JP7497348B2

JP7497348B2 - リボフラビンの改善された産生

Info

Publication number: JP7497348B2
Application number: JP2021520944A
Authority: JP
Inventors: クリストファー，マークファレル，; セバスチャン，エリックポトット，; ゾルターンプラガイ，; マイケル，パトリックアナーヤ，
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2018-11-15
Filing date: 2019-11-11
Publication date: 2024-06-10
Anticipated expiration: 2039-11-11
Also published as: US20220010291A1; WO2020099303A1; EP3880835A1; EA202191360A1; BR112021009177A2; JP2022512708A; CN113015811A

Description

発明の詳細な説明

本発明は、ピリドキサールホスファターゼ活性を有する異種酵素を含む、遺伝子操作された宿主細胞を使用して、ビタミンＢ２を産生する改善された方法に関する。前記改変宿主細胞を使用すると、リボフラビン産生の収率は少なくとも約５％増加し得る。

リボフラビンは全ての植物及び多くの微生物によって合成されるが、高等動物では産生されない。リボフラビンは、炭水化物の酵素的酸化に必要なフラビンアデニンジヌクレオチド及びフラビンモノヌクレオチドなどの補酵素の前駆体であるため、基礎代謝に必要不可欠である。高等動物においては、リボフラビンの供給が不足すると、脱毛、皮膚の炎症、視力の悪化、及び成長阻害を引き起こす可能性がある。

リボフラビンの生合成は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）及びリブロース－５－リン酸から出発する。リボフラビンの生合成に要する遺伝子は、様々な供給源、例えば、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エレオテシウム・アシュビイ（Ｅｒｅｏｔｈｅｃｉｕｍａｓｈｂｙｉｉ）、アシュビア・ゴシッピイ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）、カンジダ・フラレリ（Ｃａｎｄｉｄａｆｌａｒｅｒｉ）、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などに由来するものが知られている（例えば、欧州特許第４０５３７０号明細書、欧州特許第１１８６６６４号明細書の図２、又はウルマン工業化学百科事典・第７版（Ｕｌｌｍａｎ’ｓＥｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａｏｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，７^ｔｈＥｄｉｔｉｏｎ）２００７、ビタミンの章を参照）。

例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株などの微生物を使用する工業産生法の確立には、宿主株及び／又は工程条件のいくらかの改変が必要である（例えば、Ｋｉｌら，ＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔ２３３，４８３－４８６，１９９２；Ｍａｃｋら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８０：９５０－９５５，１９９８を参照）。リボフラビン生合成経路の中への、及びそれを通過する代謝フラックスは、リブロース－５－ホフェート（ｒｉｂｕｌｏｓｅ－５－ｐｈｏｐｈａｔｅ）の細胞内濃度を、リボフラビン生合成経路の推定律速酵素である３，４－ジヒドロキシ－２－ブタノン４－ホスフェートシンターゼの飽和基質濃度より高く、又はそれに可能な限り近く保持することによって、高レベルに維持されなければならない。

ｒｉｂプロモーター（Ｐ_ｒｉｂ）からのリボフラビンオペロンの転写は、オペロン中の最初の遺伝子であるｒｉｂＧの転写開始コドンと翻訳開始コドンとの間のｒｉｂオペロンの５’領域に位置するほぼ３００のヌクレオチドの非翻訳の制御性先導領域を要するリボスイッチによって制御される。新生リボフラビンＲＮＡの伸長は、ＦＭＮ又はＦＡＤの存在又は非存在に依存する。これらのエフェクターの存在下では、転写終結ヘアピンが形成され（いわゆるｒｉｂターミネーター）、これらのエフェクターの非存在下では、いわゆる抗ターミネーターが形成され、ｒｉｂオペロンの読み過ごし転写が起こる。

したがって、微生物を使用する工業的方法の確立には、例えば全工程にわたる効率的で直接的な代謝フラックスの維持など、幾つかの障害を伴う、高度に精巧な、多酵素が関与する工程が必要である。

驚くべきことに、今般、本発明者らは、ビタミンＢ６生合成経路から知られている特定のホスファターゼがリボフラビンの発酵産生において重要な役割を果たし、少なくとも約５％の収率の増加をもたらすことを発見した。

特に、本発明は、リボフラビンを産生する宿主細胞、例えば、リボフラビン生合成遺伝子を含む（及び発現する）（組換え）宿主細胞、特に、ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種酵素を含む、リボフラビンを産生するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）を対象とする。

本発明によれば、リボフラビンを産生する宿主細胞は、リボフラビンを産生することができる、即ちリボフラビン生合成遺伝子を含む（及び発現する）、任意の好適な宿主細胞とすることができる。好ましくは、リボフラビン生合成遺伝子は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に由来し、特に枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来し、例えばリボフラビン生合成遺伝子ｒｉｂＧ（ｒｉｂＤ）、ｒｉｂＢ（ｒｉｂＥ）、ｒｉｂＡ、及びｒｉｂＨを含む。

本明細書に定義されるリボフラビンを産生する宿主細胞中に存在する、ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種酵素は、様々な供給源、例えば、動物、植物、細菌又は真菌（酵母を含む）を含む微生物などから取得可能な場合がある。一実施形態では、本明細書に定義される活性を有する異種酵素は、配列番号２（配列番号１のポリヌクレオチドによって発現され得る）と少なくとも約７０％、例えば７５、８０、８５、９０、９５、９８％又は１００％までの同一性を有するポリペプチドから選択される。

配列番号２のポリペプチドは、アルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＩＦＯ１４７８２（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ７ＢＫ７８を参照）から単離された。本明細書に定義されるリボフラビンを産生する宿主細胞において使用することが可能な、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドのさらなる供給源には、以下に限定されないが、根粒菌の株、例えば、シノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｓｐ．）ＲＡＣ０２、アルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＵＳＤＡ１０２１－ＡＴＣＣ１４５８０株、エンドウ根粒菌（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｅｇｕｍｉｎｏｓａｒｕｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＷＰ＿０１８０６８７２１）、アルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）ＢＬ２２５Ｃ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥＧ０３０１８．１）又は表４に記載のものが含まれる。

リボフラビン生合成遺伝子を含むリボフラビンを産生する宿主細胞、例えば、ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する本明細書に定義される異種酵素、特に、配列番号２と少なくとも約７０％の同一性を有する異種酵素／ポリペプチドを含む微生物、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）などは、本明細書において「改変」又は「組換え」宿主細胞と呼ばれる。

本明細書で使用する場合、「非改変の」又は「野生型の」リボフラビンを産生する宿主細胞は、リボフラビン生合成遺伝子を含むが、本明細書に定義される異種酵素の活性を有する酵素を含まない（発現しない）細胞、例えば微生物、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。

本明細書で使用する場合、「異種酵素」という用語は、それぞれの宿主細胞、即ちリボフラビンを産生する宿主細胞の内在性酵素ではない酵素に関する。宿主細胞の中に発現されるために、前記酵素をコードする対応するＤＮＡが、好適なリボフラビンを産生する宿主細胞、例えばバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などの中に導入されなければならない。したがって、本発明は、リボフラビンを産生する宿主細胞、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、好ましくは枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であって、ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有し、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有する酵素をコードするポリヌクレオチドが当該宿主細胞の中に導入され、さらに前記ポリヌクレオチドが発現される（及び活性である）、宿主細胞に関する。

本明細書に定義される酵素をコードするＤＮＡ配列の導入は、例えば宿主細胞の染色体中への形質転換、接合又は形質導入によるＤＮＡ配列の追加又は挿入を介してもよく、又はＤＮＡ配列は、複製プラスミドＤＮＡで、即ち好適な発現ベクターで導入されてもよい。前記追加又は挿入は、ＤＮＡ組換えによって生じる場合があり、その結果、染色体ＤＮＡヌクレオチドの除去又は欠失が起こる場合もあり、起こらない場合もある。宿主細胞中、例えば微生物中へのＤＮＡ配列の導入が、特に部位特異的な導入によって実現される方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ，ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｒｅｓｓ，ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）；及びＡｕｓｕｂｅｌら（共編），１９９５，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ニューヨーク）に記載されている。「改変」宿主細胞又は「形質転換」宿主細胞という用語は、本明細書において互換的に使用される場合がある。当業者は、本明細書に定義される改変宿主細胞の生成に使用されるべき好適な方法及び／又は発現ベクターを心得ている。

本発明の実施形態によれば、本明細書に定義される異種酵素、好ましくはピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有し、配列番号２と少なくとも約７０％の同一性を有するポリペプチド、例えば、配列番号１のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドなどの１つ又は複数のコピー、例えば１、２、３、４、又は５以上のコピーが、本明細書に定義される改変宿主細胞の中に導入され、発現される場合がある。本明細書に定義され、本発明の一態様による異種酵素をコードするポリヌクレオチドは、強力なプロモーター及び／又は構成的プロモーター若しくは誘導性プロモーターの制御下にある場合があり、或いは、例えば異種酵素をコードする遺伝子の変異を通して、又は転写阻害因子及び／若しくは翻訳阻害因子の不活性化を含む、転写制御因子及び／若しくは翻訳制御因子の導入及び／若しくは遺伝子改変を介して、さらに改変される場合がある。これらの技術を当業者は心得ている。

本発明の実行に有用な構成的プロモーターには、例えば、原核生物のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｐｏＶＧ遺伝子のＲＢＳ、例えば配列番号３の１～４６位（ＡＴＧ－７１ｂｐからＡＴＧ－２６ｂｐ）及び配列番号３の５５～７１位（ＡＴＧ－１７ｂｐからＡＴＧ－１ｂｐ）にそれぞれ相当するヌクレオチドに結合するＰ_ｖｅｇが含まれる。さらなる有用な強力なプロモーターはＰ_{ｓｐｏ１５}である。本明細書に定義される改変宿主細胞の中にそのような強力なプロモーターを導入すると、リボフラビンの産生を、本明細書に定義される非改変宿主細胞を使用する場合と比較して、少なくとも５０％、７５％、１００％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、５００％又は１０００％よりさらに多く増加させる場合がある。したがって、一実施形態では、本明細書に定義される異種酵素は、ＲＢＳに結合するＰ_ｖｅｇを含むがこれに限定されない特定のプロモーターと一緒に使用される。

一実施形態では、改変宿主細胞は、リボフラビンの産生が可能であり、リボフラビンの収率は、非改変宿主細胞と比較して、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７、８、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０％以上、増加する。

一実施形態では、本明細書に定義されるリボフラビンを産生する改変宿主細胞中の（内在性）ｒｉｂＣ遺伝子の活性は、減少しているか又は消失しており、特に少なくとも約２０％、好ましくは、例えば少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０％減少している。最も好ましくは、ｒｉｂＣ活性は消失している、即ち、ゼロ活性まで減少している。これは、例えば、本明細書に記載されるｒｉｂＣ遺伝子又はこの遺伝子の一部をノックアウトすることによって実現することができる（例えば米国特許第５８３７５２８号明細書を参照）。

当業者は、そのような宿主細胞をどのように遺伝子操作又は遺伝子改変すれば、例えばｒｉｂＣ活性が減少又は消失するのかを心得ている。これには、以下に限定されないが、例えば、プラスミド、ウイルス、又は他のベクターを使用する、遺伝子置換、遺伝子増幅、遺伝子破壊、トランスフェクション、形質転換が含まれる。

宿主細胞に、ｒｉｂＣ遺伝子及び／又はタンパク質のコピーの産生を少なくさせるか又は全く産生させなくするための改変には、弱いプロモーターの使用、又は（本明細書に記載される）ｒｉｂＣ遺伝子（の一部）、特にその調節エレメントの変異（例えば挿入、欠失又は点変異）が含まれ得る。さらに、ｒｉｂＣに特異的な活性の減少又は消失は、ｒｉｂＣを、特定の阻害剤又はｒｉｂＣと特異的に相互作用する他の物質に接触させることによって実現することができる。当技術分野において公知であるこれらの方法は、ｒｉｂＣの活性が減少又は消失しており、本明細書に記載されるピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種ポリペプチドを含む、リボフラビンを産生する宿主細胞を生成するために使用することができる。

本明細書に定義される改変宿主細胞は、例えば１つ又は複数のリボフラビン生合成遺伝子、特にｒｉｂＡの過剰発現、又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＲＢ５０株において実行されたような（例えば欧州特許４０５３７０号明細書を参照）、宿主細胞中へのｒｉｂオペロンの多重コピーの導入などのさらなる改変を担持していてもよい。そのように、即ちｒｉｂ遺伝子の強力なプロモーターへの融合を介して微生物を遺伝子改変することによって、リボフラビンの産生は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０におけるリボフラビンの産生と比較して、少なくとも１００％、２００％、２５０％、５００％、又は７５０％よりさらに多く増加し得る。本発明の特定の一態様によれば、任意選択により強力なプロモーター及び／又はｒｉｂオペロンの１つ若しくは複数の多重コピーの導入と組み合わされた、本明細書に定義されるピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種酵素を担持する微生物は、例えば、ビオチンについて欧州特許第１１８６６６４号明細書に記載されているような栄養要求性の導入を介して、リボフラビンの産生から増殖を分離することによってさらに改変されていてもよく、及び／又は例えば、国際公開第２００７０５１５５２号パンフレットに記載されているような改変トランスケトラーゼ遺伝子の導入とさらに組み合わされていてもよく、及び／又は例えば、国際公開第２０１００５２３１９号パンフレットに記載されているような改変ｒｉｂリーダー配列の使用とさらに組み合わされていてもよい。

リボフラビンの産生のための宿主として使用することができる本発明による特定の好ましい菌株は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。より好ましい菌株は、ｒｉｂ遺伝子の転写を増強するために強力なプロモーターＰ_{ｓｐｏ１５}で改変されたｒｉｂオペロンをコードするｐＲＦ６９の多重（ｎ）コピー（例えば約５～約２０コピー）を含有する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲＢ５０：：［ｐＲＦ６９］_ｎである（リボフラビンの産生に至るための菌株の構築及び培養条件については、例えば欧州特許第４０５３７０号明細書及びパーキンズ（Ｐｅｒｋｉｎｓ）ら、Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２２：８－１８，１９９９を参照）。

「発現」という用語は、ポリペプチドの産生において必要とされる任意のステップを含み、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌を含むが、これらに限定されない。

配列同一性又は配列相同性は、本明細書において互換的に使用される。２つのアミノ酸配列又は２つの核酸配列の配列同一性のパーセンテージを決定するために、配列は最適な比較ができるようにアラインされる。２つの配列間のアラインメントを最適化するために、比較される２つの配列のうちいずれかにギャップが導入されてもよい。そのようなアラインメントを、比較される配列の全長にわたって行うことができる。或いは、アラインメントは、長さを短くして、例えば約２０、約５０、約１００又はそれより多い核酸／塩基若しくはアミノ酸で行われてもよい。配列同一性とは、２つの配列間の、報告され、アラインされた領域にわたる完全な一致のパーセンテージである。２つのアミノ酸配列間の、又は２つのヌクレオチド配列間の配列同一性のパーセントは、２つの配列のアラインメントについてのＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３－４５３）を使用して決定することができる。アミノ酸配列とヌクレオチド配列の両方とも、このアルゴリズムによってアラインすることができる。Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムは、コンピュータープログラムＮＥＥＤＬＥにおいて実行されている。本発明の目的では、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮＥＥＤＬＥプログラムを使用した（バージョン２．８．０以上、ＥＭＢＯＳＳ：ＴｈｅＥｕｒｏｐｅａｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＯｐｅｎＳｏｆｔｗａｒｅＳｕｉｔｅ（２０００）Ｒｉｃｅ，Ｐ．，Ｌｏｎｇｄｅｎ，Ｉ．及びＢｌｅａｓｂｙ，Ａ．ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓ１６，（６）２７６－２７７ページ，ｈｔｔｐ：／／ｅｍｂｏｓｓ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｎｌ／）。タンパク質配列では、置換マトリックスについてＥＢＬＯＳＵＭ６２が使用される。ヌクレオチド配列では、ＥＤＮＡＦＵＬＬが使用される。使用される任意選択のパラメーターは、ギャップ開始ペナルティが１０、及びギャップ伸長ペナルティが０．５である。これらの異なるパラメーターは全て、わずかに異なる結果を生じさせるが、２つの配列の同一性の全体的なパーセンテージは、異なるアルゴリズムを使用する場合でも大きくは変わらないことを当業者は理解するであろう。上記のプログラムＮＥＥＤＬＥによるアラインメント後、問い合わせ配列と本発明の配列との間の配列同一性のパーセンテージは、次のように計算される：［両配列中の同一のアミノ酸又は同一のヌクレオチドを示すアラインメント中の対応する位置の数］÷［アラインメント中のギャップの総数を減算した後のアラインメントの全長］。本明細書に定義される同一性は、ＮＯＢＲＩＥＦオプションを使用してＮＥＥＤＬＥから取得することができ、プログラムのアウトプットに「最長同一性」とラベルされる。

本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、例えば、他のファミリーメンバー又は関連する配列を特定するために、公開データベースに対する検索を行うための「問い合わせ配列」としてさらに使用することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を使用して実行することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で実行して、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実行して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較用に、ギャップのあるアラインメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２に記載されているように、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用することができる。アメリカ国立生物工学情報センター（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照されたい。

本明細書に記載される「合成分子」、例えば、合成核酸又は合成ポリペプチドなどは、ｉｎｖｉｔｒｏの化学合成又は酵素的合成によって製造される。合成分子には、最適な宿主生物のために最適なコドン使用頻度で作製された変異核酸が含まれるが、これに限定されない。

合成核酸は、好ましくは、コドンペア最適化の方法を含む、国際公開第２００６０７７２５８号パンフレット及び／又は国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに記載されている方法に従って、コドンの使用について最適化され得る。コドンペア最適化とは、ヌクレオチド配列のコドン使用頻度に関して、特に使用されているコドンペアに関して改変されている、ポリペプチドをコードする当該ヌクレオチド配列が、ポリペプチドをコードする当該ヌクレオチド配列の発現が改善されるように、及び／又はコードされたポリペプチドの産生が改善されるように、最適化される方法である。コドンペアは、コード配列中の２つの連続するトリプレット（コドン）の一組と定義される。コドン使用頻度は宿主種に応じて適応させる必要があり、場合によっては配列番号２から相同性がかなり離れた変異体になる可能性があるが、それでもなお本発明によるポリペプチドをコードしているということを当業者は理解するであろう。一実施形態では、本発明は、リボフラビンを産生する好適な宿主細胞中に異種発現することになるコドン最適化した配列に関する。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）中に発現するのに適したそのようなコドン最適化配列の例は、配列番号４に示されている。

本明細書で使用する場合、「変異体」又は「ミュータント」という用語は互換的に使用することができる。これらはポリペプチド又はポリヌクレオチドを指すことができる。変異体は、参照配列に対する１つ又は複数の位置での、置換、挿入、欠失、トランケーション、塩基転換、及び／又は逆位を含む。変異体は、例えば、部位飽和変異導入法、系統的変異導入法、挿入変異導入法、ランダム変異導入法、部位特異的変異導入法、及び指向性進化法、並びに当業者に既知の様々な他の組換え手法によって作製することができる。核酸の変異体遺伝子は、当技術分野において公知の技術により、人工的に合成することができる。

本明細書で使用する場合、酵素に関する「特異的活性」又は「活性」という用語は、その触媒活性、即ち所与の基質からの産物の形成を触媒するその能力を意味する。特異的活性は、ある一定時間に規定温度で規定量のタンパク質当たり、消費される基質及び／又は産生される産物の量を規定する。通常、特異的活性は、分当たり、タンパク質ｍｇ当たり、消費される基質又は形成される産物のμｍｏｌで表される。通常、μｍｏｌ／分はＵ（＝単位）と略される。したがって、特異的活性の単位の定義であるμｍｏｌ／分／（タンパク質ｍｇ）又はＵ／（タンパク質ｍｇ）は、本文書の全体で互換的に使用される。酵素は、ｉｎｖｉｖｏで、即ち、本明細書に定義される宿主細胞の中で、又は好適な基質の存在下でのシステムの中で、その触媒活性を行う場合、活性である。当業者は、酵素活性、特に本明細書に定義されるピリドキサールホスファターゼ又はリボフラビン生合成酵素の活性を測定する方法を心得ている。本明細書に定義される好適な酵素の能力を評価するための、単離及び精製を含む分析方法は、当技術分野において公知である。

ピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］に特異的な生物学的活性の増加の測定は、次のように行うことができる：宿主細胞の遺伝子操作の前に、前記酵素の特異的活性を測定し、１００％と設定する。同じ測定を宿主細胞の改変／変異後に実行すると、異種酵素に特異的な活性、即ち１００％を超える活性が得られる。この測定は当技術分野において公知である。（ＳａｒｇｅＳら、Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．２０１５、１１月；１６（１７）：２４６６に記載されている）。

本発明に関して、当然のことながら、生物、例えば微生物、真菌、藻類又は植物などはまた、国際原核生物命名規約（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｄｅｏｆＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｏｆＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）又は国際藻類・菌類・植物命名規約（ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＣｏｄｅｏｆＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅｆｏｒａｌｇａｅ，ｆｕｎｇｉ，ａｎｄｐｌａｎｔｓ）（メルボルン規約）により定義されている、同じ生理学的性質を有するそのような種のシノニム又はバソニムも含む。

本明細書で使用する場合、「リボフラビン」という用語はまた、リボフラビン前駆体、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）、フラビンアデニンジヌクレオチド（ＦＡＤ）、及びそれらの誘導体も含む。リボフラビン前駆体、及びリボフラビン、ＦＭＮ又はＦＡＤの誘導体には、以下に限定されないが、２，５－ジアミノ－６－リボシルアミノ－４（３Ｈ）－ピリミジノン－５’－ホスフェート（ＤＲＡＰＰ）；５－アミノ－６－リボシルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン－５’－ホスフェート；２，５－ジアミノ－６－リビチルアミノ－４（３Ｈ）－ピリミジノン－５’－ホスフェート；５－アミノ－６－リビチルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン－５’－ホスフェート；５－アミノ－６－リビチルアミノ－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ピリミジンジオン；６，７－ジメチル－８－リビチルルマジン（ＤＭＲＬ）；及びフラボタンパク質が含まれる。リボフラビンの誘導体には、以下に限定されないが、リボフラビン－５－ホスフェート及びその塩、例えば、リボフラビン－５－リン酸ナトリウムなどが含まれる。

「リボフラビン」及び「ビタミンＢ２」という用語は、本明細書において互換的に使用される。リボフラビンの生合成に必要とされる遺伝子、及びリボフラビンの発酵産生、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の菌株を使用する発酵産生の方法は既知である（例えば、欧州特許第４０５３７０号明細書又はウルマン工業化学百科事典・第７版、２００７、ビタミンの章を参照）。これらの方法は、本明細書に記載されるような、改変宿主細胞、特にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）などを使用するリボフラビンの産生にも適用することができる。

本発明は、リボフラビンを産生する宿主細胞、例えば本明細書に定義される改変宿主細胞が、所与の基質からのリボフラビンの産生を可能にする条件下で、水性培地中でインキュベートされる、リボフラビンを産生する方法にさらに関する。リボフラビンを産生する方法において前記改変宿主細胞を使用すると、非改変宿主細胞を用いて産生されるリボフラビンと比較して、収率を、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約７、８、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０％以上増加させることができる。

本発明の方法、即ち上記のリボフラビンを産生する方法において、幾つかの基質を炭素源として使用してもよい。特に適した炭素源は、３個、５個又は６個の炭素原子からなる化合物、例えば、Ｄ－グルコース、グリセロール、シックジュース（ｔｈｉｃｋｊｕｉｃｅ）、デキストロース、デンプン、スクロース又はリボースなどから選択することができる。好ましくは、炭素源はＤ－グルコースである。上記の方法に関する「炭素源」、「基質」及び「産生用基質」という用語は、本明細書において互換的に使用される。

本明細書に定義される改変宿主細胞を使用する上記の方法のために、本明細書において使用される培地は、リボフラビンの産生に適した任意の培地とすることができる。典型的には、培地は、例えば、塩、基質を含み、ある特定のｐＨの水性培地である。基質がリボフラビンに変換される培地は、産生培地とも呼ばれる。リボフラビンの産生に適した培地の例は、国際公開第２００４１１３５１０号パンフレットに記載されており（ＶＦ－培地）、これはバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に関して特に有用であり、本発明の目的のために使用することができる。

「発酵」又は「産生」又は「発酵法」は、本明細書で使用する場合、当業者に既知の培地、条件及び手順を使用する増殖細胞の使用、又は、当業者に既知の培地、条件及び手順を使用することにより培養された後での非増殖のいわゆる休止細胞の使用を、好適な基質のリボフラビンへの変換に適切な条件下で行うこととすることができる。

産生されたリボフラビンは、任意の好適な手段で細胞から回収することができる。回収とは、例えば、産生されたリボフラビンが産生培地から分離され得ることを意味する。任意選択により、このように産生された発酵産物は、さらに加工されてもよく、例えば精製されてもよい。

本明細書に定義される、リボフラビンを産生する改変宿主細胞を使用する上記の方法に関し、一態様において、増殖ステップは、水性培地、即ち増殖に適切な栄養素を添加した増殖培地の中で、通常、好気条件下で実行することができる。培養は、例えば、回分方式、流加方式、半連続方式又は連続方式で行うことができ、流加方式又は半連続方式が好ましい。詳細な発酵方法は当業者に既知であり、又はそうでなければ、例えば欧州特許第４０５３７０号明細書に記載されている。

本発明による方法のために使用されるべき培養期間は、例えば、使用されることになる宿主、ｐＨ、温度及び栄養培地に依存して変化する場合があり、例えば、微生物に応じて、約１０時間～約１０日、好ましくは約４～約７日、より好ましくは約２～約６日とすることができる。当業者は、本発明に関して使用されるべき好適な微生物の最適培養条件が分かるであろう。

培養は、例えば、約７．０、好ましくは約６～約８、より好ましくは約６．５～７．５の範囲のｐＨで行うことができる。培養を行うための好適な温度範囲は、例えば、約１３℃～約７０℃、好ましくは約３０℃～約３９℃、より好ましくは約３５℃～約３９℃、最も好ましくは約３６℃～約３９℃とすることができる。増殖用の培養培地は、通常、同化性炭素源、例えば、Ｄ－グルコース、グリセロール、シックジュース、デキストロース、デンプン、スクロース又はリボース；及び可消化窒素源、例えば有機物など、例えば、ペプトン、酵母エキス及びアミノ酸のような栄養素を含有することができる。培地は、尿素及び／又はコーンスティープリカー及び／又はパン酵母を含んでもよく、含まなくてもよい。様々な無機物、例えば、ナイトレート及びアンモニウム塩もまた、窒素源として使用することができる。さらに、増殖培地は、通常、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、及び炭酸カルシウムを含有することができる。上記の手順を使用して得られる細胞は、次に、上記と実質的に同じ方式、温度及びｐＨ条件で、上記のような基質の存在下で、当該細胞がこれらの基質を所望の標的発酵産物に変換するように、さらにインキュベートすることができる。インキュベートは、例えば、有機窒素源、例えば、ペプトン、酵母エキス、パン酵母、尿素、アミノ酸、及びコーンスティープリカー、又は無機窒素源、例えば、ナイトレート及びアンモニウム塩を含有する、窒素に富んだ培地の中で行うことができ、この場合、細胞は、所望の発酵産物を産生しながらさらに増殖することが可能である。或いは、インキュベートは窒素に乏しい培地の中で行うことができ、この場合、細胞は実質的に増殖せず、休止細胞モード、又は生体内変換モードにある。全ての場合において、培養培地は、無機塩、例えば、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、リン酸カリウム、及び塩化カルシウムを含有することもできる。当業者は、宿主細胞に応じてどの条件を適用すべきかが分かるであろう。

「産生」又は「産生力」という用語は当技術分野において認識されており、所与の時間内及び所与の発酵体積内に形成されるリボフラビンの濃度（例えば、時間当たり、リットル当たりの産物ｋｇ）を含む。「産生の効率」という用語は、実現されるべき産生の特定のレベルに必要な時間（例えば、細胞が発酵産物の特定の産出率を達成するのにどれだけの時間を要するか）を含む。「収率」という用語は当技術分野において認識されており、炭素源を産物（即ちリボフラビン）に変換する効率を含む。これは一般に、例えば、炭素源ｋｇ当たりの産物ｋｇとして記述される。化合物の「収率及び／又は産生／産生力の増加」とは、所与の培養量で、所与の時間にわたって、その化合物の、回収された分子の、又は回収された有用な分子の量を増加させることを意味する。

リボフラビンの収率／産生力を決定するための分析方法は当技術分野において公知である。そのような方法には、ＨＰＬＣ又は指示菌株の使用が含まれ得るが、これらに限定されない（例えば、Ｂｒｅｔｚｅｌら，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２，１９－２６，１９９９を参照）。
本発明は以下を含む。
［１］
リボフラビン生合成遺伝子（ｒｉｂオペロン）及びピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種酵素を含む、リボフラビンを産生する宿主細胞。
［２］
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）由来のリボフラビン生合成遺伝子を含む、［１］に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［３］
配列番号２と少なくとも約７０％の同一性を有するポリペプチドを含む、［１］又は［２］に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［４］
配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する、［３］に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［５］
前記異種酵素が、細菌、好ましくは根粒菌、より好ましくはシノリゾビウム属（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）から選択される、［１］～［４］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［６］
前記内在性ｒｉｂＣ遺伝子の活性が減少している、［１］～［５］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［７］
所与の炭素源からのリボフラビンの収率が、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現しない宿主細胞を使用するリボフラビンの産生と比較して、少なくとも約５％増加する、［１］～［６］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［８］
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）又はストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）から選択され、好ましくは、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ハロデュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｈａｌｏｄｕｒａｎｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、ストレプトコッカス・アウレウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｃｔｉｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ）及びコリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）からなる群から選択される、［１］～［７］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。
［９］
［１］～［８］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞が、所与の基質からのリボフラビンの産生を可能にする条件下で、水性培地中でインキュベートされる、リボフラビンを産生する方法。
［１０］
宿主細胞が配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現しない方法と比較して、リボフラビンの収率が少なくとも５％増加する、［９］に記載の方法。
［１１］
（ａ）［１］～［７］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞を用意するステップ、
（ｂ）所与の基質からのリボフラビンの前記産生を可能にする条件下で、前記宿主細胞を水性培地中でインキュベートするステップ、及び任意選択により、
（ｃ）前記培養培地から前記リボフラビンを単離し、精製するステップ
を含む、請求項［９］又は［１０］に記載の方法。
［１２］
リボフラビンを産生する方法における、配列番号２と少なくとも７０％の同一性を有するポリペプチドの、又は［１］～［８］のいずれかに記載のリボフラビンを産生する宿主細胞の使用。
［１３］
リボフラビンを産生する方法のために使用される、リボフラビン生合成遺伝子（ｒｉｂオペロン）及びピリドキサールホスファターゼ活性［ＥＣ３．１．３．７４］を有する異種酵素を含むリボフラビンを産生する宿主細胞。

枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株系のスキーム。ｐｄｘＰ遺伝子の存在下（即ちＢＳ９６４６）又は非存在下（ＢＳ９６４５）でのリボフラビンの産生収率（単位：％）（ｙ軸）。より詳細には、実施例４（表３）を参照されたい。ｐｄｘＰ遺伝子の存在下（即ちＢＳ８６３８）又は非存在下（ＢＳ４９０５）でのリボフラビンの産生収率（単位：％）（ｙ軸）。より詳細には、実施例４（表３）を参照されたい。

以下の実施例は、実例となるに過ぎず、本発明の範囲を限定するものでは一切ない。本出願の至るところで引用されている全ての参考文献、特許出願、特許、及び公開特許出願、特に、欧州特許第４０５３７０号明細書、国際公開第２００７０５１５５２号パンフレット、米国特許第５８３７５２８号明細書、国際公開第２００６０７７２５８号パンフレット、国際公開第２００８０００６３２号パンフレット、国際公開第２０１７０３６９０３号パンフレット、国際公開第２０１００５２３１９号パンフレット、国際公開第２００４１１３５１０号パンフレット及び欧州特許第１１８６６６４号明細書の内容は、参照により本明細書に援用される。

［実施例］
［実施例１：一般的方法、菌株及びプラスミド］
別段の記載がない限り、全ての培地及び一般的方法は、国際公開第２０１７０３６９０３号パンフレットに開示されている。使用される枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の菌株の遺伝子型（Ｇｅｎｏｔｙｐｓ）は表１に挙げられている。

枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）からのプラスミドＤＮＡの単離については、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を、製造元の推奨事項に従って使用した。アンピシリン（最終１００μｇ／ｍｌ）を添加したＶＹ中１０ｍｌの培養物から、遠心分離によって細胞を回収し、３７℃、２５０ｒｐｍ、ＯＤ_{６００ｎｍ}約０．８～１．２まででインキュベートした。溶解バッファーにリゾチーム（１ｍｇ／ｍｌｆ．ｃ．）を添加して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の細胞壁を３７℃で１０分間、分解した。

ＰＣＲによるＤＮＡの増幅については、アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）又は枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）に由来する０．１μｇの染色体ＤＮＡを、２５μｌの２ＸＰｈｕｓｉｏｎｈｉｇｈ－ｆｉｄｅｌｉｔｙＰＣＲｍａｓｔｅｒｍｉｘ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ）、１μｌの各プライマー（表２）を含有する５０μｌ反応体積中で使用した。ＰＣＲ反応を、３つの逐次ステップ：（ｉ）９５℃で３０秒間の変性ステップ、（ｉｉ）５５℃で３０秒間のアニーリングステップ、（ｉｉｉ）７２℃で１分間／ｋｂの伸長ステップで２９サイクル実行した。ＰＣＲサイクルに先行して９５℃で２分間の変性ステップを行った。

ＳＰＰ１バクテリオファージライセートを用いる枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質導入については、ドナー株の単一コロニーを３ｍｌのＶＹ培地に播種することにより、ドナーライセートを調製した。培養物を、ローラードラムの中で、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、１００μｌの事前培養物を、１００μｌの新鮮ＶＹ及び３０μｌのＳＰＰ１バクテリオファージライセートと混合した。３７℃の水浴で１５分インキュベートした後に、ＣａＣｌ_２（最終５ｍＭ）を添加した４ｍｌの新鮮ＶＹを加えた。感染させた培養物を、ローラードラムの中で、３７℃で４時間インキュベートした。溶解した培養物を遠心分離し、上清を濾過滅菌した。得られたドナーライセートを、さらに使用するために＋４℃で保管した。ドナー株の単一コロニーを３ｍｌのＶＹ培地に播種することにより、レシピエント株を調製した。培養物を、ローラードラムの中で、３７℃で終夜インキュベートした。翌日、１０ｍｌの新鮮ＶＹ培地に５００μｌの事前培養物を播種し、３７℃、２５０ｒｐｍ、ＯＤ_{６００ｎｍ}約０．８～１．２まででインキュベートした。次いで、９００μｌの培養物を１０又は１００μｌのドナーライセートに感染させた。ＭｇＳＯ_４（最終１０ｍＭ）を添加した９ｍｌの新鮮ＶＹを培養物に加えた。３７℃の水浴で３０分インキュベートした後に、細胞を遠心分離（１０分、３５００ｒｐｍ）によって回収し、１５０μｌの１ＸＳＳに懸濁させ、選択寒天培地に塗布し、その後３７℃で１日間インキュベートした。

ディープウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）中でのリボフラビン産生のアッセイを、次のように実行した：必要に応じて選択抗生物質を含有する３ｍｌのＶＹ中に、単一コロニーから終夜培養物を作製した。事前培養物を、３９℃、５５０ｒｐｍ、湿度８０％でインキュベートした。翌日、３ｍｌのＲＳＭに、事前培養物を、出発ＯＤ_{６００ｎｍ}約０．０５で播種した。ＭＴＰ中の培養物を三重反復で作製し、ウェルをブレスシールでカバーした。ＭＴＰを、３９℃、５５０ｒｐｍ、湿度８０％で４８時間インキュベートした。２５０μｌの４８時間培養物を２０μｌの４ＭＮａＯＨ溶液で処理して、リボフラビンの結晶を可溶化した（３００ｒｐｍで１分間振盪）。２３０μｌの１Ｍリン酸カリウムバッファー、ｐＨ６．８を加えた（３００ｒｐｍで１分間振盪）。クォータナリポンプ、オートサンプラー、ＵＶ検出器及び蛍光検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ１１００シリーズＨＰＬＣシステムを使用して、ＨＰＬＣによりリボフラビンをアッセイした。ＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌＬＣ－８ＤＢ（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ×５ｕｍ）を使用して分離した。最適カラム温度は２０℃とした。移動相は、０．１Ｍ酢酸が１００％から、分析１回につき全３３分間の１５分時点で０．１Ｍ酢酸／メタノールが５０／５０への勾配とした。流速は１．０ｍｌ／分とし、注入量を５μｌに設定した。ＵＶシグナルをモニターし、検出のために使用した。０．１μｇ／ｍｌ～５００μｇ／ｍｌの較正範囲。加えて、培養ブロス中のグルコースの蓄積の可能性を、ＷａｔｅｒｓＨＰＬＣシステムにより、バイナリポンプ、オートサンプラー、ＵＶ検出器及び屈折率検出器を使用して分析した。ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＮＨ２ＵＧ８０カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ；株式会社資生堂）で分離した。最適カラム温度は４０℃とした。移動相は、アセトニトリルと脱イオン水との６５：３５の比での混合物とした。流速は１．０ｍｌ／分とし、注入量を５μｌ又は１０μｌに設定した。屈折率シグナルをモニターし、検出のために使用した。各化合物の較正範囲を０．３ｍｇ／ｍｌ～３ｍｇ／ｍｌとした。

［実施例２：複製ベクター中でのアルファルファ根粒菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｐｄｘＰのクローニング及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主中への挿入］
アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＩＦＯ１４７８２株のｐｄｘＰ遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲにより、プライマーＰ１（配列番号５）及びＰ２（配列番号６）を使用して増幅させた。これらのオリゴは、ＢａｍＨＩ（ＧＧＡＴＴＣ）制限部位及びＮｈｅＩ（ＧＣＴＡＧＣ）制限部位をそれぞれもつ。得られた０．８ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン）を使用してゲルから抽出した。精製したＰＣＲ産物を、国際公開第２００８０００６３２号パンフレットに記載されているｐＢＨＡ１２大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）／枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）シャトルベクターの多重クローニング部位のＢａｍＨＩ及びＮｈｅＩでクローン化した。このベクターは、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）のａｍｙＱ遺伝子に由来するプロモーターの制御下で、ｐｄｘＰ遺伝子の発現を可能にする。クローニング及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の形質転換の手順において、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を中間宿主として使用した。ライゲーション混合物の形質転換を、最初にＴＯＰ１０ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＣｏｍｐｅｔｅｎｔＥ．ｃｏｌｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行った。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性コロニーを幾つか単離し、組換えプラスミドｐＢＶ２１３Ｌ（図１を参照）を、ＱＩＡｐｒｅｐＳｐｉｎＭｉｎｉｐｒｅｐＫｉｔ（キアゲン）を使用して抽出した。枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＢＳ１６８－ＳＰ１株は、Ｍａｒｂｕｒｇ１６８株（ドイツ）のトリプトファン原栄養性誘導体であり、ｔｒｐＣ２変異を、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ６０５１株に由来する非変異のｔｒｐＣ遺伝子で置換することによって作製した。ＢＳ１６８－ＳＰ１の構築は、国際公開第２０１７０３６９０３号パンフレットに詳細に記載されている。ＢＳ１６８－ＳＰ１は、リボフラビンの過剰産生に関してはナイーブな株である。次のステップでは、１０μｌのプラスミドｐＢＨＡ１２（国際公開第２００８０００６３２号パンフレット）又は１０μｌのプラスミドｐＢＶ２１３Ｌで、ＢＳ１６８－ＳＰ１株を、コンピテント細胞形質転換により形質転換し、ＴＢＡＢプレート上でカナマイシン耐性クローンを選択した（１０μｇ／ｍｌｆ．ｃ．）。得られたＢＳ９６４５株及びＢＳ９６４６株は、空ベクターｐＢＨＡ１２（ＢＳ９６４５）又はアルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のｐｄｘＰ遺伝子（ＢＳ９６４６）を含む組換えベクターｐＢＶ２１３Ｌをそれぞれもっていることを確認した。コード配列の開始コドンを示すヌクレオチド配列が、表２に、配列表の配列番号に対応して記載されている。

［実施例３：リボフラビンを過剰産生する枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）宿主の染色体中へのアルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）ｐｄｘＰの挿入］
コドン最適化したｐｄｘＰ遺伝子（配列番号４）－非改変の遺伝子と同じタンパク質をコードする－を、ＢＳ１６８－ＳＰ１レシピエント株の染色体中のａｍｙＥ遺伝子座に挿入した。オーバーハングエクステンションによるスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇｂｙｏｖｅｒｈａｎｇｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：ＳＯＥｉｎｇ）ＰＣＲを使用して、ａｍｙＥ－５’ＤＮＡ配列及びａｍｙＥ－３’ＤＮＡ配列が隣接する、ｐｄｘＰ＊遺伝子を担持するＤＮＡ断片を生成した。これは二重交差によってＢＳ１６８－ＳＰ１染色体中に安定な挿入を可能にする。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｃ２．３．１．２８）遺伝子をもつ遺伝子モジュール（クロラムフェニコールに対する抗生物質耐性になってくれる）も、ａｍｙ－Ｅ３’隣接領域とｐｄｘＰ＊遺伝子との間に、ｐｄｘＰ＊とは逆向きに挿入した。最初に、個別のＰＣＲを実行して、（ｉ）ｐＤＧ１６６２プラスミド（ＢａｃｉｌｌｕｓＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋＣｅｎｔｅｒ，オハイオ州立大学（ＴｈｅＯｈｉｏＳｔａｔｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ），米国；ＧｅｎＢａｎｋＵ４６１９７）からの、ａｍｙＥ－３’隣接領域及びクロラムフェニコールカセットを担持する１．９ｋｂのＤＮＡ領域を、プライマー対Ｐ３（配列番号７）及びＰ４（配列番号８）を使用して増幅し；（ｉｉ）ｐｄｘＰ＊遺伝子を担持する０．９ｋｂのＤＮＡ領域を、プライマー対Ｐ５（配列番号９）及びＰ６（配列番号１０）を使用して増幅した。アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＩＦＯ１４７８２ｐｄｘＰ＊コード配列（配列番号４）（その発現は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｖｅｇプロモーター及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｐｏＶＧＲＢＳ（配列番号３）によって引き起こされる）を、ジェンスクリプト、ピスカタウェイ、ニュージャージー（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、米国が合成し、ベクターｐＪＥＴ１．２（サーモフィッシャーサイエンティフィック（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））の中にクローン化した。この組換えベクターをＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、（ｉｉｉ）ｐＤＧ１６６２プラスミドからのａｍｙＥ－５’隣接領域を担持する０．５ｋｂのＤＮＡ領域を、プライマー対Ｐ７（配列番号１１）及びＰ８（配列番号１２）を使用して増幅した。３つのＰＣＲ産物を、アガロースゲル電気泳動により分離し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン）を使用してゲルから抽出した。重複ＤＮＡ領域があるため、プライマー対Ｐ３及びＰ８を使用すると、これらは３．２ｋｂのＳＯＥｉｎｇＰＣＲ断片中に集合した。得られたＳＯＥｉｎｇＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ（キアゲン）を使用してゲルから抽出した。次いで、コンピテント枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＢＳ１６８－ＳＰ１の形質転換のために１μｇを使用した。クロラムフェニコール耐性（ＣｍＲ）コロニーを、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含有するＴＢＡＢプレート上で選択した。ＢＳ１６８－ＳＰ１の染色体のａｍｙＥ遺伝子（アルファアミラーゼ）の中へのｐｄｘＰ＊の挿入を、デンプン加水分解試験により、ヨード染色法を使用して確認した。得られたＢＳ９５０２株の正確な遺伝子型もＰＣＲにより確認した。次いで、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のリボフラビンを過剰産生するＢＳ４９０５株（国際公開第２０１７０３６９０３号パンフレットに記載されている）の染色体のａｍｙＥ遺伝子座の中へのｐｄｘＰ＊遺伝子の挿入を、上記の方法に従ってＳＰＰ１ファージを用いて実行し、ＢＳ９５０２のライセートを使用して、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のＢＳ４９０５株に形質導入した。ＣｍＲコロニーを、クロラムフェニコール５μｇ／ｍｌを含有するＴＢＡＢプレート上で選択した。ＢＳ１６８－ＳＰ１の染色体のａｍｙＥ遺伝子（アルファアミラーゼ）の中へのｐｄｘＰ＊の挿入を、デンプン加水分解試験により、ヨード染色法を使用して確認した。得られたＢＳ８６３８株の正確な遺伝子型もＰＣＲにより確認した。

［実施例４：ｐｄｘＰ遺伝子の存在／非存在下でのリボフラビン産生アッセイ］
ｐｄｘＰ遺伝子は、ＢＳ９６４６株の中の複製ベクターに（実施例２を参照）、及びＢＳ８６３８株の中への染色体の挿入により（実施例３を参照）、過剰発現する。リボフラビン産生のアッセイを、上記のように、ディープウェルマイクロタイタープレート中、ＲＳＭでの培養物から行った。結果を表３に示す。

ＢＳ９６４６のリボフラビン産生収率は、その直接の親株ＢＳ９６４５と比較して少なくとも１８０００％改善された（図２Ａを参照）。ＢＳ９６４５の培養物にはリボフラビンの検出が不可能であるため、ＢＳ９６４６は、発明者らのＨＰＬＣリボフラビンアッセイ（０．００３ｇ／１００ｇグルコース）の検出限界と比較した。リボフラビンを過剰産生する株の背景において実験を行うと、リボフラビン産生収率は、その直接の親株と比較して１４．５％改善された（ＢＳ８６３８をＢＳ４９０２と比較（表３及び図２Ｂを参照）。これらの結果は、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）の野生型に基づく株（過剰産生しない株の背景）とリボフラビンを過剰産生する株の背景の両方において、リボフラビン産生に対し、ｐｄｘＰ遺伝子発現のプラスの影響を示した。

［実施例５：ｐｄｘＰホモログの同定及びクローニング］
アルファルファ根粒菌（Ｓ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のＰｄｘＰを使用してホモロジー検索をすると、他のリゾビウム属（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）の菌株から幾つかのｐｄｘＰホモログが明らかになった（表４を参照）。

上記のように、ホモログを、リボフラビンを産生する宿主、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなど）の中にクローン化し、続いて実施例４に記載されているようにリボフラビン産生アッセイを行う。

ｐｄｘＰのホモログを使用する場合、リボフラビンを過剰産生する株の背景、即ち表３に示した数字と等しい株では、リボフラビンの収率を、少なくとも５～２０％の範囲で増加させることができる。

Claims

リボフラビン生合成遺伝子（ｒｉｂオペロン）及びピリドキサールホスファターゼ［ＥＣ３．１．３．７４］活性を有する異種酵素を含む、リボフラビンを産生する宿主細胞であって、
前記異種酵素は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性を有しピリドキサールホスファターゼ活性を有するポリペプチドを含み、
前記宿主細胞は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）であり、
前記宿主細胞は、内在性ｒｉｂＣ遺伝子の活性を減少又は消失させる改変を含む、リボフラビンを産生する宿主細胞。
請求項１に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞が、所与の基質からのリボフラビンの産生を可能にする条件下で、水性培地中でインキュベートされる、リボフラビンを産生する方法。
リボフラビンを産生する方法における、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有しピリドキサールホスファターゼ活性を有するポリペプチドの、又は請求項１に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞の使用。
リボフラビンを産生する方法のために使用される、請求項１に記載のリボフラビンを産生する宿主細胞。