汗、細胞、細胞溶解液、細胞
上澄み液、細菌および細菌培地などが含まれるがこれら
に限られるものではない。
基質／補助因子系
分析対象物酵素により反応を受けることかでき本発明に
用いるのに適した試薬の基質／′補助因子グループの１
種は、分析しようとする酵素の特定の性質に応じて選択
する。そのような反応系は一般に技術分野で知られてお
り、本発明の方法に従って容易に応用することかできる
。一般に、従来の試験管またはストリップ浸漬法に従っ
て有用な単一および２酵素反応系は、本発明に従って利
用することかできる。適当な系には、酵素触媒反応の基
質またはそのような反応の補助因子が反応して染料のよ
うな視覚または分光光学的に検出可能な反応生成物を生
成するような系が含まれる。別の方法としては、酵素基
質または分析対象物酵素触媒反応の補助因子それ自体が
視覚または分光光学的に検出可能（補助因子ＮＡＤＨの
ように）であるが、酵素触媒反応の進行につれて消費さ
れるようなものであってよい。
用いるのに適した試薬の基質／′補助因子グループの１
種は、分析しようとする酵素の特定の性質に応じて選択
する。そのような反応系は一般に技術分野で知られてお
り、本発明の方法に従って容易に応用することかできる
。一般に、従来の試験管またはストリップ浸漬法に従っ
て有用な単一および２酵素反応系は、本発明に従って利
用することかできる。適当な系には、酵素触媒反応の基
質またはそのような反応の補助因子が反応して染料のよ
うな視覚または分光光学的に検出可能な反応生成物を生
成するような系が含まれる。別の方法としては、酵素基
質または分析対象物酵素触媒反応の補助因子それ自体が
視覚または分光光学的に検出可能（補助因子ＮＡＤＨの
ように）であるが、酵素触媒反応の進行につれて消費さ
れるようなものであってよい。
本発明の別の態様に従って、酵素触媒反応の試薬の基質
／補助因子グループの１種もその反応の反応生成物も視
覚または分光光学的に容易に検出可能でない場合に、分
析対象物酵素触媒反応を第二の反応と組み合わせ、この
第二の反応において容易に検出可能な反応物か消費され
るかまたはそのような反応生成物を生成するようにする
。リットマン（Ｌｉｔｍａｎ）らの米国特許第４．５３
３．６２９号明細書（１９８５年８月６日発行）には、
多くの組合わせ酵素反応系を利用して酵素ｉ票識イムノ
アッセイにおいてシグナルを生成することか開示されて
いる。そのような組合わせ反応系では、しばしば加水分
解または酸化還元反応を利用して染料前駆体を活性化す
ることを行う。幾つかの方法に従えば、基質を酸化して
過酸化水素を生成し、ついて過酸化水素が染料前駆体と
反応して検出可能な染料を活性化する。基質／補助因子
グループ含有溶液には、安定化剤、インヒビターなとの
他の試薬を加えてもよい。分析対象物酵素触媒反応を第
二の反応と組合わせる場合には、基質／補助因子グルー
プ含有溶液はまた分析対象物酵素触媒反応の反応生成物
との反応のための試薬をも含んでいてよい。
／補助因子グループの１種もその反応の反応生成物も視
覚または分光光学的に容易に検出可能でない場合に、分
析対象物酵素触媒反応を第二の反応と組み合わせ、この
第二の反応において容易に検出可能な反応物か消費され
るかまたはそのような反応生成物を生成するようにする
。リットマン（Ｌｉｔｍａｎ）らの米国特許第４．５３
３．６２９号明細書（１９８５年８月６日発行）には、
多くの組合わせ酵素反応系を利用して酵素ｉ票識イムノ
アッセイにおいてシグナルを生成することか開示されて
いる。そのような組合わせ反応系では、しばしば加水分
解または酸化還元反応を利用して染料前駆体を活性化す
ることを行う。幾つかの方法に従えば、基質を酸化して
過酸化水素を生成し、ついて過酸化水素が染料前駆体と
反応して検出可能な染料を活性化する。基質／補助因子
グループ含有溶液には、安定化剤、インヒビターなとの
他の試薬を加えてもよい。分析対象物酵素触媒反応を第
二の反応と組合わせる場合には、基質／補助因子グルー
プ含有溶液はまた分析対象物酵素触媒反応の反応生成物
との反応のための試薬をも含んでいてよい。
そのような試薬はそれ自体か検出可能であり、組合わせ
た第二の反応において消費することかできるかまたは分
析対象物酵素触媒反応の反応生成物と反応して検出可能
な反応生成物を生成することができる。
た第二の反応において消費することかできるかまたは分
析対象物酵素触媒反応の反応生成物と反応して検出可能
な反応生成物を生成することができる。
実施例１
本実施例においては、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の定量
のための装置を製造し、これを本発明の方法に従って用
いた。厚さが約０．１５ｍｍで孔径が３μｍの微多孔質
ニトロセルロース物質（ミリポア５ＳＷＰ）を、フィル
ム乾燥装置中６０〜６５°Ｃでミラール・アンド・アド
ヒーシブ（Ｍｙｌａｒ ’ａｎｄａｄｈｅｓ １ｖｅ）
Ｅモノコート（Ｍｏｎｏｋｏｔｅ）、トップ・フライ
ト・モデルズ（Ｔｏｐ ＦｌｉＬｅ Ｍｏｄｅｌｓ
、Ｉｎｃ、。
のための装置を製造し、これを本発明の方法に従って用
いた。厚さが約０．１５ｍｍで孔径が３μｍの微多孔質
ニトロセルロース物質（ミリポア５ＳＷＰ）を、フィル
ム乾燥装置中６０〜６５°Ｃでミラール・アンド・アド
ヒーシブ（Ｍｙｌａｒ ’ａｎｄａｄｈｅｓ １ｖｅ）
Ｅモノコート（Ｍｏｎｏｋｏｔｅ）、トップ・フライ
ト・モデルズ（Ｔｏｐ ＦｌｉＬｅ Ｍｏｄｅｌｓ
、Ｉｎｃ、。
ンカコ、＋ｒ−）］にラミネートシた。膜および支持体
は幅０．３ｃｍ、長さ３．５ｃＩＩのストリップにカッ
ティングした。
は幅０．３ｃｍ、長さ３．５ｃＩＩのストリップにカッ
ティングした。
上記のごとく構成した装置の使用方法に従って、ウシ血
清アルブミン（０，８ｚｙ／ａのを含む溶液中のＬＤＨ
（シグマ・ケミカル社、セン］・ルイス、Ｍ Ｏンの種
々の希釈液を調製した。ＬＤＨ溶液２μＱを含むアリコ
ートを、クロマトグラフストリップの第一の末端からｌ
ｃｘにある反応部位に含浸させた。ついでスＩ・リップ
の第一の末端を、リン酸バッファー（０，１ｍＭ、ｐＨ
７，８）、ピルビン酸、還元βニコチンアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）（０，２２ｍＭ）およびピルビン
酸ナトリウム（１ｍＭ）を含む溶液中に浸した。流動バ
ッファーは、ＬＤＨ試料を固定化しである反応部位に達
するまでストリップに沿ってクロマトグラフ的に移動し
た。反応部位においてＬＤＨは、ピルビン酸とＮＡＤＨ
およびプロトンとの反応を触媒して乳酸および酸化型ニ
コチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成した。
清アルブミン（０，８ｚｙ／ａのを含む溶液中のＬＤＨ
（シグマ・ケミカル社、セン］・ルイス、Ｍ Ｏンの種
々の希釈液を調製した。ＬＤＨ溶液２μＱを含むアリコ
ートを、クロマトグラフストリップの第一の末端からｌ
ｃｘにある反応部位に含浸させた。ついでスＩ・リップ
の第一の末端を、リン酸バッファー（０，１ｍＭ、ｐＨ
７，８）、ピルビン酸、還元βニコチンアデニンジヌク
レオチド（ＮＡＤＨ）（０，２２ｍＭ）およびピルビン
酸ナトリウム（１ｍＭ）を含む溶液中に浸した。流動バ
ッファーは、ＬＤＨ試料を固定化しである反応部位に達
するまでストリップに沿ってクロマトグラフ的に移動し
た。反応部位においてＬＤＨは、ピルビン酸とＮＡＤＨ
およびプロトンとの反応を触媒して乳酸および酸化型ニ
コチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）を生成した。
これらの反応生成物は溶液の他の成分とともに、溶液が
ストリップの末端に達して溶媒移動が停止するまで、反
応部位から下流の方へクロマトグラフストリップに沿っ
てクロマトグラフ的に移動した。その結果は、紫外線（
３７５ｎｍ）ランプの下で観察したところ、反応部位の
下流において蛍光の消失として視覚的に観察された。
ストリップの末端に達して溶媒移動が停止するまで、反
応部位から下流の方へクロマトグラフストリップに沿っ
てクロマトグラフ的に移動した。その結果は、紫外線（
３７５ｎｍ）ランプの下で観察したところ、反応部位の
下流において蛍光の消失として視覚的に観察された。
実施例２
本実施例においては、ＡＬＴ酵素の定量のための２反応
部位装置を製造し、これを本発明の方法に従って用いた
。厚さか約０．１５ｍｍで孔径が３μ友の微多孔質二ｌ
・ロセルロース物質（ミリボアＳｓｗｐ）を、フィルム
乾燥装置中６０〜６５°Ｃてミラール・アンド・アＩＳ
ヒーシブ［モノコート、トップ・フライト・モデルズ（
シカゴ、ＩＬ）］に］ラミ不−１した。膜および支持体
は幅Ｑ、３ｃｍ。
部位装置を製造し、これを本発明の方法に従って用いた
。厚さか約０．１５ｍｍで孔径が３μ友の微多孔質二ｌ
・ロセルロース物質（ミリボアＳｓｗｐ）を、フィルム
乾燥装置中６０〜６５°Ｃてミラール・アンド・アＩＳ
ヒーシブ［モノコート、トップ・フライト・モデルズ（
シカゴ、ＩＬ）］に］ラミ不−１した。膜および支持体
は幅Ｑ、３ｃｍ。
長さ８．５ｃｚのストリップにカッティングした。
各ス１す・、プの第一の末端から２０のところにある第
二の反応部位には、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）（シグマ
・ケミカフ１社、セントルイス、ＭＯ）のアリコート（
２μのを固定化させた。 上記のごとく構成した装置の
使用方法に従って、ウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）
（０，８ｍｙ／ｍ（１）を含む溶液中のＡ Ｌ Ｔの種
々の希釈液を調製した。ついで臨床化学試薬（Ａ試薬、
アボット・ラホラトリーズ、ノースンカゴ、ＩＬ）を用
い、溶液を酵素活性について分析した。Ｌ Ｄ Ｈ含浸
部位と第一の末端とのあいだに位置し第一の末端から１
ｃｍのところにある第一の反応部位にＡＬＴ含何含液溶
液μのを含浸させた。酵素試料を該反応部位で１０〜１
５分間乾燥させた。
二の反応部位には、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）（シグマ
・ケミカフ１社、セントルイス、ＭＯ）のアリコート（
２μのを固定化させた。 上記のごとく構成した装置の
使用方法に従って、ウシ血清アルブミン（Ｂ Ｓ Ａ）
（０，８ｍｙ／ｍ（１）を含む溶液中のＡ Ｌ Ｔの種
々の希釈液を調製した。ついで臨床化学試薬（Ａ試薬、
アボット・ラホラトリーズ、ノースンカゴ、ＩＬ）を用
い、溶液を酵素活性について分析した。Ｌ Ｄ Ｈ含浸
部位と第一の末端とのあいだに位置し第一の末端から１
ｃｍのところにある第一の反応部位にＡＬＴ含何含液溶
液μのを含浸させた。酵素試料を該反応部位で１０〜１
５分間乾燥させた。
ストリップの第一の末端を、Ｌ−アラニン（５００ｍＭ
）、還元βニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ
）（０，３ｍＭ）、αケトゲルタール酸（１５ｍＭ）、
ピリドキサルー５−リン酸（０，１ｍＭ）、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（ｌｏｏｍＭ）、コハク
酸（３０、３ｍＭ）およびエチレンジアミン四酢酸ナト
リウム（ＥＤＴＡＸ２．２６ｍＭ）からなる溶媒の溶液
中に浸した。溶媒は、ＡＬＴ試料を固定化しである第一
の反応部位に達するまでス！・リップに沿ってクロマト
グラフ的に移動した。
）、還元βニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ
）（０，３ｍＭ）、αケトゲルタール酸（１５ｍＭ）、
ピリドキサルー５−リン酸（０，１ｍＭ）、トリス（ヒ
ドロキシメチル）アミノメタン（ｌｏｏｍＭ）、コハク
酸（３０、３ｍＭ）およびエチレンジアミン四酢酸ナト
リウム（ＥＤＴＡＸ２．２６ｍＭ）からなる溶媒の溶液
中に浸した。溶媒は、ＡＬＴ試料を固定化しである第一
の反応部位に達するまでス！・リップに沿ってクロマト
グラフ的に移動した。
第一の反応部位においてＡＬＴは、Ｌ−アラニンとαケ
トゲルタール酸との反応を触媒してピルビン酸およびＬ
−グルタミン酸を生成する。溶媒が進行するに従い、こ
れらの反応生成物は未反応の酵素基質および補助因子お
よび流動バッファーの池の成分とともに、Ａ Ｌ Ｔ試
料か固定化しである第一の反応部位からＬＤＨが固定化
しである第二の反応部位へクロマトグラフ的に移動した
。ピルビン酸および溶媒の他の成分が第二の反応部位に
固定化されたＬＤＨと接触すると、Ｌ Ｄ Ｈは、ピル
ビン酸とＮＡＤＨおよびプロトンとの反応を触媒して乳
酸および酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ”）を生成した。ついで第二の反応のこれらの反応生
成物は、クロマトグラフ移動が停止するまでクロマトグ
ラフ媒体に沿って３〜４ｃｍ移動した。ＮＡＤＨのＮＡ
Ｄ゛への酸化は、紫外線（３７５ｎｍ）ランプの下での
観察により、ＬＤＨ反応部位の下流において蛍光の消失
として視覚的に追跡した。フロン［・の前方の流体は蛍
光を示さなかったが、始動の動力学に対応するフロント
・における流体は蛍光のピークを示し、これが−定のレ
ベル（定常状態の動力学に対応）に減少し、ついて第二
の反応部位に広がっていく。
トゲルタール酸との反応を触媒してピルビン酸およびＬ
−グルタミン酸を生成する。溶媒が進行するに従い、こ
れらの反応生成物は未反応の酵素基質および補助因子お
よび流動バッファーの池の成分とともに、Ａ Ｌ Ｔ試
料か固定化しである第一の反応部位からＬＤＨが固定化
しである第二の反応部位へクロマトグラフ的に移動した
。ピルビン酸および溶媒の他の成分が第二の反応部位に
固定化されたＬＤＨと接触すると、Ｌ Ｄ Ｈは、ピル
ビン酸とＮＡＤＨおよびプロトンとの反応を触媒して乳
酸および酸化型ニコチンアデニンジヌクレオチド（ＮＡ
Ｄ”）を生成した。ついで第二の反応のこれらの反応生
成物は、クロマトグラフ移動が停止するまでクロマトグ
ラフ媒体に沿って３〜４ｃｍ移動した。ＮＡＤＨのＮＡ
Ｄ゛への酸化は、紫外線（３７５ｎｍ）ランプの下での
観察により、ＬＤＨ反応部位の下流において蛍光の消失
として視覚的に追跡した。フロン［・の前方の流体は蛍
光を示さなかったが、始動の動力学に対応するフロント
・における流体は蛍光のピークを示し、これが−定のレ
ベル（定常状態の動力学に対応）に減少し、ついて第二
の反応部位に広がっていく。
蛍光は視覚により観察することもできるが、ＣＡＭＡＧ
スキャナー１１ （ｃＡ Ｍ Ａ Ｇ 、ムッテンツ、
スイス）のような薄層クロマトグラフィースキャナーを
用い分光光学的に観察することもてきる。
スキャナー１１ （ｃＡ Ｍ Ａ Ｇ 、ムッテンツ、
スイス）のような薄層クロマトグラフィースキャナーを
用い分光光学的に観察することもてきる。
スキャナーは３６５ｎｍの励起波長を用い、検出は４２
０ｎｍ未満で遮断したフィルターを用いる。
０ｎｍ未満で遮断したフィルターを用いる。
第１ａ図および第３ａ図は、本発明の試験装置の２つの
異なる態様の正平面図、 第１ｂ図および第３ｂ図は、それぞれ第１ａ図および第
３ａ図に示した本発明の試験装置の１ｂ−１ｂ線および
３ ｂ−３ｂ線での横断面図、第１ｃ図は、一定量の基
質／補助因子溶液と接触させた状態の第１ａ図に示した
本発明の試験装置のｉ黄断面図、 第２ａ図〜第２ｄ図は、本発明の方法を実施した場合の
異なる時点における第１ａ図に示した本発明の試験装置
の正平面図、 第４図は、本発明の装置において、アラニンアミノＩ・
ランスフェラーゼの濃度とＮ Ａ Ｄ ＨｈＴｉ助因子
の消費により引き起こされた蛍光の減少との関係を示す
グラフである。 （図面の主要符号） １１．３１・・・クロマトグラフ媒体 Ｉ５・・・反応部位 １６．３７・・・検出領域 １９・・・溶媒フロント ３５・・・第一の反応部位 ３６・・・第二の反応部位 特許出願人 アボット・ラボラトリーズ代 理 人
弁理士 青 山 葆ほか１名ＦＩＧ、 ３ａ ＦＩＧ、３ｂ
異なる態様の正平面図、 第１ｂ図および第３ｂ図は、それぞれ第１ａ図および第
３ａ図に示した本発明の試験装置の１ｂ−１ｂ線および
３ ｂ−３ｂ線での横断面図、第１ｃ図は、一定量の基
質／補助因子溶液と接触させた状態の第１ａ図に示した
本発明の試験装置のｉ黄断面図、 第２ａ図〜第２ｄ図は、本発明の方法を実施した場合の
異なる時点における第１ａ図に示した本発明の試験装置
の正平面図、 第４図は、本発明の装置において、アラニンアミノＩ・
ランスフェラーゼの濃度とＮ Ａ Ｄ ＨｈＴｉ助因子
の消費により引き起こされた蛍光の減少との関係を示す
グラフである。 （図面の主要符号） １１．３１・・・クロマトグラフ媒体 Ｉ５・・・反応部位 １６．３７・・・検出領域 １９・・・溶媒フロント ３５・・・第一の反応部位 ３６・・・第二の反応部位 特許出願人 アボット・ラボラトリーズ代 理 人
弁理士 青 山 葆ほか１名ＦＩＧ、 ３ａ ＦＩＧ、３ｂ
Claims (10)
- （１）試料中の酵素分析対象物の定量法であって、基質
／補助因子グループの１種の酵素触媒反応により該酵素
の存在を決定し、 （ａ）分析しようとする一定量の試料中に存在する酵素
分析対象物をクロマトグラフ媒体上の反応部位に固定化
し、 （ｂ）基質／補助因子グループの１種を含有する溶液に
該クロマトグラフ媒体を接触させ、その際、少なくとも
１種の反応生成物を生じさせるための該基質／補助因子
グループの１種の反応は、存在する酵素の量に関連した
速度で該酵素分析対象物により触媒され、 （ｃ）該溶液を該反応部位に移動させ、該酵素の存在下
で該基質／補助因子グループの１種を反応させて該反応
生成物を生成させ、 （ｄ）該溶液および該反応生成物を該反応部位から該反
応部位の下流に位置する検出領域に移動させ、ついで （ｅ）（ｉ）基質／補助因子グループの１種の消失速度
かまたは（ｉｉ）該反応生成物の生成速度を測定するこ
とにより酵素触媒反応の速度を決定する ことを特徴とする方法。 - （２）反応生成物の生成速度を、該反応生成物をさらに
１またはそれ以上の反応に供し、（ｉ）該１またはそれ
以上の反応における反応物の消失速度かまたは（ｉｉ）
該１またはそれ以上の反応における生成物の生成速度を
測定することにより決定する特許請求の範囲第（１）項
記載の方法。 - （３）（ｉ）基質／補助因子グループの１種、（ｉｉ）
該第一の反応生成物、（ｉｉｉ）該１またはそれ以上の
反応の少なくとも１つの反応における反応物、および（
ｉｖ）該１またはそれ以上の反応の少なくとも１つの反
応の反応生成物よりなる群から選ばれた１種の消失また
は生成速度を、検出領域中の選択された部位で該１種の
濃度を測定することにより決定する特許請求の範囲第（
１）項または第（２）項記載の方法。 - （４）検出領域中の選択された部位が、（ｉ）基質／補
助因子グループの１種、（ｉｉ）該第一の反応生成物、
（ｉｉｉ）該１またはそれ以上の反応の少なくとも１つ
の反応における反応物、および（ｉｖ）該１またはそれ
以上の反応の少なくとも１つの反応の反応生成物よりな
る群から選ばれた１種を含み、該１種が酵素分析対象物
の定常状態反応中に生成される特許請求の範囲第（３）
項記載の方法。 - （５）１またはそれ以上の反応が、第二の反応部位に固
定化された触媒により触媒される特許請求の範囲第（２
）項記載の方法。 - （６）触媒が酵素である特許請求の範囲第（５）項記載
の方法。 - （７）（ｉ）基質／補助因子グループの１種、（ｉｉ）
該第一の反応生成物、（ｉｉｉ）該１またはそれ以上の
反応の少なくとも１つの反応における反応物、および（
ｉｖ）該１またはそれ以上の反応の少なくとも１つの反
応の反応生成物よりなる群から選ばれた１種の濃度が、
視覚によりまたは分光光度計により決定される特許請求
の範囲第（３）項記載の方法。 - （８）前記濃度が視覚により決定される特許請求の範囲
第（７）項記載の方法。 - （９）試料中の酵素分析対象物の定量法であって基質／
補助因子グループの１種の酵素触媒反応により該酵素の
存在を決定するものに使用するキットであって、 （ａ）該試料中に存在する酵素分析対象物が固定化され
た反応部位を含むクロマトグラフ媒体、および （ｂ）その反応が該酵素により触媒される基質／補助因
子グループの１種を含む一定の量の溶液からなることを
特徴とするキット。 - （１０）クロマトグラフ媒体が第二の反応部位を含み、
該第二の反応部位には触媒が固定化され、該酵素分析対
象物により触媒された反応の生成物を消費する第二の反
応を触媒することができるものである特許請求の範囲第
（９）項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US11727887A | 1987-11-05 | 1987-11-05 | |
| US117278 | 1987-11-05 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160498A true JPH01160498A (ja) | 1989-06-23 |
| JP2788264B2 JP2788264B2 (ja) | 1998-08-20 |
Family
ID=22371973
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63280228A Expired - Lifetime JP2788264B2 (ja) | 1987-11-05 | 1988-11-04 | 酵素の定量法およびそれに用いる装置 |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5612178A (ja) |
| EP (1) | EP0315058B1 (ja) |
| JP (1) | JP2788264B2 (ja) |
| KR (1) | KR960002559B1 (ja) |
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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