CN117568433B - 一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法,属于生物工程技术领域。本发明从具有不同表达强度的强启动子中筛选出了在单位菌体量的细胞中具有较强转录强度的启动子,并用筛选获得的强启动子调控ribO区域的表达,解除了核黄素合成过程中的反馈抑制,使发酵70 h的核黄素效价提高了54.8%。
Description
技术领域
一种提高枯草芽孢杆菌发酵生产核黄素的方法,属于生物工程技术领域。
背景技术
核黄素是一种水溶性 B 族维生素,又名维生素B2。大多数微生物和植物可自主合成,而人和动物只能从食物中摄取。核黄素在细胞内以黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和黄素单核苷酸(FMN)的形式存在,作为电子载体,以黄素蛋白辅酶的形式,参与催化某些氧化还原反应,而具有重要的生理功能。若机体缺乏核黄素,就会引起多种代谢障碍。
在枯草芽孢杆菌(B. subtilis)中,核黄素合成的直接前体物是鸟嘌呤三磷酸核苷(GTP)和5-磷酸核酮糖。GTP来自于细胞的嘌呤合成途径,5-磷酸核酮糖则来自于葡萄糖经磷酸戊糖途径的代谢产物。而合成过程所用到的所有酶,全部由rib操纵子控制表达,涉及核黄素生物合成的基因包括ribG(ribD)、ribB(ribE)、ribA和ribH。ribA基因编码两种酶活性,即催化核黄素生物合成中第一步的GTP环式水解酶II和催化5-磷酸核糖体转化成4-磷酸3,4-二羟基-2-丁酮(DHBP)的4-磷酸3,4-二羟基-2-丁酮合酶(DHBPS)。脱氨酶和还原酶由操纵子的第一个基因 ribG(ribD)编码。核黄素生物合成的倒数第二步由2,4-二氧四氢蝶啶(lumazine)合酶催化,所述2,4-二氧四氢蝶啶是ribH的基因产物。催化途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因 ribB(ribD)编码。位于rib操纵子3’端的 ribT的功能目前是不清楚的;然而,其基因产物不是核黄素合成所必需。
Rib操纵子的mRNA前导区的非编码序列全长295bp,其中含有具有调控rib操纵子表达水平的序列,称之为ribO区。在其转录产生的mRNA前导区中,存在与黄素单核苷酸(FMN)直接结合的序列(RFN元件),还存在能够形成终止子或者抗终止子结构的序列,这二者构成了rib操纵子表达的FMN riboswitch调控元件。Riboswitches是指位于mRNA前导区,作为特定代谢物受体的RNA折叠形成的复杂域。它通过与代谢物直接结合,导致 mRNA 前导区构象的变化,影响mRNA的转录延伸或翻译起始,以控制特定基因的表达水平。rib操纵子的RFN元件响应胞内FMN浓度的变化。当胞内FMN水平较高时,FMN与RFN元件结合,mRNA前导区形成类似终止子的二级结构,导致rib操纵子的转录发生提前终止。当 FMN 水平降低时,FMN 与RFN元件解离,mRNA 前导区形成抗终止子结构,转录继续进行,rib操纵子得以表达。
因此,解调控过量生产核黄素以及将其分泌进培养液可以通过以下途径来实现:(I)干扰FMN与从rib前导序列转录的新生mRNA的结合;(II)修饰抗-抗终止子,使其不能与抗终止子有效地碱基配对(III)修饰或缺失终止子。
已有一些方法通过对ribC基因进行突变,降低胞内FMN浓度以降低核黄素合成过程的反馈调控过程;或采用传统诱变方法筛选核黄素高产菌株;又如,利用强/人工启动子替换天然/弱启动子,例如Spo2、P43、Pveg等启动子过表达rib操纵子,或者在染色体内增加rib operon的拷贝数并连接相应的单个启动子来增加核黄素的生产。
但这些方式都存在若干缺点。比如,通过单个启动子驱动rib operon的转录,可能无法实现饱和的mRNA水平。并且,宿主细胞染色体多拷贝表达盒,可能在生产中表现出不稳定,甚至可能因为反馈抑制阻止rib operon各个基因的进一步表达。
发明内容
本发明提供了一种提高枯草芽孢杆菌核黄素生产能力的方法,所述方法是用强启动子调控SEQ ID NO.1所示的MribO区域;所述强启动子为pJ23119、PtrnQ或TP2。
在一种实施方式中,所述强启动子为pJ23119,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中,所述强启动子为PtrnQ,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中,所述强启动子为TP2,其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
本发明还提供了核黄素生产能力提高的重组枯草芽孢杆菌,所述重组枯草芽孢杆菌具有SEQ ID NO.1所示的MribO区域,并以强启动子调控SEQ ID NO.1所示的ribO区域;所述强启动子为pJ23119、PtrnQ或TP2。
在一种实施方式中,所述强启动子为pJ23119,其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
在一种实施方式中,所述强启动子为PtrnQ,其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
在一种实施方式中,所述强启动子为TP2,其核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
在一种实施方式中,所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
本发明还提供了应用所述重组枯草芽孢杆菌生产核黄素的方法。
在一种实施方式中,所述方法是将所述重组枯草芽孢杆菌在含葡萄糖、生物氮素、蛋白胨、玉米浆、硫酸镁和磷酸二氢钾的培养基中培养。
在一种实施方式中,所述培养是在35~40℃培养至少48 h。
本发明还提供了所述重组枯草芽孢杆菌或所述方法在生产含核黄素的产品中的应用。
有益效果:本发明用强启动子pJ23119调控SEQ ID NO.1所示MribO区域的表达,解除了核黄素合成过程中的反馈抑制,使发酵70 h的核黄素效价提高了54.8%。
附图说明
图1为ribP1启动子核心区域和ribO突变区域。
图2为启动子表征质粒。
图3为突变菌株构建原理。
具体实施方式
1、egfp荧光强度的检测方法:①将含有增强绿色荧光蛋白表达质粒的菌株接种于LB 液体培养基中,220 rpm,37℃培养;②当菌体培养至一定时间时,收集菌体,10000g离心2 min,弃上清;③用等体积的 dd H2O重悬菌体,充分混匀;④取200μL重悬菌体置入黑色96孔酶标板中,采用酶标仪测定荧光强度(RFU),激发波长485nm,吸收波长533nm,等体积ddH2O作为空白参比;⑤同时取原始LB 培养液测定每株菌株的生物量,最终荧光强度用单位菌体浓度的荧光强度表示:Relative activity of GFP=RFU/OD600。
2、培养基:
种子培养基:蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L,pH 7 .0。
固体培养基/斜面培养基:在种子培养基的组分基础上再加20g/L的琼脂。
发酵培养基:葡萄糖50g/L,生物氮素30g/L,蛋白胨6g/L,玉米浆10g/L,硫酸镁0.5g/L,磷酸二氢钾1g/L,pH7.0。
3、枯草芽孢杆菌电转化方法:①从-80℃冰箱中取出感受态放置在冰上,等待2-5min融化后加入质粒(0.1-1μg),放置5min。②在超净台将菌液转移到预冷过的无菌电转杯中。将复苏缓冲液1mL分装在1.5mL离心管中。③根据使用的电转杯的型号调节电转仪参数(2mm,3kV,4ms/1mm,2kV,4ms)。将电转杯外壁水分擦干,放入电转仪中,按下开关,电转结束,从离心管中吸取适量复苏缓冲液立即加入到电转杯中,将电转杯的菌液转移到离心管中(吸取缓冲液的离心管)。④将离心管放入小摇瓶中,30℃/37℃(根据所用质粒调节温度),200rpm复苏3h。⑤涂布相应平板,30℃/37℃(根据所用质粒调节温度)过夜培养,一般16-48h之间能得到单菌落。
4、核黄素产量的检测:发酵液混匀,用0.05mol/L NaOH将其稀释50倍后,混匀,12000rpm转速下离心5min,取上清液用水稀释适当倍数后以水做空白在444nm下测定吸光度(显示值控制在0.1~0.8之间)。
表1 启动子及序列
注:加粗序列分别是-35区和-10区,TP2为串联启动子。
实施例1:pHP13-MribO-egfp载体的构建
(1)合成SEQ ID NO.1所示的MribO序列,设计引物HXYW-001和HXYW-002,以合成的MribO序列为模板扩增MribO区域,扩增长度为242bp。
(2)以pET-30a(+)-egfp质粒为模板,设计引物HXYW-003和HXYW-004扩增egfp基因,扩增长度为862bp。
(3)将pHP13-P43质粒经Hind III和BamH I双酶切后,与步骤(1)、(2)中得到的片段混合,然后进行一步克隆获得目标载体质粒pHP13-MribO-egfp,将该质粒转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确的质粒-20℃保存。
HXYW-001:accatgattacgccaagcttTaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-002:CTCGCCCTTGCTCACCATggccagcttcatataatactcttccatttgtttccctcccctctttt;
HXYW-003:ATGGTGAGCAAGGGCGAG;
HXYW-004:cagtgaattcccggggatccATCCGGATATAGTTCCTCCTTTc。
实施例2:不同启动子载体的构建与表征
(1)pHP13-SPO1-15-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-006,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5846bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-007,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度5879bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13-SPO1-15-MribO-egfp质粒。
(2)pHP13-P43-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-008,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5854bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-009,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度为5874bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13-P43-MribO-egfp质粒。
(3)pHP13-pJ23119-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-010,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5855bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确则命名为pHP13-pJ23119-MribO-egfp质粒。
(4)pHP13-PtrnQ-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-011,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5850bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-012,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度为5870bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13-PtrnQ-MribO-egfp质粒。
(5)pHP13-Pveg-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-013,以实施例1构建pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5848bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-014,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度为5868bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13-Pveg-MribO-egfp质粒。
(6)pHP13-TP2-MribO-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-015,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5864bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-016,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度为5924bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13-TP2-MribO-egfp质粒。
(7)pHP13-MribO-ribP1-egfp质粒的构建。设计引物HXYW-005和HXYW-017,以实施例1构建的pHP13-MribO-egfp质粒为模板,扩增长度为5833bp;继续设计引物HXYW-005和HXYW-18,以第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度为5856bp,将扩增的片段转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证后送测序,测序正确则命名为pHP13- ribP1-egfp质粒。
HXYW-005:Aagcttggcgtaatcatggt;
HXYW-006:Caaaaaggtattgactttccctacagggtgtgtaataatttaattataaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-007:tgaccatgattacgccaagctttaaaaattttacaaaaaggtattgactttccc;
HXYW-008:Tttttagaaatgggcgtgaaaaaaagcgcgcgattatgtaaaatataaagtgattaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-009:Accatgattacgccaagctttttttagaaatgggcgtgaaaaaaag;
HXYW-010:Accatgattacgccaagcttttgacagctagctcagtcctaggtataatactagctaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-011:GAAATAGAGGGTTGTTATTTGAAAGGAATTATCGTATAATTAGTTGTGCTtaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-012:accatgattacgccaagcttGAAATAGAGGGTTGTTATTTGAAAGG;
HXYW-013:aaattttatttgacaaaaatGGGCCCgtgttgtacaataaatgtagtgtaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-014:accatgattacgccaagcttaaattttatttgacaaaaatGGGCCC;
HXYW-015:GTATAATGCCCCCAAAATCGCAAAAAAGTGTTGACAACTTAACTCAGATCTGGTATAATAGAAAtaaggacaaatgaataaagattg;
HXYW-016:accatgattacgccaagcttTTAAATCTCAAAAAGGTGTTGACATTCAAAACAAAATATGGTATAATGCCCCCAAAATCGC;
HXYW-017:GCGTACTTTAAAAAGGATCGCTATAATAACCAAtaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-018:accatgattacgccaagcttATTGCGTACTTTAAAAAGGATCG;
将表达单启动子的质粒pHP13-SPO1-15-MribO-egfp、pHP13-P43-MribO-egfp、pHP13-pJ23119-MribO-egfp、pHP13-PtrnQ-MribO-egfp、pHP13-Pveg-MribO-egfp、pHP13-TP2-MribO-egfp、pHP13-MribO-ribP1-egfp转化至枯草芽孢杆菌168菌株中,将获得的重组枯草芽孢杆菌分别在LB培养基中,于37℃、220rpm条件下分别培养6h、12h、24h,收集菌体,分别测定RFU和OD600,然后得到RFU/OD600值,结果如表2所示。
表2 不同启动子对菌株生长能力(RFU/OD600值)的影响
可见,优选的几个强启动子SPO1-15、P43、pJ23119、PtrnQ、TP2,相对于rib operon的原始启动子都有更好的表现。其中pJ23119、PtrnQ和TP2启动子有明显的转录强度,在24h时,相比较原始启动子,转录强度分别提高了0.76倍、0.74倍和0.68倍。
实施例3:强启动子过表达rib operon
1、N20质粒的构建:
(1)以pJOE8999质粒为模板,利用BsaI单酶切后,胶回收;
(2)设计引物HXYW-019和HXYW-020,放置沸水中自然冷却退火;
HXYW-019:tacgctttaggtattttacgcaat;
HXYW-020:aaacattgcgtaaaatacctaaag;
反应体系共20μL:
10×Taq酶 buffer (或者T4连接酶酶buffer) 2μL,HXYW-019(引物配制成100 μM) 1μL,HXYW-020(引物配制成100 μM ) 1μL,灭菌水 16μL;
(3)将步骤(1)酶切后的质粒片段和步骤(2)中得到的片段ribP1N20利用T4连接酶连接起来,转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,测序正确则命名为pJOE8999-ribP1N20。
2、启动子替换质粒的构建。
引物序列如下:
HXYW-021:Ttaatacgactcactatagggtcgaccggtcatcccctaaaaacag;
HXYW-022:gaaataaacttacaatttgagaaaaacaaaacatc;
HXYW-023:ctcaaattgtaagtttatttcttgacagctagctcagtcctaggtataatactagctaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-024:Atactcttccatttgtttccctcccctctttt;
HXYW-025:ggaaacaaatggaagagtattatatgaagctggc;
HXYW-026:agatgaagattatttcttaatctagaatcgcaaatcactttagcgt。
HXYW-027:GAAATAGAGGGTTGTTATTTGAAAGGAATTATCGTATAATTAGTTGTGCTtaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg;
HXYW-028:gtttttctcaaattgtaagtttatttcGAAATAGAGGGTTGTTATTTGAAAGG;
HXYW-029:gtttttctcaaattgtaagtttatttcTTAAATCTCAAAAAGGTGTTGACATTCAAAACAAAATATGGTATAATGCCCCCAAAATCGC。
HXYW-030:gtttttctcaaattgtaagtttatttcATTGCGTACTTTAAAAAGGATCGCTATAATAACCAAtaaggacaaatgaataaagattgtatccttcg
(1)pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor质粒的构建:
①设计引物HXYW-021和HXYW-022,以枯草芽孢杆菌168基因组为模板,扩增长度640bp,得到上游同源臂;
②设计引物HXYW-023和HXYW-024,以实施例2构建的任意启动子表征质粒为模板,扩增长度244bp,得到SEQ ID NO.1所示含突变的ribO区域;
③设计引物HXYW-025和HXYW-026,以枯草芽孢杆菌168基因组为模板,扩增长度736bp,得到下游同源臂;
④Xba I和sal I双酶切pJOE8999-ribP1N20质粒,然后胶回收;
⑤将①②③④中获得的片段和线性化载体混合在同一体系中,利用一步克隆获得目标载体质粒pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor,将该质粒转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确的质粒-20℃保存。
(2)pJOE8999-ribP1N20-PtrnQ-ribDdonor质粒的构建:
①设计引物HXYW-027和HXYW-026,以pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor质粒为模板,扩增长度975bp;
②设计引物HXYW-026和HXYW-028,第一轮PCR产物为模板进行嵌套PCR,扩增长度1002bp,得到下游同源臂;
③将步骤(1)获得的上游同源臂、步骤(2)获得的下游同源臂以及步骤(1)中获得的线性化载体(Xba I和sal I双酶切pJOE8999-ribP1N20质粒)混合在同一体系中,利用一步克隆获得目标载体质粒pJOE8999-ribP1N20-PtrnQ-ribDdonor,将该质粒转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确的质粒-20℃保存。
(3)pJOE8999-ribP1N20-TP2-ribDdonor质粒的构建:
①设计引物HXYW-015和HXYW-026,以pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor质粒为模板,扩增长度989bp;
②设计引物HXYW-029和HXYW-026,以第一轮PCR产物为模板,进行嵌套PCR,扩增长度1048bp,得到下游同源臂;
③将(1)中的上游同源臂、(3)中的下游同源臂以及步骤(1)中获得的线性化载体(Xba I和sal I双酶切pJOE8999-ribP1N20质粒)混合在同一体系中,利用一步克隆获得目标载体质粒pJOE8999-ribP1N20-TP2-ribDdonor,将该质粒转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确的质粒-20℃保存。
(4)pJOE8999-ribP1N20-ribP1-ribDdonor质粒的构建:
①设计引物HXYW-030和HXYW-026,以pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor质粒为模板,进行嵌套PCR,扩增长度988bp,得到下游同源臂;
②将(1)中的上游同源臂、(4)中的下游同源臂以及步骤(1)中获得的线性化载体(Xba I和sal I双酶切pJOE8999-ribP1N20质粒)混合在同一体系中,利用一步克隆获得目标载体质粒pJOE8999-ribP1N20-ribP1-ribDdonor,将该质粒转化至大肠杆菌Top10,长出阳性克隆,酶切验证正确后送测序,测序正确的质粒-20℃保存。
3、电转以及编辑启动子替换。
(1)将pJOE8999-ribP1N20-pJ23119-ribDdonor质粒电转至枯草芽孢杆菌168,诱导编辑重组,测序正确后命名为菌株Ⅰ;
(2)将pJOE8999-ribP1N20-PtrnQ-ribDdonor质粒电转至枯草芽孢杆菌168,诱导编辑重组,测序正确后命名为菌株Ⅱ;
(3)将pJOE8999-ribP1N20-TP2-ribDdonor质粒电转至枯草芽孢杆菌168,诱导编辑重组,测序正确后命名为菌株Ⅲ。
(4)将pJOE8999-ribP1N20-ribP1-ribDdonor质粒电转至枯草芽孢杆菌168,诱导编辑重组,测序正确后命名为菌株Ⅳ。
实施例4:突变菌株的核黄素发酵验证
将实施例3构建的菌株Ⅰ、菌株Ⅱ、菌株Ⅲ制备成茄形瓶斜面,以菌株Ⅳ为对照菌株,在种子培养基中,于37℃、220rpm条件培养24h,获得菌浓为OD600=20的种子液;将种子液接种2.5mL至250mL发酵培养基中,于37℃、220rpm摇瓶发酵,发酵培养70h。结果如表3所示,用强启动子过表达rib operon的核黄素效价都有明显的提升,pJ23119、PtrnQ和TP2分别提高了54.8%、30.3%和23.3%。
表3 不同菌株的发酵效果
虽然本发明已以较佳实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明的精神和范围内,都可做各种的改动与修饰,因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (5)
1.一种提高枯草芽孢杆菌核黄素生产能力的方法,其特征在于,用强启动子调控SEQID NO.1所示的MribO区域;所述强启动子为pJ23119、PtrnQ或TP2;强启动子pJ23119的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示,强启动子PtrnQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,强启动子TP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
2.一种核黄素生产能力提高的重组枯草芽孢杆菌,其特征在于,所述重组枯草芽孢杆菌具有SEQ ID NO.1所示的MribO区域,并以强启动子调控SEQ ID NO.1所示的MribO区域;所述强启动子为pJ23119、PtrnQ或TP2;强启动子PtrnQ的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示,强启动子TP2的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌168。
3.一种生产核黄素的方法,其特征在于,将权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌在含葡萄糖、生物氮素、蛋白胨、玉米浆、硫酸镁和磷酸二氢钾的培养基中培养。
4.根据权利要求3所述的方法,其特征在于,所述培养是在35~40℃培养至少48h。
5.权利要求2所述的重组枯草芽孢杆菌,或权利要求3~4任一所述的方法在生产含核黄素的产品中的应用。
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