JP7474240B2 - 抗薬物抗体を検出するための方法 - Google Patents
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Description
この出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる2018年8月3日に出願された米国仮出願第62/714,183号の優先権を主張する。
本発明は、試料からADAを定性的および/または定量的に検出するための新規なアプローチに関する。
1.導入
生物学的治療薬、または生物治療薬は、多くの病状の処置に承認されている。従来の小分子に勝る多くの利点にも関わらず、生物治療薬は、典型的に免疫原性と呼ばれるそれ自体に対する免疫応答を誘導する可能性を有する(1)。免疫原性は人体の自然な防御機構であり、通常は保護的である。適応免疫応答の一部として、宿主が感染性病原体、腫瘍抗原またはワクチンなどの外因性タンパク質または変化した自己抗原に遭遇すると、体はこれらの外来/変化した自己タンパク質に対する抗体を開発してもよい。しかしながら、生物治療薬の場合、一般に抗薬物抗体(ADA)と呼ばれるこれらの薬物特異的抗体は、局所的なインフュージョンリアクションから生命を脅かす過敏症および赤芽球癆、PRCAなどのより深刻な有害事象に至るまで幅広い安全関連の事象を誘導することができる(2、3)。さらに、ADAは、低下した薬効をもたらすことができる(4-6)。
2.1.試薬
RPMI-1640、熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、G418、HEPESおよびピルビン酸ナトリウムを、Gibco/Life Technology(グランドアイランド、NY)から購入した。NeoLite Luciferase Reporter Gene Assay Systemを、PerkinElmer(ウォルサム、MA)から購入し、Hi-Sur Mag Streptavidin Beadを、OceanNanotech(サンディエゴ、CA)から購入した。プールされたヒト血清、個々の正常なヒト血清、および個々の罹患ループスヒト血清を、Bioreclamation(ヒクスビル、NY)から購入した。Jurkat T細胞およびRaji B細胞株をATCCから元は得て、Jurkat T細胞をさらに改変し、IL-2駆動ルシフェラーゼを安定して発現するJurkat.CA細胞を生成した。中和陽性対照は、医薬品に対する独自のモノクローナルマウスアフィニティー精製抗体である。
IL-2駆動ルシフェラーゼを発現する安定的にトランスフェクトされたJurkat細胞(Jurkat.CA)およびRaji細胞を、ベントキャップ細胞培養フラスコ(BD Falcon、フランクリンレイクス、NJ)中で37℃、5%CO2および95%相対湿度(RH)で増殖させた。増殖培地は、両方の細胞について10%熱不活化FBSを有するRPMI 1640であった。Jurkat.CA細胞株増殖培地は、400μg/mLのG418、HEPESおよびピルビン酸ナトリウムも含有した。両方の細胞株についての低温培地は、10%DMSOを補足した純粋なFBSであった。解凍時、細胞を1回洗浄し、バイオアッセイ培地(10%FBSを補足したRPMI-1640培地)中に再懸濁し、バイオアッセイにおいて直接使用した。
異なる濃度のNAb PCを、5μg/mlの医薬品ありまたはなしで、プールされたまたは個々の健康なヒト血清中にスパイクし、室温で4時間回転させてインキュベートし、免疫複合体を形成させた。異なる濃度の医薬品も、同じ方法でヒト血清中にスパイクし、調製した。次いで、試料を分注し、使用するまで-70℃で凍結した。
以前に公開された酸解離による固相またはビーズ抽出(BEAD)手順を採用して、わずかに変更してADAを抽出した(9)。簡単に説明すると、上記で調製した100μLのヒト血清試料および対照試料を、最初に等量の400mMグリシン-HCl、pH2.0と混合し、室温(RT)で60分間、シェーカー(Labnet Orbit P4、ウッドブリッジ、NJ)で1200rpmでインキュベートした。次いで、各試料を、50μg/mLビオチン化薬物を含有する28μLの1.8M Trizma Base(pH8.8)で中和し、シェーカーで90分間1200rpmでインキュベートした。あるいは、100μLの対照および試料を、KingFisher Deepウェル96ウェルポリプロピレンプレートに加え、プレートシーラーで覆い、62℃に設定され400rpmで振とうするEppendorf Thermomixer R中で40-60分間インキュベートした。ディープウェルプレートを~15分間冷却した後、28μLのビオチン化薬物(DPBS中の1%BSAで希釈した50μg/mL)を加え、次いで試料プレートを、1000rpmで振とうしながら2-8℃で一晩インキュベートした。次いで、医薬品から解離され、酸または加熱処理のいずれかからのビオチン薬物に結合したADAを、250μgのストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズ(10mg/mLで加え、1000-1200rpmで振とうしながらRTで60分間インキュベートした25μL)上に固定した。次いで、ビーズ複合体を、磁気プレートにより捕捉し、600μLのPBSTで2回洗浄し、KingFisher Flex Magnetic Particle Processor(Thermo Scientific、ウォルサム、MA)を使用して60μLの2xRPMI-1640、pH2.3で溶出した。50μLの最終溶出溶液を、22μLの100mM HEPES、pH8.2を含有する新しい96ウェルポリプロピレンプレートに移した。
IL-2-ルシフェラーゼバイオアッセイを使用して、試料中の抗治療タンパク質中和抗体の不在、存在、または相対レベルを評価した。簡単に説明すると、セクション2.4からの30μLの中和されたBEAD溶出液を、15μLの250ng/mLのシステム薬物とともに、96ウェルハーフエリア白色プレート中でRTで20-40分間インキュベートした。Jurkat.CA細胞を解凍、洗浄し、バイオアッセイ培地(RPMI 1640中の10%FBS)中で最終濃度3.0x106細胞/mLに再懸濁し、15μLをプレートに加え、RTでさらに20分間インキュベートした。最後の工程で、Raji細胞を解凍、洗浄し、2.5μg/mLの抗ヒトCD3Abを含有するバイオアッセイ培地中で最終濃度1.5x106細胞/mLに再懸濁し、これの15μLをプレートに加え、混合し、次いで37℃、5%CO2、95%湿度に設定されたインキュベーターに4時間移した。インキュベーション後、75μLのNeolite Luciferase溶液を各ウェルに加え、混合し、500rpmで振とうしながら暗所RTインキュベーター中に入れ、遠心分離し、次いでデフォルト96ウェル発光プロトコルを有するEnSpire(PerkinElmer、ウォルサム、MA)プレートリーダーを使用して読み取った。
同時静的光散乱による示差走査蛍光測定を、UNcleプラットフォーム(Unchained Labs Inc.)で実行した。簡単に説明すると、精製タンパク質試料をDPBSバッファー、pH7.2(Thermofisher)中で1mg/mLに希釈し、それぞれの9μLをマイクロキュベットアレイ中に3重にロードした。試料凝集の程度を、分析開始前にオンライン動的光散乱により決定した。温度により誘導されるタンパク質アンフォールディングを、各工程で30秒の温度安定化を伴う1℃の工程勾配を使用して、20℃から85℃までの加熱による固有蛍光の変化を測定することにより決定した。Tm(融解温度に対応するアンフォールディング曲線の中点)を、摂氏温度の関数として、ナノメートルの重心蛍光を使用して、UNcle Softwareにおいて計算した。実験の過程の間、凝集体形成について検出および制御するために、266nmおよび473nmでの同時静的光散乱を記録した。
2.7.1対照精度評価
分散分析(ANOVA)モデルの文脈における分散成分法を使用して、対照試料について精度の推定値を計算した(11)。ANOVAモデルは、日内に(within day)分析者、アッセイ日およびアッセイプレートについての要素を含んだ。分析者間、日間、プレート間およびプレート内の分散の推定値を、ANOVAモデルにおいて算出し、それぞれを標準偏差(SD)として表し、次いで変動係数(CV[%]=100*SD/平均)として表した。総標準偏差(Total SD)を、これらの分散推定値の合計の平方根として算出した。総CV(%)(100*Total SD/平均)を使用してプレート許容(acceptance)を設定した。
各ループス患者試料を、3人の分析者により2回、6つの異なる機会にアッセイした。NAbアッセイカットポイントを、公開された方法を使用して計算した(12)。日に渡るRLUのプレート間の変動を補正するために、患者試料RLUとプレートNegative Control(NegC)RLU(それぞれについての平均デュプリケート)の比を算出した。カットポイント評価のために比を使用したため、同じプレートからの患者試料RLUとNegC RLUの間の相関を計算し、データをプロットした。正の相関は、比計算方法の使用を支持する。
3.1.細胞アッセイにおけるIL-2製造の治療誘導阻害
ルリズマブは、40kDaの分岐PEGでフォーマットされた抗ヒトCD28拮抗免疫グロブリン軽鎖可変領域(Vκ)dAbである。それは、T細胞活性化の強力な阻害剤であり、インビトロアゴニスト、共刺激、および架橋実験により決定される純粋なアンタゴニストである(13-15)。図1Aに示すように、連続培養からのJurkat.CA細胞は、アゴニスト抗CD3AbおよびRaji B細胞(CD80/CD86を提供してJurkat.CA細胞上のCD28に関与させる)により活性化されると、高レベルのIL-2プロモーター駆動ルシフェラーゼレポーターを製造した。ルリズマブは、T細胞活性化およびルシフェラーゼレポーター製造を用量依存的に阻害した(図1A)。
潜在的なNAb陽性対照(PC)のパネルを細胞アッセイにおいてスクリーニングし、最も強力なクローンを選択した。図2Aに示すように、ウサギポリクローナル抗体(pAb)PCおよびマウスモノクローナル抗体(mAb)PC両方が、0.4μg/mLのルリズマブ(すなわち、細胞アッセイにおける薬物の最終濃度であるシステム薬物)の存在下で用量依存的にルシフェラーゼレポーターの発現をレスキューした。最も感度の高いNAbアッセイを行うには、良好なシグナル対ノイズ比(S/N)および低い変動係数(CV)をなお維持しながら、システムの薬物レベルを可能な限り低くする必要がある。予想通り、薬物濃度が高いほど、NAb PCの不在下でのルシフェラーゼレポーターのシグナルは低くなる(図2Bおよび表9)。0.3μg/mLのシステム薬物はNAb曲線全体で最高のS/Nを示したが、NAbアッセイの感度が決定されたNAb曲線の下端に注意を払う必要がある。したがって、0.25μg/mLのシステム薬物を、さらなるアッセイの最適化のために選択し;このシステム薬物レベルでは、0.125、0.25および0.5μg/mLのNAbは一貫して他の2つの薬物濃度より高いS/Nを有した(表2)。
ルリズマブは、自己免疫疾患および炎症性疾患の処置のために開発されており、患者は循環中に高い量の炎症性サイトカインをしばしば発現する(14)。図3に示すように、10の個々の全身性エリテマトーデス(SLE)血清を、アッセイ培地中に10倍に希釈し、細胞ベースのアッセイに加えると、1つの試料(S8)は50%を超える増加を有し、4つの試料(S2、S3、S5&S9)は、培地のみの対照試料と比較して、ルシフェラーゼ生シグナルの50%を超える阻害を有した。このことは、10倍希釈はSLE血清中の全ての干渉因子を希釈するのに十分ではないことを示唆する。しかしながら、試料中のNAbも希釈されるため、さらなる希釈はNAbアッセイの低下した感度をもたらす。例えば、アッセイが20倍希釈を必要とし、かつアッセイが希釈後に0.5μg/mL NAbしか検出できない場合、NAbアッセイの感度は純粋なテスト血清において10μg/mLと高くなる可能性が潜在的にある。臨床試料において予想されるルリズマブレベルは5μg/mLと高く、これは試料を希釈して抽出せずにアッセイに加えた場合、15μg/mL未満のNAbは検出されなくてもよいことを意味する(ルリズマブの分子量は約50KDaであり、15μg/mLのNAbは全て、5μg/mLのルリズマブと1:1のモル比で免疫複合体を形成し、アッセイにおいてシステム薬物に結合できなくなる)。酸解離によるビーズ抽出(BEAD)を最初にテストして、NAb PCが酸処理、続いてビオチン化薬物/ビーズ複合体に結合させること、およびストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズから溶出されることにより試料中の薬物から解離できるかどうかを見た。この抽出は、試料中の過剰な量の薬物だけでなく、アッセイに干渉する可能性のあるマトリックス因子も除去する。BEADは複数の細胞ベースの機能的NAbアッセイにうまく適用されているが、BEAD処理後のNAb活性は、ルリズマブNAbアッセイについて不十分であった。相対NAb活性の任意カットポイントを1.3に設定すると、5μg/mLの薬物の存在下でのNAb検出の感度は8μg/mLあたりになる(表2およびデータは示さず)。クローン13H4が酸安定性であること、およびビオチン薬物の増加した量、ストレプトアビジン磁性ビーズの増加した量、並びにさまざまなpHでの酸処理の可変の長さなど抽出の各重要な工程の最適化を確認した後、何も改善を達成しなかった(データは示さず)。ルリズマブは小さな12kDaのタンパク質骨格を有するが、それは500kDaのタンパク質のものと同等の巨大なスペースを占める40kDaの分岐PEG部分を有する。低pH下で分岐PEG部分が、NAbおよびビオチン化ルリズマブタンパク質の相互作用を(例えば立体障害により)防ぎ、最終的にNAbの低い回収をもたらしてもよいとの仮説を立てた。
非ペグ化ルリズマブは、150kDaのNAb PCと比較してわずか12kDaと非常に小さい。このことにより、加熱時にルリズマブが選択的かつ不可逆的に変性され、ビオチン化非ペグ化薬物により抽出されるべきインタクトなNAbが残ってもよいかどうかを調べた。最初に、ペグ化または非ペグ化いずれかのルリズマブ、並びにUNcleプラットフォームで示差走査蛍光測定(DSF)を使用してPBSで調製された抗ルリズマブNAb PCのパネルの熱安定性を比較した。図4A&表3に示すように、PEG部分を有するまたは有しないルリズマブははるかに低い融解温度を有し、そのためそれらのほとんどは62℃ですでに変性した一方、pAbおよびmAb両方を含む全てのNAb PCはこの温度下で変性し始めているのみであった。
薬物とNAb PCの間の有意差を示す有望な熱安定性データを用いて、BEAD抽出における酸解離の効果のない最初の工程の代わりとして62℃での加熱を評価した。血清中の異なる濃度のウサギpAbまたはマウスmAbクローン13H4を、5μg/mLルリズマブありまたはなしでRTで少なくとも4時間インキュベートして、免疫複合体の形成を確実にした。次いで、試料を予熱した62℃のヒートブロック中でインキュベートし、30分間カバーし;または400mMグリシン、pH2.0で60分間処理した。次いで、pH8.8である1%BSAを含むPBSまたは1.8M Trisのいずれかで調製したルリズマブのビオチン化タンパク質骨格(50μg/mL)28μLを、それぞれ冷却プレートまたは酸処理プレートに加えた。4℃で一晩インキュベートした後、ストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズを加えて、ビオチン-薬物/NAb複合体をプルダウンした。ビーズ洗浄後、NAbをビーズから酸溶出し、中和し、最後に細胞ベースのアッセイに加えた。表4に示すように、薬物/NAb免疫複合体を解離するための加熱は、酸解離よりはるかに優れたNAb回収を有し、この新しい手順を、ビーズ抽出および加熱解離(Bead Extraction and Heating Dissociation)(BEHD)と呼ぶ。ウサギpAb PCについて、加熱は、薬物群ありまたはなしの両方において、4μg/mL NAbで1.5を超える相対NAb活性を達成したが;酸処理群において、16μg/mLのNAbのみが1.5を超える相対NAb活性を達成した。同様に、4μg/mLのクローン13H4は、加熱により処理した場合に1.6を超える相対NAb活性を達成したが、同じレベルの1.6を超える相対NAb活性は、酸処理群において8-16μg/mLでのみ発生した。
最適化された細胞アッセイおよびBEHD抽出を用いて、アッセイを次のパラメーターを用いて検証した:カットポイント、精度、感度、薬物干渉、選択性および安定性。
カットポイントを、50の研究中の処置歴のないSLE患者の血清試料を使用して評価した。各試料を、2日間にわたって3人の分析者により2つのプレート上でデュプリケートで分析した。SLE患者試料に加えて、各プレートは対照試料を含有した。陽性対照クローン13H4(PC)を、抗ルリズマブNAbを健康なドナーからのプールされた血清中にスパイクすることにより調製した。LPCは、血清中の3μg/mL(LPC-1)または2.5μg/mL(LPC-2)の低陽性対照中和抗体であった。該方法はBEHD抽出の前処理を有するため、LPC-1およびLPC-2も、LPC抽出対照(LPC-EXC)として5μg/mLルリズマブの存在下で調製し、各分析においてBEHD抽出をモニターした。HPCは、10μg/mLの高陽性対照中和抗体であった。NegCは、PCを有さない健康なドナーからの同じプール血清である。PCおよびNegC試料を、各プレート上でそれぞれ2および3セットのデュプリケートとして分析した。各プレートについての許容基準は、変動係数、各PCの30.0%以下のCV(%)として設定された。さらに、NegCの平均生相対発光単位(RLU)値は、LPC、LPC-EXC、およびHPCの値より低い必要がある。6個のPC(HPC、LPC、およびLPC-EXC)の少なくとも4個および各レベルで少なくとも1個は、プレート許容を満たす必要がある。3個のNegCデュプリケートの少なくとも2個は、%CV基準を満たす必要がある。
精度評価(CV[%])を、PC比(PC/NegC RLU比)についての全ての12回の分析に渡って実行した。表6を参照のこと。分析を、セクション2.7.1で説明されるように、各対象試料およびドナー試料について別々に実行した。総精度を含む全ての精度の推定値は、全ての対照試料に渡って18.4%(%CV)以内であった。HPC/NegCのみがカットポイント1.61より高い片側99%予測区間の下限を有するため、HPC/NegCについての許容基準は1.94以上であるが、他の全てのPCはカットポイント(cup point)1.61以上である。
選択性を、20の個々のSLEヒト血清研究試料を用いて評価した。試料を、スパイクせずにおよびLPCレベルの抗ルリズマブ(3μg/mL)でスパイクして分析した。スパイクされていない試料の75%が陰性で、LPCでスパイクされた試料の100%が陽性であった(表7)。
アッセイ感度を、アフィニティー精製されたマウス抗ルリズマブNAb PCがカットポイント1.61以上で一貫して結果を製造する最低濃度として定義する。PC抗体を、プールされた正常なヒト血清中に40、20、10、4、2、1および0.5μg/mLでスパイクした。カットポイント評価中に、3人の分析者が2日間で合計6個の曲線を分析した。これら全ての分析において陽性と確実にテストされたPCの最低濃度は、2.0μg/mLであることが見出された。全ての6つの曲線を4パラメーターロジスティック(4PL)関数を用いて分析し、GraphPad Prismaソフトウェアを使用して1.61で補間した。中央値(media value)は1.31であるため、アッセイの推定感度は1.31μg/mLに設定される(図5)。
3μg/mLのLPC-1およびNegCを、10、5、2.5および1μg/mLのルリズマブでスパイクして、アッセイの薬物耐性を推定した。ルリズマブでスパイクしたLPCは、テストした最高濃度(10μg/mL)で陽性反応を製造することができ、ルリズマブでスパイクした全てのNegC試料は陰性(非中和)結果を製造したため、アッセイはLPC-1レベルの10μg/mLを超える薬物に耐えることができる(表8)。
ヒト血清中の抗ルリズマブNAb PCの室温および凍結融解安定性を、HPC、LPC-1およびLPC-1-EXCレベルを使用して評価した。各対照レベルの3つのアリコートを、周囲室温に24時間さらすかまたは10回の凍結融解サイクルにかけた。試料をアッセイし、カットポイントに関して分類した。全ての試料は、NAb PCが周囲室温で24時間、または最大10回の凍結融解サイクルで安定していることを確認する各条件でスクリーニング基準を満たした(表9)。
細胞ベースの機能的NAbアッセイについて、特にmAb生物療法についての主な課題の1つは、細胞ベースのアッセイにおいてNAbの検出にしばしば干渉する、患者のテスト試料中に存在する高い量の薬物である(16、17)。
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載の発明の特定の実施形態の多くの等価物を認識するかまたは確認することができる。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
Claims (21)
- 抗薬物抗体(ADA):薬物免疫複合体試料における抗薬物抗体(ADA)を検出する方法であって、方法は、
a)60℃から68℃の間である高温で試料を前処理し、試料中のADA:薬物免疫複合体を解離させ、そして薬物を選択的に変性させること;
b)マトリックスにより試料から解離されたADAを単離すること;
c)バッファーを使用してマトリックスから解離されたADAを回収すること;および
d)細胞ベースのアッセイまたはインビトロアッセイにおいてADAを検出すること
を含み、
薬物は、ADAより低い熱安定性を有する、
方法。 - 高温が、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、または68℃である、請求項1に記載の方法。
- 試料が、30分から2時間の期間、高温で前処理される、請求項1に記載の方法。
- ADAが、酸処理に感受性である、請求項1に記載の方法。
- 薬物が、ADAより低い熱安定性を有する、請求項1に記載の方法。
- 薬物が、抗体またはそのフラグメント、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣物、炭水化物、または脂質から選択される、請求項1に記載の方法。
- 試料が、体液、粘液分泌物、唾液、血液、全血、血漿、および血清から選択される生物学的試料である、請求項1に記載の方法。
- ADAが、ビオチン化薬物、続いてストレプトアビジンでコーティングされたマトリックスと接触することにより試料から単離される、請求項1に記載の方法。
- ADAが、薬物と結合したマトリックスにより試料から単離される、請求項1に記載の方法。
- マトリックスが、磁気ビーズである、請求項8-9のいずれか一項に記載の方法。
- 回収されたADAが、細胞ベースのアッセイにおいて検出される、請求項1に記載の方法。
- i)薬物の存在下で、回収されたADAを細胞に加えること;およびii)細胞に対する薬物の活性の低下を測定することによりADAを検出することを含む、請求項11に記載の方法。
- 回収されたADAが、インビトロアッセイにおいて検出される、請求項1に記載の方法。
- i)回収されたADAを、検出可能な標識で標識された薬物と接触させること;およびii)検出可能な標識を測定することによりADAを検出することを含む、請求項13に記載の方法。
- 検出可能な標識が、放射性同位体、酵素、蛍光標識、化学発光標識、電気化学発光標識、または酵素検出反応のための基質である、請求項14に記載の方法。
- 薬物が、ドメイン抗体である、請求項1に記載の方法。
- 薬物が、ペグ化されている、請求項1に記載の方法。
- 薬物が、ルリズマブである、請求項1に記載の方法。
- 高温が、62℃である、請求項1に記載の方法。
- 試料が、血清である、請求項1に記載の方法。
- 試料が、薬物で処理された対象からのものである、請求項1に記載の方法。
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