JPH0113062B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は血液試料中のグルコース濃度を測定す
る方法及び装置に関し、特に患者の糖尿病の検出
ばかりでなく、糖尿病患者に対する治療レベルの
決定にも使用するため考慮されたものである。 本発明の目的は、少なくとも公衆に有用な選択
対象を与える、血液試料中のグルコース濃度を測
定する方法及び／又は物質を提供することであ
る。 従つて、本発明は一面では、血液試料又は血液
から誘導した試料中の血清グルコース濃度の測定
方法にあり、該方法は試料を調節された温度に保
持し、試料のPHを10〜14の適当な数値に調節し、
試料に着色剤を添加し、最初の遅延時間後に最初
の色測定を行い、第二の遅延時間後に第二の色測
定を行い、生ずる色の変化を標準溶液の色の変化
と比較する工程からなり、着色剤及びPH条件を、
グルコースがなおその血液中の蛋白質のアミン基
と反応又は会合している間及びグルコースが分子
転移を受け、フルクトサミンの形で存在する場合
に試料中のそのグルコースによつて着色剤の色の
変化が起こされるように選択することからなる。 他面では、本発明は人の糖尿病の検出方法にあ
り、該方法は患者から血液試料又は血液から誘導
した試料を採取し、緩衝剤を添加して試料のPHを
10〜14の適当な数値に調節し、色を変化する着色
剤を添加し、その際着色剤及びPH条件を、グルコ
ースがなおその血液中の蛋白質のアミン基と反応
又は会合している間及びグルコースが分子転移を
受け、フルクトサミンの形で存在する場合に試料
中のそのグルコースによつて着色剤の色の変化が
起こされるように選択し、着色剤を添加してから
第一及び第二の時間間隔後に第一及び第二の色レ
ベルを読み、補正された読み取り値を得、このよ
うな読み取り補正値を糖尿病の既知段階を表す標
準と比較する工程からなる。 次ぎに、本発明の背景及び本発明の好ましい、
択一的実施態様を添付図面を参照しながら説明す
る。 第１図は75ｇｍのグルコース耐性試験の判定に
関するWHO基準をそれぞれ適用してグルコース
耐性正常の患者、グルコース耐性の損なわれた患
者及び糖尿病患者における血清フルクトサミン濃
度のグラフである。 第２図は妊娠28〜32週の妊婦患者における血清
フルクトサミン濃度のグラフである。 第３図は本発明を使用する連続的試験方法のフ
ローシートである。 蛋白質のグリコシル化は主要なグルコース濃度
に直接左右される、酵素によらない後翻訳修飾と
して起こる。従つて、糖尿病は高濃度のグリコシ
ル蛋白を含む傾向にあり、ヘモグロビン及び血清
蛋白のグリコシル化の程度を糖血症の指標と相関
させていた。 グリコシル蛋白の濃度は一定時間にわたる血清
グルコース濃度の平均を反映するので、グリコシ
ル蛋白の濃度の測定は糖尿病治療を監視する魅力
的手段であり、本発明はこのような監視を行う便
利で、実用的システムを提供するものである。 本発明は、特に人の循環系において血液中のグ
ルコースが蛋白質と連続的に反応し、その際グル
コースが蛋白質のアミン基に結合してシツフの塩
基であるアルジミンを形成し、このアルジミンは
分子転移〔アマドリ（Amadori）〕を受けて安定
なケトアルジミン（以下一般に「フルクトサミ
ン」と記す）を形成するという血液の特性を利用
するものである。このことについては、本明細書
に後で論ずる。本発明は少なくとも好ましい態様
ではアルカリ溶液中で還元剤として作用するフル
クトサミンの性質に基づく比色分析にかんする。 最近、糖尿病を治療する主要な努力は糖尿病の
合併症の予防又は治療に集中している。合併症で
ある網膜症、ネフロパシー、ニユーロパシー及び
動脈硬化症は長期の高血糖症から起こり、血液中
のグルコースをできるだけ正常に近く保持すれば
予防できる。 糖尿病治療の程度を決定する現在の方法の多く
は、患者の協力（例えば、患者による家庭での尿
の分割収集）を必要とするか、又は煩雑で、不確
かである（例えば、24時間の尿のグルコース排
泄）ので、信頼性にかける。血液のグルコース濃
度は、食事、活動及び治療に影響されて一日の間
に著しく変動する。無作為の血液グルコース濃度
は、糖尿病治療の不適切で誤りに導く指標である
ことが判つた。慢性糖尿病の治療には、血液中の
グルコース濃度の長期的指標が必要である。これ
に関連して研究された最初の試験の１つは、グリ
コシル化ヘモグロビンである。この試験は糖尿病
の治療に有用であるが、高価で、再現し難いこと
が証明された。更に信頼性の高い試験に対する必
要から血清フルクトサミンの研究が行われた。数
日〜数週間にわたる血清グルコースと血清蛋白と
の反応生成物であるフルクトサミンは、安定であ
り、血液グルコース濃度の短期変動があつても、
変化しないので、前記の難点を若干解決する。こ
の試験はまた、経済的であり、自動化でき、極め
て再現性が高いという利点を有する。この試験は
約２mlの血液で実施しうる。 フルクトサミンは、患者の食事、活動又は治療
に左右される糖尿病管理の指標を提供する。その
主要な臨床的用途は既知糖尿病患者の治療の規制
及び新しい治療の評価である。更に、糖尿病にな
る危険の増加した集団である妊婦、肥満及び糖尿
病になり易いことの知られている民族群（例えば
ポリネシア人）をスクリーニングするために、フ
ルクトサミンを使用することもできる。 昨年、正常な妊婦患者、グルコース耐性の異常
な、妊娠した母親及び慢性糖尿病の、妊娠した母
親における血清フルクトサミンの濃度が研究され
た。正常な患者〔オサリバン（O'Sullivan）のデ
ータ（オサリバンJ.B.、マホン（Mahon C.M）、
チヤールス（Charles D.）、ダンドロウ
（Dandrow Ｒ）（1973）著、スクリーニング・ク
リテリア・フオー・ハイ・リスク・ゲステイシヨ
ナル・ダイアベーテス・ペイシエンツ
（Screening criteria for high risk gestational
diabetes patients）、Amer.J.Obstet.116：895）
を使用して評価したグルコース耐性試験正常の患
者76人〕において、妊娠28〜32週での平均血清フ
ルクトサミン濃度は1.51ｍmol／であり、その
標準偏差は0.24であつた。 「妊娠糖尿病」の患者及び慢性糖尿病患者にお
ける妊娠28〜32週に集めた最近のフルクトサミン
濃度から３群の間に著しい差異があることが判つ
た（第２図）。妊娠中に診断された糖尿病患者の
平均フルクトサミン濃度は1.91ｍmol／（標準
偏差0.23）であり、慢性糖尿病患者のそれは、
2.17ｍmol／（標準偏差0.36）である。血清フ
ルクトサミンに関する上限として1.8ｍmol／
の濃度を使用すると、スクリーニング試験に使用
して妊娠中の糖尿病を80％の検出率で検出するこ
とができる。 本発明によれば、血清蛋白に結合したフルクト
サミンを、アルカリ中で、即ちPH10〜14で活性エ
ノール形に変えることによつて測定する。本発明
者は、異なるPH値が本発明方法に使用する着色剤
に異なる吸光度を与え、従つて、好ましいPHは
10.0〜11.0であり、更に好ましくは、10.5〜10.8
であることを見いだした。 フルクトサミンのエノール形は化学的に活性な
物質であり、適当な着色剤を変色させる。着色剤
はテトラゾリウム塩、例えば約535nｍに広い吸
光度のピークを有する高度に着色した青色（紫
色）フオルマザン染料に変わるテトラニトロブル
ー又は好ましくはニトロ−ブルーテトラゾリウム
から選択した染料であるのが好ましい。 他の血清還元性物質からの妨害を回避するため
に、着色剤添加後の適当な時間、例えば10〜15分
に吸光度の変化を測定し、他の血清還元性物質か
らの妨害を減少又は回避することは、本発明の一
部である。 試料は血液から誘導したものであり、好ましく
は全血又は全血清の試料である。 血液試料に関連して、中程度〜重度の溶血は誤
つた低い結果を生ずることに注意が必要である。
全血清及び血漿を試料材料として使用しうるが、
血漿は、抗凝固剤が結果を妨害することがあるの
で、操作にあまり適当でない。 試料は好ましくは保存剤を添加してない血清で
あるべきである。 血液試料を適当なPH値にするため、緩衝剤を血
液試料に溶液の形で添加するのが好ましい。緩衝
剤を選択し、配合して血液試料のPHを10〜14、好
ましくは10.0〜11.0、更に好ましく10.5〜10.8に
する。この緩衝剤は炭酸ナトリウム及び重炭酸ナ
トリウムを適当な割合で含むのが好ましい。本発
明者は、緩衝剤を着色剤とともに１つの試薬とし
て提供するのが好ましいことを見いだした。緩衝
剤は炭酸ナトリウムを重炭酸ナトリウム0.210gm
に対して炭酸ナトリウム0.795gmの割合で含むの
が望ましい。所望のPHを生ずる他の緩衝剤を使用
することもできる。前記のように、着色剤はニト
ロ−ブルーテトラゾリウム（NBT）であるのが
好ましい。 試薬を血液又は血清試料と混合し、適当な時
間、例えば10〜15分放置し、その後色の変化を測
定する、例えば適当な分光光度計を使用して吸光
度の変化を測定する。 色の変化の測定は、標準溶液を色の読み取り値
に関して検出する操作を使用して照査するのが好
ましい。好ましい標準溶液はアルブミンのような
蛋白質と、これに添加して１−デオキシ、１−モ
ルホリノフルクトース（DMF）を含む。このよ
うな標準溶液は、１−デオキシ、１−モルホリノ
フルクトース（DMF）の0.01ｍ水溶液の既知量
をアルブミン溶液に添加することによつて製造す
るのが好ましい。アルブミンは、使用のため40
ｇ／に希釈されるアルブミン（Albumin）25
ｇ／100ml（即ち250ｇ／）であつてよい。 アルブミンの存在はDMFのピークの吸光度を
移動させるのに必要であるので、これらの標準溶
液をアルブミン中で作る。しかしながら、アルブ
ミン自体も若干の活性を有し、好ましい（DMF）
標準に対して適切に検定されたアルブミン溶液又
は既知量の ¹⁴C−グルコース又は ³H−グルコー
スを配合して含む蛋白質溶液に対して検定したア
ルブミン溶液を標準溶液として使用することもで
きる。 実験により、測定値は低分子量の還元剤によつ
ては極めて少ししか影響されず、NBT還元が主
として高分子量ケトアミン又はグルコシル蛋白、
即ちフルクトサミンの濃度を反映するという見解
と一致することが判る。 ５〜20分の間の連続する５分間隔の530nｍで
の吸光度の変化として評価するとNBT還元は各
時間間隔毎にDMF濃度に直線的に相関し、その
直線関係は試験した最高濃度である８ｍmolの
DMF／まで維持された。グラフにプロツトす
ると、標準が自体若干の活性を有するアルブミン
を40ｇ／含むので、線は原点を通過しないこと
に注意すべきである。本発明方法は人為操作で又
は自動システムで実施することができる。分析は
簡単に人為的に行われ、再現性がある。更に、分
析は迅速である。それぞれの場合に全時間経過を
記録する場合、一般に毎時12個の試料しか測定出
来ないが、不連続的分析で10分及び15分に20秒毎
に試料を読み取ることによつて、毎時40個の試料
を適応させることができる。 緩衝剤及び着色剤を含む試薬並びにアルブミン
のような蛋白質及び１−デオキシ、１−モルホリ
ノフルクトース（DMF）のような合成フルクト
サミンを含む標準溶液は、共に新規組成物であ
り、本発明の一部をなす。 従つて、本発明はまた、本発明方法に使用する
試薬にあり、該試薬は緩衝剤及び変色する着色剤
を含む。この試薬は、血液試料又は血液から誘導
した試料に添加すると、グルコースがなおその血
液中の蛋白質のアミン基と反応又は会合している
間及びグルコースが分子転移を受け、フルクトサ
ミンの形で存在する場合に試料中のそのグルコー
スによつて着色剤の色の変化が起こされるように
着色剤及びPH条件を与える。 本発明は更に、アルブミンのような蛋白質及び
DMFのような合成フルクトサミンを含む標準溶
液、好ましくは40ｇ／の濃度のアルブミン溶液
中のDMFの0.01ｍ水溶液にある。 本発明の原理を利用しながら、前記の方法及び
材料を変更することができる。即ち、フルクトサ
ミンのエノール形は、着色剤を変換して、グルコ
ースがないその血液中の蛋白質又はアミンと反応
又は会合しており、グルコースが分子転移を受け
てフルクトサミンを形成していても、血液試料中
のグルコース濃度の指標を得るため測定し、標準
と比較しうる色又は吸光度の変化を生ずる、化学
的に活性な物質である。 本発明の構成及び広範な実施態様及び適用につ
いて、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの
変更をなしうることは、当業者には明らかであ
る。本明細書における開示及び記載は純粋に説明
のためのものであり、何等限定を意味するもので
はない。 例 １ 人為操作 材料：アルブミンは、オーストリア国メルボル
ンのコモンウエルス・シーラム・ラボラトリイー
ス（Commonwealth Serum Laboratories）か
らのヒト・アルブミンであり、NBTはアメリカ
合衆国ミズーリ州セントルイスのシグマ・ケミカ
ル（Sigma Chemical Co.）製のものである。 着色試薬（0.1M Na₂CO₃／NaHCO₃、PH10.8）
を得るため、下記の物質を順次秤量する： Na₂CO₃ 7.95ｇ NaHCO₃ 2.1ｇ ニトロ−ブルーテトラゾリウム（シグマ社）
0.2ｇ エタノール ４ml 脱イオン水 全量１にする。 容量1000mlのフラスコ中に各試薬を少量の蒸留
水（脱イオン水）とともに流入させる。緩和に動
揺させ、蒸留水で1000mlにして溶解させる。PHは
10.5〜11.00であるべきであり、10.8であるのが好
ましい。試薬は室温では安定でないので、毎週新
しく作るか、または好ましくは多量に作り、少量
に分割し、凍結して貯蔵し、使用前に溶解させ
る。アルブミン標準は食塩水（0.14ｍ NaCl）
１中にアルブミン40ｇを含む。 １−デオキシ、１−モルホリノフルクトース
（DMF）５ｍmol／標準溶液を得るため、124.5
ｍgmのDMF（分子量249）を秤量し、アルブミン
40ｇ／を用いて100mlにする。アルブミンの存
在はDMFのピークの吸光度を移動させるために
必要であるので、アルブミン中で標準を作る。し
かしながら、アルブミン自体も若干の活性を有す
るので、下記の検定の際にこれを標準の活性から
差し引く。 濃度1.0、2.0、3.0及び4.00ｍmol／の標準を
同様に製造する。標準を0.5mlずつに分け、−20℃
で貯蔵する。 血液試料中のフルクトサミン濃度を測定するた
め採用する操作は下記のとおりである： 血液試料を普通の管に集め、凝固させ、迅速に
分離する。直ちに分析しない場合には、血清を−
20℃に保持することができる。この温度では、フ
ルクトサミンは無限に安定である。 血清0.1mlを37℃でニトロ−ブルーテトラゾリ
ウム（NBT）0.25ｍmolを含む炭酸塩緩衝液
（0.1mol／、PH10.8）１mlに添加する。530nｍ
での吸光度を混合後10分及び15分に測定し、同じ
方法で処理した１−デオキシ、１−モルホリノフ
ルクトース（DMF）＋アルブミン（40ｇ／）の
標準のそれと比較する。吸光度は、パイ・ユニカ
ム（Pye Unicam）SR800又はギルフオード250
のような記録分光光度計で測定する。必要に応
じ、恒温制御される記録分光光度計で反応速度を
追跡することができる。 時間限定が精確に維持されうるように、選択し
た時間間隔、例えば15秒に血清試料を採取し、各
血清試料0.1mlを着色試薬1.0mlに添加する。次
に、吸光度を530nｍで試験の開始から10分及び
15分に読み取る。アルブミン及びDMF標準を同
様に処理して対照標準を作る。フルクトサミンの
補正した読み取り値を下記のように計算すること
ができる（Ａ＝吸光度）： （A15分−A10分）試験×５／（A15分−A10分）標準−（
A15分−A10分）アルブミン＝フルクトサミン濃度（単位
／） 対照範囲： 1.40〜1.96単位／ 注： １ 抗凝固剤が妨害することがあるので、血漿は
この試験にはあまり適当でない。 ２ 標本は−20℃で貯蔵すれば、少なくとも３ケ
月安定である。 ３ 対照−ウシ及びヒトからの市販の凍結乾燥血
清は適当な低い、中程度及び高い対照を生ず
る。 例 ２ 連続分析器、例えばテクニコン・オート−アナ
ライザー（Technicon Auto−Analyser）によ
る血清または血漿フルクトサミン濃度の測定 前記のように、アルブミンと結合したフルクト
サミンは、アルカリ性PHでニトロ−ブルーテトラ
ゾリウム染料を還元する。他の物質による非特異
的還元は数分競合するが、フルクトサミン還元
は、はるかに長い時間進行する。 第３図に示したように、連続的装置、例えばテ
クニコン・オート−アナライザーを使用する場
合、他の物質による非特異的還元に関する補正
は、ブランク・チヤンネル１を使用して行なうこ
とができる。このチヤンネルでの色の変化を5.5
分の反応時間後に読み、試験チヤンネル２は、
8.5分の反応時間後に読む。反応流を45℃に加熱
してピークの遅延時間を短縮し、応答を線状にす
るため、着色試薬はエタノールを含む。色を
350nｍで読む。 アルブミン欠乏状態でのフルクトサミン濃度は
無効であるので、血清アルブミン濃度を平行して
測定する。 システムの説明 第３図において、管路３より入る試料は予め希
釈（１：16）され、次に試薬流４及び５中に再採
取される。ブランクチヤンネルは、より短い加熱
コイルを有する遅延コイル６と結合して、反応時
間が試験チヤンネルより３分短くなるが、全体の
滞留時間は同じであるようにする。反応は45℃で
起り、ピークの読み取り値が自動的に差し引かれ
る場合、瞬間的に比色計にピークが到達する。比
色計の直前に、ブランク管路に整相コイルを設け
て正確な整相が達成される。 方 法 １ 試料採取速度75／時、試料採取時間40秒、洗
浄時間８秒を選択する。 ２ 希釈剤及びNBT試薬を試薬びんに接続する。 ３ ポンプを始動させる。 ４ 深冷凍結から標準を取り出し、室温に放置す
る。 ５ 10分後、記録器を始動させ、基線を10％にセ
ツトする。 ６ 標準、次に試料を装入し、流す。10分毎に対
照を置く。 ７ 最後のピークが通過した後５分間、試薬管路
をNaOH（1M）で洗浄し、次に10分間水で洗
浄する。 バツチの構造 (a) 標準バツチ カツプ番号 １ ０標準 ２ 1.0ｍmol標準 ３ 2.0ｍmol標準 ４ 3.0ｍmol標準 ５ 4.0ｍmol標準 ６ 5.0ｍmol標準 (b) 患者バツチ カツプ５、25 低対照血清 カツプ15、35 高対照血清 カツプ10、20、30、40 参考対照血清 計 算 標準アルブミン溶液（40ｇ／）中で作り、標
準曲線をプロツトする前にアルブミン活性に関し
て補正する必要がある。「０」標準を他の標準か
ら差し引き、補正した標準を使用して、濃度（ｘ
軸）に対してピークの高さ（ｙ軸）をプロツトし
た標準曲線を作る。 試料のピークを標準曲線から直接読み取る。 試 薬 希釈剤：塩化ナトリウム（BDH） 0.9ｇ ブリジ（Brij）−35（30％） 20ml 水 全量１にする。 着色試料：ニトロ−ブルーテトラゾリウム（シグ
マ社） 0.20ｇ 炭酸ナトリウム（Riedel−de Haen）
7.95ｇ 重炭酸ナトリウム（Riedel−de
Haen） 2.10ｇ 水 全量１にする。 標 準 デオキシ−モルホリノフルクトース（DMF）
1.245ｇを秤取し、アルブミン溶液１に溶かす
ことによつてDMFのストツク溶液を製造する。
濃度は５ｍmol／である。 アルブミン40ｇを食塩水（0.14ｍ NaCl）１
に溶かしてアルブミン溶液を調製する。 これから操作標準を1.0；2.0；3.0；4.0及び5.0
ｍmol／の濃度で製造する。DMFを添加せず
アルブミン希釈液だけを使用してブランクを製造
する。 技術的事項 １ 試料採取速度は、ピークが定常状態になるの
に要する時間に左右される。試験及びブランク
に対して若干のプラトー時間が必要であり、位
相調整することができる。30秒程度の少ない試
料採取時間で屡々充分であるが、通常の試験に
は40秒の方が良い。 ２ 標準はアルブミンを含み、冷凍する必要があ
る。 ３ 各試験の後に水酸化ナトリウム（1M）を用
いてシステムを５分洗浄する必要がある。 例 ３ 二色性不連続分析器〔アボツト（ABBOTT）〕
による血清フルクトサミンの測定 Ａ 材料 (1) 緩衝剤及び着色試薬：（0.1M Na₂CO₃／
NaHCO₃、PH10.57） 下記の物質を順次秤取する。 Na₂CO₃ 0.795ｇ NaHCO₃ 0.210ｇ ニトロ−ブルーテトラゾリウム（NBT）
0.02ｇ (2) デオキシモルホリノフルクトース（DMF）
の0.01ｍ水溶液の既知量をアルブミン溶液を
添加して標準溶液を作る。

【表】 標準を0.5mlずつに分割し、−20℃で貯蔵す
る。 各試薬を容量100mlのフラスコ中に少量の蒸
留水と共に流入させる。穏やかに撹拌して溶解
させ、蒸留水で100mlにする。PHは10.55〜
10.60であるべきであり、10.57であるのが好ま
しい。試薬は無限には安定ではなく、毎週新し
く作るか、または−20℃で貯蔵すべきである。 Ｂ 操作： アボツト200二色性分析器で一連の試験を下
記のように行なう： １ 装置を下記のように設定する： 試験コード78 試料容量25uL（07） 試薬容量250uL（06） フイルター550／650 Rx型割合 Rx方向上 分析時間５分 回 転４ 温 度37℃ ２ 新しく、きれいなキユベツトを使用する。 ３ 洗浄サイクルを活動させて、システムに水
を流し、気泡を除去する。次に、水を操作試
薬に代え、プライムサイクルを開始する。初
めの３ジエツトを捨て、次に少なくとも10回
びんにもどす。 ４ カローセル中に必要な数の試料カツプを挿
入し、各カツプに50uLの試料を加える。 01 H₂O 02 ゼロ標準 03 1.0ｍmol／Ｌ 04 2.0ｍmol／Ｌ 05 3.0ｍmol／Ｌ 06 4.0ｍmol／Ｌ 07 対照血清 08 対照血清 31 対照血清 32 正常血清 09〜30は患者の試料である。50uLの陽性
置換注射器を使用する。 ５ 各試験列に検定曲線を入れる。カローシル
を00の位置に回転させ、運転ボタンを押す。 ６ ABA200は４回転し、第１回は試料及び試
薬を分配し、第２回は遅延サイクルを行な
い、第３回及び第４回はそれぞれ最初及び最
後の吸光度の読み取りを行なう。最初及び最
後の吸光度の読み取り値の間の差を用いて、
標準曲線を用いて試料濃度を計算する。 ７ マルチキユベツトを取り除き、水で洗浄す
る。水中に一夜浸漬しておく。洗浄サイクル
を活動させて「コントラド（Contrad）」洗
浄液をピペツトに流し、水による洗浄操作を
繰り返す。 ８ 正常範囲は1.14〜1.96ｍmol／Ｌである。
糖尿病患者の試料は通常2.0ｍmol／Ｌより
大きいであろう。 ９ 温度を好ましくは37℃に制限する。 技術的事項 １ ABA200は、誤まつたRX型、Rx方向、温
度、回転及び時間を自動的に拒絶するが、誤ま
つたフイルタまたは試料／試薬容量の設定を拒
絶しない。 ２ 炭酸ナトリウム／重炭酸ナトリウム緩衝液を
含む着色試薬は、４℃で貯蔵する場合、１週間
まで安定である。使用直前にPHを確認し、PHが
10.55〜10.60であることを確認する。着色試薬
を使用する前にすべてのNBTが溶解している
ことを確認する。 ３ 対照試料は、好ましい品質対照チヤートによ
り２×SD範囲内の数値を生ずべきである。２
×SD範囲以外への偏奇が起る場合、すべての
分析を記録するのが好ましい。 ４ 試料は、保存剤を添加しない血清であるべき
である。 本発明方法は、下記の化学変化を利用するもの
である： 蛋白質は、グルコースと利用しうるアミン基と
の間の非酵素反応で生体内でグリコシル化され
る。 グリコシル化はグルコース濃度に左右され、糖
尿病患者は正常より高いフルクトサミン濃度を有
する。アルカリ溶液中のフルクトサミンは、還元
性物質であるエナミノールを形成する。 本発明の好ましい態様では、アルブミンに結合
したフルクトサミンの還元活性は、アルカリ性PH
でニトロ−ブルーテトラゾリウムで検出すること
ができ、吸光度の変化の割合として測定する。 前記のことから、少なくとも好ましい態様で
は、従来の方法と比較して利点を有するか、また
は従来方法の欠点を克服していることが判るであ
ろう。 特に、本発明の臨床的意義は、下記のようにま
とめることができる； １ フルクトサミンは、糖尿病患者における代謝
管理の指標である。フルクトサミンは患者の許
容性、医療の質、及びインシユリン療法の効果
を反映する。本発明を使用することにより、フ
ルクトサミンを毎週測定することができ、この
ような測定が管理の変更による糖尿病患者の治
療の改善／悪化を精密かつ確実に検出すると考
えられる。 ２ フルクトサミンは血清蛋白質のグルコシル化
を反映する。80％より大きい主たる寄与はアル
ブミンによる。その崩壊の速度はアルブミンの
挙動に近似する。（Ｔ1/2＝20日） ３ 低アルブミン血症（アルブミンは30ｇ／Ｌよ
り少ない）の個体では、試験の数値は著しく損
なわれる。 ４ フルクトサミンは絶食血液中のグルコース濃
度に直接相関し、食後の高血糖にはあまり影響
されない。試料採取時間及びその食事との関係
は重要でない。 ５ フルクトサミンは、糖尿病の個体を検出する
ためのスクリーニング試験として有用である。 ６ 緩和なアルカリ条件（11.0より低いPH）及び
制御された温度（50℃より低い）で反応を行な
うことによつて、本発明方法は遊離なグルコー
スまたは不安定なアルジミン形のグルコースを
測定しないで、安定なフルクトサミン形のグル
コースだけを測定する。 ７ 色の変化の測定を試験開始後数分間遅延させ
ることによつて、妨害物質の寄与を最小にす
る。

【図面の簡単な説明】

第１図は血清フルクトサミン濃度を示すグラ
フ、第２図は妊娠患者の血清フルクトサミン濃度
を示すグラフ、第３図は本発明による連続試験法
のフローシートである。 １……ブランクチヤンネル、２……試験チヤン
ネル、４，５……試薬流、６……遅延コイル。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ フルクトサミンの濃度が一定時間にわたつて
   試料中の平均血清グルコース濃度を反映してい
   る、血液試料又は血液から誘導した試料中のフル
   クトサミン濃度の測定方法であつて、50℃未満の
   調節された温度で試料を維持し、試料のPHを10〜
   14の数値に調節し、試料に着色剤を添加し次いで
   最初の遅延時間後に予じめ定めた波長で最初の色
   測定を行い、第二の遅延時間後に予じめ定めた波
   長で第二の色測定を行い、次いで第一の色の測定
   と第二の色の測定との間に生じた変化を比較する
   ことにより該試料中のフルクトサミン濃度を測定
   することを含んでなり、着色剤、遅延時間、波長
   およびPH条件を、前記第一の色測定と第二の色測
   定との間の着色剤の色の変化が、蛋白質のアミン
   基と反応又は会合し次いで分子転位を受け、フル
   クトサミンを形成するような試料中のグルコース
   によつて優先的に起こされ、更に試料中に存在す
   る非特異的還元物質によつては本質的に起こされ
   ないように、選択することを特徴とする、前記方
   法。 ２ 前記PHレベルを、着色剤を含む緩衝剤を試料
   に添加することによつて調節する、特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 前記緩衝剤が炭酸ナトリウム及び重炭酸ナト
   リウムを含む特許請求の範囲第２項記載の方法。 ４ 前記着色剤が還元されると変色するテトラゾ
   リウム塩を含む、特許請求の範囲第１項記載の方
   法。 ５ 前記着色剤がニトロ−ブル−テトラゾリウム
   である特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６ 前記工程を約37℃で行う、特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ７ 前記工程を自動試験装置で試料列について行
   う特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ８ 前記試料が試験の間、約45℃の温度にある特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 既知読み取り値を生ずる試験標準を少なくと
   も１種使用して、前記試料の試験の間に使用する
   試験装置の検定を行う工程を含む特許請求の範囲
   第１項に記載の方法。 １０ 前記標準溶液が蛋白質および１−デオキソ
   −１−モルホリノフルクトースの水溶液を含んで
   なる、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １１ 前記蛋白質がアルブミンである、特許請求
   の範囲第１０項記載の方法。 １２ 着色剤を試料に添加後、それぞれ５〜10分
   及び８〜15分後に530nｍで吸光度を測定するこ
   とにより、前記第一および第二の色測定を行う、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３ 前記吸光度を試験開始後約10分及び次に試
   験開始後15分に測定する特許請求の範囲第１２項
   に記載の方法。 １４ 蛋白質および１−デオキソ−１−モルホリ
   ノフルクトースの水溶液を含んでなる、血液試料
   又は血液から誘導される試料中の血清フルクトサ
   ミン濃度の測定用標準溶液。 １５ 前記蛋白質がアルブミンである、特許請求
   の範囲第１４項記載の標準溶液。 １６ 血液試料又は血液から誘導される試料中の
   血清フルクトサミン濃度を測定する試剤であつ
   て、初期時間後、蛋白質のアミン基と反応又は会
   合し次いで分子転位を受けフルクトサミンを形成
   する、試料中のグルコースによつて色変化が優先
   的に行なわれ、試料中に存在し得る非特異的還元
   物質によつては本質的に行なわれないように、緩
   衝剤およびニトロ−ブルテトラゾリウムを試料に
   添加後試料中に存在するフルクトサミンをその活
   性エノール形に変え全期間反応し得るのに十分な
   量のアルカリ性緩衝剤およびニトロ−ブル−テト
   ラゾリウムを含んでなる、前記試剤。