JP7457558B2 - 抗体の挿入可能な可変フラグメントおよびnkg2dリガンドの改変α1-α2ドメイン - Google Patents
抗体の挿入可能な可変フラグメントおよびnkg2dリガンドの改変α1-α2ドメイン Download PDFInfo
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Description
実施例1(iFv).具体例として、我々は、以下の順:(親ペプチドとして)ヒトMICAのα3ドメインの第182アミノ酸~第194アミノ酸(α3ドメインのループ1の始まり)、スペーサーなしまたはGGSアミノ酸スペーサー領域(SR)、線維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR3)結合抗体の構造に基づくiFvペプチド(MAbR3; Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C, and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229)、スペーサーなしまたは別のGGSスペーサー領域、第196アミノ酸で始まるα3ドメインのループ1の遠位部、でコードし、かつ、可溶性MICA分子の第276アミノ酸までのα3ドメインの残りのカルボキシ末端部分を含む、1126bpおよび1144bpのDNA断片を合成した(それぞれ配列番号1および2)。次に、それぞれの合成の、二本鎖DNAポリヌクレオチドはMICAのα3ドメインのループ1内に挿入されたiFvの形態で6つのCDRを含むポリペプチドをコードした。
ULBP-1からULBP-6で示されるヒトタンパク質は、MICAやMICBのように、天然の、ストレス誘発性であって、その上にNKG2D受容体を結合し、そして、ヒトNK細胞および特定のT細胞を活性化する細胞表面リガンドである(15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi.T0.1034/j.l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652)。加えて、牛痘ウイルスタンパク質OMCPは、MICタンパク質のα1-α2ドメインのようにNKG2Dに結合する分泌ドメインである。OMCPはNKG2Dに対して非常に高い親和性を示し、NKG2Dがその感染宿主細胞においてウイルスによって誘発される天然ストレスリガンドを認識するのを妨げるほどである(Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol. 2013 January; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI.01948-12)。ULBPおよびOMCPは標準的α1-α2ドメイン構造を共有するNKG2Dリガンド(NKG2DL)であると考えられるが、MICAα1-α2との配列相同性は27%未満であるので、それらは皆、標的化ドメインをつなぎ留めるα3ドメインを天然には欠いている。我々は、その中に標的化iFvが挿入されたMICAの改変α3ドメインの、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP-6およびOMCPのそれぞれとの融合の結果として、FGFR3発現細胞を特異的に標的とし、殺滅した異種ポリペプチドを付加することによって、一連の非天然ULBおよびOMCPタンパク質を構築した。加えて、我々は、MICAのα1-α2ドメインを改変して、NKG2Dに対するα1-α2ドメインの親和性を高め、次に、ポリペプチドなどの異種分子に改変α1-α2ドメインを付加した。改変α3-iFvドメインに付加したULBPおよびOMCPα1-α2ドメインから成るタンパク質を作製するために、我々は、ULBP-1、ULBP-2、ULBP-3、ULBP-4、ULBP-6、およびOMCP(それぞれ配列番号15~20)の異なるα1-α2ドメインをコードしたDNA断片(配列番号9~14)の入ったバキュロウイルス発現ベクターを作り出した。DNA断片を、PCRによって増幅し、BlpIおよびNcoI制限酵素を使用して消化し、バキュロウイルス発現ベクター、KLM44内に個別にサブクローニングし、そして、MICAα1-α2ドメインを置換した。KLM44は、その中にMICA-α3-iFv.2があらかじめクローニングされた、SW403由来のバキュロウイルス発現ベクターである。α3-iFv.2(ULBPl-α3-iFv.2、ULBP2-α3-iFv.2、ULBP3-α3-iFv.2、ULBP4-α3-iFv.2、ULBP6-α3-iFv.2、およびOMCP-α3-iFv.2;それぞれ配列番号21~26)に融合したULBPおよびOMCPα1-α2ドメインを含む新しいNKG2DL-α3-iFv.2構築物を、バキュロウイルスDNAと共にSF9昆虫細胞内に形質移入した。バキュロウイルスを、2増幅サイクルにわたり培養し、そして、製造業者のプロトコール(Invitrogen)に従って、T.ni昆虫細胞におけるHisタグ付与NKG2DL-α3-iFv.2タンパク質の発現に使用した。発現を、100mLの体積中で3日間実施し、そして、Ni親和性クロマトグラフィーを使用した分泌可溶性タンパク質の精製のために、成長培地を採集した。正しい分子量の単量体タンパク質を、SDS-PAGEによてt決定した場合に>90%の純度まで精製した。機能の特徴づけを、結合ELISAおよび試験管内における標的細胞殺滅アッセイを使用して実施した。
これらは、ヒトNKG2D受容体へのそれらの結合親和性を有意に高めるために改変したNKG2DLへのポリペプチドの付加に関する実施例である。MICタンパク質のα1-α2ドメインは、NKG2D受容体に対するNKG2DLである。この親和性は、NK細胞の生理的活性化に十分であり、「標的細胞」の二次元的血漿細胞膜表面に不可逆的につなぎ留められた天然の完全長MICタンパク質を発現する細胞の溶解を刺激する(Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 1999 Jul 30;285(5428):727-9.)。しかしながら、本発明の遺伝子操作した可溶性MICタンパク質が標的細胞表面の標的抗原に可逆的に特異的に結合するので、NKG2Dに対する遺伝子操作した可溶性MICタンパク質の結合親和性は、NK細胞と標的抗原を発現する細胞との間で形成された可溶性MIC依存性複合体の安定性に直接影響する。特に、sMICAとNKG2Dとの間の親和性が、NKG2Dから改変したsMICAの実質的に遅い分離速度または解離速度によって増強されている場合、NK細胞ベースの殺滅は、標的細胞に結合した可溶性MIC分子の密度が低いほどより優れていると予想される。本発明以前には、可溶性MICタンパク質の殺滅活性を有意に変更するか、またはNKG2Dに対するMICタンパク質の親和性を高めるために結合の解離速度を低減するどんなα1-α2突然変異も同定されていなかった。コンピューター設計の取り組みは、組み合わせた状態で、野生型MICAのα1-α2ドメインの3つの突然変異:N69W、K152E、およびK154D(WED-MICA)が、非結合MICAの安定性に影響することによってNKG2D結合親和性に適度に影響し、その結果、会合速度またはNKG2Dへの結合の結合速度に適度に影響すること(Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ.J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8);公開された構造作図に従った、理論的にNKG2Dに接触するMICAの22個のアミノ酸位置の繰り返し計算により同じ群を走査することによるその後の大規模なコンピューター設計は(Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. 2001 May;2(5):443-451)、より以前に設計された3種類の変更と組み合わせたとき、MICAの更なる合理的で、繰り返しのコンピューター設計が、NKG2Dに対するその親和性を弱いもの(Kd~2.5μΜ)から合計で7つの組み合わせられ突然変異を有する中程度にしっかりしたもの(Kd=51nM)へと質的に変化させたことを実験的に示した(Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21:1396-1402)。対照的に、本発明に記載した実験的なアプローチは、MICAのα1-α2ドメインとNKG2Dとの間の解離速度を遅くしたMICAのアミノ酸修飾を実験的に選択し、Lengyelら(Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem. 2007 Oct 19;282(42):30658-66. Epub 2007 Aug 8)の3つのWED変更によって安定化させたMICAを用いて開始した。
本発明のこの実施形態は、実施例3に記載したとおり、可溶性MIC分子のα1-α2ドメイン内の選択したアミノ酸位置における特異的突然変異を操作することによって得られた追加のNKG2DL親和性変異型α1-α2ドメインに関し(表1)、そしてそれはまた、解離速度の結合速度論にも影響を及ぼし、その結果、非天然α1-αのNK細胞媒介性殺滅活性が変化する。変異型15~18が、S20、G68、K125、およびH161位に見出された特異的突然変異に注目する一方で、別の変異型セットを、E152、H158、およびQ166位における追加の変異を用いて単離した(表4)。
この実施形態は、ULBPタンパク質のα1-α2ドメインを遺伝子操作することによって得られた追加のα1-α2NKG2DL親和性変異型に関する。ULBPタンパク質はα1-α2ドメインを含み、そしてそれは、NKG2D受容体に結合することができるNKG2Dリガンドである(Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.l399-0039.2003.00070.x.PMID 12753652)。NKG2D結合のこの親和性は、NK細胞の生理的活性化に十分であり、「標的細胞」の二次元的血漿細胞膜表面に不可逆的につなぎ留められた天然の、天然完全長ULBPタンパク質を発現する細胞の溶解を刺激する(Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.l399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652)。しかしながら、異種ポリペプチドと融合した遺伝子操作した可溶性α1-α2ドメインが、本発明の特定の実施形態において、標的細胞表面の標的抗原に可逆的に特異的に結合するので、遺伝子操作した可溶性MICタンパク質によって既に示したように(実施例2~4)、NKG2Dに対する遺伝子操作したULBPα1-α2ドメインの結合親和性は、NK細胞と標的抗原を発現する細胞との間で形成された人工シナプスの安定性に直接影響する。NKG2Dリガンドとしての遺伝子操作した非天然α1-α2ドメインのレパートリーを多様化させるために、ULBPタンパク質を、それらのNKG2D結合親和性についてファージディスプレイベースの遺伝子操作のための基質または出発点として使用した。ULBPとMICAとの間で観察された構造上の相同性にもかかわらず(Radaev, S., Rostra, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC- like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.)、MICAに対するULBPα1-α2ドメインに関して、配列相同性は<50%であった(図18)。これにより、我々は、NKG2D結合親和性を改善するULBPα1-α2ドメイン内のコドン位置の同一性を求めた。
システインからセリンへの突然変異を、ULBP2中のC103S(配列番号16)およびULBP3中のC8S(配列番号17)で実施した。これらのα1-α2ドメインをコードし、および選択されたアミノ酸位置のそれぞれにNNK変異原性コドンを入れるための合成DNAライブラリを合成し、Ml3ファージのpIIIマイナーコートタンパク質との融合物として個別にクローニングし、そして、α1-α2ULBP2またはULBP3変異型を提示する突然変異誘発ファージ粒子を、標準的な方法論に従ってSS320 E.コリ(E. coli)細胞に産生させた(Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C, and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011)。α1-α2ファージディスプレイライブラリーを、標的タンパク質としてヒトNKG2D-Fcを使用してNKG2Dに対する高い結合親和性に関して選別し、そして、遅い分解または解離速度について高められた高親和性変異型を選択するために、意図的に長い結合、延長された洗浄、そして、ファージクローンの溶解の繰り返しラウンドを反復した。ULBP2に関して、特定のアミノ酸突然変異が、α1-α2内のR80、V151、V152、およびA153位において高頻度で見られたので、高いNKG2D結合親和性を有する好ましいアミノ酸置換と見なした(図19Aおよび表6)。
これらは、ヒトNKG2D受容体へのそれらの結合親和性を有意に高めるために改変したNKG2DLへの抗体ポリペプチドの付加に関する実施例である。MICタンパク質のα1-α2ドメインは、NKG2D受容体に対するNKG2DLである。抗体は、2本の大きい重鎖および2本の小さい軽鎖からできた非常に安定した糖タンパク質である(図1)。可変ドメインのCDR領域内で作り出すことができる多くの多様性は、特異的抗体が特異的抗原標的に対して産生されることを可能にする(Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.)。抗体は、医薬品開発のための重要な治療薬プラットフォームになり、標的の結合および中和の両方を媒介でき、ならびに補体およびFc受容体結合を通じて免疫系を調節できる(Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology 5, 520.)。本発明以前に、NKG2D受容体に対して天然NKG2DLより厳密に結合する非天然α1-α2ドメインを使用して免疫細胞を直接活性化するIgG抗体形式は存在しなかった。先行研究は、マウスNKG2DリガンドであるRaelβが、マウスにおける抗腫瘍薬として使用するために抗Her2抗体と融合できることが実証した(Cho, HM., Rosenblatt, JD., Tolba, K., Shin, SJ., Shin, D., Calfa, C, Zhang, Y., Shin, SU. (2010) Delivery of NKG2D ligand using and anti-Her2 antibody-NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptive antitumor response. Cancer Research 70, 10121- 30.)。しかしながら、マウスNKG2DリガンドはヒトNKG2Dに結合しないので、ヒトおよびマウスNKG2Dに対して高親和性を有する天然ヒトNKG2Dリガンドは存在しない。本発明の遺伝子操作したα1-α2NKG2DリガンドとIgG抗体の重鎖または軽鎖との間の融合(図20AおよびB)は、これらの限界を克服し、そして、改変α1-α2ドメインの異種タンパク質またはペプチドとの融合物の多用途性を際立たせた。
高い親和性でNKG2Dに結合するα1-α2ドメイン変異型を含む融合物タンパク質は、生体内においてNK細胞と結合する。これにより、改変したα1-α2融合物を含む抗原特異的抗体は、NKG2Dに強く結合し、その結果、特定の抗原を発現する標的細胞を捜し出すために、生体内において抗体を用いてNK細胞表面を効果的に作動状態にする。この活性は、遺伝子操作したCAR細胞と同様であったが(Gill, S., and June, CH. (2015) Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol Rev 263, 68-89.)、しかし、NKG2D発現細胞型の遺伝的修飾を必要としなかった。
改変したα1-α2と融合した抗原特異的抗体について抗標的細胞活性を有する可能性を調べるために、変異型25のα1-α2と抗PDL1抗体重鎖との融合を、同種同系MC38腫瘍モデルで評価した。MC38腫瘍を、C57BL/6マウスの皮下に移植し、そして、腫瘍を平均100mm3まで増殖させた後に処置した。処置開始時に、1群あたり10匹のマウスから成る4つのコホートを、ビヒクル、抗CTLA4(100μg i.p.)、親抗PDL1(300μg i.v.)、または抗PDL1 HC_25融合物(300μg i.v.)で1、4、および7日目に処置した。図25では、腫瘍増殖曲線は、抗PDL1 HC_25が処置の最初の2週間以内に最も効果的な抗腫瘍活性を媒介したことを示した。腫瘍増殖阻害は、処置開始後から最初の12日間にわたって確立した抗CTLA4処置および親抗PDL1抗体よりも有意に良好であった。16日目までに、抗PDL1 HC25処置は、トラスツズマブ融合物に関して観察したADA応答の出現と一致して(実施例7)、有効性を失い始めた。有意な抗腫瘍活性は、親抗体および標準的な抗CTLA4処置の両方と比較して変異型25との抗体重鎖融合物で観察され、高親和性NKG2Dリガンドとしての役目を果たした改変α1-α2ドメインとの抗体融合物の印象的な治療効果を実証した。
Claims (16)
- 抗体の可変フラグメント(Fv)を備えた、特異的な抗原結合特性を示す挿入可能なFvポリペプチド(iFv)であって、ここで、Fvの特異的抗原結合ドメインが、軽鎖(VL)由来の1の可変ドメイン及び重鎖(VH)由来の1の可変ドメインを含み、その各々は3個の相補性決定領域(CDR)を有し、ここで、それぞれC末端およびN末端を有し;そしてここで、前記VLおよびVHドメインが、VLドメインの標準的な末端の両方をVHドメインの標準的な末端の両方に接続する2つのリンカー領域によって連結され、そしてここで前記VL又は前記VHドメインのいずれか内の非天然の切断部位により、非天然のN末端とC末端の対が、それぞれVL又はVHドメインのいずれかの中に作り出されて、そしてここで前記非天然の切断部位が、CDRの成分ではないベータ鎖間のループの先端又は湾曲部、又はそれらの付近に存在するiFv。
- 非天然のN末端とC末端の対が、受容分子内への結合または挿入のための付加部位を提供する、請求項1に記載のiFv。
- 非天然のN末端とC末端が、互いに空間的に近位に配置される、請求項2に記載のiFv。
- 1つもしくは複数の溶媒に晒されたループを含む受容ポリペプチドを含む融合ポリペプチドであって、請求項2に記載のiFvが該溶媒に晒されたループの1つもしくは複数の中に挿入される、前記融合ポリペプチド。
- VLまたはVHドメイン内の非天然N末端とC末端が互いに空間的に近位に配置される、請求項4に記載の融合ポリペプチド。
- VLドメインのC末端がVHドメインのN末端に接続され、かつ、VLドメインのN末端がVHドメインのC末端に接続されるか;または、VLドメインのN末端がVHドメインのC末端に接続され、かつ、VLドメインのC末端がVHドメインのN末端に接続される、請求項1に記載のiFv。
- 非天然のN末端とC末端の間の距離が、約0.2~約2.0nmである、請求項5に記載の融合ポリペプチド。
- 前記末端間の距離が、約0.5nm~約1.5nmである、請求項7に記載の融合ポリペプチド。
- 前記2つのリンカー領域が、約10~25個のアミノ酸から成る同一または非同一のペプチドを含む、請求項1に記載のiFv。
- 前記受容ポリペプチドまたはタンパク質が、抗体、Ig折り畳み、Igドメイン、グロブリン、アルブミン、フィブロネクチン、フィブロネクチンドメイン、インテグリン、蛍光タンパク質、酵素、外膜タンパク質、受容体タンパク質、T細胞受容体、キメラ抗原受容体、ウイルス抗原、ウイルスカプシド、細胞受容体についてのウイルス性リガンド、高分子量バクテリオシン、ヒストン、ホルモン、ノッティン、環状ペプチド、ULBタンパク質、レクチン、又はレクチンのリガンドである、請求項5に記載の融合ポリペプチド。
- 前記iFvが非タンパク質分子に挿入可能である、請求項1に記載のiFv。
- 前記非タンパク質分子が、多糖、デンドリマー、ポリグリコール、ペプチドグリカン、化学療法薬、毒素、フルオロフォア、クロモフォア、ファルマコホア、抗生物質またはポリケチドである、請求項11に記載のiFv。
- 前記非タンパク質分子が、前記非天然N末端および非天然C末端の両方に結合される、請求項11に記載のiFv。
- 受容ポリペプチドの溶媒に晒された1つもしくは複数のループのすべてまたはそのうちの一部がiFvに置換される、請求項5に記載の融合タンパク質。
- 請求項4、5、7、8、10及び14のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドと、医薬として許容される担体とを含む、医薬組成物。
- 請求項4、5、7、8、10及び14のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含む、悪性腫瘍又はウイルス感染を治療するための医薬組成物。
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