JP7460129B2 - 多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 - Google Patents
多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7460129B2 JP7460129B2 JP2020067344A JP2020067344A JP7460129B2 JP 7460129 B2 JP7460129 B2 JP 7460129B2 JP 2020067344 A JP2020067344 A JP 2020067344A JP 2020067344 A JP2020067344 A JP 2020067344A JP 7460129 B2 JP7460129 B2 JP 7460129B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- metal
- fluorescence
- protein
- multicolor fluorescent
- fluorescent protein
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 title claims description 142
- 239000002184 metal Substances 0.000 title claims description 142
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 title claims description 95
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 title claims description 95
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 44
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 title claims description 39
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims description 33
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 26
- 239000012085 test solution Substances 0.000 title description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 85
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 74
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 62
- 230000005284 excitation Effects 0.000 claims description 46
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 42
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 40
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 claims description 33
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 27
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 24
- JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N tellanylidenegermanium Chemical compound [Te]=[Ge] JBQYATWDVHIOAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 claims description 12
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 9
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910021654 trace metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 claims description 5
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 28
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 24
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 23
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 16
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 11
- 241000123069 Ocyurus chrysurus Species 0.000 description 10
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol bis(2-aminoethyl)tetraacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCOCCOCCN(CC(O)=O)CC(O)=O DEFVIWRASFVYLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 5
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 5
- 241000124001 Alcyonacea Species 0.000 description 4
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000012854 evaluation process Methods 0.000 description 4
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 230000009920 chelation Effects 0.000 description 3
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000002612 dispersion medium Substances 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L lithium carbonate Chemical compound [Li+].[Li+].[O-]C([O-])=O XGZVUEUWXADBQD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229910052808 lithium carbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 3
- 229910052720 vanadium Inorganic materials 0.000 description 3
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical group [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 150000004697 chelate complex Chemical class 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 210000001819 pancreatic juice Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-4-[(4-methyl-2-nitrophenyl)diazenyl]-N-(3-nitrophenyl)naphthalene-2-carboxamide Chemical compound Cc1ccc(N=Nc2c(O)c(cc3ccccc23)C(=O)Nc2cccc(c2)[N+]([O-])=O)c(c1)[N+]([O-])=O MCSXGCZMEPXKIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 101100495769 Caenorhabditis elegans che-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000000668 Chronic Pancreatitis Diseases 0.000 description 1
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical group [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010026749 Mania Diseases 0.000 description 1
- AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]-2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound O=C(CCNC(=O)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)N1CC2=C(CC1)NN=N2 AFCARXCZXQIEQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033649 Pancreatitis chronic Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000813148 Scleronephthya gracillimum Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 1
- 229910052784 alkaline earth metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001342 alkaline earth metals Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000000935 antidepressant agent Substances 0.000 description 1
- 229940005513 antidepressants Drugs 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052788 barium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052790 beryllium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052792 caesium Inorganic materials 0.000 description 1
- ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N calcium nitrate tetrahydrate Chemical compound O.O.O.O.[Ca+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O ICSSIKVYVJQJND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N nickel Substances [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010970 precious metal Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 229910052705 radium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000005057 refrigeration Methods 0.000 description 1
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229910052702 rhenium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052701 rubidium Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229910052706 scandium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910052712 strontium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229910052718 tin Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
Description
前記混合液の蛍光を評価する評価工程とを有する、被検液の金属検出方法。
(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(b)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
<2> 前記被検液に含まれる検査対象の金属が、亜鉛(Zn)、銅(Cu)、リチウム(Li)、およびカルシウム(Ca)からなる群から選択される1以上の金属、または遷移金属から選択される1以上の金属である<1>記載の金属検出方法。
<3> 前記評価工程における前記混合液のpHが、10~13である<1>または<2>に記載の金属検出方法。
<4> (a)~(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入する工程と、
前記組み換えベクターが導入された前記宿主における励起光-蛍光を評価することで、前記宿主における金属挙動の評価方法。
<5> 前記金属挙動を評価する金属がリチウム(Li)であり、前記宿主が細胞、動物、動物組織、および動物器官からなる群から選択されるいずれかである<4>記載の評価方法。
<6> (a)~(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み、導入される宿主の微量金属挙動の評価に用いられるための組み換えベクター。
<7> (a)~(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬。
本発明に用いる多色蛍光タンパク質は、下記(a)~(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質である。
(a)配列番号1~4(akane, akane1, akane2, akane3)のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(b)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質に対して、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質
本発明に用いる多色蛍光タンパク質は、(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質に関する。
配列番号1は「akane」のアミノ酸配列である。配列番号2は「akane1」のアミノ酸配列である。配列番号3は「akane2」のアミノ酸配列である。配列番号4は「akane3」のアミノ酸配列である。本願においては、これらのアミノ酸配列からなる発現したタンパク質を総称して多色蛍光タンパク質アカネと呼ぶ場合がある。なお、これらのタンパク質は、超長波長の蛍光色を含むマルチカラー多色蛍光タンパク質に係る特許文献1(特許第5334007号公報)において、配列番号5~7がそれぞれ本願における配列番号1~4に対応するものとして開示されている。
多色蛍光タンパク質アカネは、冷蔵保存したとき蛍光寿命が1年~数年程度続き、また、凍結乾燥後、冷蔵保存では数年~20年程度と、非常に安定な蛍光物質である点で優れている。
また、多色蛍光タンパク質アカネは多色蛍光を発するので、緑、青、オレンジ、赤、濃赤などの蛍光色を使い分けることもできる。
本発明に用いる多色蛍光タンパク質は、天然由来のものや、遺伝子組み換え技術によって人工的に作製されたタンパク質(リコンビナントタンパク質)などを用いることができる。本発明の多色蛍光タンパク質は、適宜特許第5334007号などを参照して得ることができる。例えば、軟サンゴ(Scleronephthya gracillimum)に由来する多色蛍光タンパク質を用いることができる。また、本発明に用いる多色蛍光タンパク質の配列を、大腸菌や酵母、昆虫細胞、動物細胞などを用いる発現系により発現させて発現、精製して得ることができる。本発明の多色蛍光タンパク質は修飾の必要や影響が少ないため、比較的安価な大腸菌(E.coli)を用いる発現系により発現させたものを大腸菌体の破砕後、樹脂カラムで精製を行うことで、アカネ遺伝子発現体を提供し、利用できる。このため大腸菌を用いて製造したものを利用することが好ましい。
多色蛍光タンパク質アカネは金属と金属キレート形成能を有し、金属の種類でキレート形成の影響が変わる。この金属は、例えば、亜鉛や銅、リチウムを対象とすることができる。また、X線吸収微細構造の測定結果から、金属の違いによるキレート構造が推定できる。
多色蛍光タンパク質アカネは、赤色蛍光色においても冷蔵保存したとき蛍光寿命が1年~数年程度続き、または凍結乾燥後、冷蔵保存では数年~20年程度と、非常に安定な蛍光物質である点で優れている。他の蛍光タンパク質と比べて、赤色蛍光色においても、非常に長寿命の安定な蛍光物質である。
本発明の金属検出用試薬は、本発明に用いる多色蛍光タンパク質を含む。
本発明の金属検出用試薬は、本発明に用いる多色蛍光タンパク質を含む。金属検出用試薬は、多色蛍光タンパク質が失活しない範囲で任意の組成で任意の条件のものとしてよい。本発明の多色蛍光タンパク質は相当に安定性が高いため、水系溶媒等に分散させた状態で冷蔵や冷凍で保管したり、常温で保管してよい。
本発明の被検液の金属検出方法は、本発明に用いる多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬と、被検液とが混合された混合液を調整する調整工程と、前記混合液の蛍光を評価する評価工程とを有する。本発明の被検液の金属検出方法により、被検液に金属が含まれているか否かの測定や、その金属の濃度の測定などを行うことができる。
本発明の被検液の金属検出方法は、金属検出用試薬と被検液とが混合された混合液を調整する調整工程を有する。
被検液は、金属の含有の有無や、濃度を検出する対象となる液である。この被検液は、試験管等に収容したものや、細胞内の液、動物組織・動物器官内の液も対象とすることができる。
被検液に含まれ得る検出対象となる金属は、本発明に用いる多色蛍光タンパク質とキレートを形成して発色が変わる任意の金属を適宜対象とすることができる。これらの金属は、被検液と金属検出試薬とを混合した混合液において、イオン化するものを対象とすることができる。
検出対象となる金属としては、化学的分類による分類として、次の分類のものがあげられる。アルカリ金属:Li、Na、K、Rb、Csがあげられる。アルカリ土類金属:Ca、Sr、Ba、Raがあげられる。マグネシウム族元素:Be、Mg、Zn、Cd、Hgがあげられる。鉄族元素:Fe、Co、Niがあげられる。マンガン族元素:Mn、Reがあげられる。貴金属:Cu、Ag、Auがあげられる。
被検液に含まれる検査対象の金属は、遷移金属を対象とすることが好ましい。遷移金属の中でも、第一遷移元素を対象とすることが好ましい。ここでの第一遷移元素は、Scや、Ti、V、Cr、Mn、Fe、Co、Ni、Cu、Znとする。
被検液に含まれる金属は、生体内必須微量金属としてもよい。本発明に用いる多色蛍光タンパク質は、生体内でも毒性がないため、生体内に導入等して、生体内必須微量金属の動態解明に用いることができる。本発明に用いる多色蛍光タンパク質は、微量の金属ともキレートを形成して発色が変わるため、生体内の元素でも微量のものや検出されにくいものを対象としてもよい。例えば、Feや、Zn、Cu、Mn、Se、Mo、Co、Cr、V、Ni、As、Sn、Si、V、Crを対象とすることができる。
被検液に含まれる測定対象となる金属元素の濃度は、多色蛍光の使い分けなどを行い検出できる範囲で特に限定は無い。被検液に含まれる金属元素が無い場合、金属元素とのキレートによる多色蛍光の蛍光強度の変化が生じないため、金属元素が含まれない、または検出下限以下と判断される。金属元素が多量に含まれすぎている場合、キレートを形成しにくくなり、発光が生じなかったりして検出されない場合があるため、金属元素の濃度が、100mmol/L以下を上限としてもよい。さらに、50mmol/L以下や、30mmol/L以下、20mmol/L以下としてもよい。
混合液は、被検液と、金属検出用試薬とが混合されたものである。混合液は、例えば試験管内に、微量の被検液と微量の金属検出用試薬とを加えて適宜撹拌などして得ることができる。また、微量の金属検出用試薬をマイクロプレートに配置し、このマイクロプレート上で被検液と接触させて緩やかに混合してもよい。
本発明の被検液の金属検出方法は、前記混合液の蛍光を評価する評価工程を有する。蛍光の評価は、被検液に含まれる金属とのキレートの種類等に応じて、励起光を照射したとき、その励起光に対応する蛍光が生じるか否か、その蛍光が生じた蛍光波長などの測定をしたり、蛍光の強度などを測定することで評価することができる。
本発明に用いる多色蛍光タンパク質と、金属とのキレートは、その組み合わせによって、蛍光が減少するものや増加するものなどが存在し得る。例えば、亜鉛やリチウムとは、キレートを形成することで蛍光が増加する傾向がみられる。また、銅とは、キレートを形成することで蛍光が減少する傾向がみられる。
本発明に用いる多色蛍光タンパク質と、金属とのキレートは、金属の濃度に対する蛍光影響の飽和や、キレート形成能の飽和、キレート形成能への干渉、他の外乱要因の影響などを確認するものとしてもよい。このために、複数の希釈段階の濃度調整を行った被検液を準備し、それらの被検液に対して、金属検出用試薬と混合して、蛍光を評価してもよい。このとき、近似曲線などを用いて解析を行い、ピーク強度が得られる希釈率との関係から原液の被検液における金属の濃度を求めることができる。または、複数の蛍光色を評価して、それらの蛍光色の励起光-蛍光の強度分布の依存性から、金属の濃度を求めることができる。
例えば、akane3から発現された多色蛍光タンパク質Akane3は、428nm励起光に対して483nm蛍光(青色蛍光)が生じ、536nm励起光に対して604nmと640nmのダブルピークの蛍光(赤色蛍光)が生じる。このAkane3と亜鉛(Zn)とのキレートを形成させると、蛍光の増強強化が確認される。Znとのキレートによる蛍光の増強効果は、青色蛍光の増強効果の方が、赤色蛍光の増強効果よりも強く、青色蛍光が約200%増強されるとき、赤色蛍光は約150~160%程度の増強となる。
前記評価工程における前記混合液のpHが3.5~13の範囲で安定した蛍光を観測することができる。多色蛍光タンパク質アカネは、特に、塩基性領域(pH10~13)で強い赤色蛍光を発し非常に安定である。よって、混合液を塩基性領域として評価することで、蛍光の観察や測定を行いやすくなる。例えば、膵臓の中の膵液は強塩基性であることが多いが、慢性膵炎ではこの膵液中の亜鉛(Zn)濃度が著しく低下するため、本評価工程を使って膵液の亜鉛濃度の評価にも応用可能となる。
本発明の金属挙動の評価方法は、本発明に用いる多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入する工程と、前記組み換えベクターが導入された前記宿主における励起光-蛍光を評価することで、前記宿主における金属挙動の評価をおこなうものである。
本発明の組み換えベクターは、本発明に用いる多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む。この組み換えベクターを用いて、宿主に、導入すると、宿主で多色蛍光タンパク質を発現して、この多色蛍光タンパク質が金属とキレートを形成して、所定の金属の有無や場所、濃度などを評価することができる。
本発明の組み換えベクターを導入する宿主は、金属挙動を評価する対象とする任意のものを選択することができる。宿主は、微生物や、植物、動物を対象とすることができる。また、これらの細胞や、組織、器官などの一部を対象としてもよい。金属挙動の評価は、特に薬物動態の評価手法として有用と考えられる。このことから、宿主は、マウスやラットなどの実験動物としてもよい。また、動物の細胞を培養して適宜分化等させた動物組織や動物器官などを対象としてもよい。また、膵臓や脳などを対象とすることができる。
本発明の多色蛍光タンパク質を、生細胞へ導入する方法で、細胞内被検液の金属の量を検出することができると考えられる。これは次のように行うことなどが考えられる。(1)多色蛍光タンパク質のみを、生細胞へ導入し、本発明の励起波長Ex(535nm~)を照射し蛍光顕微鏡などで蛍光を検出する。次に(2)多色蛍光タンパク質に数段階の既知量の金属を結合させたものを生細胞へ導入し、励起波長Ex(535nm~)を照射し蛍光顕微鏡などで蛍光を検出する。
本発明の多色蛍光タンパク質を、生細胞へ導入する方法では、採用する励起波長Exは、535nmや、Ex564nmという長波長域なので、励起光で照射したときに、生細胞を損傷することがほとんどない。これまでの従来法では励起波長は、紫外光Ex350nm~が使われており、紫外光なので生細胞の損傷が危惧されていたが、本法はこの欠点を改良できる。
本発明の被検液の金属検出方法や、本発明の金属挙動の評価方法を利用して、例えば、薬物動態のモニタリングを行うことができる。躁病や抗うつ治療の補助薬として、炭酸リチウム(LiCO3)が多用されているが、その薬物動態は不明ともいわれている。また、本発明の多色蛍光タンパク質が、塩基性下で、蛍光強度が強く、また安定であることを利用して、塩基性の膵臓内におけるZnイオンや、脳内における薬物中のLi存在量の把握などは、薬物動態を評価する対象として特に有用と考えられる。
1.分光光度計:Perkin Elmer UV/Vis Spectrometer Lambda35
2.蛍光分光光度計:Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrometer
3.蛍光及び分光光度計測定プレートリーダー:Tecan社 Infinite 200 PRO
専門家により種を同定された、軟サンゴをPBS溶液中でホモジナイズし、抽出液を遠心分離したものについて硫安沈殿を行い、その沈殿タンパク質を透析膜により透析した。透析した溶液を凍結乾燥したものを粗抽出試料とした。この粗抽出試料を、ゲルろ過カラム、次に陰イオンカラムにかけて、Tris-HCl buffer(pH8.5)で流し、次に塩濃度を順次変えて溶出し、分光光度計の波長280nmでタンパク質量を測定した。タンパク質の吸光度の高い画分を、さらに分離精製したのちの溶出画分をウルトラフィルターで濃縮した。ポリアクリルアミドゲルでSDS-PAGE電気泳動後に染色を行うことで、27kDaおよび21kDaの分子量のタンパク質バンドが得られたものを、天然型アカネ試料(以下、「天然型RFP」と表記)として用いた。なお、天然型アカネ試料のより詳しい調製方法は、特許第5334007号公報の実施例に係る天然型の蛍光タンパク質に準じるものである。
・akane3遺伝子の作成:軟サンゴベニウミトサカ種からmRNAを抽出し、F1,R1のプライマーを作成後、RT-PCR増幅させ、PCR産物をもとにクローニングを行った。複数の遺伝子をえた中で、akane3をコードする遺伝子(配列4)を選んだ。
・Akane3タンパク質の回収:akane3遺伝子をpET15bベクター(クロンテック社製)に組み込み、組み替えベクターを作成した。そのベクターを大腸菌に挿入し発現させた。その後、大腸菌からAkane3タンパク質(以下、単に「Akane3」)を回収した。
・Akane3含有液:前述のAkane3を用いて、530μg/1mL(20nmol/L)溶液を使用した。
・亜鉛(Zn)含有液:Zn(NO3)2・6H2O(MW:297.5)(和光純薬・特級)を溶媒に溶解させて用いた。
・銅(Cu)含有液:Cu(NO3)2・3H2O(MW:241.6)(和光純薬・特級)を溶媒に溶解させて用いた。
・リチウム(Li)含有液:Li2(CO3)(MW:73.85)(和光純薬・特級)を溶媒に溶解させて用いた。
・カルシウム(Ca)含有液:Ca(NO3)2・4H2O(MW:236.15)(和光純薬・特級)を溶媒に溶解させて用いた。
・溶媒:10mmol/L Tris buffer pH 7.5 (和光純薬・生化学用)
Akane3と、亜鉛含有液または銅含有液とを混合したときの励起波長Ex434nmにおける蛍光スペクトルを評価した。
・試験例1-1
多色蛍光タンパク質濃度530μg/1mL(20nmol/L)のAkane3含有液0.5mLと、亜鉛含有液(亜鉛濃度:100μmol/L)1mLとを混合して、励起光波長434nmに対する蛍光スペクトルを、Hitachi 蛍光分光光度計「F-7000」で評価した。なお、スペクトルの評価は混合後2時間(120分)後を基本とした。
多色蛍光タンパク質濃度530μg/1mL(20nmol/L)のAkane3含有液0.5mLと、銅含有液(銅濃度:100μmol/L)1mLとを混合して、励起光波長434nmに対するスペクトルを、Hitachi蛍光分光光度計「F-7000」で評価した。なお、スペクトルの評価は混合後2時間(120分)後を基本とした。
亜鉛濃度を変更し、励起光波長Ex536nmに対するスペクトルを評価した。
Akane3含有液、22.4nmol/L濃度の溶液を、マイクロプレートの各プレート穴に50μLずつマイクロピペットを使い分注する。被検液に含まれる検査対象の亜鉛(Zn)0, 0.25, 0.50, 2.5, 5.0(mmol/L)濃度の溶液を、50μLずつマイクロピペットを使い分注する。次に、攪拌機で緩やかに撹拌し、Akane3と被検液に含まれる検査対象の金属が、亜鉛(Zn)が、接触することで、Akane3と亜鉛はキレートを形成する。
図4に示すように、蛍光波長Em604nm,640nmにおける蛍光強度が、亜鉛濃度2.5mmol/Lまで、上昇傾向が確認された。
試験例4に準じて、反応開始後30分後と、2時間後の励起光波長536nmに対するスペクトルを評価した。
Akane3含有液、22.4nmol/L濃度の溶液を、マイクロプレートの各プレート穴に50μLずつマイクロピペットを使い分注する。被検液に含まれる検査対象の銅(Cu)0, 0.125、 0.25、 0.50、 1.25、 2.5、 5.0、 25.0(mmol/L)濃度の溶液を、50μLずつマイクロピペットを使い分注する。次に、攪拌機で緩やかに撹拌し、Akane3と被検液に含まれる検査対象の金属が、銅(Cu)が、接触することで、Akane3と銅はキレートを形成する。
亜鉛含有液に代えて銅含有液を用い、銅濃度を変更しながら、励起光波長536nmに対するスペクトルを評価した。なお、図中の銅の量は混合溶液中の銅含有量で表記したものである。
試験例1に準じて、Akane3に代えて天然型RFPを用いて、天然型RFPとLi含有液を混合したときの励起光-蛍光スペクトルを評価した。
試験例1-1に準じて、亜鉛濃度を変更しながら、励起波長Ex434nm、536nmに対するスペクトルを評価した。
Ca濃度を変更しながら、励起波長Ex434nm-蛍光波長Em(475nm,508nm)、励起波長Ex564nm-蛍光波長Em(596nm,641nm)に対するスペクトルを評価した。
図11は、多色蛍光タンパク質アカネの推定構造である。多色蛍光タンパク質アカネのクロモフォア(発色団)は、微量金属(亜鉛、銅、リチウム)とのキレート錯体を形成すると考えられる。すなわち、多色蛍光タンパク質はキレート剤として働く。X線吸収微細構造によりこの錯体形成状態の構造を明らかにすることができると考えられる。
Claims (7)
- 下記(a)および(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬と、被検液とが混合された混合液を調整する調整工程と、前記混合液の蛍光を評価する評価工程とを有する、被検液の金属検出方法。
(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記被検液に含まれる検査対象の金属が、亜鉛(Zn)、銅(Cu)、リチウム(Li)、およびカルシウム(Ca)からなる群から選択される1以上の金属、または遷移金属から選択される1以上の金属である請求項1記載の金属検出方法。
- 前記評価工程における前記混合液のpHが、10~13である請求項1または2に記載の金属検出方法。
- 下記(a)および(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えベクターを宿主に導入する工程と、前記組み換えベクターが導入された前記宿主における励起光-蛍光を評価することで、前記宿主における金属挙動の評価方法。
(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 前記金属挙動を評価する金属がリチウム(Li)であり、前記宿主が細胞、動物、動物組織、および動物器官からなる群から選択されるいずれかである請求項4記載の評価方法。
- 下記(a)および(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み、導入される宿主の微量金属挙動の評価に用いられるための組み換えベクター。
(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなるタンパク質 - 下記(a)および(c)からなる群から選択される1以上の多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬。
(a)配列番号1~4のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
(c)上記(a)において、少なくとも一つのタンパク質が、それぞれ対応する配列番号で表されたタンパク質の配列との同一性が90%以上であるアミノ酸配列からなる多色蛍光タンパク質
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020067344A JP7460129B2 (ja) | 2020-04-03 | 2020-04-03 | 多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2020067344A JP7460129B2 (ja) | 2020-04-03 | 2020-04-03 | 多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2021162549A JP2021162549A (ja) | 2021-10-11 |
JP7460129B2 true JP7460129B2 (ja) | 2024-04-02 |
Family
ID=78003211
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2020067344A Active JP7460129B2 (ja) | 2020-04-03 | 2020-04-03 | 多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7460129B2 (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001240855A (ja) | 2000-03-01 | 2001-09-04 | Masashi Sugimoto | 生物発光方法及び発光物品 |
WO2005014633A8 (ja) | 2003-08-12 | 2005-03-31 | Chisso Corp | 蛍光蛋白質 |
US20060030029A1 (en) | 2004-08-09 | 2006-02-09 | Yang Jenny J | Analyte sensors |
JP2008067613A (ja) | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Nagoya Institute Of Technology | 金属イオン応答性蛍光発色タンパク質 |
JP2008104461A (ja) | 2006-09-29 | 2008-05-08 | Yuko Kato | 超長波長の蛍光色を含むマルチカラー蛍光タンパク質 |
-
2020
- 2020-04-03 JP JP2020067344A patent/JP7460129B2/ja active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2001240855A (ja) | 2000-03-01 | 2001-09-04 | Masashi Sugimoto | 生物発光方法及び発光物品 |
WO2005014633A8 (ja) | 2003-08-12 | 2005-03-31 | Chisso Corp | 蛍光蛋白質 |
US20060030029A1 (en) | 2004-08-09 | 2006-02-09 | Yang Jenny J | Analyte sensors |
JP2008067613A (ja) | 2006-09-12 | 2008-03-27 | Nagoya Institute Of Technology | 金属イオン応答性蛍光発色タンパク質 |
JP2008104461A (ja) | 2006-09-29 | 2008-05-08 | Yuko Kato | 超長波長の蛍光色を含むマルチカラー蛍光タンパク質 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
加藤祐子 ほか,多色発光機能をもつ赤色蛍光タンパク質Akane familiesの蛍光特性,日本分析化学会第68年会講演要旨集,2019年08月28日,p.104 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2021162549A (ja) | 2021-10-11 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Hirayama et al. | Chemical tools for detecting Fe ions | |
Saito et al. | Peroxynitrite generation and tyrosine nitration in defense responses in tobacco BY-2 cells | |
Kolemen et al. | Reaction-based BODIPY probes for selective bio-imaging | |
Chen et al. | A thiol-specific fluorescent probe and its application for bioimaging | |
Singh et al. | “Turn-on” Pb 2+ sensing and rapid detection of biothiols in aqueous medium and real samples | |
Zhang et al. | A ruthenium (II) complex–cyanine energy transfer scaffold based luminescence probe for ratiometric detection and imaging of mitochondrial peroxynitrite | |
CN105669708B (zh) | 一种基于香豆素席夫碱铜离子配合物硫醇荧光探针及其制备方法和应用 | |
US10620215B2 (en) | Real-time imaging sensor for measuring cellular thiol level | |
Li et al. | A cyanine dye-based fluorescent probe as indicator of copper clock reaction for tracing Cu2+-catalyzed oxidation of cysteine | |
Zhou et al. | A fast, highly selective and sensitive dansyl-based fluorescent sensor for copper (II) ions and its imaging application in living cells | |
CN106370638A (zh) | 用于Hg2+检测的比色、荧光双信号生物传感器及检测方法 | |
Akter et al. | Measuring ROS and redox markers in plant cells | |
Chen et al. | Detection of Ag+ ions and cysteine based on chelation actions between Ag+ ions and guanine bases | |
CN109142301A (zh) | 一种检测溶液中次氯酸钠的方法 | |
Qiao et al. | Long wavelength emission fluorescent probe for highly selective detection of cysteine in living cells | |
JP7460129B2 (ja) | 多色蛍光タンパク質を含む金属検出用試薬および被検液の金属検出方法、ならびに組み換えベクター、金属挙動の評価方法 | |
Li et al. | A novel colorimetric and “turn-on” fluorescent sensor for selective detection of Cu2+ | |
Lopez et al. | Probing metal-dependent G-quadruplexes using the intrinsic fluorescence of DNA | |
Mahapatra et al. | A new selective turn-on fluorogenic dipodal-cobalt (II) ensemble probe for nitrite ion detection and live cell imaging | |
KR20170118597A (ko) | 시스테인 검출용 이광자 형광 프로브 화합물 | |
CN106518800A (zh) | 一种基于氢离子激活的双响应检测ClO‑/H2S荧光分子探针的制备方法及应用 | |
Peng et al. | A fluorescein-based fluorescent probe for fast detection of malondialdehyde and its imaging study | |
Veitch et al. | Solution characterisation by NMR spectroscopy of two horseradish peroxidase isoenzyme C mutants with alanine replacing either Phe142 or Phe143 | |
Tong et al. | Comprehensive study of the adsorption of an acylhydrazone derivative by serum albumin: unclassical static quenching | |
Le Clainche et al. | Engineering new metal specificity in EF-hand peptides |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20230331 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20231117 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20231128 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20240123 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20240305 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20240313 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7460129 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |