JP7449862B2 - エオシン染色技術 - Google Patents
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Description
本出願は、ここで参照したことによりその開示全体が本明細書に組み込まれる2017年12月24日に出願された米国仮特許出願第62/610,211号の出願日の利益を主張するものである。
多くの組織はプロセシング後その成分を明視野顕微鏡下で目に見えるようにするのに十分な色を保持しない。したがって、組織を染色することにより色または染料を組織に加えることが一般的な方法である。ヘマトキシリンおよびエオシン(「H&E」)染色がおそらく最も広く使用されている組織学的染色である。その人気は、そのかなりの簡単さおよび膨大な数の異なる組織構造を明確に示す能力に基づいている。ヘマトキシリンは多くの方法で調製することができ、いろいろな部位に由来する組織に対して広範囲に及ぶ適用可能性を有する。本質的に、ヘマトキシリン成分は良好な核内の細部と共に細胞核を青色/黒色に染色し、一方エオシンは細胞質およびほとんどの結合組織繊維を様々な色調および強度のピンク、オレンジおよび赤色に染色する。
明らかに反対に示されない限り、本明細書で特許請求されている1つより多くの工程または行為を含むあらゆる方法において、方法の工程または行為の順序はその方法の工程または行為が列挙されている順序に必ずしも限られないことも理解される。
本開示は、生物学的試料を一次染色剤(例えば、ヘマトキシリン)および対比染色剤(例えば、エオシン)で染色する方法、特に、対比染色剤を用いて染色を増強する方法に関する。いくつかの実施形態において、方法は自動検体処理装置を利用する。出願人は、予想外のことに、ある種の流体を基材に導入または分配する配列、すなわち順序、タイミング等を変更することにより、標準的な染色プロトコールと比較して染色強度および一貫性を増強することができるということを発見した。
洗浄液分配を2つの移送溶液分配と置き換える-ダイヤル設定可能性の決定
コントロール構成の機器で、および表1に示されている代わりのプロトコールで染色実験を行った。また、洗浄液分配工程を2つの移送溶液工程と置き換えて全部で4つの移送溶液工程とした「緩和」技術(図3)を用いて染色実験を行った。試験構成はスクリプト変更により達成される。以下の染色実験を行い、次いで各々の構成で比較した。
表1:染色プロトコール実験、ここで整数1~10は特定の流体が検体と接触したままである相対持続時間を表し、より小さい整数がより短い時間を示し、より大きい整数がより長い持続時間を示す
-3:コントロールより著しく弱い試験スライドの[属性]
-2:コントロールより実質的に弱い試験スライドの[属性]
-1:コントロールより少し弱い試験スライドの[属性]
0:コントロールとほぼ等しい試験スライドの[属性]
1:コントロールより少し強い試験スライドの[属性]
2:コントロールより実質的に強い試験スライドの[属性]
3:コントロールより著しく強い試験スライドの[属性]
ここで、「少し」=繰返しの検査によってのみ気付く差;「実質的に」=最初の検査で気付く差、および「著しく」=差は最初の検査で明らかである(すなわち、顕微鏡なしで気付く差)。
表2:実験中利用した消耗材料、ここですべての材料はVentana Medical Systems, Tucson, AZ, USAから入手可能である。
明るいエオシンは洗浄識別を2つの移送溶液分配と置き換える:診断明瞭さ
この研究は、実施例に記載されている緩和手法が組織を診断する能力において何らかの意図されない結果を引き起こしたかどうかを決定するために開発された。試料は実施例1と同一の手順に従って調製した。
ムチンのダイヤル設定可能性
このムチン染色研究はムチン染色を除去するHE600の能力に対する染色プロトコール緩和の影響を決定するために導出された。ムチン染色に関するいくつかの結腸事例をスクリーニングした後、我々は4つの事例を選択し、全部で100のスライドに様々なヘマトキシリン溶液、酸溶液、およびエオシン溶液設定(HAE設定)(実施例1参照)で高Aおよび低Aスライドを対にしてムチン染色がダイヤル設定であるかどうか見るためにHおよびEを調和させて染色した(表4参照)。
表4:ムチン研究に使用したプロトコールおよび緩和
緩和対基準染色剤の非劣性
図3に示した両方の緩和は使用した組織全体にわたって全般的な非劣性を立証しており、両方の緩和#1および緩和#2が使用した組織に関して診断明瞭さ、エオシン染色一貫性、および優先度スコアを現行の基準染色剤より改良している(ここですべてのスコアは緩和スライドと現行の染色基準スライドとの比較に基づく)。平均が(95%の信頼区間により)あらゆる測定でゼロとかなり異なっていた図9Aに見られるように、緩和#1と緩和#2の両方が基準染色剤より有意な改良を示した。緩和#1は一貫性(p<.001、2つの試料t-検定Minitab)および全体の優先度(p=.009、2つの試料t-検定Minitab)において緩和#2より大きな改良を示し、診断明瞭さは緩和#2と緩和#1で類似の結果(p<.058、識別試験、2つの試料t-検定Minitab)を示した。加えて、-2または-3のスコアを落第と考えるならば、両方の緩和の100%が診断明瞭さに合格し、両方の緩和の<1%が全体優先度に落第であり、緩和#2の1.25%および緩和#1の<.5%がエオシン一貫性に落第であった。
再現性
この研究で4つの型の再現性を検討した:新しい染色プロセス内の再現性(緩和#1-緩和#1、緩和#2-緩和#2、および新しいスクリプト基準-新しいスクリプト基準)ならびに新しいスクリプト基準(NSN)と古いスクリプト基準(OSN)との間の再現性。これは、新しい染色プロセスが現行の基準染色プロセス(OSN)と同じように再現性があること、ならびにNSNおよびOSN染色が同じであることを確保するためであった。緩和#1および緩和#2は図3に示されている。
表5:再現性一致率、限界、およびカウント
いくつかの実施形態において、染色システムは本明細書に記載されているものに加えて構成要素を含む。本システムおよび方法に組み込まれ得る追加の実施形態、特徴、システム、デバイス、材料、方法、および技術は、開示内容が全体としてここで参照したことにより本明細書に組み込まれる米国特許第8,911,815号;同第9,498,791号;同第9,618,430号;同第7,468,161号;および同第6,352,861号に記載されている。染色システムのさらに追加の構成要素が、開示内容が全体としてここで参照したことにより組み込まれる米国特許第7,303,725号、同第8,048,373号、同第9,528,918号、および同第9,192,935号に記載されている。
Claims (13)
- 基材上に配置された検体を自動検体処理装置で染色する方法であって、方法が、
(a)所定量のヘマトキシリン溶液を検体に分配すること;
(b)ヘマトキシリン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(c)所定量のアルカリ性溶液を検体に分配すること;
(d)アルカリ性溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(e)所定量の少なくとも1つの追加の溶液を検体に分配すること;
(f)少なくとも1つの追加の溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(g)所定量のエオシン染色溶液を検体に分配すること;
(h)エオシン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(i)所定量の酸溶液を検体に分配すること;
(j)酸溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;および
(k)追加の溶液を検体に分配すること、を含み、ここで、酸溶液はヘマトキシリン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体からの少なくとも部分的な除去との間に分配されず、少なくとも1つの追加の溶液が、洗浄溶液または移送溶液からなる群から選択される、方法。 - 少なくとも1つの追加の溶液が洗浄溶液である、請求項1に記載の方法。
- 少なくとも1つの追加の溶液が移送溶液である、請求項1または2に記載の方法。
- 少なくとも1つの追加の溶液を検体に分配することが、(i)洗浄溶液を分配すること;および(ii)洗浄溶液を少なくとも部分的に除去することを含む、請求項3に記載の方法。
- 検体からのヘマトキシリン溶液の少なくとも部分的な除去の後で且つアルカリ性溶液の分配前に洗浄溶液を分配することをさらに含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- アルカリ性溶液の分配前に洗浄溶液を検体に分配することをさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の方法に従って染色された生物学的試料。
- 1以上のプロセッサー;および
1以上のプロセッサーにより実行されたとき、自動組織学的染色システムに:
(a)所定量のヘマトキシリン溶液を検体に分配させ;
(b)ヘマトキシリン溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(c)所定量のアルカリ性溶液を検体に分配させ;
(d)アルカリ性溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(e)所定量の少なくとも1つの追加の溶液を検体に分配させ;
(f)少なくとも1つの追加の溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(g)所定量のエオシン染色溶液を検体に分配させ;
(h)エオシン溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(i)所定量の酸溶液を検体に分配させ;
(j)酸溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;および
(k)追加の溶液を検体に分配させる;ここで、酸溶液はヘマトキシリン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体からの少なくとも部分的な除去との間に分配させず、少なくとも1つの追加の溶液を、洗浄溶液または移送溶液からなる群から選択させる、
命令を格納する、非一過性コンピューター可読メモリー
を含む、システム。 - システムが、エオシン染色前に酸溶液を分配させない命令を含む、請求項8に記載のシステム。
- 計算システムの処理リソースにより実行されたとき、自動組織学的染色システムに:
(a)所定量のヘマトキシリン溶液を検体に分配させ;
(b)ヘマトキシリン溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(c)所定量のアルカリ性溶液を検体に分配させ;
(d)アルカリ性溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(e)所定量の少なくとも1つの追加の溶液を検体に分配させ;
(f)少なくとも1つの追加の溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(g)所定量のエオシン染色溶液を検体に分配させ;
(h)エオシン溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;
(i)所定量の酸溶液を検体に分配させ;
(j)酸溶液を検体から少なくとも部分的に除去させ;および
(k)追加の溶液を検体に分配させる;ここで、酸溶液はヘマトキシリン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体からの少なくとも部分的な除去との間に分配させず、少なくとも1つの追加の溶液を、洗浄溶液または移送溶液からなる群から選択させる、
命令によりエンコードされた非一過性コンピューター可読記憶媒体。 - (a)所定量のヘマトキシリン溶液を検体に適用すること;
(b)ヘマトキシリン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(c)所定量のエオシン溶液を検体に適用すること;
(d)エオシン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;
(e)所定量の酸溶液を検体に適用すること;
(f)酸溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;および
(g)追加の溶液を検体に適用すること
からなり、酸溶液はヘマトキシリン溶液の検体への適用とエオシン溶液の検体への適用とエオシン溶液の検体からの少なくとも部分的な除去との間に適用されず、少なくとも1つの追加の溶液が、洗浄溶液または移送溶液からなる群から選択される、検体を染色する方法。 - 適用する工程を各々手動で行う、請求項11に記載の方法。
- 生物学的組織試料を担持する複数のスライドを処理する自動化方法であって、
1以上のワークステーション内の複数のスライド上でスライド処理操作のセットを行い、一方複数のスライドをスライドトレイ内で空間的に同一平面内の実質的に水平の位置に保持すること、ここでスライド処理操作のセットは、1以上の染色剤を少なくとも1つの試薬容器から流体モジュールを介してスライドトレイ上方に位置する少なくとも1つの分配ノズルから外へ流し、溶媒交換することにより、空間的に同一平面内の実質的に水平の位置のスライド上で試料を染色することを含む;
少なくとも染色および溶媒交換を含むスライド処理操作のセットを行った後、複数のスライドを保持するスライドトレイを自動カバースリッパーワークステーションに輸送すること;
自動カバースリッパーワークステーションを用いて、スライド上のカバースリップが互いに離隔するように、複数のスライドをスライドトレイ内で空間的に同一平面内の実質的に水平の位置に保持したまま、スライドトレイ内に保持された複数のスライドを別々のそれぞれのカバースリップで被覆すること;
カバースリップで覆われたスライドを保持するスライドトレイを自動カバースリッパーワークステーションから取り出すこと
を含み;
スライド処理操作が、所定量のヘマトキシリン溶液を検体に分配すること;ヘマトキシリン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;所定量のアルカリ性溶液を検体に分配すること;アルカリ性溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;所定量の少なくとも1つの追加の溶液を検体に分配すること;少なくとも1つの追加の溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;所定量のエオシン染色溶液を検体に分配すること;エオシン溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;所定量の酸溶液を検体に分配すること;酸溶液を検体から少なくとも部分的に除去すること;および追加の溶液を検体に分配すること、を含み、ここで、酸溶液はヘマトキシリン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体への分配とエオシン溶液の検体からの少なくとも部分的な除去との間に分配されず、少なくとも1つの追加の溶液が、洗浄溶液または移送溶液からなる群から選択される、方法。
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