JP3488767B2 - モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キット - Google Patents
モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キットInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、リン酸化ＰＳペプ
チドと特異的に結合するモノクローナル抗体、これを産
生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸
化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キットに関す
る。
チドと特異的に結合するモノクローナル抗体、これを産
生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸
化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キットに関す
る。
【０００２】
【従来の技術】高等生物は多様に分化した細胞の集まり
であり、細胞はそれぞれ周囲の状況を認識しながら自ら
の行動を律している。それは、他の細胞が分泌する物質
や他の細胞の表面に表現される物質がそれぞれに特異的
な受容体に結合し、その情報が細胞内に伝えられること
によって行われていると考えられる。
であり、細胞はそれぞれ周囲の状況を認識しながら自ら
の行動を律している。それは、他の細胞が分泌する物質
や他の細胞の表面に表現される物質がそれぞれに特異的
な受容体に結合し、その情報が細胞内に伝えられること
によって行われていると考えられる。
【０００３】増殖因子の刺激によって細胞が増殖を始め
る場合には、細胞外からの情報が細胞膜を通って細胞内
へ伝達され、さらにそれが細胞質から核に伝えられるこ
とによって新たな蛋白質の合成が始まる。このように細
胞外の情報が細胞核に伝えられる過程を細胞内情報伝達
と呼び、細胞内情報伝達には蛋白質のリン酸化と脱リン
酸化が大きな役割を担っていることが知られている。
る場合には、細胞外からの情報が細胞膜を通って細胞内
へ伝達され、さらにそれが細胞質から核に伝えられるこ
とによって新たな蛋白質の合成が始まる。このように細
胞外の情報が細胞核に伝えられる過程を細胞内情報伝達
と呼び、細胞内情報伝達には蛋白質のリン酸化と脱リン
酸化が大きな役割を担っていることが知られている。
【０００４】プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、サイク
リックＡＭＰ依存性プロテイン（ＰＫＡ）も、このよう
な細胞内情報伝達を担う蛋白質リン酸化酵素であり、細
胞内情報伝達の研究に欠くことのできないものとなって
いる。即ち、細胞内の情報伝達は蛋白質のリン酸化のカ
スケードによって行われているため、細胞内における蛋
白質のリン酸化を測定することは細胞内の情報伝達機構
の解明に不可欠なのである。一方、癌や一部の糖尿病等
の疾患は細胞内における情報伝達機構の異常として捉え
られることから、具体的にはこれらの疾患の原因解明の
手段としてＰＫＡ、ＰＫＣの酵素活性の測定が行われ
る。
リックＡＭＰ依存性プロテイン（ＰＫＡ）も、このよう
な細胞内情報伝達を担う蛋白質リン酸化酵素であり、細
胞内情報伝達の研究に欠くことのできないものとなって
いる。即ち、細胞内の情報伝達は蛋白質のリン酸化のカ
スケードによって行われているため、細胞内における蛋
白質のリン酸化を測定することは細胞内の情報伝達機構
の解明に不可欠なのである。一方、癌や一部の糖尿病等
の疾患は細胞内における情報伝達機構の異常として捉え
られることから、具体的にはこれらの疾患の原因解明の
手段としてＰＫＡ、ＰＫＣの酵素活性の測定が行われ
る。
【０００５】従来、ＰＫＡ、ＰＫＣの酵素活性測定は、
ヒストンＨ２ＢあるいはヒストンＩＩＩＳを用い、[γ-
32P]ＡＴＰをトレーサーとして使う方法が知られていた
（バイオケミストリー（Biochemistry）第２３巻, P503
6-5041, 1984、 Proc. Natl.Acad. Sci. USA, Vol.80,
P36-40, 1983）。また、ＰＫＣ活性測定試薬としては
「ＰＫＣアッセイシステム」がアメルシャム社より販売
されていた。しかし、この方法ではＲＩＡ施設を使うた
め一般の施設で測定することはできなかった。
ヒストンＨ２ＢあるいはヒストンＩＩＩＳを用い、[γ-
32P]ＡＴＰをトレーサーとして使う方法が知られていた
（バイオケミストリー（Biochemistry）第２３巻, P503
6-5041, 1984、 Proc. Natl.Acad. Sci. USA, Vol.80,
P36-40, 1983）。また、ＰＫＣ活性測定試薬としては
「ＰＫＣアッセイシステム」がアメルシャム社より販売
されていた。しかし、この方法ではＲＩＡ施設を使うた
め一般の施設で測定することはできなかった。
【０００６】一方、放射性物質を用いない方法として、
本発明者らは既に抗リン酸化ペプチド抗体ＹＣ−１０を
用いたＥＬＩＳＡ法による測定を報告し（B. B. R. C.,
Vol.175, P1144-1151, 1991）、株式会社医学生物学研
究所においてこの測定キットの製品化がなされ、既に販
売されている。
本発明者らは既に抗リン酸化ペプチド抗体ＹＣ−１０を
用いたＥＬＩＳＡ法による測定を報告し（B. B. R. C.,
Vol.175, P1144-1151, 1991）、株式会社医学生物学研
究所においてこの測定キットの製品化がなされ、既に販
売されている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記試
薬は放射性物質を用いず一度に大量の検体を処理できる
ものの実際の細胞を検体として細胞内のリン酸化酵素の
活性を測定するには感度として不十分なものであった。
このため、上記試薬は、精製した分画についてリン酸化
酵素活性を測定することは可能であったが、生きた細胞
そのものを使って測定することは実質的に不可能であっ
た。
薬は放射性物質を用いず一度に大量の検体を処理できる
ものの実際の細胞を検体として細胞内のリン酸化酵素の
活性を測定するには感度として不十分なものであった。
このため、上記試薬は、精製した分画についてリン酸化
酵素活性を測定することは可能であったが、生きた細胞
そのものを使って測定することは実質的に不可能であっ
た。
【０００８】本発明は、上記課題に鑑みなされたもので
あり、リン酸化ペプチドに対する新たなモノクローナル
抗体を提供するとともに、このモノクローナル抗体を産
生する細胞、該モノクローナル抗体を用いてＰＫＡ、Ｐ
ＫＣの酵素活性を感度よく測定する免疫学的測定キット
及び測定方法を提供するものである。
あり、リン酸化ペプチドに対する新たなモノクローナル
抗体を提供するとともに、このモノクローナル抗体を産
生する細胞、該モノクローナル抗体を用いてＰＫＡ、Ｐ
ＫＣの酵素活性を感度よく測定する免疫学的測定キット
及び測定方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決するた
め、本発明の第１であるモノクローナル抗体は、請求項
１に記載したように、リン酸化ＰＳペプチド（配列番号
１で表されるＰＳペプチドのアミノ酸番号７のセリンが
リン酸化されたもの）と特異的に結合することを特徴と
する。
め、本発明の第１であるモノクローナル抗体は、請求項
１に記載したように、リン酸化ＰＳペプチド（配列番号
１で表されるＰＳペプチドのアミノ酸番号７のセリンが
リン酸化されたもの）と特異的に結合することを特徴と
する。
【００１０】本発明の第２である融合細胞は、請求項２
に記載したように、請求項１のモノクローナル抗体を産
生することを特徴とする。かかる融合細胞としては、請
求項３に記載したように、リン酸化ＰＳペプチドを免疫
感作させた哺乳動物から取得される抗体産生細胞と哺乳
動物骨髄腫系細胞との融合により得られるものが好まし
い。また、請求項４に記載したように、融合細胞クロー
ン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３）又は融
合細胞クローン２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
３４）であることが好ましい。
に記載したように、請求項１のモノクローナル抗体を産
生することを特徴とする。かかる融合細胞としては、請
求項３に記載したように、リン酸化ＰＳペプチドを免疫
感作させた哺乳動物から取得される抗体産生細胞と哺乳
動物骨髄腫系細胞との融合により得られるものが好まし
い。また、請求項４に記載したように、融合細胞クロー
ン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３）又は融
合細胞クローン２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
３４）であることが好ましい。
【００１１】本発明の第３である蛋白質リン酸化酵素活
性の免疫学的測定方法は、請求項５に記載したように、
下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を含むことを特徴
とする。即ち、 ａ）配列番号１で表されるＰＳペプチドを不溶性支持体
に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドに標準物質とし
てのＰＫＡ又はＰＫＣを反応せしめた後、 ｂ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｃ）この反応生成物の標識量を測定することにより検量
線を作成する工程、及び ｄ）前記固相化ＰＳペプチドに検体を反応せしめた後、 ｅ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｆ）この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から
検体中に含まれるＰＫＡ又はＰＫＣの酵素活性を測定す
る工程。
性の免疫学的測定方法は、請求項５に記載したように、
下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を含むことを特徴
とする。即ち、 ａ）配列番号１で表されるＰＳペプチドを不溶性支持体
に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドに標準物質とし
てのＰＫＡ又はＰＫＣを反応せしめた後、 ｂ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｃ）この反応生成物の標識量を測定することにより検量
線を作成する工程、及び ｄ）前記固相化ＰＳペプチドに検体を反応せしめた後、 ｅ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｆ）この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から
検体中に含まれるＰＫＡ又はＰＫＣの酵素活性を測定す
る工程。
【００１２】ここで、請求項６に記載したように、標識
モノクローナル抗体は、請求項２〜４のいずれかに記載
の融合細胞により産生されるモノクローナル抗体を標識
物質により標識化したものが好ましい。また、請求項７
に記載したように、標識物質は、ビオチン、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から
選ばれたものが好ましい。
モノクローナル抗体は、請求項２〜４のいずれかに記載
の融合細胞により産生されるモノクローナル抗体を標識
物質により標識化したものが好ましい。また、請求項７
に記載したように、標識物質は、ビオチン、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から
選ばれたものが好ましい。
【００１３】本発明の第４である蛋白質リン酸化酵素活
性の免疫学的測定キットは、請求項８に記載したよう
に、配列番号１で表されるＰＳペプチドを不溶性支持体
に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドと、請求項１記
載のモノクローナル抗体を標識物質により標識化した標
識モノクローナル抗体とを備えたことを特徴とする。こ
こで、請求項９に記載したように、標識モノクローナル
抗体は、請求項２〜４のいずれかに記載の融合細胞によ
り産生されるモノクローナル抗体を標識物質により標識
化されたものが好ましい。また、請求項１０に記載した
ように、標識物質は、ビオチン、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及
びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれたも
のが好ましい。
性の免疫学的測定キットは、請求項８に記載したよう
に、配列番号１で表されるＰＳペプチドを不溶性支持体
に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドと、請求項１記
載のモノクローナル抗体を標識物質により標識化した標
識モノクローナル抗体とを備えたことを特徴とする。こ
こで、請求項９に記載したように、標識モノクローナル
抗体は、請求項２〜４のいずれかに記載の融合細胞によ
り産生されるモノクローナル抗体を標識物質により標識
化されたものが好ましい。また、請求項１０に記載した
ように、標識物質は、ビオチン、ペルオキシダーゼ、β
−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスファターゼ及
びマイクロペルオキシダーゼからなる群から選ばれたも
のが好ましい。
【００１４】
［本発明の第１であるモノクローナル抗体及び本発明の
第２である融合細胞］蛋白質リン酸化酵素の酵素活性
は、一般に、蛋白質リン酸化酵素によってリン酸化され
た蛋白質を検出することによって測定することができ
る。本発明者らは、当初、グリア細胞に存在する中間系
フィラメントであるグリアフィラメントの構成蛋白質で
あるグリア繊維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）がＰＫＡ、ＰＫ
Ｃのよい基質蛋白質であることから、これら蛋白質のリ
ン酸化部位を含むペプチド（Ｇ１ペプチド）を合成し、
リン酸化Ｇ１ペプチドに対するモノクローナル抗体であ
るＹＣ−１０を用いて蛋白質リン酸化酵素の活性を測定
する方法を発明した。しかし、今回ＰＫＣのアイソタイ
プに広く認められる偽基質配列（配列番号２）のアミノ
酸番号７のアラニンをセリンに置換したペプチド（ＰＳ
ペプチド、配列番号１）がＰＫＣの非常によい基質であ
ることが報告された（サイエンス(SCIENCE)第238巻P172
6-(1990)）ことから、リン酸化ＰＳペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を作製することにより新たな測定系の
発明に至った。
第２である融合細胞］蛋白質リン酸化酵素の酵素活性
は、一般に、蛋白質リン酸化酵素によってリン酸化され
た蛋白質を検出することによって測定することができ
る。本発明者らは、当初、グリア細胞に存在する中間系
フィラメントであるグリアフィラメントの構成蛋白質で
あるグリア繊維酸性蛋白質（ＧＦＡＰ）がＰＫＡ、ＰＫ
Ｃのよい基質蛋白質であることから、これら蛋白質のリ
ン酸化部位を含むペプチド（Ｇ１ペプチド）を合成し、
リン酸化Ｇ１ペプチドに対するモノクローナル抗体であ
るＹＣ−１０を用いて蛋白質リン酸化酵素の活性を測定
する方法を発明した。しかし、今回ＰＫＣのアイソタイ
プに広く認められる偽基質配列（配列番号２）のアミノ
酸番号７のアラニンをセリンに置換したペプチド（ＰＳ
ペプチド、配列番号１）がＰＫＣの非常によい基質であ
ることが報告された（サイエンス(SCIENCE)第238巻P172
6-(1990)）ことから、リン酸化ＰＳペプチドに対するモ
ノクローナル抗体を作製することにより新たな測定系の
発明に至った。
【００１５】このモノクローナル抗体の作製について以
下に説明する。 Ａ．抗原 抗原としてはリン酸化ＰＳペプチド（配列番号１で表さ
れるＰＳペプチドのアミノ酸番号７のセリンがリン酸化
されたもの）を合成し、免疫原として使用した。当該ペ
プチドは比較的低分子であり、このものをそのまま免疫
しても抗体ができにくいため、通常、ＫＬＨ（スカシガ
イヘモシアニン）やアルブミンのようなキャリアー蛋白
質と結合させることにより免疫原として使用する。 Ｂ．上記抗原による免疫 免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、
ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最
も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒ
ａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫
計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリン
パ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウ
ス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫
後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日
後に融合のための脾臓細胞を取り出す。 Ｃ．細胞融合 上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的
に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾
臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融
合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞とし
ては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望まし
いが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの
融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤とし
ては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチ
レングリコールを有利に使用できるが、この分野で知ら
れている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別
名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合
促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法に
より細胞融合を行ってもよい。 Ｄ．目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞
の選択 別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合
の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の
混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希
釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
時間）培養する。倍地は薬物抵抗性（例えば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中で
は未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾細胞
は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（１週間後）死滅
する。これに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中
で生存できる。
下に説明する。 Ａ．抗原 抗原としてはリン酸化ＰＳペプチド（配列番号１で表さ
れるＰＳペプチドのアミノ酸番号７のセリンがリン酸化
されたもの）を合成し、免疫原として使用した。当該ペ
プチドは比較的低分子であり、このものをそのまま免疫
しても抗体ができにくいため、通常、ＫＬＨ（スカシガ
イヘモシアニン）やアルブミンのようなキャリアー蛋白
質と結合させることにより免疫原として使用する。 Ｂ．上記抗原による免疫 免疫動物としては哺乳動物であるマウスのほかラット、
ハムスターなども用いることができる。通常マウスが最
も汎用され、ＢＡＬＢ／ｃマウス、その他の系（ｓｔｒ
ａｉｎ）のマウスを用いることができる。この際、免疫
計画及び抗原の濃度は十分な量の抗原刺激を受けたリン
パ球が形成されるよう選ばれるべきである。例えばマウ
ス１匹に２５μｇの抗原を２週間間隔で腹腔に３回免疫
後、さらに２５μｇを静脈に投与する。最終免疫の数日
後に融合のための脾臓細胞を取り出す。 Ｃ．細胞融合 上記のごとく免疫した哺乳動物の個体から脾臓を無菌的
に取り出し、そこから単細胞懸濁液を調製する。この脾
臓細胞（抗体産生細胞）を適当な骨髄腫細胞と適当な融
合促進剤の使用により細胞融合させる。骨髄腫細胞とし
ては免疫動物と同種の哺乳動物に由来するものが望まし
いが、ラット、ハムスター等の脾臓細胞とマウスの骨髄
腫細胞を融合させることもできる。脾臓細胞と骨髄腫細
胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。約１０8個の脾細胞について０．５〜１．５ｍｌの
融合媒体の使用が適当である。好ましい融合促進剤とし
ては、例えば平均分子量１０００〜４０００のポリエチ
レングリコールを有利に使用できるが、この分野で知ら
れている他の融合促進剤（例えばセンダイウイルス（別
名ＨＶＪ））を用いることもできる。また、これら融合
促進剤を用いた方法以外に電気ショックを用いる方法に
より細胞融合を行ってもよい。 Ｄ．目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞
の選択 別の容器（例えばマイクロタイタープレート）で未融合
の脾細胞、未融合の骨髄腫細胞及び融合した融合細胞の
混合物を未融合の骨髄腫細胞を支持しない選択培地で希
釈し、未融合の細胞を死滅させるのに十分な時間（約１
時間）培養する。倍地は薬物抵抗性（例えば８−アザグ
アニン抵抗性）で未融合の骨髄腫細胞を支持しないもの
（例えばＨＡＴ培地）が使用される。この選択培地中で
は未融合の骨髄腫細胞は死滅する。この未融合の脾細胞
は非腫瘍性細胞なので、ある一定期間（１週間後）死滅
する。これに対して融合した細胞は、骨髄腫の親細胞の
腫瘍性と親脾細胞の性質を合わせ持つため、選択培地中
で生存できる。
【００１６】かくして、融合細胞が検出された後、前記
のＰＳペプチドに対する抗体について酵素免疫測定法(E
nzyme Linked Immunosorbent Assay)によりスクリーニ
ングを行い、リン酸化ＰＳペプチドと特異的に結合する
モノクローナル抗体を産生する融合細胞だけを選択す
る。このような融合細胞として、例えば融合細胞クロー
ン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３）又は融
合細胞クローン２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
３４）が挙げられる。 Ｆ．目的とするモノクローナル抗体の取得 目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞を適
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗
体は２つの異なった方法で産生することができる。その
第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からその融合細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同
質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、
その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。 ［本発明の第３である免疫学的測定方法］ Ａ．固相化ＰＳペプチド 蛋白質リン酸化酵素の活性は、当該酵素によってリン酸
化された蛋白質の量を測定することによって行われる。
リン酸化基質としては各種の蛋白質、ペプチドが考えら
れるが、ＰＫＣに広く見いだされる偽基質配列（配列番
号２）のアミノ酸番号７のアラニンをセリンに置換した
ＰＳペプチド（配列番号１）がＰＫＣに対するＫｍ値
（ミカエリス常数）が最も小さいことから、これを基質
として選択し、リン酸化ＰＳペプチドに対するモノクロ
ーナル抗体との組み合わせで測定した場合に高い感度を
得ることができる。ＰＳペプチドの不溶性支持体への結
合はＰＳペプチドの溶液と不溶性支持体を接触させるこ
とにより不溶性支持体の表面にＰＳペプチドを吸着させ
て行うほか、共有結合等の化学的な方法によっても結合
させることができる。
のＰＳペプチドに対する抗体について酵素免疫測定法(E
nzyme Linked Immunosorbent Assay)によりスクリーニ
ングを行い、リン酸化ＰＳペプチドと特異的に結合する
モノクローナル抗体を産生する融合細胞だけを選択す
る。このような融合細胞として、例えば融合細胞クロー
ン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３）又は融
合細胞クローン２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１
３４）が挙げられる。 Ｆ．目的とするモノクローナル抗体の取得 目的とするモノクローナル抗体を産生する融合細胞を適
当な方法（例えば限界希釈法）でクローン化した後、抗
体は２つの異なった方法で産生することができる。その
第１の方法によれば、融合細胞を一定期間、適当な培地
で培養することにより、その培養上清からその融合細胞
の産生するモノクローナル抗体を得ることができる。第
２の方法によれば、融合細胞は同質遺伝子、または半同
質遺伝子を持つ免疫動物の腹腔に注射することができ
る。一定時間後の宿主動物の血液中および腹水中より、
その融合細胞の産生するモノクローナル抗体を得ること
ができる。 ［本発明の第３である免疫学的測定方法］ Ａ．固相化ＰＳペプチド 蛋白質リン酸化酵素の活性は、当該酵素によってリン酸
化された蛋白質の量を測定することによって行われる。
リン酸化基質としては各種の蛋白質、ペプチドが考えら
れるが、ＰＫＣに広く見いだされる偽基質配列（配列番
号２）のアミノ酸番号７のアラニンをセリンに置換した
ＰＳペプチド（配列番号１）がＰＫＣに対するＫｍ値
（ミカエリス常数）が最も小さいことから、これを基質
として選択し、リン酸化ＰＳペプチドに対するモノクロ
ーナル抗体との組み合わせで測定した場合に高い感度を
得ることができる。ＰＳペプチドの不溶性支持体への結
合はＰＳペプチドの溶液と不溶性支持体を接触させるこ
とにより不溶性支持体の表面にＰＳペプチドを吸着させ
て行うほか、共有結合等の化学的な方法によっても結合
させることができる。
【００１７】不溶性担体としては、例えばポリスチレ
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金
属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどを例示す
ることができる。また、不溶性担体の形状としては、ト
レイ状、球状、棒状、繊維状、盤状、容器状、セル、試
験管など種々の形状であることができる。 Ｂ．標識モノクローナル抗体 リン酸化ＰＳペプチドに対するモノクローナル抗体は、
リン酸化ＰＳペプチドを免疫感作させた哺乳動物から取
得される抗体産生細胞と哺乳動物骨髄腫系細胞との融合
により得られる融合細胞から産生することができる。例
えば、融合細胞クローン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１３３）または融合細胞クローン２Ｇ３（受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３４）から産生されるモノクロ
ーナル抗体を用いることができるが、クローン２Ｂ９よ
り産生されるモノクローナル抗体を用いた場合、より高
い感度を得ることができる。抗体は、完全抗体であって
もよく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2等のフラグメント
であってもよい。
ン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポ
リアクリルニトリル、フッ素樹脂、架橋デキストラン、
ポリサッカライドなどの高分子、その他紙、ガラス、金
属、アガロースおよびこれらの組み合わせなどを例示す
ることができる。また、不溶性担体の形状としては、ト
レイ状、球状、棒状、繊維状、盤状、容器状、セル、試
験管など種々の形状であることができる。 Ｂ．標識モノクローナル抗体 リン酸化ＰＳペプチドに対するモノクローナル抗体は、
リン酸化ＰＳペプチドを免疫感作させた哺乳動物から取
得される抗体産生細胞と哺乳動物骨髄腫系細胞との融合
により得られる融合細胞から産生することができる。例
えば、融合細胞クローン２Ｂ９（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ
−１５１３３）または融合細胞クローン２Ｇ３（受託番
号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３４）から産生されるモノクロ
ーナル抗体を用いることができるが、クローン２Ｂ９よ
り産生されるモノクローナル抗体を用いた場合、より高
い感度を得ることができる。抗体は、完全抗体であって
もよく、ＦａｂまたはＦ（ａｂ）’2等のフラグメント
であってもよい。
【００１８】標識物質としては、通常の免疫学的測定方
法に使用し得るものであれば特に限定されるものではな
いが、酵素、アビジン、蛍光物質、発光物質及び放射性
物質等を使用するのが好ましい。酵素としてはペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、蛍光物質とし
てはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリ
プロテイン、フィコエリスリン等、発光物質としてはイ
ソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質として
は125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等を用いることができる。
標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標
識アビジンを用いることにより高い感度を得ることがで
きるので、より好ましい。この場合の標識酵素としては
抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることが
できるが、ペルオキシダーゼは特に好ましい。
法に使用し得るものであれば特に限定されるものではな
いが、酵素、アビジン、蛍光物質、発光物質及び放射性
物質等を使用するのが好ましい。酵素としてはペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ、マイクロペルオキシダーゼ、蛍光物質とし
てはフルオレッセインイソチオシアネート、フィコビリ
プロテイン、フィコエリスリン等、発光物質としてはイ
ソルシノール、ルシゲニン等、そして放射性物質として
は125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ等を用いることができる。
標識物質としてビオチンを用いた場合にはさらに酵素標
識アビジンを用いることにより高い感度を得ることがで
きるので、より好ましい。この場合の標識酵素としては
抗体に標識した場合の酵素と同様の酵素を用いることが
できるが、ペルオキシダーゼは特に好ましい。
【００１９】酵素を標識物質として用いた場合にはその
活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いら
れる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、
基質としてＨ2Ｏ2を用い、発色剤として２，２’−アジ
ノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］ア
ンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ
−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、４−アミノアンチピ
リン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
等、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基
質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素に
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフ
ルオロセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド等を用いることができる。 Ｃ．検量線の作成 固相化ＰＳペプチドに標準物質としてのＰＫＡ又はＰＫ
Ｃを反応せしめる。このときに用いる標準物質の量に応
じてＰＳペプチドはリン酸化され、リン酸化ＰＳペプチ
ドとなる。次に、生成したリン酸化ＰＳペプチドに、標
識モノクローナル抗体を反応させる。すると、リン酸化
ＰＳペプチドに標識モノクローナル抗体が特異的に結合
する。その後、リン酸化ＰＳペプチドに結合した標識モ
ノクローナル抗体の標識量を測定する。これにより、標
準物質（ＰＫＡ又はＰＫＣ）の量に対する標識量の関
係、即ち検量線が得られる。
活性を測定するために基質、必要により発色剤が用いら
れる。酵素としてペルオキシダーゼを用いる場合には、
基質としてＨ2Ｏ2を用い、発色剤として２，２’−アジ
ノ−ジ−［３−エチルベンズチアゾリンスルホン酸］ア
ンモニウム塩（ＡＢＴＳ）、５−アミノサリチル酸、ｏ
−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、４−アミノアンチピ
リン、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン
等、酵素にアルカリフォスファターゼを用いる場合は基
質としてｏ−ニトロフェニルフォスフェート等、酵素に
β−Ｄ−ガラクトシダーゼを用いる場合は基質としてフ
ルオロセイン−ジ−（β−Ｄ−ガラクトピラノシド）、
４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノ
シド等を用いることができる。 Ｃ．検量線の作成 固相化ＰＳペプチドに標準物質としてのＰＫＡ又はＰＫ
Ｃを反応せしめる。このときに用いる標準物質の量に応
じてＰＳペプチドはリン酸化され、リン酸化ＰＳペプチ
ドとなる。次に、生成したリン酸化ＰＳペプチドに、標
識モノクローナル抗体を反応させる。すると、リン酸化
ＰＳペプチドに標識モノクローナル抗体が特異的に結合
する。その後、リン酸化ＰＳペプチドに結合した標識モ
ノクローナル抗体の標識量を測定する。これにより、標
準物質（ＰＫＡ又はＰＫＣ）の量に対する標識量の関
係、即ち検量線が得られる。
【００２０】この免疫学的測定方法において用いられる
反応用媒体としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨ６．０〜８．０の
範囲のものが示されるが、ＰＫＡ活性を測定する場合に
はｃＡＭＰ、ＰＫＣ活性を測定する場合にはカルシウム
イオンを含んでいることが好ましい。 Ｄ．検体のリン酸化酵素活性の測定 固相化ＰＳペプチドに検体を反応せしめる。このときに
用いる検体中に含まれるリン酸化酵素の量に応じてＰＳ
ペプチドはリン酸化され、リン酸化ＰＳペプチドとな
る。次に、生成したリン酸化ＰＳペプチドに、標識モノ
クローナル抗体を反応させる。すると、リン酸化ＰＳペ
プチドに標識モノクローナル抗体が特異的に結合する。
そして、リン酸化ＰＳペプチドに結合した標識モノクロ
ーナル抗体の標識量を測定する。この測定値を検量線に
照らすことにより、検体中のリン酸化酵素活性が測定さ
れる。尚、反応用媒体については、上記Ｃ．で述べた通
りである。 ［本発明の第４である免疫学的測定キット］免疫学的測
定キットは、少なくとも、（１）不溶性担体に結合され
たＰＳペプチド、（２）リン酸化ＰＳペプチドに特異的
に結合するモノクローナル抗体を標識物質で標識化した
標識モノクローナル抗体を含み、その他に、反応用媒体
を含んでいてもよいし、あるいは、標準物質（ＰＫＡ又
はＰＫＣ）を含んでいてもよい。尚、標識モノクローナ
ル抗体の標識物質が酵素の場合には、通常、酵素の活性
を測定するための基質及び反応停止液を含む。また、不
溶性担体、標識物質については上述したので詳細は省略
する。
反応用媒体としては、例えばリン酸緩衝液、トリス塩酸
緩衝液、酢酸緩衝液などを含んだｐＨ６．０〜８．０の
範囲のものが示されるが、ＰＫＡ活性を測定する場合に
はｃＡＭＰ、ＰＫＣ活性を測定する場合にはカルシウム
イオンを含んでいることが好ましい。 Ｄ．検体のリン酸化酵素活性の測定 固相化ＰＳペプチドに検体を反応せしめる。このときに
用いる検体中に含まれるリン酸化酵素の量に応じてＰＳ
ペプチドはリン酸化され、リン酸化ＰＳペプチドとな
る。次に、生成したリン酸化ＰＳペプチドに、標識モノ
クローナル抗体を反応させる。すると、リン酸化ＰＳペ
プチドに標識モノクローナル抗体が特異的に結合する。
そして、リン酸化ＰＳペプチドに結合した標識モノクロ
ーナル抗体の標識量を測定する。この測定値を検量線に
照らすことにより、検体中のリン酸化酵素活性が測定さ
れる。尚、反応用媒体については、上記Ｃ．で述べた通
りである。 ［本発明の第４である免疫学的測定キット］免疫学的測
定キットは、少なくとも、（１）不溶性担体に結合され
たＰＳペプチド、（２）リン酸化ＰＳペプチドに特異的
に結合するモノクローナル抗体を標識物質で標識化した
標識モノクローナル抗体を含み、その他に、反応用媒体
を含んでいてもよいし、あるいは、標準物質（ＰＫＡ又
はＰＫＣ）を含んでいてもよい。尚、標識モノクローナ
ル抗体の標識物質が酵素の場合には、通常、酵素の活性
を測定するための基質及び反応停止液を含む。また、不
溶性担体、標識物質については上述したので詳細は省略
する。
【００２１】この免疫学的測定キットによれば、まずＰ
Ｓペプチドと検体とを反応させ、次いでその反応生成物
と標識モノクローナル抗体とを反応させ、その後、標識
物質の量を測定することにより、リン酸化酵素活性を測
定することができる。検量線によりリン酸化酵素活性を
定量的に測定する本発明の第３の免疫学的測定方法の
他、例えばリン酸化酵素活性を定性的に測定する場合に
もこのキットを用いることができる。
Ｓペプチドと検体とを反応させ、次いでその反応生成物
と標識モノクローナル抗体とを反応させ、その後、標識
物質の量を測定することにより、リン酸化酵素活性を測
定することができる。検量線によりリン酸化酵素活性を
定量的に測定する本発明の第３の免疫学的測定方法の
他、例えばリン酸化酵素活性を定性的に測定する場合に
もこのキットを用いることができる。
【００２２】
【実施例】以下に、本発明の好適な実施例を説明する。
尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定さ
れるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種
々の形態を採り得ることはいうまでもない。 ［実施例１］ 免疫原の作製 リン酸化ＰＳペプチド（配列番号１のＰＳペプチドのア
ミノ酸番号７のセリンがリン酸化されたもの）は通常の
ペプチド合成機（例えば、(株)パーキンエルマージャパ
ン製のＡ４３１）を用い、予めリン酸化したセリンを使
用して合成することにより得た。その他に、ペプチド合
成機を用いて合成したＰＳペプチドをＰＫＣ又はＰＫＡ
を用いてセリンをリン酸化することによっても得ること
ができる。
尚、本発明の実施の形態は、下記の実施例に何ら限定さ
れるものではなく、本発明の技術的範囲に属する限り種
々の形態を採り得ることはいうまでもない。 ［実施例１］ 免疫原の作製 リン酸化ＰＳペプチド（配列番号１のＰＳペプチドのア
ミノ酸番号７のセリンがリン酸化されたもの）は通常の
ペプチド合成機（例えば、(株)パーキンエルマージャパ
ン製のＡ４３１）を用い、予めリン酸化したセリンを使
用して合成することにより得た。その他に、ペプチド合
成機を用いて合成したＰＳペプチドをＰＫＣ又はＰＫＡ
を用いてセリンをリン酸化することによっても得ること
ができる。
【００２３】このリン酸化ＰＳペプチドをＭＢＳ法によ
ってＫＬＨに結合させ免疫原とした。即ち、４ｍｇのＫ
ＬＨを０．２５ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
７．２）に溶解し、この溶液に、２０μｌのジメチルフ
ォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した０．７ｍｇの３−マ
レイミドベンゾイックアシド−Ｎ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステル（ＭＢＳ）を加え、室温で３０分間反応さ
せた。反応後、セファデックスＧ２５を充填したカラム
（１．５×１０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行い、ＫＬＨ
−ＭＢ複合体と遊離のＫＬＨを分離し、ＫＬＨ−ＭＢ複
合体を集めた。そして、リン酸化ＰＳペプチド５ｍｇを
１ｍｌの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶
解し、この液とＫＬＨ−ＭＢ複合体溶液を混合し、ｐＨ
を７．０〜７．５に調整して室温で３時間放置して反応
させた。反応後、ＰＢＳに十分透析した後、ＰＢＳで
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、１００μｌづつ分注
して−２０℃に凍結して保存した。 ［実施例２］ マウスの免疫 実施例１で凍結保存した合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液１
００μｌと完全フロインドアジュバント１００μｌとを
よく混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を２匹のマウ
ス（雌、ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔に１匹あたり抗原として
２５μｇずつ投与した。さらに１週間おきに同量の抗原
を５回投与し、その３日後に脾臓を取り出し実施例３に
示すように細胞融合を行った。 ［実施例３］ 細胞融合及び目的とするモノクローナル
抗体を産生する融合細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（ＳＰ−２／０−Ａｇ−１４）とを約１０：１の割合で
混合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合
促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１
０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％牛
血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロ
タイタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下同
じ）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
ってＫＬＨに結合させ免疫原とした。即ち、４ｍｇのＫ
ＬＨを０．２５ｍｌの１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ
７．２）に溶解し、この溶液に、２０μｌのジメチルフ
ォルムアミド（ＤＭＦ）に溶解した０．７ｍｇの３−マ
レイミドベンゾイックアシド−Ｎ−ヒドロキシサクシニ
ミドエステル（ＭＢＳ）を加え、室温で３０分間反応さ
せた。反応後、セファデックスＧ２５を充填したカラム
（１．５×１０ｃｍ）を用いてゲルろ過を行い、ＫＬＨ
−ＭＢ複合体と遊離のＫＬＨを分離し、ＫＬＨ−ＭＢ複
合体を集めた。そして、リン酸化ＰＳペプチド５ｍｇを
１ｍｌの０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ９．０）に溶
解し、この液とＫＬＨ−ＭＢ複合体溶液を混合し、ｐＨ
を７．０〜７．５に調整して室温で３時間放置して反応
させた。反応後、ＰＢＳに十分透析した後、ＰＢＳで
０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に調整し、１００μｌづつ分注
して−２０℃に凍結して保存した。 ［実施例２］ マウスの免疫 実施例１で凍結保存した合成ペプチド結合ＫＬＨ溶液１
００μｌと完全フロインドアジュバント１００μｌとを
よく混合して懸濁液を作製し、この懸濁液を２匹のマウ
ス（雌、ＢＡＬＢ／ｃ）の腹腔に１匹あたり抗原として
２５μｇずつ投与した。さらに１週間おきに同量の抗原
を５回投与し、その３日後に脾臓を取り出し実施例３に
示すように細胞融合を行った。 ［実施例３］ 細胞融合及び目的とするモノクローナル
抗体を産生する融合細胞の選択と取得 摘出したマウスの脾臓細胞と、同系マウスの骨髄腫細胞
（ＳＰ−２／０−Ａｇ−１４）とを約１０：１の割合で
混合し、５０％ポリエチレングリコール４０００を融合
促進剤として細胞融合を行った。融合後の細胞は１×１
０6ｃｅｌｌｓ／ｍｌの細胞濃度となるように１０％牛
血清を含むＨＡＴ培地に懸濁し、９６ウエルのマイクロ
タイタープレート（ヌンク社製マキシソープ、以下同
じ）に１ウエルあたり１００μｌずつ分注した。
【００２４】融合細胞は、ＣＯ2インキュベータ（５％
ＣＯ2，３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交
換を行い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、脾臓細胞と骨髄
腫細胞からなる融合細胞のスクリーニングを行った。次
いでＨＴ培地中で馴化し、さらに１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で馴化した。
ＣＯ2，３７℃）中で培養し、ヒポキサンチン、アミノ
プテリン、チミジンを含む培地（ＨＡＴ培地）で培地交
換を行い、ＨＡＴ培地中で増殖させて、脾臓細胞と骨髄
腫細胞からなる融合細胞のスクリーニングを行った。次
いでＨＴ培地中で馴化し、さらに１０％ＦＣＳ−ＲＰＭ
Ｉ１６４０培地で馴化した。
【００２５】融合細胞培養上清中の抗体は、リン酸化Ｐ
Ｓペプチドを固相化したマイクロタイタープレートを用
いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウエル
に対しては、限界希釈法によるクローニングを２回繰り
返し、リン酸化ＰＳペプチドに対する反応性を有するク
ローンを２種類選出し、それぞれ融合細胞クローン２Ｂ
９及び２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５１３４）と名付けた。得られたクロー
ン２Ｂ９及び２Ｇ３は、それぞれ１０％ＤＭＳＯを含む
９０％牛血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。各
クローンの産生するモノクローナル抗体は、クローンを
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水中か
らプロテイン−Ａセファロース４Ｂカラムを用いてそれ
ぞれを精製した。 ［実施例４］ モノクローナル抗体の特異性の確認 （４−１）ＥＬＩＳＡ法によるリン酸化ＰＳペプチドに
対する反応性の確認 実施例３で得られた融合細胞クローン２Ｇ３、２Ｂ９か
ら産生された２種類のモノクローナル抗体について、Ｅ
ＬＩＳＡ法によりリン酸化ＰＳペプチドに対する反応の
特異性を確認した。
Ｓペプチドを固相化したマイクロタイタープレートを用
いてＥＬＩＳＡ法により検出した。陽性となったウエル
に対しては、限界希釈法によるクローニングを２回繰り
返し、リン酸化ＰＳペプチドに対する反応性を有するク
ローンを２種類選出し、それぞれ融合細胞クローン２Ｂ
９及び２Ｇ３（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３３、Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１５１３４）と名付けた。得られたクロー
ン２Ｂ９及び２Ｇ３は、それぞれ１０％ＤＭＳＯを含む
９０％牛血清中に懸濁させ、液体窒素中に保存した。各
クローンの産生するモノクローナル抗体は、クローンを
ＢＡＬＢ／ｃマウスの腹腔内で増殖させ、その腹水中か
らプロテイン−Ａセファロース４Ｂカラムを用いてそれ
ぞれを精製した。 ［実施例４］ モノクローナル抗体の特異性の確認 （４−１）ＥＬＩＳＡ法によるリン酸化ＰＳペプチドに
対する反応性の確認 実施例３で得られた融合細胞クローン２Ｇ３、２Ｂ９か
ら産生された２種類のモノクローナル抗体について、Ｅ
ＬＩＳＡ法によりリン酸化ＰＳペプチドに対する反応の
特異性を確認した。
【００２６】固相には、リン酸化ＰＳペプチドを固相化
したマイクロタイタープレート、非リン酸化ＰＳペプチ
ドを固相化したマイクロタイタープレート、及びコント
ロールペプチド（配列番号３で表されるＭＩＰＰ４ペプ
チドのアミノ酸番号１０のセリンをリン酸化することに
より得たリン酸化ＭＩＰＰ４ペプチド）を固相化したマ
イクロタイタープレートを用いた（これらの作製法につ
いては実施例５の固相化ＰＳペプチドの作製法を参
照）。
したマイクロタイタープレート、非リン酸化ＰＳペプチ
ドを固相化したマイクロタイタープレート、及びコント
ロールペプチド（配列番号３で表されるＭＩＰＰ４ペプ
チドのアミノ酸番号１０のセリンをリン酸化することに
より得たリン酸化ＭＩＰＰ４ペプチド）を固相化したマ
イクロタイタープレートを用いた（これらの作製法につ
いては実施例５の固相化ＰＳペプチドの作製法を参
照）。
【００２７】検体としては、クローン２Ｇ３より産生さ
れたモノクローナル抗体、クローン２Ｂ９より産生され
たモノクローナル抗体、及び対照としてリン酸化Ｇ１ペ
プチドに特異的に結合するモノクローナル抗体ＹＣ−１
０（（株）医学生物学研究所製）を用いた。
れたモノクローナル抗体、クローン２Ｂ９より産生され
たモノクローナル抗体、及び対照としてリン酸化Ｇ１ペ
プチドに特異的に結合するモノクローナル抗体ＹＣ−１
０（（株）医学生物学研究所製）を用いた。
【００２８】各モノクローナル抗体の希釈系列（１０μ
ｇ／ｍｌから順に２０倍希釈した）を作製して、この液
１００μｌを上記３種類の固相化したマイクロタイター
プレートの各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた
後、液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した。一定濃度に希釈
したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（株式会社医
学生物学研究所製）１００μｌを各ウエルに添加し、室
温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、過酸化水素
及びオルトフェニレンジアミンの溶液を添加して発色反
応を行いリン酸化ＰＳペプチドに対する反応性を確認し
た。その結果を下記表１及び図１〜図３に示す。尚、表
１及び図１〜図３中、「ＩｇＧ濃度」はモノクローナル
抗体の濃度を表し、「２Ｇ３」はクローン２Ｇ３から産
生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｂ９」はクロ
ーン２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体を表す。
ｇ／ｍｌから順に２０倍希釈した）を作製して、この液
１００μｌを上記３種類の固相化したマイクロタイター
プレートの各ウエルに添加し、室温で１時間反応させた
後、液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄した。一定濃度に希釈
したペルオキシダーゼ標識抗マウスＩｇＧ（株式会社医
学生物学研究所製）１００μｌを各ウエルに添加し、室
温で１時間反応させた後、ＰＢＳで洗浄し、過酸化水素
及びオルトフェニレンジアミンの溶液を添加して発色反
応を行いリン酸化ＰＳペプチドに対する反応性を確認し
た。その結果を下記表１及び図１〜図３に示す。尚、表
１及び図１〜図３中、「ＩｇＧ濃度」はモノクローナル
抗体の濃度を表し、「２Ｇ３」はクローン２Ｇ３から産
生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｂ９」はクロ
ーン２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体を表す。
【００２９】
【表１】
【００３０】上記の結果から、融合細胞クローン２Ｇ３
及び２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体は、リン
酸化ＰＳペプチドにのみ反応性を示し、非リン酸化ＰＳ
ペプチド及びコントロールペプチドには反応性を示さな
かった。また、対照としたリン酸化Ｇ１ペプチドに対す
るモノクローナル抗体ＹＣ−１０は、いずれのペプチド
とも反応性を示さなかった。このことから、両モノクロ
ーナル抗体はリン酸化ＰＳペプチドに特異的に反応する
ことが確認された。 （４−２）免疫ブロット法による特異性の確認 さらにマウス脳抽出物を用いて常法により免疫ブロット
法により各クローン２Ｇ３及び２Ｂ９から産生されるモ
ノクローナル抗体の反応性を確認した。その結果を図４
に示す。尚、図４中、「２Ｇ３」はクローン２Ｇ３から
産生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｂ９」はク
ローン２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体を表
す。また、ＰＫＣ活性を調べる場合には、通常、Ｃａ2+
とホスファチジルセリン（ＰＳ）を添加して試料中のＰ
ＫＣを活性化させるため、これらの試薬を添加した場合
についても調べた（ＥＧＴＡを添加すると試料中のＣａ
2+は錯体となりＰＫＣは活性化されない）。
及び２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体は、リン
酸化ＰＳペプチドにのみ反応性を示し、非リン酸化ＰＳ
ペプチド及びコントロールペプチドには反応性を示さな
かった。また、対照としたリン酸化Ｇ１ペプチドに対す
るモノクローナル抗体ＹＣ−１０は、いずれのペプチド
とも反応性を示さなかった。このことから、両モノクロ
ーナル抗体はリン酸化ＰＳペプチドに特異的に反応する
ことが確認された。 （４−２）免疫ブロット法による特異性の確認 さらにマウス脳抽出物を用いて常法により免疫ブロット
法により各クローン２Ｇ３及び２Ｂ９から産生されるモ
ノクローナル抗体の反応性を確認した。その結果を図４
に示す。尚、図４中、「２Ｇ３」はクローン２Ｇ３から
産生されるモノクローナル抗体を表し、「２Ｂ９」はク
ローン２Ｂ９から産生されるモノクローナル抗体を表
す。また、ＰＫＣ活性を調べる場合には、通常、Ｃａ2+
とホスファチジルセリン（ＰＳ）を添加して試料中のＰ
ＫＣを活性化させるため、これらの試薬を添加した場合
についても調べた（ＥＧＴＡを添加すると試料中のＣａ
2+は錯体となりＰＫＣは活性化されない）。
【００３１】図４から次の点が明らかとなった。即ち、
クローン２Ｂ９により産生されるモノクローナル抗体
はマウス脳抽出物中の蛋白質と反応しない、クローン
２Ｇ３により産生されるモノクローナル抗体は２０ｋＤ
より少し小さい蛋白質との反応性が認められた、抗Ｐ
ＫＣモノクローナル抗体によってバンドが認められたこ
とからマウス脳抽出物中には確かにＰＫＣが存在する
（抗ＰＫＣモノクローナル抗体を反応させた場合にＰＳ
及びＣａ2+存在下でバンドが２本認められたのは、試料
中のカルシウム依存性タンパク分解酵素が活性化されて
ＰＫＣ分子が分解され、ＰＫＣ分子の調節ドメインと抗
ＰＫＣモノクローナル抗体が反応したからと考えられ
る）点が明らかとなった。
クローン２Ｂ９により産生されるモノクローナル抗体
はマウス脳抽出物中の蛋白質と反応しない、クローン
２Ｇ３により産生されるモノクローナル抗体は２０ｋＤ
より少し小さい蛋白質との反応性が認められた、抗Ｐ
ＫＣモノクローナル抗体によってバンドが認められたこ
とからマウス脳抽出物中には確かにＰＫＣが存在する
（抗ＰＫＣモノクローナル抗体を反応させた場合にＰＳ
及びＣａ2+存在下でバンドが２本認められたのは、試料
中のカルシウム依存性タンパク分解酵素が活性化されて
ＰＫＣ分子が分解され、ＰＫＣ分子の調節ドメインと抗
ＰＫＣモノクローナル抗体が反応したからと考えられ
る）点が明らかとなった。
【００３２】以上の結果から、クローン２Ｇ３により産
生されるモノクローナル抗体は、マウス脳抽出物を検体
として用いる場合、リン酸化ＰＳペプチド以外の蛋白質
と反応してリン酸化ＰＳペプチドの測定精度に影響する
ことが懸念される。このため、ＥＬＩＳＡでの測定系に
はクローン２Ｂ９により産生されるモノクローナル抗体
を用いることとした。 ［実施例５］ 測定系の構築 リン酸化ＰＳペプチドに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体を用いて検体中の蛋白質リン酸化酵素の活性を測
定する系を以下のように構築した。
生されるモノクローナル抗体は、マウス脳抽出物を検体
として用いる場合、リン酸化ＰＳペプチド以外の蛋白質
と反応してリン酸化ＰＳペプチドの測定精度に影響する
ことが懸念される。このため、ＥＬＩＳＡでの測定系に
はクローン２Ｂ９により産生されるモノクローナル抗体
を用いることとした。 ［実施例５］ 測定系の構築 リン酸化ＰＳペプチドに特異的に結合するモノクローナ
ル抗体を用いて検体中の蛋白質リン酸化酵素の活性を測
定する系を以下のように構築した。
【００３３】ＰＳペプチドを生理的リン酸緩衝液（ＰＢ
Ｓ）に溶解して１μｇ／ｍｌの溶液を調製した。この液
１００μｌを９６ウエルのマイクロタイタープレートの
各ウエルに添加し、４℃で１２時間〜１８時間静置反応
させた後、ペプチド溶液を除き、５％牛血清アルブミ
ン、５％シュクロース及び０．１％アジ化ナトリウムを
含むＰＢＳ３５０μｌを加えて４℃で１２〜１８時間静
置してマイクロタイタープレートの未反応部位をブロッ
キングし、ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄
することにより、固相化ＰＳペプチドを得た。
Ｓ）に溶解して１μｇ／ｍｌの溶液を調製した。この液
１００μｌを９６ウエルのマイクロタイタープレートの
各ウエルに添加し、４℃で１２時間〜１８時間静置反応
させた後、ペプチド溶液を除き、５％牛血清アルブミ
ン、５％シュクロース及び０．１％アジ化ナトリウムを
含むＰＢＳ３５０μｌを加えて４℃で１２〜１８時間静
置してマイクロタイタープレートの未反応部位をブロッ
キングし、ブロッキング溶液を捨て、ＰＢＳで３回洗浄
することにより、固相化ＰＳペプチドを得た。
【００３４】一方、精製したＰＫＡを３ｍＭ ＭｇＣｌ
2、０．１ｍＭ ＡＴＰ、２μＭｃＡＭＰ、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ及び５ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液で希釈
し、表２に示す濃度のＰＫＡ溶液を調製した。
2、０．１ｍＭ ＡＴＰ、２μＭｃＡＭＰ、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ及び５ｍＭ ２−メルカ
プトエタノールを含む２５ｍＭトリス塩酸緩衝液で希釈
し、表２に示す濃度のＰＫＡ溶液を調製した。
【００３５】そして、各濃度のＰＫＡ溶液１００μｌを
固相化ＰＳペプチドに添加し、室温で５〜２０分間反応
させ、２０％リン酸溶液１００μｌを加えてリン酸化反
応を停止し、ＰＢＳで５回洗浄した（これにより、固相
化ＰＳペプチドはリン酸化される）。
固相化ＰＳペプチドに添加し、室温で５〜２０分間反応
させ、２０％リン酸溶液１００μｌを加えてリン酸化反
応を停止し、ＰＢＳで５回洗浄した（これにより、固相
化ＰＳペプチドはリン酸化される）。
【００３６】ビオチン標識モノクローナル抗体は次のよ
うにして作製した。即ち、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶解したモノクローナル抗体（２Ｂ９、５ｍ
ｇ／ｍｌ）とＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣ
Ｅ社製 ２５ｍｇ／ｍｌ）をＩｇＧとＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ＩＯＴＩＮのモル比が１：６０になるように加え、室温
で４時間スターラーを用いて攪拌した。攪拌後、この溶
液を生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に透析し、ビオチン
標識モノクローナル抗体を得た。
うにして作製した。即ち、０．１Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶解したモノクローナル抗体（２Ｂ９、５ｍ
ｇ／ｍｌ）とＮＨＳ−ＬＣ−ＢＩＯＴＩＮ（ＰＩＥＲＣ
Ｅ社製 ２５ｍｇ／ｍｌ）をＩｇＧとＮＨＳ−ＬＣ−Ｂ
ＩＯＴＩＮのモル比が１：６０になるように加え、室温
で４時間スターラーを用いて攪拌した。攪拌後、この溶
液を生理的リン酸緩衝液（ＰＢＳ）に透析し、ビオチン
標識モノクローナル抗体を得た。
【００３７】そして、固相化ＰＳペプチドをＰＫＡと反
応させた後、ビオチン標識モノクローナル抗体１００μ
ｌを加え、室温で６０分間反応させ洗浄した後、ストレ
プトアビジン−ＰＯＤ複合体溶液１００μｌを加えた。
さらに室温で６０分間反応させた後、洗浄し、オルトフ
ェニレンジアミンと過酸化水素の混合溶液１００μｌを
加え、室温で３〜５分間反応させ、発色した後、２０％
リン酸溶液１００μｌを加えて反応を停止した。発色し
た溶液につき波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
応させた後、ビオチン標識モノクローナル抗体１００μ
ｌを加え、室温で６０分間反応させ洗浄した後、ストレ
プトアビジン−ＰＯＤ複合体溶液１００μｌを加えた。
さらに室温で６０分間反応させた後、洗浄し、オルトフ
ェニレンジアミンと過酸化水素の混合溶液１００μｌを
加え、室温で３〜５分間反応させ、発色した後、２０％
リン酸溶液１００μｌを加えて反応を停止した。発色し
た溶液につき波長４９２ｎｍの吸光度を測定した。
【００３８】尚、比較品として、Ｇ１ペプチド（基質）
をマイクロタイタープレートに結合させることにより得
た固相化Ｇ１ペプチド、及び、リン酸化Ｇ１ペプチドに
特異的に結合するモノクローナル抗体ＹＣ−１０をペル
オキシダーゼで標識化したペルオキシダーゼ標識ＹＣ−
１０を用いて、各濃度のＰＫＡ溶液の測定を行い、本実
施例との感度を比較した。その結果を表２及び図５に示
す。
をマイクロタイタープレートに結合させることにより得
た固相化Ｇ１ペプチド、及び、リン酸化Ｇ１ペプチドに
特異的に結合するモノクローナル抗体ＹＣ−１０をペル
オキシダーゼで標識化したペルオキシダーゼ標識ＹＣ−
１０を用いて、各濃度のＰＫＡ溶液の測定を行い、本実
施例との感度を比較した。その結果を表２及び図５に示
す。
【００３９】
【表２】
【００４０】上記の結果から、本実施例の試薬は、従来
の試薬（比較品）に比べて、きわめて感度よく蛋白質リ
ン酸化酵素活性を検出できることが示された。 ［実施例６］ 反応性の確認 当該測定試薬がＰＫＡ及びＰＫＣ活性を特異的に捕らえ
ていることを確認するため、ＣＯＳ細胞及びＭｏｌｔ３
細胞の抽出物を用いてリン酸化活性の測定を行った。即
ち、ＣＯＳ細胞及びＭｏｌｔ３細胞の抽出物を検体とし
た。また、ＰＫＡ活性を調べる場合は、試料中にｃＡＭ
Ｐ（ＰＫＡを活性化させるもの）を添加し又は添加しな
いで、一方、ＰＫＣ活性を調べる場合は、試料中にＣａ
2+とＰＳ（これらはＰＫＣを活性化させる）を添加し又
はＥＧＴＡ（試料中のＣａ2+をキレート化するもの）を
添加して、実施例５と同様にその活性を測定した。その
結果を表３、４及び図６〜９に示す。これらの表及び図
中、「蛋白濃度」とは、ＣＯＳ細胞またはＭｏｌｔ３細
胞の抽出物の濃度を表す。
の試薬（比較品）に比べて、きわめて感度よく蛋白質リ
ン酸化酵素活性を検出できることが示された。 ［実施例６］ 反応性の確認 当該測定試薬がＰＫＡ及びＰＫＣ活性を特異的に捕らえ
ていることを確認するため、ＣＯＳ細胞及びＭｏｌｔ３
細胞の抽出物を用いてリン酸化活性の測定を行った。即
ち、ＣＯＳ細胞及びＭｏｌｔ３細胞の抽出物を検体とし
た。また、ＰＫＡ活性を調べる場合は、試料中にｃＡＭ
Ｐ（ＰＫＡを活性化させるもの）を添加し又は添加しな
いで、一方、ＰＫＣ活性を調べる場合は、試料中にＣａ
2+とＰＳ（これらはＰＫＣを活性化させる）を添加し又
はＥＧＴＡ（試料中のＣａ2+をキレート化するもの）を
添加して、実施例５と同様にその活性を測定した。その
結果を表３、４及び図６〜９に示す。これらの表及び図
中、「蛋白濃度」とは、ＣＯＳ細胞またはＭｏｌｔ３細
胞の抽出物の濃度を表す。
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】上記の結果から、当該試薬はＰＫＡ及びＰ
ＫＣの活性測定においていずれも特異的にこれら酵素の
活性を測定していることが示された。尚、対照例（ｃＡ
ＭＰ（−）、ＥＧＴＡ（＋））でも反応性が見られたの
は、細胞抽出物中にあって既に活性化されていたＰＫＡ
やＰＫＣ、又は、ＰＫＡやＰＫＣ以外のプロテインキナ
ーゼの影響によるものである。
ＫＣの活性測定においていずれも特異的にこれら酵素の
活性を測定していることが示された。尚、対照例（ｃＡ
ＭＰ（−）、ＥＧＴＡ（＋））でも反応性が見られたの
は、細胞抽出物中にあって既に活性化されていたＰＫＡ
やＰＫＣ、又は、ＰＫＡやＰＫＣ以外のプロテインキナ
ーゼの影響によるものである。
【００４４】
【発明の効果】本発明によれば、検体中の蛋白質リン酸
化酵素の活性を高感度に測定することが可能な免疫学的
測定方法及びそのためのキットが提供される。細胞中の
蛋白質リン酸化酵素の活性を測定することは従来困難で
あったが、未調整の検体中におけるこれら酵素の活性を
感度よく測定することにより、細胞内における情報伝達
のメカニズム解明のための手段が提供されると同時に、
情報伝達機構の異常として捉えられる疾患（癌や一部の
糖尿病等）の原因解明の手段が提供される。また、これ
らに使用される有用なモノクローナル抗体が提供され、
更にこのモノクローナル抗体を産生する有用な融合細胞
が提供される。
化酵素の活性を高感度に測定することが可能な免疫学的
測定方法及びそのためのキットが提供される。細胞中の
蛋白質リン酸化酵素の活性を測定することは従来困難で
あったが、未調整の検体中におけるこれら酵素の活性を
感度よく測定することにより、細胞内における情報伝達
のメカニズム解明のための手段が提供されると同時に、
情報伝達機構の異常として捉えられる疾患（癌や一部の
糖尿病等）の原因解明の手段が提供される。また、これ
らに使用される有用なモノクローナル抗体が提供され、
更にこのモノクローナル抗体を産生する有用な融合細胞
が提供される。
【００４５】
配列番号：１
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トボロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ser Leu Arg Gln Lys Asn Val Cys
1 5 10
【００４６】配列番号：２
配列の長さ：１４
配列の型：アミノ酸
トボロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Arg Phe Ala Arg Lys Gly Ala Leu Arg Gln Lys Asn Val Cys
1 5 10
【００４７】配列番号：３
配列の長さ：１５
配列の型：アミノ酸
トボロジー：直鎖状
配列の種類：ペプチド
配列
Lys Arg Arg Leu Asn Arg Glu Glu Ser Ser Val Val Leu Gly Tyr
1 5 10 15
【図１】 非リン酸化ＰＳペプチドを用いたときのＩｇ
Ｇ（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を
表すグラフである。
Ｇ（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を
表すグラフである。
【図２】 リン酸化ＰＳペプチドを用いたときのＩｇＧ
（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を表
すグラフである。
（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を表
すグラフである。
【図３】 コントロールペプチドを用いたときのＩｇＧ
（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を表
すグラフである。
（モノクローナル抗体）濃度に対する吸光度の関係を表
すグラフである。
【図４】 マウス脳抽出物を用いたときの各種モノクロ
ーナル抗体の免疫ブロット法の結果を表す説明図（電気
泳動の様子を書き写したもの）である。
ーナル抗体の免疫ブロット法の結果を表す説明図（電気
泳動の様子を書き写したもの）である。
【図５】 実施例５の試薬及び比較品を用いたときのＰ
ＫＡに対する吸光度の関係を表すグラフである。
ＫＡに対する吸光度の関係を表すグラフである。
【図６】 ＰＫＡ活性に関し、ＣＯＳ細胞の蛋白濃度に
対する吸光度の関係を表すグラフである。
対する吸光度の関係を表すグラフである。
【図７】 ＰＫＡ活性に関し、Ｍｏｌｔ３細胞の蛋白濃
度に対する吸光度の関係を表すグラフである。
度に対する吸光度の関係を表すグラフである。
【図８】 ＰＫＣ活性に関し、ＣＯＳ細胞の蛋白濃度に
対する吸光度の関係を表すグラフである。
対する吸光度の関係を表すグラフである。
【図９】 ＰＫＣ活性に関し、Ｍｏｌｔ３細胞の蛋白濃
度に対する吸光度の関係を表すグラフである。
度に対する吸光度の関係を表すグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
G01N 33/53
C07K 16/40
G01N 33/577
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ
ｅｑ
Claims (10)
- 【請求項１】 リン酸化ＰＳペプチド（配列番号１で表
されるＰＳペプチドのアミノ酸番号７のセリンがリン酸
化されたもの）と特異的に結合するモノクローナル抗
体。 - 【請求項２】 請求項１記載のモノクローナル抗体を産
生する融合細胞。 - 【請求項３】 リン酸化ＰＳペプチドを免疫感作させた
哺乳動物から取得される抗体産生細胞と哺乳動物骨髄腫
系細胞との融合により得られる請求項２記載の融合細
胞。 - 【請求項４】 融合細胞クローン２Ｂ９（受託番号ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１５１３３）又は融合細胞クローン２Ｇ３
（受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１５１３４）である請求項２
記載の融合細胞。 - 【請求項５】 下記ａ）〜ｃ）及びｄ）〜ｆ）の工程を
含むことを特徴とする蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学
的測定方法。 ａ）配列番号１で表されるＰＳペプチドを不溶性支持体
に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドに標準物質とし
てのサイクリックＡＭＰ依存性プロテイン（ＰＫＡ）又
はプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を反応せしめた後、 ｂ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｃ）この反応生成物の標識量を測定することにより検量
線を作成する工程、及び ｄ）前記固相化ＰＳペプチドに検体を反応せしめた後、 ｅ）請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質によ
り標識化した標識モノクローナル抗体を反応させ、 ｆ）この反応生成物の標識量を測定し、前記検量線から
検体中に含まれるＰＫＡ又はＰＫＣの酵素活性を測定す
る工程。 - 【請求項６】 前記標識モノクローナル抗体は、請求項
２〜４のいずれかに記載の融合細胞により産生されるモ
ノクローナル抗体を標識物質により標識化したことを特
徴とする請求項５記載の免疫学的測定方法。 - 【請求項７】 前記標識物質は、ビオチン、ペルオキシ
ダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォスフ
ァターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群から
選ばれたことを特徴とする請求項５又は６記載の免疫学
的測定方法。 - 【請求項８】 配列番号１で表されるＰＳペプチドを不
溶性支持体に結合せしめてなる固相化ＰＳペプチドと、 請求項１記載のモノクローナル抗体を標識物質により標
識化した標識モノクローナル抗体とを備えたことを特徴
とする蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定キット。 - 【請求項９】 前記標識モノクローナル抗体は、請求項
２〜４のいずれかに記載の融合細胞により産生されるモ
ノクローナル抗体を標識物質により標識化したことを特
徴とする請求項９記載の免疫学的測定キット。 - 【請求項１０】 前記標識物質は、ビオチン、ペルオキ
シダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、アルカリフォス
ファターゼ及びマイクロペルオキシダーゼからなる群か
ら選ばれたことを特徴とする請求項８又は９記載の免疫
学的測定キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22417995A JP3488767B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP22417995A JP3488767B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0968527A JPH0968527A (ja) | 1997-03-11 |
| JP3488767B2 true JP3488767B2 (ja) | 2004-01-19 |
Family
ID=16809770
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP22417995A Expired - Lifetime JP3488767B2 (ja) | 1995-08-31 | 1995-08-31 | モノクローナル抗体、これを産生する融合細胞、並びに、これを利用した蛋白質リン酸化酵素活性の免疫学的測定方法及び測定キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3488767B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002236125A (ja) * | 2001-02-06 | 2002-08-23 | Igaku Seibutsugaku Kenkyusho:Kk | タンパク質リン酸化酵素活性の測定方法、測定用キット及び測定に用いる抗体 |
| WO2009119167A1 (ja) | 2008-03-25 | 2009-10-01 | 株式会社キノファーマ | 抗ｒｎａウイルス作用を有するアニリン誘導体 |
| CN114624448B (zh) * | 2022-03-18 | 2022-09-20 | 北京美联泰科生物技术有限公司 | 一种用于检测胶质纤维酸性蛋白的试剂盒 |
-
1995
- 1995-08-31 JP JP22417995A patent/JP3488767B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0968527A (ja) | 1997-03-11 |
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