CN111492224A - 伊红染色技术 - Google Patents

Abstract

本文提供了改进用复染剂染色的一致性的方法。在一些实施方案中，所述方法使用自动标本加工装置或其他染色设备。在一些实施方案中，所述染色方法手动应用。在一些实施方案中，所述复染剂包括伊红。

Description

伊红染色技术

与相关申请的交叉引用

本申请要求2017年12月24日提交的美国临时专利申请No. 62/610,211的申请日的利益，其公开内容特此整体引入本文作为参考。

公开内容的背景

许多组织不在加工后保留足够的颜色以使它们的组分在明视场显微镜下可见。因此，通常的做法是通过对组织进行染色来向其添加颜色或染料。苏木精和伊红（“H＆E”）染色剂可能是使用最广泛的组织学染色剂。它的流行是基于其比较简单和清楚地显示大量不同组织结构的能力。苏木精可以以多种方式制备，并且对来自不同部位的组织具有广泛的适用性。本质上，苏木精组分将细胞核染色成蓝色/黑色，同时具有良好的核内细节，而伊红则以各不相同的色调和强度的粉红色、橙色和红色将细胞质和大多数***纤维染色。

准确的诊断取决于病理学家或细胞学家检查染色的显微镜载玻片，通常是H＆E石蜡切片，H＆E染色已通过自动染色机大量进行。对一致性的需要对避免困难的组织学解释极端重要。通常，自动染色机允许通过调整每个步骤的时间来进行准确和一致的染色、分色（differentiation）和脱水。

某些标准程序通常适用于载玻片上组织的染色。石蜡切片首先必须被脱蜡，这是因为大多数染色剂是在水溶液或醇溶液中应用的，并且将不透入石蜡浸润的组织。在载玻片被脱蜡之后，一般将载玻片在烘箱或其他加热的室中烘烤以驱除脱蜡溶剂，并将组织黏附到载玻片上。然后可以使用例如标准染色剂如苏木精和伊红对组织染色。最后，通过将薄的玻璃盖玻片黏附到染色的组织切片上并然后用封固剂将其密封来进行盖片，从而产生适合于归档的气密环境。

公开内容概述

申请人已经开发了使用自动标本加工装置来改进用复染剂染色的一致性的***和方法。申请人认为，本文所述的***和方法允许在组织的边缘上和/或在组织的脂肪部分内改善的复染。实际上，申请人已意想不到地发现，移动和/或改变某些自动流体分配步骤允许组织内染色剂改善的一致性、改善的复染剂强度以及样品与样品之间的染色一致性和/或强度的再现性。改进的复染技术允许减少在伊红染色剂自动应用的情况下有时发现的不一致性。

鉴于前述内容，本公开内容的一个方面是用自动标本加工装置对布置在基底上的标本进行染色的方法，其中自动染色装置被进行配置以用初级染色剂和复染剂对标本进行染色，以及其中所述自动染色装置被进行配置以：（i）紧接在用复染剂染色之后向标本应用酸性溶液，并且其中在用初级染色剂和复染剂染色之间没有将酸性溶液应用于标本；（ii）在初级染色和复染之间向标本应用酸性溶液，并还紧接在复染之后向标本应用酸性溶液；或（iii）紧接在复染之后但在应用有机流体溶液或添加盖玻片之前应用两等分部分或更少等分部分的洗涤溶液，并且还在复染与应用有机流体溶液或盖玻片之间应用至少两等分部分的转移溶液。在一些实施方案中，转移溶液是对染色或复染具有中性作用的任何溶液。在其中转移溶液在其对染色剂的完全中性作用的方面使用的这些非限制性实施方案中，其被完全用于至少部分地从载玻片除去剩余的染色剂溶液，不是用于对染色剂进行分色，或不是用于将染色剂分色到任何可辨别的程度。在这些情况中，由于由转移溶液引起的最小限度的分色，所以已使得染色剂变得完全进行性（progressive）。

本公开内容的另一方面是用于在自动染色***内加工标本的方法，所述方法包括：使所述标本与染色试剂接触；使所述标本与洗涤溶液接触以至少部分地从所述标本除去染色试剂；在使所述标本与洗涤溶液接触后，使所述标本与复染试剂接触；以及使所述标本与酸性溶液接触；其中在所述标本与复染剂接触之前所述标本不与酸性溶液接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述标本与染色试剂接触之后但在使所述标本与复染试剂接触之前使所述标本与碱性溶液接触。

本公开内容的另一方面是用于在自动染色***内加工标本的方法，所述方法包括：使所述标本与染色试剂接触；使所述标本与洗涤溶液接触以至少部分地从所述标本除去染色试剂；在使所述标本与洗涤溶液接触后，使所述标本与复染试剂接触；以及反复使所述标本与转移溶液接触；其中在所述标本与复染剂接触之后所述标本不与洗涤溶液接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在使所述标本与染色试剂接触之后但在使所述标本与复染试剂接触之前使所述标本与碱性溶液接触。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，其包括：（a）将预定量的苏木精溶液分配至所述标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（f）将预定量的复染溶液分配至所述标本；（g）从所述标本至少部分地除去所述复染溶液；和（h）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，复染溶液包括伊红。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工装置对标本进行染色的方法，其包括：（a）将预定量的苏木精溶液分配至所述标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（f）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（g）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（h）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，在伊红染色之前不分配酸性溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。

在一些实施方案中，至少一种额外的溶液选自洗涤溶液、转移溶液或酸性溶液。在一些实施方案中，至少一种额外的溶液是洗涤溶液。在一些实施方案中，将至少一种额外的溶液分配至所述标本包括：（i）分配洗涤溶液；（ii）至少部分地除去洗涤溶液；（iii）分配酸性溶液；和（iv）至少部分地除去酸性溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在从所述标本至少部分地除去苏木精溶液之后并且在分配碱性溶液之前分配洗涤溶液。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括（i）在从所述标本至少部分地除去苏木精溶液之后并且在分配碱性溶液之前分配酸性溶液；（ii）从所述标本至少部分地除去所述酸性溶液；和（iii）在分配碱性溶液之前将洗涤溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工***染色的生物标本，其中所述样品通过下述进行染色：（a）将预定量的苏木精溶液分配至所述生物标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（f）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（g）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（h）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工装置对标本进行染色的方法，其基本上由下述组成：将预定量的洗涤溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述洗涤溶液；将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；将预定量的酸性溶液分配至所述标本；至少部分地除去所述酸性溶液；和将洗涤溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工装置对标本进行染色的方法，其由下述组成：将预定量的洗涤溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述洗涤溶液；将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；将预定量的酸性溶液分配至所述标本；至少部分地除去所述酸性溶液；和将洗涤溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是用自动标本加工装置对标本进行染色的方法，所述方法包括：将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。在一些实施方案中，标本是用苏木精染色的标本。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在至少四种额外的溶液中的最后一种已经被除去之后，将有机流体溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是自动组织学染色***，其包括：染色器（stainer）；染色器内的载玻片载体，其中所述载玻片载体装有具有在其上布置的生物标本的载玻片；和染色器内的分配器，其被进行配置以将许多流体递送至所述载玻片；其中所述***被进行配置以使得所述生物标本可以被初级染色剂和复染剂染色；并且其中所述***被进行配置以在用所述初级染色剂染色和用所述复染剂染色之间仅分配洗涤溶液、转移溶液和/或碱性溶液。在一些实施方案中，所述***被进行配置以在用复染剂染色后递送酸性溶液。在一些实施方案中，所述***被进行配置以在用复染剂染色后仅分配酸性溶液、转移溶液和有机流体溶液。在一些实施方案中，所述***在用复染剂染色后序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四等分部分的转移溶液。在一些实施方案中，自动组织学染色***包括用于从载玻片除去流体的装置。在一些实施方案中，所述***包括载玻片盘，其将许多载玻片固定在基本水平的位置。在一些实施方案中，公开的***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。在一些实施方案中，工作站在没有试剂（和试剂带有的污染物，例如取出的细胞）从一个载玻片到另一个载玻片的相当大转移的情况下将试剂递送到载玻片表面。在一些实施方案中，载玻片以两排固定在矩形载玻片盘中，从而使得它们的长尺寸从盘的中心长轴朝着盘的长边缘向外布置。在一些实施方案中，工作站中的分配器安置于相对排中的一对或多对载玻片之上，并将流体、试剂、溶液等递送到两排中的一排或另一排中的一个或多个载玻片，例如，递送到在两排中彼此相对的一对载玻片。在一些实施方案中，如果分配器安置于少于总数的盘中所固定的载玻片之上，则分配器可以移动以将流体、试剂、溶液等分配给每排载玻片中的其他载玻片，和/或可以移动载玻片盘以使额外的载玻片进入用于进行分配的位置。在一些实施方案中，可以在工作站中包括两个或更多个固定的或移动的试剂分配器，或者可以将一个或多个分配喷嘴的歧管例如沿着盘的中心长轴安置在两排载玻片之上。在一些实施方案中，分配器的喷嘴可将试剂向下和/或向上射向载玻片的表面。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器：（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，所述***包括在伊红染色之前不分配任何酸性溶液的指令。在一些实施方案中，所述***进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本的指令。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘，且可进一步包括容纳所述载玻片盘的工作站。在一些实施方案中，所述***包括控制器。在一些实施方案中，所述控制器包括处理器和存储器；并且进一步包括用于分配和/或除去溶液的指令。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，所述***包括在伊红染色之前不分配任何酸性溶液的指令。在一些实施方案中，所述***进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本的指令。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘，且可进一步包括容纳所述载玻片盘的工作站。在一些实施方案中，所述***包括控制器。在一些实施方案中，所述控制器包括处理器和存储器；并且进一步包括用于分配和/或除去溶液的指令。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器：（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。在一些实施方案中，所述标本包含苏木精染色剂。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。在一些实施方案中，所述***包括控制器。在一些实施方案中，所述控制器包括处理器和存储器；并且进一步包括用于分配和/或除去溶液的指令。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。在一些实施方案中，所述标本包含苏木精染色剂。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。在一些实施方案中，所述***包括控制器。在一些实施方案中，所述控制器包括处理器和存储器；并且进一步包括用于分配和/或除去溶液的指令。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器：（a）将预定量的苏木精溶液引入至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液引入至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液引入至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液引入至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液引入至所述标本。在一些实施方案中，所述***包括在伊红染色之前不引入任何酸性溶液的指令。在一些实施方案中，所述***进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液引入至所述标本的指令。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的苏木精溶液引入至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液引入至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液引入至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液引入至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液引入至所述标本。在一些实施方案中，所述***包括在伊红染色之前不引入任何酸性溶液的指令。在一些实施方案中，所述***进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液引入至所述标本的指令。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使所述一个或多个处理器：（a）将预定量的伊红染色溶液引入至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本引入并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地引入和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。在一些实施方案中，所述标本包含苏木精染色剂。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。

本公开内容的另一方面是一种***，其包括：一个或多个处理器；和存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的伊红染色溶液引入至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本引入并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地引入和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。在一些实施方案中，所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。在一些实施方案中，所述标本包含苏木精染色剂。在一些实施方案中，所述***包括将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘和容纳所述载玻片盘的工作站。

本公开内容的另一方面是一种编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令可由计算***的处理设备执行，以使所述计算***：（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是一种编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令当由计算***的处理设备执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是一种编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令可由计算***的处理设备执行，以使所述计算***：（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

本公开内容的另一方面是一种编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令当由计算***的处理设备执行时，使自动组织学染色***：（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

本公开内容的另一方面是对标本进行染色的方法，其包括：（a）使预定量的苏木精溶液与所述标本接触；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）使预定量的碱性溶液与所述标本接触；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）使预定量的至少一种额外的溶液与所述标本接触；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）使预定量的伊红染色溶液与所述标本接触；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）使预定量的酸性溶液与所述标本接触。在一些实施方案中，在伊红染色之前不分配酸性溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，使用自动标本加工装置对标本进行染色。在一些实施方案中，标本被手动染色。

本公开内容的另一方面是对标本进行染色的方法，其包括：（a）将预定量的苏木精溶液引入至所述标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；（c）将预定量的碱性溶液引入至所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；（e）将预定量的至少一种额外的溶液引入至所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；（g）将预定量的伊红染色溶液引入至所述标本；（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和（i）将预定量的酸性溶液引入至所述标本。在一些实施方案中，在伊红染色之前不分配酸性溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，使用自动标本加工装置对标本进行染色。在一些实施方案中，使用浸与泡（dip-and-dunk）技术将标本染色。在一些实施方案中，标本被手动染色。

本公开内容的另一方面是对标本进行染色的方法，其由下述组成：（a）将预定量的复染溶液应用于所述标本；（b）从所述标本至少部分地除去伊红溶液；（c）将预定量的酸性溶液应用于所述标本；（d）至少部分地除去所述酸性溶液；以及（e）将额外的溶液应用于所述标本；其中在向所述标本应用初级染色溶液和向所述标本应用复染溶液之间不应用酸性溶液。在一些实施方案中，每个应用步骤都是手动执行的。

本公开内容的另一方面是对标本进行染色的方法，其由下述组成：（a）将预定量的初级染色溶液应用于所述标本；（b）从所述标本至少部分地除去所述染色溶液；（c）将预定量的复染溶液应用于所述标本；（d）从所述标本至少部分地除去所述复染溶液；（e）将预定量的酸性溶液应用于所述标本；（f）从所述标本至少部分地除去所述酸性溶液；以及（g）将额外的溶液应用于所述标本；其中在向所述标本应用初级染色溶液和向所述标本应用复染溶液之间不应用酸性溶液。在一些实施方案中，每个应用步骤都是手动执行的。

本公开内容的另一方面是用于加工许多带有生物组织样品的载玻片的方法，包括：在大多数载玻片固定在载玻片盘中空间上共平面的、基本水平的位置的同时，在一个或多个工作站中的许多载玻片上执行一组载玻片加工操作，其中，所述载玻片加工操作组包括通过使一种或多种染色剂从至少一个试剂容器流动，通过流控技术构件，并流出安置于载玻片盘之上的至少一个分配喷嘴使处于空间上共平面、基本水平的位置上的载玻片上的样品染色，以及溶剂交换；在执行至少包括染色和溶剂交换的一组载玻片加工操作之后，将固定许多载玻片的载玻片盘运输到自动盖片机（coverslipper）工作站；在将许多载玻片固定在载玻片盘中空间上共平面的、基本水平的位置的同时，使用自动盖片机工作站用单独的各个盖玻片将固定在载玻片盘中的许多载玻片盖片，从而使得载玻片上的盖玻片彼此隔开；以及从自动盖片机工作站上取出固定了盖片的载玻片的载玻片盘；其中，所述载玻片加工操作包括将预定量的苏木精溶液分配至标本；从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；将预定量的碱性溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，所述方法是自动方法。在一些实施方案中，在伊红染色之前不分配酸性溶液。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。

本公开内容的另一方面是用于自动处理生物标本的装置，其包括：至少一个将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘，其中所述生物标本位于所述载玻片上；一个或多个工作站，其容纳所述载玻片盘并且对固定在所述载玻片盘中的所述许多载玻片执行一个或多个载玻片加工操作；将所述载玻片盘移入和移出所述一个或多个工作站的运输机；与所述一个或多个工作站流体连通的流控技术构件，其向所述一个或多个工作站供应试剂；与所述一个或多个工作站和所述流控技术构件流体连通的气动构件；其中，所述气动构件向所述一个或多个工作站和所述流控技术构件供应真空和/或压缩气体；以及与所述运输机、所述一个或多个工作站、所述流控技术构件和所述气动构件电连通的控制构件，其中，所述控制构件在处理所述生物标本期间使所述装置的部件的功能协调；其中所述***被这样进行配置以使得在应用染色剂和应用复染剂之间不分配酸性溶液。在一些实施方案中，该***适合于将预定量的初级染色溶液分配至标本；从所述标本至少部分地除去所述初级染色溶液；将预定量的碱性溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；将预定量的复染溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述复染溶液；和将预定量的酸性溶液分配至所述标本。在一些实施方案中，初级染色溶液包括苏木精。在一些实施方案中，复染溶液包括伊红。在一些实施方案中，初级染色溶液包括苏木精，且复染溶液包括伊红。

在一些实施方案中，本文所述的技术还可以应用于除伊红以外的染色剂。据信酸性染料已染色后对组织进行的酸性后处理将通过改善组织的电荷状态并增加其保持在酸性染料上的倾向来改善染色剂的黏附。因此，组织的酸性后处理可以应用于任何酸性染料染色剂。使用更惰性的分色剂（differentiation agent）（例如转移溶液）来控制染色过程的进行性部分和退行性（regressive）部分可以与既退行性又进行性的任何染色剂一起使用。

附图简述

为了总的理解本公开内容的特征，提供附图以进行介绍。在附图中，相似的参考数字自始至终用于标记相同的元件。

图1概述了用初级染色剂和复染剂染色组织样品的一般方法。

图2举例说明了两组的三个图像，它们比较地举例说明了使用标准染色规程（上部），使用除去伊红染色剂后的洗涤步骤的染色规程（中部）；以及使用在伊红染色之前不应用酸性溶液而是在伊红染色之后应用酸洗的染色规程（底部）进行的伊红染色。图2A显示了当应用于乳腺组织时的这些规程；而图2B显示了当应用于皮肤时的这些规程。

图3比较地举例说明了标准H＆E染色规程中的分配步骤（上部）；改进的规程中的那些分配步骤，其中洗涤溶液的分配在三对二的基础上用转移溶液替换（中部，“缓和＃1”）；以及改进的规程中的那些分配步骤，其中酸性溶液的分配从紧接在苏木精染色溶液分配之后移到紧接在伊红染色溶液分配之后（底部，“缓和＃2”）；其中H代表苏木精染色溶液的分配；A代表酸性溶液的分配；B代表碱性溶液的分配；E代表伊红染色溶液的分配；W代表洗涤溶液的分配；T代表转移溶液的分配；且O代表有机流体溶液。

图4A显示了乳腺组织的对照和测试图像，其中对照载玻片使用标准染色规程染色，并且其中测试图像使用其中洗涤溶液分配步骤被转移溶液分配步骤替换的规程（“缓和＃1”）染色。

图4B显示了皮肤组织的对照和测试图像，其中对照载玻片使用标准染色规程染色，并且其中测试图像使用其中洗涤溶液分配步骤被转移溶液分配步骤替换的规程（“缓和＃1”）染色。

图4C显示了结肠组织的对照和测试图像，其中对照载玻片使用标准染色规程染色，并且其中测试图像使用其中洗涤溶液分配步骤被转移溶液分配步骤替换的规程（“缓和＃1”）染色。

图5A和5B举例说明了由病理学家检查的每种组织类型的诊断清晰度分数。

图6显示了用两种不同的染色规程染色的皮肤样品。用缓和技术对图像右侧的图像进行染色，其中样品使用的规程是洗涤溶液分配步骤用转移溶液分配步骤替换（“缓和＃1”）。当与对照相比时，用缓和技术染色的H1A0E5得到-2的分数。当与对照相比时，用缓和技术染色的H5A3E1得到0的分数。在没有缓和的情况下在H1A0E5图像中观察到苏木精沉淀物，但被认为与研究无关。

图7A提供了两种染色规程的代表性实例：（1）其中在苏木精染色和伊红染色之间第一次分配酸性溶液，且其中紧接在伊红染色之后第二次分配相同的酸性溶液（图像的左列）；和（2）其中在苏木精染色和伊红染色之间没有分配酸性溶液，但其中紧接在伊红染色之后分配酸性溶液（伊红染色之后没有立即洗涤的步骤）（图像的右列）。这个图是伊红染色之前和之后的酸洗（HABEAWWWTTL分配步骤）和用酸性溶液代替了所有伊红后洗涤步骤（HABEAAATTL分配步骤）的表征；其中H =苏木精染色；A =应用酸性溶液；B =应用碱性溶液；E =应用伊红染色剂；T =应用转移溶液；W =应用洗涤溶液，且L =应用另一种流体。

图7B显示了柱状图表，其提供了对于图7A所显示的每个染色规程实例的吸光度值。

图8A举例说明了横过各苏木精溶液、酸性溶液和伊红溶液设置的混合的黏蛋白强度，如本文进一步所述的。

图8B举例说明了横过各种测试技术的使用苏木精溶液、酸性溶液和伊红溶液设置的黏蛋白强度。

图9A显示了与相当的标称染色剂（使用相同的“HAE设置”）相比时，每种缓和的分数。在下述评分类别的情况下，更高的分数更好：诊断清晰度-载玻片多么容易阅读以用于诊断，载玻片偏爱-您作为病理学家是否更喜欢这种染色剂用于诊断，以及伊红一致性-复染剂横过组织适当且均匀地染色了吗。

图9B按缓和和组织细分了9A的伊红一致性分数，从而显示了对于所有两种缓和横过所有组织的改善。

图9C按缓和和规程细分了诊断清晰度分数，从而显示了横过规程的改进。

图10A是缓和再现性或染色剂之间的相似性的比较。每个分数是用相同的方法和规程染色的同一组织接近的切割（cuts）的两张载玻片之间的比较。分数从表明所述对看来像是相同的0一直到表明所述对看来像是完全不同的4。在这里，我们看到，与标称染色剂（NSN或OSN）相比，4T缓和显示了再现性中的大大增加。

图10B是一种显示与10A中相同的数据的不同方法，从而显示每个染色方法的数据分布直方图。

详述

还应该理解的是，除非清楚地有相反指示，否则在本文请求保护的包括不止一个步骤或动作的任何方法中，所述方法的步骤或动作的顺序不必定限于叙述所述方法的步骤或动作的顺序。

如本文所用的，除非上下文另外清楚地指出，否则单数术语“一个（a）”、“一种（an）”和“该（the）”包括复数对象。类似地，除非上下文另外清楚地指出，否则单词“或”意图包括“和”。术语“包括”内含地进行定义，以致于“包括A或B”表示包括A、B或A和B。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，“或”应被理解为具有与上文定义的“和/或”相同的含义。例如，当将表中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为内含的，即包含多个要素或要素表中的至少一个，但也包括不止一个，以及任选地额外的未列举的项目。仅清楚地有相反指示的术语，例如“仅一个或“恰好一个”，或当在权利要求书中使用时，“由……组成”将指包括多个要素或要素表中的恰好一个要素。通常，如本文中所使用的术语“或”当前面是排他性术语（例如“任何一个”、“一个”、“仅一个”或“恰好一个”）时仅应被解释为表示排他性的选择对象（即，“一个或另一个但不是两者”）。当在权利要求书中使用时，“基本上由……组成”应具有其如在专利法领域中所使用的普通含义。

术语“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。类似地，“包含”、“包括”、“具有”等可互换使用并且具有相同的含义。具体而言，每个术语均与美国专利法中通常的“包含”定义一致地进行定义，且因此被解释为表示“至少以下内容”的开放术语，并且也被解释为不排除额外的特征、限制、方面等。因此，例如，“具有部件a、b和c的设备”指所述设备包括至少部件a、b和c。类似地，短语：“涉及步骤a、b和c的方法”指所述方法包括至少步骤a、b和c。此外，尽管这里可以以特定顺序概述步骤和过程，但是本领域技术人员将认识到步骤和过程的次序关系可以变化。

如本文在说明书和权利要求书中所使用的，关于一个或多个要素的表的短语“至少一个”应理解为指从该要素表中的任何一个或多个要素中选择的至少一个要素，但不必定包括要素表中具体列举的每个要素中的至少一个，并且不排除要素表中要素的任何组合。这个定义还允许除了短语“至少一个”所指的要素表中明确确定的要素以外的要素可以任选地存在，无论与那些明确确定的要素有关还是无关。因此，作为非限制性示例，“A和B的至少一个”（或等价地，“A或B的至少一个”，或等价地“A和/或B的至少一个”） 可以在一个实施方案中，指在没有B的情况下的至少一个，任选地包括不止一个A（并且任选地包括除B以外的要素）；在另一个实施方案中，指在没有A的情况下的至少一个，任选地包括不止一个B（并且任选地包括除A以外的要素）；在又另一实施方案中，指至少一个，任选地包括不止一个A，以及至少一个，任选地包括不止一个B（并且任选地包括其他要素）；等等。

如本文所用的，术语“生物样品”、“生物标本”、“组织样品”等是指包括从任何生物包括病毒获得的生物分子（例如蛋白质、肽、核酸、脂质、碳水化合物或其组合）的任何样品。生物的其他实例包括哺乳动物（例如人；兽医动物，例如猫、狗、马、牛和猪；和实验室动物，例如小鼠、大鼠和灵长类动物）、昆虫、环节动物、蜘蛛、有袋类、爬行类、两栖类、细菌和真菌。生物样品包括组织样品（例如组织切片和组织的针吸活组织检查），细胞样品（例如细胞学涂片如巴氏涂片（Pap smears）或血涂片或通过显微解剖获得的细胞样品），或细胞级分，碎片或细胞器（例如通过裂解细胞并通过离心或其他方法分离其组分而获得的）。生物样品的其他实例包括血液、血清、尿、***、粪便物质、脑脊液、组织液、黏液、眼泪、汗、脓、活组织检查的组织（例如，通过手术活组织检查或针吸活组织检查获得的）、***抽吸物、耵聍、乳、***液（vaginal fluid）、唾液、拭子（例如颊拭子）或任何包含衍生自第一生物样品的生物分子的材料。在某些实施方案中，如本文所用的术语“生物样品”是指从获得自主体的肿瘤或其一部分制备的样品（例如均化或液化的样品）。

如本文所用的，术语“流体”是指任何液体，包括水、溶剂、溶液（例如缓冲液）等。术语“流体”还指任何混合物、胶体、悬浮液等。术语“流体”还包括可以应用于显微镜载玻片和/或标本的试剂、染色剂和其他标本加工剂（例如胶水、固定剂等）。流体可以是水性的或非水性的。进一步的实例包括抗体的溶液或悬浮液、核酸探针的溶液或悬浮液以及染料或染色剂分子的溶液或悬浮液（例如，H＆E染色溶液、Pap染色溶液等）。流体的再进一步的实例包括用于使石蜡包埋的生物标本脱蜡的溶剂和/或溶液、水性去污剂溶液和烃（例如，烷、异烷烃和芳族化合物，例如二甲苯）。流体的再进一步的实例包括用于使生物标本脱水或再水化的溶剂（及其混合物）。

如本文所用的，术语“HAE设置”是指当建立HAE染色规程时可用的染色参数设置。H是苏木精温育时间，A是酸洗温育时间，且E是伊红温育时间，其中设置不是精确的温育时间，但是以已知的方式对应于实际的染色时间。

如本文所用的，术语“载玻片”是指其上放置生物标本用于分析的任何合适尺寸的任何基底（例如，全部或部分由玻璃、石英、塑料、硅等制成的基底），且更特别地是指“显微镜载玻片”，例如标准的3英寸×1英寸的显微镜载玻片或标准的75 mm×25 mm的显微镜载玻片。可以放置在载玻片上的生物标本的例子包括但不限于细胞学涂片，薄组织切片（例如来自活组织检查）和生物标本阵列，例如组织阵列，细胞阵列，DNA阵列，RNA阵列，蛋白质阵列，或其任何组合。因此，在一个实施方案中，将组织切片、DNA样品、RNA样品和/或蛋白质于特定位置放置在载玻片上。在一些实施方案中，术语载玻片可以指SELDI和MALDI芯片以及硅片。

如本文所用的，如本文所用的术语“染色（stain）”、“染色（staining）”等通常是指检测和/或区分生物标本中的特定分子（例如脂质、蛋白质或核酸）或特定结构（例如正常或恶性细胞、细胞溶胶、核、高尔基体或细胞骨架）的存在、位置和/或量（例如浓度）的生物标本的任何处理。例如，染色可以提供生物标本的特定分子或特定细胞结构与周围部分之间的对比，并且染色的强度可以提供标本中特定分子的量的量度。染色可以用于帮助不仅用明视场显微镜而且用其他观察工具如相差显微镜、电子显微镜和荧光显微镜来观察分子、细胞结构和生物。***2执行的一些染色可用于显示细胞的轮廓。***2执行的其他染色可以取决于在没有或有相对少的其他细胞组分染色的情况下被染色的某些细胞组分（例如分子或结构）。***2执行的染色方法的类型的实例包括，但不限于，组织化学方法、免疫组织化学方法和其他基于分子之间的反应（包括非共价结合相互作用）的方法，例如核酸分子之间的杂交反应。特定的染色方法包括，但不限于，初级染色方法（例如，H＆E染色、Pap染色等）、酶联免疫组织化学方法以及原位RNA和DNA杂交方法，例如荧光原位杂交（FISH）。

术语“基本水平”通常是指在水平线的约+/-2度内的角度，例如在水平线的约+/-1度内，例如在水平线的约+/-0.8度内。基本水平还指与水平线成小的角度范围，例如，与水平线成约0.1度至1.8度的角度，例如约0.2度至约1.2度的角度，例如约0.3度至约0.8度的角度。基本水平固定的载玻片将具有这样的取向，以使载玻片的大表面通常面朝上和面朝下。在特定实施方案中，基本水平固定的矩形载玻片，例如显微镜载玻片，将具有沿其短轴相对于水平线约0.0度至约2.0度的角度，以及沿其长轴相对于水平线约0.0度至2.0度的角度，同时载玻片的大表面通常也面朝上和面朝下。一般，如果载玻片的一端贴上条形码，则固定在基本水平位置的载玻片将沿着其长轴具有向离开条形码的方向的向下倾斜。

术语“工作站”是指所公开的***中的位置或场所，在那里执行至少一个载玻片加工操作，并且更特别地是指模块式单元，在其内部在固定在载玻片盘中的许多载玻片（例如，在载玻片盘中固定在基本水平位置的许多载玻片）上执行一个或多个载玻片加工操作。工作站可以在基本上单个位置容纳载玻片盘，以便工作站的可移动部件可以确定载玻片盘内各个载玻片的位置，并在盘中的一个或多个载玻片上精确执行载玻片加工操作（例如递送流体、溶液、试剂等到特定的载玻片或其部分）。可以由工作站执行的载玻片加工操作的实例包括加热、干燥、脱蜡、染色前准备、漂洗、溶剂交换、染色和盖片以及它们的组合。在一些实施方案中，在载玻片加工操作或多种操作如脱蜡、染色和/或溶剂交换期间，在载玻片不从一个工作站移动到另一个的情况下，工作站分配两种或更多种流体、溶液、试剂等到载玻片上。因此，在一个实施方案中，工作站包括递送装置，例如喷嘴或喷嘴的歧管，通过所述递送装置将流体、溶液、试剂等递送到固定在载玻片盘中的载玻片，所述递送装置可以是可移动的或固定在工作站内的适当位置。因此，在一些实施方案中，工作站包括主动的机械设备，其将流体（例如两种或更多种流体）递送到在载玻片盘中固定在一起的载玻片组。因此，在一个非限制性方面，工作站不是将载玻片浸入其中的试剂浴器。在其他实施方案中，工作站可以包括加热元件，并且可以进一步包括热导引元件（heat directing element）。热导引元件可以帮助在载玻片盘中固定的载玻片之间更均匀地散布热量。工作站还可以包括一个或多个辐射加热器。工作站还可以包括盘倾架（例如倾斜盘），以抬起载玻片盘的一端以帮助从盘中除去液体。另一方面，工作站可以包括使载玻片盘中的一个或多个单独载玻片向离开水平位置的方向倾斜的机构。工作站可以进一步包括移动或控制其他工作站部件的各种部件，例如步进电机、螺杆驱动器（screw drives）和微处理器。可以包括在工作站中的其他部件包括软管、皮带、导轨、流控技术接头、计量泵、计量阀、电接头（electricalconnections）、传感器等。在另一个实施方案中，工作站是模块式单元，其可以在公开的***内的两个或更多个位置之间互换位置并且经由共同的电子底板和共同的流控技术歧管电和流体地连接到***。在再另一个实施方案中，工作站可以包括光源，例如紫外光源，用于固化用于将盖玻片在载玻片上固定就位的粘合剂。

总览

本公开内容涉及用初级染色剂（例如苏木精）和复染剂（例如伊红）对生物样品进行染色的方法，且特别地，涉及增强用复染剂染色的方法的方法。在一些实施方案中，所述方法利用自动标本加工装置。申请人已出乎意料地发现，通过改变将某些流体引入或分配到基底的顺序，即次序、时间控制等，与标准染色规程相比，可以增强染色剂强度和一致性。

在一些实施方案中，将溶液手动应用或引入至样品中或使用浸与泡技术来应用。在一些实施方案中，样品与流体接触，并且接着在引入另一种流体之前将所述流体除去。

在其他实施方案中，将溶液引入（例如分配）至样品，例如通过自动染色装置。本领域技术人员将理解，任何流体的分配是指将所述流体应用到样品或基底（例如载玻片）。本领域技术人员将理解，在分配流体之后，必须至少部分地将其除去，从而使得接着分配的流体能够接触布置在基底上的标本。因此，本文的一些实施方案可以指流体的序贯、接连或反复应用。除非另有详细说明，否则应该推断出，在分配第二流体之前至少部分地除去了分配的第一流体。

在一些实施方案中，本公开内容的染色***能够执行对基底（例如，载玻片）封固的标本进行加工、染色和盖片的所有或一些步骤。在一些实施方案中，将带有生物标本的载玻片放置在载玻片盘上，并将带有样品载玻片的载玻片盘装载到***中，在那里，通过一系列步骤处理载玻片，其中载玻片被烘烤、去蜡、染色且最后盖片。在一些实施方案中，本文公开的方法涉及在显微镜载玻片（或其他基底）上自动制备组织样品用于病理分析的方法，其包括通过使仪器向组织施加足以将其黏附到载玻片的热来将组织样品烘烤到载玻片上；通过在高于石蜡熔点的温度使组织样品与脱蜡流体接触并接着将液化的石蜡漂洗掉来使其脱蜡；通过使组织样品与染色试剂接触来对其进行染色；和通过使载玻片上的染色的组织样品与预先用胶水粘合的盖玻片和黏合剂活化流体接触来将载玻片盖片。在一些实施方案中，本文公开的方法仅利用前述步骤中的一些。

在一些实施方案中，用初级染色剂（例如苏木精）和复染剂（例如伊红）对标本的染色是通过使用标本加工***来完成的。在一些实施方案中，标本加工装置是自动装置，例如由Ventana Medical Systems, Inc.销售的BENCHMARK XT仪器、BenchMark专用染色剂（Special Stains）仪器、NexES专用染色器（Special Stainer）仪器、SYMPHONY仪器或BENCHMARK ULTRA仪器。Ventana Medical Systems, Inc.是许多美国专利的受让人，所述美国专利公开了用于执行自动分析的***和方法，包括美国专利Nos. 5,650,327、5,654,200、6,296,809、6,352,861、6,827,901和6,943,029以及美国公开专利申请Nos. 2003/0211630和2004/0052685，其各自整体引入本文作为参考。

可通过其应用苏木精和伊红染色组合物的其他可商购获得的标本加工***的实例包括VENTANA SYMPHONY（单独载玻片染色器）和VENTANA HE 600（单独载玻片染色器）系列；来自Agilent Technologies的Dako CoverStainer（分批染色器）；来自LeicaBiosystems Nussloch GmbH的Leica ST4020小线性染色器（Small Linear Stainer）（分批染色器）、Leica ST5020 Multistainer（分批染色器）和Leica ST5010 Autostainer XL系列（分批染色器）H＆E染色器。

在一些实施方案中，自动标本加工装置可以包括用于固定许多基底（例如显微镜载玻片）的圆盘传送带，其中每个基底包括要染色的生物样品。在一些实施方案中，自动染色设备还可包括用于以预定速度旋转圆盘传送带的设备以及用于在圆盘传送带旋转期间指导和控制试剂（包括苏木精和伊红染色组合物）应用到基底和样品上的机构。在一些实施方案中，一旦将载玻片装载到仪器中，测试规程就将规定在特定时间将哪些流体分配到基底上。在一些实施方案中，在适当的时间，分配器支架将旋转以在基底上排列正确的流体，并且仪器将在基底上分配预定量的流体。在一些实施方案中，仪器将允许流体保持与生物样品接触达预定量的时间。

在一些实施方案中，***是自动载玻片加工***，其包括以基本水平的位置（例如，在两行中，在那里载玻片以与水平线成约0.2度至约1.2度的角度固定）固定许多载玻片的载玻片盘和一个或多个容纳载玻片盘并在载玻片盘中的载玻片上执行一种或多种载玻片加工操作的工作站（例如，以垂直堆积排列的）。在一些实施方案中，工作站可以在载玻片盘中的一个或多个个别的载玻片上执行载玻片加工操作，例如，载玻片盘中的至少两个或四个载玻片，或者它可以同时在载玻片盘中的所有载玻片上执行载玻片加工操作。在一些实施方案中，一个或多个工作站在没有相当大量的接触第一载玻片的试剂和第二载玻片接触的情况下将试剂分配到载玻片盘中的载玻片，从而将载玻片之间的交叉污染减至最小。这种工作站可以包括将试剂分配到载玻片上的一个或多个定向喷嘴，例如，一个或多个定向喷嘴可以包括在穿过载玻片的表面以相反的方向分配试剂的一对定向喷嘴。在更特定的实施方案中，一个或多个定向喷嘴可以进一步包括将试剂朝向载玻片的底表面分配的定向喷嘴。在其他特定实施方案中，一个或多个工作站可以同时将试剂（例如，相同的试剂）分配到给定工作站内固定于载玻片盘中的至少两个载玻片，或者一个或多个工作站可以同时将试剂（例如相同的试剂）分配到给定工作站内固定于载玻片盘中的所有载玻片。在美国专利Nos. 8,663,991、7,468,161和9,528,918中描述了额外的***部件和盘配置（以及控制***），其公开内容特此整体引入本文作为参考。

在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以将预定量的每种流体（包括苏木精和伊红染色溶液）分配至标本。在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以将至少约200微升的流体分配至生物样品。在其他实施方案中，将至少约350微升的流体分配至生物样品。在再其他实施方案中，将至少约1000微升的流体分配至生物样品。在进一步的实施方案中，将约200微升至约2000微升的流体分配至生物样品。在甚至进一步的实施方案中，将约200微升至约1500微升的流体分配至生物样品。在一些实施方案中，分配约400微升的流体。在一些实施方案中，分配约800微升的流体。在一些实施方案中，分配约1400微升的流体。本领域技术人员将理解，可以以不同的量分配不同的流体，例如，以约1400微升的量分配初级染色剂，并且可以以约400微升的量分配洗涤溶液。本领域技术人员还将理解，在相同流体的任何两次分配（即分配步骤）之间，任何特定分配中的量可以相同或不同。例如，洗涤溶液的第一次分配可以具有200微升的体积，而洗涤溶液的第二次分配可以具有400微升的体积。

在一些实施方案中，自动标本加工装置用于序贯地或反复地将一系列流体应用于带有标本的载玻片上。例如，自动标本加工***可以适合于将苏木精和伊红染色剂分配到标本。在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以在将苏木精和伊红染色组合物分配到生物样品之前和之后都应用其他流体。例如，自动标本加工装置可以准备好以分配包括水、二醇和表面活性剂的洗涤水溶液。自动标本加工装置还可以准备好以分配酸性溶液（例如，包括水、二醇和弱酸的酸性溶液）或碱性溶液（例如，包括水、二醇和弱碱的碱性溶液）。自动标本加工装置可以再进一步准备好以分配有机溶液（例如脂族烃的混合物）或转移溶液（例如包括醚的转移溶液）。

在一些实施方案中，转移溶液包括一种或多种二元醇醚（glycol ethers），例如一种或多种基于丙烯的二元醇醚（例如，丙二醇醚、二丙二醇醚和三丙二醇醚，基于乙烯的二元醇醚（例如，乙二醇醚、二乙二醇醚和三乙二醇醚）及其功能类似物。在一些实施方案中，转移溶液至少基本上仅包括二丙二醇甲基醚和二丙二醇丙基醚的混合物。在其他实施方案中，转移溶液至少基本上仅包括二丙二醇丙基醚。合适的二元醇醚包括，例如，可从DowChemical Company（Midland, Michigan）获得的DOWANOL产品。

在一些实施方案中，洗涤溶液包括表面活性剂，以促进洗涤液体在载玻片的带有标本的表面上的散布。可以选择表面活性剂以对洗涤后的标本加工操作几乎没有或没有消极影响。例如，表面活性剂可以是非离子型的，以便减少或防止不期望的缓冲。在至少一些情况下，表面活性剂包括乙氧基化醇和/或二元醇醚。合适的乙氧基化醇表面活性剂包括，例如，可从Air Products and Chemicals, Inc.（Allentown, Pennsylvania）获得的TOMADOL® 900和可从Stepan Company（Northfield, Illinois）获得的Merpol SH。合适的二元醇醚表面活性剂包括，例如，可从Dow Chemical Company（Midland, Michigan）获得的TERGITOL® NP-9。

在一些实施方案中，酸性溶液包括去离子水、酸（例如，乙酸）和溶剂。如同洗涤溶液一样，溶剂可以是多元醇，例如乙二醇、丙二醇或其组合。例如，染色剂分色液体（stain-differentiating liquid）可包括大于10体积％的多元醇。

在一些实施方案中，碱性溶液包括去离子水、碱和溶剂。在一些实施方案中，溶剂可以是多元醇，例如乙二醇、丙二醇或其组合。例如，碱性溶液可以包括大于10体积％的多元醇，例如按体积计10％至60％>的多元醇。在一些实施方案中，碱是三(羟甲基)氨基甲烷（“TRIS”）。

在美国专利申请公开No. 2016/0282374中描述了额外的洗涤溶液、转移溶液、酸性溶液和碱性溶液，以及它们的应用方法和用于应用它们的仪器，其公开内容特此整体引入本文作为参考。

自动标本加工装置可以准备好以反复分配（和除去）相同的流体预定的次数。在一些实施方案中，与使单种流体与标本接触预定的时间段相反，重复分配、除去和重新应用（reapply）特定流体是有益的。据信重复的分配和除去步骤优于具有较长的温育时间的单次分配。例如，重复的分配提供了流体或溶液浓度的更新；其防止了静止流（standingcurrents），并且其至少促进了部分混合。对于正在添加或除去染料（染色或分色）的流体，流体的更新将相对于组织保持流体中的染料的适当浓度。例如，在染色期间，相对于组织保持流体中染料的高浓度将加速并强化染色。类似地，在洗涤中保持染料的低浓度将更快且更有效地除去染料并分色。就静止流而论，允许流体池搁置允许形成空间上不均匀的对流，这可影响染色剂一致性，且就混合而论，重新应用流体允许新的流体浴易于接近组织，而静止池必须等待扩散以将其有效混合。例如，尽管洗涤溶液可以被序贯地重复分配、除去和重新应用四次，但是与使单体积的洗涤溶液与生物样品接触相同的持续时间相比，这种重复过程可以提供益处。在一些实施方案中，样品的洗涤包括下述的几次反复（例如，2、3或另一个合适的反复次数）：将洗涤溶液分配到载玻片上，从而允许分配的洗涤液体保持与标本接触适当的时间段以便完全或增量式地洗涤标本（例如，当洗涤液体呈具有至少部分地由表面张力维持的形状的小塘（puddle）形式时），以及然后除去分配的洗涤液体。所分配的洗涤液体与标本在其期间接触的时间可以是例如从5秒一直到30秒内的时间。

在H＆E染色的情况下，自动标本加工装置可以将苏木精染色溶液分配到布置在载玻片上的标本。苏木精染色溶液的分配促进在载玻片上形成第一小塘，使所述小塘与标本接触预定的时间段。接着，至少部分地除去这个第一小塘以至少部分地使标本露出。其次，可以在用伊红染色之前应用一种或多种流体，由此在与标本保持接触达预定的时间量之后，除去在伊红染色之前应用的一种或多种流体中的每一种。在一些实施方案中，在伊红染色之前应用洗涤水溶液、酸性溶液或碱性溶液中的至少一种。

参考图1，并且在H＆E染色的情况下，自动加工***通常可以执行以下步骤：（1）在苏木精染色之前应用一种或多种流体（步骤10）；（2）应用苏木精染色溶液（步骤11）；（3）在苏木精染色与伊红染色前之间应用一种或多种流体（步骤12）；（4）应用复染溶液（步骤13）；和（5）在伊红染色后应用一种或多种流体（步骤14）。在一些实施方案中，复染溶液包含伊红。在一些实施方案中，以预定量分配每种流体，并允许它们保持与标本接触达预定的时间量。在其他实施方案中，在步骤（3）中，至少将洗涤溶液和酸性溶液或碱性溶液中的每一种应用一次，并且这些流体可以以任何次序应用。在再其他实施方案中，在步骤（3）中，至少将洗涤溶液、酸性溶液或碱性溶液中的每一种应用一次，并且这些流体可以以任何次序应用，并且这些流体中的至少一种在步骤（3）应用不止一次。在一些实施方案中，在步骤（3）期间不应用酸性溶液。在其他实施方案中，在步骤（3）期间不应用酸性溶液，但是碱性溶液和洗涤溶液各自应用至少一次。在一些实施方案中，在步骤（3）期间应用酸性溶液，并且紧接在分配和至少部分除去复染溶液之后分配另一等分部分的酸性溶液。在其他实施方案中，在步骤（3）期间应用洗涤溶液、碱性溶液和酸性溶液中的全部三种，并且在步骤（5）期间应用酸性溶液。

在一些实施方案中，将洗涤水溶液、酸性溶液和碱性溶液中的所有三种序贯地并在伊红染色之前应用。例如，自动标本加工装置在用苏木精染色后可以执行以下操作：（i）分配酸性溶液；（ii）分配洗涤溶液；（iii）分配碱性溶液；（iv）分配洗涤溶液；（v）分配伊红染色溶液；和（vi）伊红染色后分配一种或多种流体。另一方面，且作为另一实例，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配洗涤溶液；（ii）分配酸性溶液；（iii）分配洗涤溶液；（iv）分配碱性溶液；（v）分配洗涤溶液；（vi）分配伊红染色溶液；和（vii）伊红染色后分配一种或多种流体。在一些实施方案中，在用伊红染色后分配至少一种洗涤溶液。在一些实施方案中，紧接伊红染色之后分配酸性溶液。

在一些实施方案中，在伊红染色之前仅应用洗涤水溶液和碱性溶液，即在伊红染色之前不应用酸性溶液。例如，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配碱性溶液；（ii）分配“洗涤”溶液；（iii）分配伊红染色溶液；和（iv）分配酸性溶液。在这个特定实施方案中，在伊红染色之前，标本不与酸性溶液接触。相反，紧接伊红染色之后，标本与酸性溶液接触。如本文中进一步指出的，申请人已经发现，与对照样品相比，根据流体分配步骤的这种次序关系的染色导致改善的伊红染色（参见本文的实施例部分）。

作为另一个实例，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配洗涤溶液；（ii）分配碱性溶液；（iii）分配“洗涤”溶液；（iv）分配伊红染色溶液；和（v）分配酸性溶液。在一些实施方案中，步骤（i）在分配碱性溶液之前进行两次。像前述实例那样，在这个特定实例中，在伊红染色之前，标本不与酸性溶液接触。再一次，紧接在伊红染色之后标本与酸性溶液接触。

在备择的方法中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配酸性溶液；（ii）分配“洗涤”溶液；（iii）分配碱性溶液；（iv）分配洗涤溶液；（v）分配伊红染色溶液；和（vi）分配酸性溶液。在另一个备择方法中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配洗涤溶液；（ii）分配酸性溶液；（iii）分配“洗涤”溶液；（iv）分配碱性溶液；（v）分配洗涤溶液；（vi）分配伊红染色溶液；和（vii）分配酸性溶液。

在再另一个备择方法中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配碱性溶液；（ii）分配“洗涤”溶液；（iii）分配酸性溶液；（iv）分配“洗涤”溶液；（v）分配伊红染色溶液；和（vi）分配酸性溶液。在再进一步的备择方法中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配洗涤溶液；（ii）分配碱性溶液；（iii）分配“洗涤”溶液；（iv）分配酸性溶液；（v）分配“洗涤”溶液；（vi）分配伊红染色溶液；和（vii）分配酸性溶液。

如文上所指出的，在用伊红染色后，将一种或多种流体序贯地应用到标本。特别地，在用伊红染色之后，可以在用伊红染色之后将洗涤溶液和/或转移溶液各自分配给标本一次或多次。例如，紧接在用伊红染色之后，可序贯地将洗涤溶液分配并除去四次。这之后，可以应用额外的溶液，例如在分配最后的洗涤溶液之后，分配转移溶液和/或有机溶液中的至少一种。

在一些实施方案中，自动标本加工装置可以在伊红染色之后但在分配不同的流体之前序贯地分配洗涤溶液1至6次。作为实例，自动标本加工装置可以在用伊红染色后执行以下操作：（i）分配洗涤溶液；（ii）分配洗涤溶液；（iii）分配洗涤溶液；（iv）分配洗涤溶液；（v）分配转移溶液；（vii）分配转移溶液；和（viii）分配有机溶液。按照这个实例，在一些实施方案中，所述***可适合于在伊红染色后分配漂洗流体小于四次，例如三次、两次或仅一次，而不是分配洗涤溶液四次。

在一些实施方案中，紧接在伊红染色之后分配洗涤溶液的一个或所有步骤可以用分配转移溶液的步骤一对一地代替。例如，如果洗涤溶液接连分配四次（即分配流体，允许其保持与标本保持接触达预定的时间量，并至少部分除去流体），则***可适合于接连分配转移溶液四次来代替，且在任何再后来的流体分配步骤（包括进一步的转移溶液分配步骤）之前。另一方面，如果洗涤溶液接连分配四次，则***可适合于分配洗涤溶液两次和转移溶液两次，且在任何再后来的流体分配步骤（包括进一步的转移溶液分配步骤）之前。在一些实施方案中，自动标本加工装置可以紧接在用伊红染色之后（和在除去伊红之后）接连地分配洗涤溶液一次或两次；后面是接连地分配转移溶液至少两次。在一些实施方案中，自动标本加工装置可以在分配洗涤溶液和分配转移溶液之间交替，例如，分配洗涤溶液、分配转移溶液、分配洗涤溶液和分配转移溶液。

在一些实施方案中，伊红染色后的所有洗涤溶液分配步骤被除去，并被分配转移溶液的步骤替换。作为另一个实例，自动标本加工装置可以紧接在用伊红染色之后执行以下操作：（i）分配转移溶液；（ii）分配转移溶液；（iii）分配转移溶液；（iv）分配转移溶液；和（v）分配有机溶液。作为再另一个实例，自动标本加工装置可以紧接在用伊红染色之后执行以下操作：（i）分配转移溶液；（ii）分配转移溶液；（iii）分配转移溶液；（iv）分配转移溶液；和（v）分配有机溶液，其中在苏木精染色和伊红染色之间不进行酸洗步骤。作为再进一步的实例，自动标本加工装置可以紧接在用伊红染色之后执行以下操作：（i）分配酸性溶液；（ii）分配洗涤溶液；（iii）分配转移溶液；（iv）分配转移溶液；（v）分配转移溶液；和（vi）分配有机溶液。在一些实施方案中，转移溶液可以紧接在伊红染色之后并且在进一步加工（包括进一步的流体分配步骤）之前分配约2次至约12次。

在一个实施方案中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配碱性溶液；（ii）分配“洗涤”溶液；（iii）分配伊红染色溶液；（iv）分配酸性溶液；（v）分配至少一种转移溶液；其中在用伊红染色后不进行洗涤步骤。在另一个实施方案中，自动标本加工装置可以在用苏木精染色后执行以下操作：（i）分配碱性溶液；（ii）分配“洗涤”溶液；（iii）分配伊红染色溶液；（iv）分配酸性溶液；（v）分配转移溶液；（vi）分配转移溶液；（vii）分配转移溶液；和（viii）分配转移溶液。当然，可以并入其他下游分配步骤。

在一些实施方案中，自动标本加工装置包括加热或冷却设备（例如传导加热器或珀尔帖（Peltier）设备），从而使得将生物样品或应用于所述样品的流体中的至少一种加热至预定温度和/或达预定的时间量。在一些实施方案中，标本加工装置可以被进行配置以提供传导和/或辐射加热。可以通过带有电阻加热器的板提供传导加热。一盏或多盏灯可提供辐射加热。所述装置可以可控制地增加或降低标本的温度。载玻片加热设备的合适的例子在美国专利Nos. 7,425,306和6,582,962中描述，其公开内容特此整体引入本文作为参考。

在一些实施方案中，将样品或分配的流体中的至少一种加热至从约30℃一直到约45℃的温度。在其他实施方案中，标本加工装置将样品或分配的流体中的至少一种加热至从约35℃一直到约40℃的温度。在一些实施方案中，标本加工装置可将样品、分配的流体或载玻片加热预定的时间段，例如10分钟至40分钟。可以加热分配到标本或载玻片的任何染色试剂和/或流体。

在一些实施方案中，标本加工装置被进行配置以在将苏木精和伊红染色组合物分配至生物样品之前和之后都应用再其他的流体。实际上，标本加工装置可以向标本应用各式各样的物质，包括，但不限于，染色剂、探针、试剂、漂洗物和/或调节剂，或本文所述的任何其他流体。探针可以是附着至可检测标记的分离的核酸或分离的合成寡核苷酸。标记可以包括放射性同位素、酶底物、辅因子、配体、化学发光或荧光剂、半抗原和酶。在一些实施方案中，标本加工装置例如通过与特异性于特定靶细菌的一种或多种抗体一起温育并使用标记（例如抗体上的标记或通过使用标记的第二抗体）进行检测来促进进行免疫测定。示例性可检测标记包括荧光团、半抗原、酶、放射性标记和本领域已知的其他标记。

在一些实施方案中，如果标本是石蜡中包埋的样品，则可以使用一种或多种适当的脱蜡流体用标本加工装置将样品脱蜡。在一些实施方案中，并且在标本加工装置的废物去除器设备除去一种或多种任何脱蜡流体之后，可以接连地将任意数目的物质应用于标本。所述物质可以用于预处理（例如，蛋白质交联、暴露核酸等）、变性、杂交、洗涤（例如，严格洗涤）、检测（例如，将肉眼可见的或标记分子与探针连接）、扩增（例如，扩增蛋白质、基因等）、复染、盖片等。

根据本文描述的程序染色的生物标本的分析可以是自动的，并且可以通过计算机分析和/或图像分析***来促进。在一些实施方案中，光学显微镜术用于图像分析。某些公开的实施方案涉及获得数字图像。这可以通过将数码相机偶联到显微镜（例如明视场显微镜）来完成。使用图像分析软件分析染色的样品获得的数字图像。还可以定性和半定量评价样品。定性评估包括评估染色强度、鉴定染色中涉及的阳性染色的细胞和胞内区室以及评价总的样品或载玻片质量。对测试样品进行单独评价，且这种分析可以包括与已知平均值的比较，以确定样品是否代表异常状态。

实施例1

实施例1-用2-转移溶液分配替换洗涤分配—可调性（dialability）确定

染色试验是使用对照配置的仪器并使用表1中显示的备择规程进行的。还使用“缓和”技术进行染色试验，其中洗涤分配步骤被两（2）个转移溶液步骤替换，达总数为四（4）个转移溶液步骤（参见图3）。通过脚本（script）变化实现测试配置。进行以下染色试验，并然后在每种配置中进行比较：

表1：染色规程试验，其中整数1一直到10表示指定流体保持与标本接触的相对持续时间，其中较小的整数表示较短的时间量，且较大的整数表示较长的持续时间。

使用包含乳腺、结肠、皮肤、脾和扁桃体的单个多组织块（MTB）。每次染色试验中将两个载玻片染色。染色试验首先在对照配置中执行。如下所述由病理学家对每种染色规程的测试和对照载玻片进行比较和评分：

-3：测试载玻片的[属性]显著少于对照

-2：测试载玻片的[属性]相当大地少于对照

-1：测试载玻片的[属性]稍微少于对照

0: 测试载玻片的[属性]大约等于对照

1：测试载玻片的[属性]稍微多于对照

2：测试载玻片的[属性]相当大地多于对照

3：测试载玻片的[属性]显著多于对照，

其中“稍微”=仅在重复检查时才引人注意的差异；“相当大地”=第一次检查时引人注意的差异，且“显著”=第一次检查时极明显的差异（即在没有显微镜的情况下引人注意的差异）。

在下述方面对载玻片进行评价：（i）伊红染色一致性-在单张载玻片上整个组织样品中对嗜伊红组织组分（如胶原和脂肪）的适当且一致的染色；和（ii）伊红分色-具有容易看得见的粉红色色调的嗜伊红组织组分（如胶原、平滑肌和红细胞）的分色。

实验过程中使用了表2中列出的消耗品：

表2：实验期间使用的消耗材料，其中所有材料均可从Ventana Medical Systems,Tucson, AZ, USA获得。

表3中显示了每种组织类型的成对组织的每种染色属性的平均病理学分数。

表3：平均病理学分数，即测试载玻片的染色属性的平均病理学分数。

表3中的值是基于上文列出的评分方法横过所有载玻片和染色规程的每种染色属性的平均值。

在适当缓和的情况下，对于每种组织类型都观察到苏木精染色强度的稍微增加。对于每种组织类型，在适当缓和的情况下，伊红的染色强度增加为稍微至相当大。对于这个研究中使用的任何组织，缓和对伊红分色都没有影响。

载玻片偏爱是一种主观评分，其中病理学家选择偏爱用标称染色剂或缓和染色的组织。对于乳腺和皮肤对缓和组织的偏爱相当大。对于结肠和脾对缓和的偏爱非常轻微，而对于扁桃体则没有偏爱。缓和，将洗涤分配步骤改变为两个转移溶液步骤，对其设计用于改正的伊红一致性有相当大影响。

对于这个研究中检查的每种组织，伊红染色强度均稍微至相当大地更强。缓和使苏木精稍微增加。伊红分色不受缓和的影响。在缓和的情况下，乳腺、结肠和皮肤中的伊红一致性相当大地提高。对于这个研究对组织评分的病理学家（一个）偏爱在适当缓和情况下的乳腺和皮肤。对于这个研究对组织评分的病理学家对结肠、脾和扁桃体没有偏爱。这些图像提示，在适当缓和的情况下，可获得较小的可调性。

总的说来，这个研究显示了横过组织的伊红一致性的强改善以及在显示不一致性的组织中病理学家偏爱中的改善，而仅强烈地影响了另一种染色剂特征，伊红强度。

实施例2-浅伊红用2-转移溶液分配替换洗涤分配：诊断清晰度

设计这个研究以确定实施例中所述的缓和程序是否对诊断组织的能力造成了无意识的后果。根据与实施例1相同的程序制备样品。

在诊断清晰度评分时包括下述：（i）由HE600染色方法引起的染色剂人工产物；（ii）染色剂问题（例如，差的分色、色泽、不正确染色）；和（iii）可能合理地由染色方法引起的其他问题，其可以影响作出诊断所需的时间和精力。

以类似于实施例1中所述的方式，以-3至3的尺度对诊断清晰度进行评分。

载玻片对由用相同染色规程染色的测试和对照载玻片组成。所述对中的每张载玻片均随机标记为A或B；在载玻片B与载玻片A相比的情况下对载玻片进行了评分。两（2）位病理学家对载玻片的诊断清晰度进行了评分。结果示于图5A和5B中，同时测试载玻片显示为载玻片B。2的分数表示对于所述测试的诊断清晰度比对照相当大地更容易诊断。也就是说，-2的分数表示对于所述测试的诊断清晰度比对照相当大地更难以诊断。

在图5A中，十二（12）张测试载玻片得到-2的分数，即，在最初检查时与对照载玻片相比它们相当大地更难以诊断。这些载玻片中的10/12是带有评论“难以看到日光性弹性纤维病”的皮肤。已知在HE600上苏木精对日光性弹性纤维病的染色浅。在适当缓和的情况下，伊红强度的增加掩盖[浅染色的]日光性弹性纤维病到达使其成为诊断所关心的问题的程度。

如在图5B中所看出的，对于规程H10A0E1、H10A1E1、H10A1E10、H1A0E5、H1A3E1和H5A3E5，每种规程的对中的一个得分为0或-1，而另一个得分为-2。这很可能是由于在HE600中观察到的载玻片之间的染色可变性。确定这种载玻片之间染色可变性的根本原因超出了本文件中工作的范围。对于规程H5A1E1，有1对得到2的分数，而另一对为-2。这再次很可能是由于在HE600中观察到的载玻片之间的染色可变性。

使用规程H1A0E5和H5A3E1在有（带有TTTT的右侧图像）和没有缓和的情况下染色的皮肤图像显示在图6中。

即使在对照载玻片上普遍存在蓝点，用H1A0E5染色的缓和载玻片仍得到-2的分数；日光性弹性纤维病被掩盖了。通过调低伊红，可能看到日光性弹性纤维病，如图6的底部2幅图像所示的。

十张载玻片得到2的分数，且主要是乳腺和结肠。这些载玻片由于浅伊红染色较容易看到的事实而通常得到2的分数。应当指出的是，20张扁桃体载玻片得到-1的分数，其中许多带有评论为“更难以看到核细节”。

在图5A中，只有两（2）张测试载玻片得到-2的分数。病理学家2在为诊断清晰度评分时观察并评论“组织上面的蓝色斑点”。这些蓝色斑点随机出现在所有组织类型上。应当指出的是，病理学家2确实评论说，在几个皮肤对上“看到日光性弹性纤维病容易得多”，但对于这个病理学家并未影响诊断清晰度。有趣的是注意到在图5A（病理学家1）中对于每种规程观察到比图5B（病理学家2）更大的散布。

如在图6中所看到的，当将伊红调至较低的设置时，用在缓和情况下染色的载玻片变得更容易看到日光性弹性纤维病。

这个研究是为了检查由于用转移溶液替换洗涤改善的伊红染色将对诊断具有的任何影响。如从结果中所看到的，对于大多数组织类型，效果是非常积极的，然而，在少数皮肤病变上，较亮的伊红可能压倒苏木精染色，从而妨碍诊断。

实施例3-黏蛋白可调性

引出这项黏蛋白染色研究以确定染色规程缓和对HE 600除去黏蛋白染色的能力的影响。在筛选了用于黏蛋白染色的几例结肠病例后，我们选择了四个病例，并在具有匹配的H和E以使高A和低A载玻片成对的各种苏木精溶液、酸性溶液和伊红溶液设置（HAE设置）（参见实施例1）对总计100张载玻片进行了染色，以查看黏蛋白染色是否可调（参见表4）。

表4：用于黏蛋白研究的规程和缓和

使利用所述六个规程的载玻片试验成对，并在H1A1E1-H1A5E1、H4A1E5-H4A3E5和H10A1E10-H10A3E10之间比较的情况下进行评分。结果显示，与标称染色剂相比，转移溶液缓和对黏蛋白的可调性具有最小的影响，而黏蛋白染色可变性稍微增加。然而，酸洗移动缓和具有显著影响，从而导致黏蛋白染色剂水平上更差的黏蛋白可调性和大得多的可变性。这可以从以下事实看出：对于酸洗移动缓和，横过HAE设置混合的黏蛋白强度的箱线图（boxplot）大得多，如在图8A中所看到的。此外，在图8B中，对于个别HAE设置，人们可以看到，酸洗移动比标称或转移溶液缓和显示出高和低酸洗设置之间黏蛋白强度中大得多的重叠。

在黏蛋白染色剂可调性方面，两种缓和均显示出消极作用，从而降低了除去黏蛋白的能力。转移溶液缓和显示了非常小的作用，这是因为我们预计它不会对苏木精染色产生任何影响。然而，酸洗移动缓和显示出对黏蛋白除去的较大影响，这是可以预期的，因为将酸洗移动到伊红之后严重影响其除去苏木精的能力。到那时已经发生了蓝化（bluing）处理，从而使苏木精不溶并且更难以除去。

黏蛋白染色剂的“可调性”不受转移溶液缓和的影响，但被酸洗缓和强有力地降低。

实施例4-缓和对标称染色剂的非劣效性（Non-Inferiority）

图3中举例说明的两种缓和遍及所使用的组织都显示了普遍的非劣效性，同时缓和＃1和缓和＃2两者比起当前的标称染色剂来对于所用组织均改善了诊断清晰度、伊红染色剂一致性和偏爱分数（此处所有分数均基于缓和载玻片和当前染色剂标称载玻片之间的比较）。缓和＃1和缓和＃2两者均显示出比起标称染色剂来显著的改善，如在图9A中所可以看出的，其中平均值在每次测量中均显著不同于零（根据95％置信区间）。缓和＃1在一致性（p<.001，双样本t-检验Minitab）和总偏爱（p=.009，双样本t-检验Minitab）中显示出比缓和＃2更大的改善，而诊断清晰度在缓和＃2和缓和＃1之间显示相似结果（差异检验中p<.058，双样本t-检验Minitab）。此外，如果人们认为-2或-3分数是失败，则两种缓和的100％均通过了诊断清晰度，两种缓和的<1％的总偏爱失败，且缓和＃2的1.25％和缓和＃1的<.5％的伊红一致性失败。

当我们如在图9B中所看到的按组织类型将非劣效性分数分开时，我们看到乳腺组织中比起标称来最大的改善，后面是结肠和皮肤，这不意外，这是因为这三种组织类型是浅伊红染色中抱怨的主要方面。然而，扁桃体和肾也显示出改善。

当我们如在图9C中所看到的按照规程试验将两种缓和分离时，唯一明显的趋势是H1A5E1（苏木精、酸洗和伊红设置）规程倾向于表现更好，而H7A0E3表现更差。不清楚为什么会发生这种情况，在A0处除外，缓和＃2应当不具有比起标称来的改善（A0表示未应用酸洗，因此标称和缓和＃2染色剂应该相同）。为什么这影响缓和＃1是不清楚的。至于为什么H1A5E1表现更好，可能更长的酸洗改善了缓和＃2（更长的伊红后酸洗温育可以改善伊红保持，或者可能改善伊红分色）。对于缓和＃1，这是不清楚的，除非更浅的伊红设置抵消了由缓和所引起的伊红强度增加。这些差异相当可能仅仅是噪声。

这项研究显示了对于横过多种组织类型的两种缓和的总染色剂改善。它还揭示了横过组织和规程类型的趋势，一些是预期的，其他则是出乎意料的，但与这些趋势无关，横过在此处测试的所有规程和组织，缓和都胜过当前的标称染色剂。

实施例5-再现性

在这个研究中考察了四种类型的再现性：新染色方法中的再现性（缓和＃1-缓和＃1，缓和＃2-缓和＃2和新脚本标称（New Script Nominal）-新脚本标称）和新脚本标称（NSN）和旧脚本标称（OSN）之间的再现性。这是为了确保新染色方法与当前的标称染色方法（OSN）一样可再现，并且NSN和OSN染色剂是相同的。缓和＃1和缓和＃2在图3中举例说明。

此处以这样的方式测量染色剂再现性，以使染色剂环境中可能的可变性达到最大。载玻片比较始终是在于不同仪器、不同盘和盘中不同载玻片位置上染色的载玻片之间进行的。彼此在10次切割内的接近的组织切片用于减少组织变化的影响。染色剂相似性以0-3的尺度进行评分，数字越高意味着越不相似。如果我们认为0和1为通过分数，则每种缓和的一致水平为：缓和＃1 62％，缓和＃2 50％，NSN 46％和NSN对OSN 55％，如在表5中所看到的。

表5：再现性一致率、界限和计数。

考察图10A和10B中的分布，缓和＃1通过强有力地减少被断定为3（显著不同）的染色剂比较数目并增加评定为0（相同）的数目来提高再现性。在Minitab中运行Tukey方法比较揭示，缓和＃1染色剂比其他染色剂显著更可再现，同时再现性水平在缓和＃1和所有其他染色方法之间显著不同。其他染色方法在染色剂相似性中没有显示任何显著差异。Tukey方法比较本质上是对于多重比较进行校正的t-检验，从而使得其比单独t-检验更适合于多重比较组（它降低了第I类错误率）。

在再现性方面，由于载玻片之间伊红染色剂再现性的改善，缓和＃1显著提高了载玻片之间的再现性。缓和＃2相似地改善了载玻片之间的伊红染色剂再现性，但是这种改善被苏木精的载玻片之间再现性降低所抵消。

这项研究是为了证明缓和没有影响染色剂再现性，且这在此处进行了证明。实际上，在分析时，洗涤的转移溶液替换显著提高再现性（特别地，伊红染色剂再现性），而酸洗移动具有总体中性的影响（在降低苏木精再现性的同时提高伊红再现性）。

额外的实施方案

在一些实施方案中，染色***包括除本文所述的那些以外的部件。可以并入本***和方法中的额外的实施方案、特征、***、设备、材料、方法和技术在美国专利Nos. 8,911,815；9,498,791；9,618,430；7,468,161；和6,352,861中描述，其公开内容特此整体引入本文作为参考。染色***的再额外的部件在美国专利Nos. 7,303,725、8,048,373、9,528,918和9,192,935中描述，其公开内容特此整体引入作为参考。

在一些实施方案中，染色***包括统装流体容器（例如，以在分配或应用于样品之前容纳本文所述的任何溶液）。在一些实施方案中，载玻片加工装置在一些实施方案中进一步包括许多额外的染色构件和被进行配置以独立地控制每个染色构件的控制器。

在一些实施方案中，染色***可以包括支撑许多工作站的框架，所述工作站包括例如排列在塔中的一个或多个干燥或烘烤操作台或构件、去蜡或脱蜡操作台或构件、一个或多个染色操作台或构件以及盖片操作台或构件。在一些实施方案中，靠近塔设置有运输和升降机机构，用于将设计为携带许多个别的带有标本的载玻片的载玻片盘从盘贮藏操作台运输通过干燥/烘烤、去蜡、染色和盖片工序。

在一些实施方案中，盘贮藏车库（garage）或操作台包括一对支柱，其带有许多用于容纳载玻片盘的彼此垂直隔开的架子或滑轨。在一些实施方案中，贮藏操作台或车库包括枢轴安装的门，从而提供到第一架子位置的通路（为清楚起见，已省略了车库的外部壳或盖）。通常表示为包括由一对由驱动马达和传动装置驱动的可旋转安装的主动轮的盘驱动组件设置在第一架子位置的下面，用于将盘移入和移出入口。

在一些实施方案中，载玻片盘包括具有大概矩形样式的盘状物或载玻片盘，包括底壁、相对的侧壁和相对的端壁。载玻片盘一般通过常规的注射模塑法使用打算供这种用途使用的合成聚合物形成，这在本领域中是众所周知的。

在一些实施方案中，盘包括标本载玻片支撑支架，用于将标本载玻片固定在同一平面中的基本水平位置。如将在下文所述的，将所有载玻片固定在同一平面上便于烘烤和干燥，并且如将在下文所述的还防止在脱蜡和染色过程中载玻片的交叉污染。在一些实施方案中，支架包括许多载玻片弹簧支撑物，其一旦放置在载玻片盘上，就限制了标本载玻片的轴向、横向和垂直运动。在一些实施方案中，支架以足够的高度被支撑在盘底部上面，以阻止或防止在标本载玻片底部与盘底部之间形成的膜或气泡的形成。在一些实施方案中，载玻片弹簧支撑物通过在标本载玻片的相对边缘上施加力来将各个标本载玻片固定就位。载玻片盘的底部朝着中部倾斜，以便于排放到中央位置用于排空去蜡流体和染色剂，如将在下文中详细描述的。在一些实施方案中，盘允许通过干燥/烘烤、脱蜡、染色和盖片的步骤自动处理许多标本载玻片。在一些实施方案中，盘包括防溅围栏，并且被布置成容纳布置在大概水平的两个载玻片宽且八个载玻片高的格子中的16个标本载玻片。

染色构件可以包括至少一个加热元件，其被进行定位以传导地加热第一侧壁、第二侧壁或两者。载玻片夹具可用于在横过标本操纵液体带的同时加热载玻片、标本和/或液体。

在一些实施方案中，控制器包括一个或多个存储器和可编程序的处理器。存储器存储第一程序指令序列和第二程序指令序列。可编程序的处理器被进行配置以执行第一程序指令序列，以使用第一液体处理载玻片上的标本，并且被进行配置以执行第二程序指令序列，以使用与第一液体不同的第二液体处理标本。在一些实施方案中，可编程序的处理器被进行配置以执行第一程序指令序列以加热载玻片，并且控制器被进行配置以执行第二程序指令序列以将载玻片加热至第二温度，所述第二温度与所述第一温度不同。

在一些实施方案中，控制器被进行配置以执行第一程序指令序列，以操作分配设备以第一速率将第一液体递送至载玻片。控制器被进一步进行配置以执行第二程序指令序列，以操作分配设备以不同于第一速率的第二速率将第二液体递送至载玻片。

本公开内容的至少一些实施方案涉及计算机***或集成到***的控制器或控制***中的计算机。数字病理学***可以包括成像装置（例如，具有用于扫描带有标本的显微镜载玻片的设备的装置）和计算机，由此成像装置和计算机可以通信联络地偶联在一起（例如，直接地或通过网络间接地）。计算机***可以包括台式计算机，膝上型计算机，平板电脑（tablet）等，数字电子电路***，固件，硬件，存储器，计算机存储介质，计算机程序或指令集（例如，在程序存储在存储器或存储介质中的场合），一个或多个处理器（包括编程序的处理器）以及任何其他硬件，软件或固件构件或其组合（如本文进一步所述的）。例如，计算***可以包括具有显示设备和外壳的计算机。

这个说明书中描述的主题和操作的实施方案可以在数字电子电路***中，或在计算机软件、固件或硬件中实施，包括这个说明书中公开的结构及其结构等价物，或者以其一种或多种的组合。这个说明书中描述的主题的实施方案可以被作为一个或多个计算机程序实施，即，计算机程序指令的一个或多个模块，其被编码在计算机存储介质上以由数据处理装置执行或控制数据处理装置的操作。本文所述的任何模块都可以包括由一个或多个处理器执行的逻辑运算（logic）。如本文中所使用的，“逻辑运算”是指具有可以被应用来影响处理器的操作的指令信号和/或数据的形式的任何信息。软件是逻辑运算的一个例子。

计算机存储介质可以是计算机可读存储设备、计算机可读存储基片、随机或串行存取存储器阵列或设备或它们中的一种或多种的组合，或可以包括在其中。此外，尽管计算机存储介质不是传播的信号，但是计算机存储介质可以是人工产生的传播的信号中编码的计算机程序指令的来源或目的地。计算机存储介质还可以是一个或多个单独的物理部件或介质（例如，多个CDs、磁盘或其他存储设备），或可以包括在其中。这个说明书中描述的操作可以被作为由数据处理装置对存储在一个或多个计算机可读存储设备上或从其他来源接收的数据执行的操作实施。

术语“编程序的处理器”包括用于处理数据的所有种类的装置、设备和机器，作为实例包括可编程序的微处理器，计算机，片上***（system on a chip），或前述的多个或组合。装置可以包括专用逻辑电路***，例如，FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路）。除了硬件之外，装置还可以包括为正在讨论中的计算机程序建立执行环境的代码，例如，构成处理器固件、协议栈（protocol stack）、数据库管理***、操作***、跨平台运行时间环境、虚拟机（virtual machine）或其中一个或多个的组合的代码。装置和执行环境可以实现各种不同的计算模型基础结构，例如万维网服务（web services）、分布式计算（distributed computing）和网格计算（grid computing）基础结构。

计算机程序（也称为程序、软件、软件应用程序、脚本或代码）可以用任何形式的程序设计语言（包括编译型或解释型语言、声明式或过程化语言）编写，且其可以以任何形式进行配置，包括作为可独立应用的程序或作为适合供计算环境里使用的模块、组件、子程序、对象或其他单元。计算机程序可以但不需要对应于文件***中的文件。程序可以存储在保存其他程序或数据的文件的一部分中（例如，存储在标记语言文件中的一个或多个脚本）、专用于正在讨论中的程序的单个文件或多个协调文件（例如，存储一个或多个模块、子程序或部分代码的文件）中。可以配置计算机程序以在位于一个位置或分布在多个位置并通过通信网络互连的一台计算机或多台计算机上执行。

这个说明书中描述的方法和逻辑流程图可以由一个或多个可编程序的处理器执行，所述可编程序的处理器执行一个或多个计算机程序以通过对输入数据进行操作并产生输出来执行动作。方法和逻辑流程图也可以由专用逻辑电路***执行，并且装置也可以作为专用逻辑电路***实施，例如，FPGA（现场可编程门阵列）或ASIC（专用集成电路）。

作为实例，适合于执行计算机程序的处理器包括通用和专用微处理器，以及任何种类的数字计算机的任何一种或多种处理器。通常，处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的基本元件是用于根据指令执行动作的处理器和用于存储指令和数据的一个或多个存储设备。通常，计算机还将包括一个或多个用于存储数据的大容量存储设备（例如，磁盘、磁光盘（magneto-optical disks）或光盘）或可操作地偶联以从一个或多个用于存储数据的大容量存储设备（例如，磁盘、磁光盘或光盘）接收数据或将数据传输到一个或多个用于存储数据的大容量存储设备（例如，磁盘、磁光盘或光盘）或两者。然而，计算机不需要具有这种设备。此外，计算机可以被嵌入另一种设备中，例如，移动电话、个人数字助理（PDA）、移动音频或视频播放机、游戏控制台、全球定位***（GPS）接收机或便携式存储设备（例如，通用串行总线（USB）闪存驱动器），仅举几个例子。适合于存储计算机程序指令和数据的设备包括所有形式的非易失性存储器、介质和存储设备，作为实例包括半导体存储设备，例如，EPROM、EEPROM和闪存设备；磁盘，例如，内部硬盘或可移动磁盘；磁光盘；以及CD-ROM和DVD-ROM盘。处理器和存储器可以由专用逻辑电路***补充或并入专用逻辑电路***中。

为了保证与用户的交互，这个说明书中描述的主题的实施方案可以在计算机上实施，所述计算机具有用于向用户显示信息的显示设备，例如，LCD（液晶显示器）、LED（发光二极管）显示器或OLED（有机发光二极管）显示器，以及键盘和定点设备（pointing device），例如，鼠标或轨迹球（trackball），用户可以通过其向计算机提供输入。在一些执行过程中，触摸屏可以用于显示信息并从用户接收输入。其他种类的设备也可以用于保证与用户的交互；例如，提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈，例如，视觉反馈、听觉反馈或触觉反馈；并且来自用户的输入可以以任何形式接收，包括声频、语言或触觉输入。此外，计算机可以通过向用户使用的设备发送文件以及从用户使用的设备接收文件来与用户进行交互；例如，通过响应从万维网浏览器收到的请求，将网页发送到用户客户端设备上的万维网浏览器。

这个说明书中描述的主题的实施方案可以在计算***中实施，所述计算***包括后端组件（back-end component），例如，作为数据服务器，或包括中间件组件（middlewarecomponent），例如，应用服务器，或包括前端组件（front-end component），例如具有图形用户界面或万维网浏览器的客户端计算机，用户可以通过其与这个说明书中描述的主题的实施进行交互，或一种或多种这种后端、中间件或前端组件的任何组合。***的组件可以通过任何形式或介质的数字数据通信（例如，通信网络）互连。通信网络的示例包括局域网（“LAN”）和广域网（“WAN”），互联网络（inter-network）（例如，因特网）和对等网络（peer-to-peer networks）（例如，特定对等网络）。例如，图1的网络20可以包括一个或多个局域网。

计算***可以包括任意数目的客户端和服务器。客户端和服务器通常彼此远离，并且一般通过通信网络进行交互。客户端和服务器的关系依靠在各个计算机上运行并彼此具有客户端-服务器关系的计算机程序产生。在一些实施方案中，服务器将数据（例如，HTML页面）发送到客户端设备（例如，为了向与客户端设备交互的用户显示数据并从其接收用户输入起见）。可以在服务器处从客户端设备接收在客户端设备处产生的数据（例如，用户交互的结果）。

成像***或装置可以是多光谱成像（multispectral imaging）（MSI）***或荧光显微镜术***。此处使用的成像***是MSI。通常，MSI通过提供使用像素水平的图像光谱分布的机会，为病理学标本的分析装备了计算机化的基于显微镜的成像***。尽管存在多种多光谱成像***，但是所有这些***共有的操作方面是形成多光谱图像的能力。多光谱图像是一种横过电磁谱捕获特定波长或特定光谱带宽的图像数据的图像。这些波长可以通过滤光片或通过使用能够选择预定光谱成分的其他仪器挑选出来，所述预定光谱成分包括超出可见光范围的波长的电磁辐射，如例如红外（IR）。

MSI***可以包括光学成像***，其一部分含有光谱选择性***（spectrally-selective system），所述光谱选择性***可调谐以限定预定数目N的离散光学频带（optical bands）。光学***可以适合于成像组织样品，其用宽频带光源透射照射到光学检测器上。在一个实施方案中可以包括如例如显微镜的放大***的光学成像***具有通常在空间上与光学***的单个光学输出对准的单个光轴。当光谱选择性***被调节或调谐时（例如利用计算机处理器），***形成组织的图像序列，以确保在不同的离散光谱带中获取图像。装置可以额外含有显示器，其中出现来自所获取的图像序列的组织的至少一个视觉可觉察的图像。光谱选择性***可以包括诸如衍射光栅的光学色散元件，诸如薄膜干涉滤光片的光学滤光片的集合或任何其他***，所述任何其他***适合于响应用户的输入或预编程序的处理器的命令从自光源通过样品朝检测器透射的光谱选择特定通带。

备择的实施，光谱选择性***限定了对应于N个离散光谱带的几个光学输出。这种类型的***吸收从光学***透射的光输出，并以这样的方式沿着N个空间上不同的光路在空间上使这种光输出的至少一部分改方向，以便沿着对应于这个鉴定的光谱带的光路在鉴定的光谱带中将样品成像到检测器***上。

这个说明书中提及的和/或申请数据表中列举的所有美国专利、美国专利申请公开物、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开物均整体引入本文作为参考。如果需要，则可以修改实施方案的各方面，以采用各专利、申请和公开物的概念以提供再进一步的实施方案。

尽管已经参考许多举例说明性实施方案描述了本公开内容，但是应当理解，本领域技术人员可以设计出许多其他修改和实施方案，它们将落入本公开内容原理的精神和范围内。更特别地，在不背离本公开内容的精神的情况下，在前述公开内容、附图和所附权利要求的范围内，主题组合布置的组成部分和/或布置中的合理变化和修改是可能的。除了组成部分和/或布置的变化和修改之外，备择用途对本领域技术人员而言也是明显的。

Claims (56)

1.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法包括：

（a）将预定量的苏木精溶液分配至所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；

（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；

（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；

（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；

（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和

（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

2.权利要求1的方法，其中在伊红染色之前不分配酸性溶液。

3.权利要求1的方法，其中所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。

4.前述权利要求任一项的方法，其中所述至少一种额外的溶液选自洗涤溶液或转移溶液。

5.权利要求1或权利要求3的方法，其中所述至少一种额外的溶液是酸性溶液。

6.权利要求4的方法，其中所述至少一种额外的溶液是洗涤溶液。

7.权利要求6的方法，其中所述将至少一种额外的溶液分配至所述标本包括：（i）分配洗涤溶液；（ii）至少部分地除去所述洗涤溶液；（iii）分配酸性溶液；和（iv）至少部分地除去所述酸性溶液。

8.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括在从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液之后并且在分配所述碱性溶液之前分配洗涤溶液。

9.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括（i）在从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液之后并且在分配所述碱性溶液之前分配酸性溶液；（ii）从所述标本至少部分地除去所述酸性溶液；和（iii）在分配所述碱性溶液之前将洗涤溶液分配至所述标本。

10.根据权利要求1-9任一项的方法染色的生物样品。

11.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法基本上由下述组成：

（a）将预定量的洗涤溶液分配至所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述洗涤溶液；

（c）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；

（e）将预定量的酸性溶液分配至所述标本；

（f）至少部分地除去所述酸性溶液；和

（g）将洗涤溶液分配至所述标本。

12.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法由下述组成：

（a）将预定量的洗涤溶液分配至所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述洗涤溶液；

（c）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；

（e）将预定量的酸性溶液分配至所述标本；

（f）至少部分地除去所述酸性溶液；和

（g）将洗涤溶液分配至所述标本。

13.根据权利要求11-12任一项的方法染色的生物样品。

14.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法包括：

（a）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及

（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中所述序贯地分配和除去的四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

15.权利要求14的方法，其中所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。

16.权利要求14-15任一项的方法，其中所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。

17.权利要求14-16任一项的方法，其中所述标本包含苏木精染色剂。

18.根据权利要求14-17任一项的方法染色的生物样品。

19.用于在自动组织学染色***内加工标本的方法，所述方法包括：

使所述标本与染色试剂接触；

使所述标本与洗涤溶液接触以至少部分地从所述标本除去所述染色试剂；

在使所述标本与所述洗涤溶液接触后，使所述标本与复染试剂接触；以及

使所述标本与酸性溶液接触；

其中在所述标本与复染剂接触之前所述标本不与酸性溶液接触。

20.用于在自动组织学染色***内加工标本的方法，所述方法包括：

使所述标本与染色试剂接触；

使所述标本与洗涤溶液接触以至少部分地从所述标本除去所述染色试剂；

在使所述标本与所述洗涤溶液接触后，使所述标本与复染试剂接触；以及

反复使所述标本与转移溶液接触；

其中在所述标本与复染剂接触之后所述标本不与洗涤溶液接触。

21.自动组织学染色***，其包括：

染色器；

染色器内的载玻片载体，其中所述载玻片载体带有具有在其上布置的生物标本的载玻片；和

染色器内的分配器，其被进行配置以将许多流体递送至所述载玻片；

其中所述***被进行配置以使得所述生物标本可以被初级染色剂和复染剂染色；并且其中所述***被进行配置以在用所述初级染色剂染色和用所述复染剂染色之间仅分配洗涤溶液、转移溶液和/或碱性溶液。

22.权利要求21的自动组织学染色***，其中所述统被进行配置以紧接在用所述复染剂染色之后递送酸性溶液。

23.权利要求21-22任一项的自动组织学染色***，其中所述***被进行配置以在用所述复染剂染色后仅分配酸性溶液、转移溶液和有机流体溶液。

24.权利要求23的自动组织学染色***，其中所述***在用所述复染剂染色后序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四等分部分的转移溶液。

25.***，其包括：

一个或多个处理器；和

存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：

（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；

（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；

（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；

（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；

（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和

（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

26.权利要求25的***，其中所述***包括在伊红染色之前不分配任何酸性溶液的指令。

27.权利要求25-26任一项的***，其中所述***进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本的指令。

28.***，其包括：

一个或多个处理器；和

存储指令的非暂时性计算机可读存储器，所述指令当由所述一个或多个处理器执行时，使自动组织学染色***：

（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和

（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

29.权利要求28的***，其中所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。

30.权利要求28-29任一项的***，其中所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。

31.权利要求28-30任一项的***，其中所述标本包含苏木精染色剂。

32.权利要求25-31任一项的***，其中所述自动组织学染色***是权利要求21-24任一项的自动组织学染色***。

33.编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令当由计算***的处理设备执行时，使自动组织学染色***：

（a）将预定量的苏木精溶液分配至标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；

（c）将预定量的碱性溶液分配至所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；

（e）将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；

（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；

（g）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和

（i）将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

34.编码有指令的非暂时性计算机可读存储介质，所述指令当由计算***的处理设备执行时，使自动组织学染色***：

（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及

（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

35.权利要求33或34的非暂时性计算机可读存储介质，其中所述自动组织学染色***是权利要求21-24任一项的自动组织学染色***。

36.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法包括：

（a）将预定量的伊红染色溶液分配至标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；以及

（c）序贯地向所述标本分配并从所述标本除去四种额外的溶液，其中序贯地分配和除去的所述四种额外的溶液选自洗涤溶液和转移溶液，且其中所述四种额外的溶液中的至少两种是转移溶液。

37.权利要求36的方法，其中所述四种额外的溶液中的至少三种是转移溶液。

38.权利要求36-37任一项的方法，其中所述四种额外的溶液中的所有四种都是转移溶液。

39.权利要求36-38任一项的方法，其中所述标本包含苏木精染色剂。

40.对标本进行染色的方法，其包括：

（a）使预定量的苏木精溶液与所述标本接触；

（b）从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；

（c）使预定量的碱性溶液与所述标本接触；

（d）从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；

（e）使预定量的至少一种额外的溶液与所述标本接触；

（f）从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；

（g）使预定量的伊红染色溶液与所述标本接触；

（h）从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和

（i）使预定量的酸性溶液与所述标本接触。

41.权利要求40的方法，其中在伊红染色之前不分配酸性溶液。

42.权利要求41的方法，其中所述方法进一步包括在苏木精染色之后但在伊红染色之前将酸性溶液分配至所述标本。

43.权利要求40-42任一项的方法，其中使用自动标本加工装置对所述标本进行染色。

44.权利要求40-43任一项的方法，其中使用浸与泡技术将所述标本染色。

45.权利要求40-42和44任一项的方法，其中所述标本被手动染色。

46.自动组织学染色***，其包括：

染色器；

染色器内的载玻片载体，其中所述载玻片载体带有具有在其上布置的生物标本的载玻片；和

染色器内的分配器，其被进行配置以将许多流体递送至所述载玻片；

其中所述***被进行配置以使得所述生物标本可以被初级染色剂和复染剂染色；并且其中所述***被进行配置以在用所述初级染色剂染色和用所述复染剂染色之间仅分配洗涤溶液、转移溶液和/或碱性溶液，且

其中所述载玻片载体是将载玻片固定在水平位置的盘。

47.用自动标本加工装置对布置于基底上的标本进行染色的方法，所述方法由下述组成：

（a）将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去伊红溶液；

（c）将预定量的酸性溶液分配至所述标本；

（d）至少部分地除去所述酸性溶液；以及

（e）将额外的溶液分配至所述标本。

48.对标本进行染色的方法，其由下述组成：

（a）将预定量的伊红染色溶液应用于所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去伊红溶液；

（c）将预定量的酸性溶液应用于所述标本；

（d）至少部分地除去所述酸性溶液；以及

（e）将额外的溶液应用于所述标本。

49.权利要求48的方法，其中至少一个所述应用步骤是手动执行的。

50.权利要求48的方法，其中每个所述应用步骤都是手动执行的。

51.权利要求48-50任一项的方法，其中至少一个所述应用步骤包括用自动标本加工装置向所述标本进行分配，所述标本布置于基底上。

52.对标本进行染色的方法，其由下述组成：

（a）将预定量的初级染色溶液应用于所述标本；

（b）从所述标本至少部分地除去所述染色溶液；

（c）将预定量的复染溶液应用于所述标本；

（d）从所述标本至少部分地除去所述复染溶液；

（e）将预定量的酸性溶液应用于所述标本；

（f）从所述标本至少部分地除去所述酸性溶液；以及

（g）将额外的溶液应用于所述标本；其中在向所述标本应用所述初级染色溶液和向所述标本应用所述复染溶液之间不应用酸性溶液。

53.权利要求52的方法，其中每个所述应用步骤都是手动执行的。

54.用于加工许多带有生物组织样品的载玻片的自动方法，包括：

在大多数载玻片固定在载玻片盘中空间上共平面的、基本水平的位置的同时，在一个或多个工作站中的许多载玻片上执行一组载玻片加工操作，其中，所述载玻片加工操作组包括通过使一种或多种染色剂从至少一个试剂容器流动，通过流控技术构件，并流出安置于载玻片盘之上的至少一个分配喷嘴使处于空间上共平面、基本水平的位置上的载玻片上的样品染色，以及溶剂交换；

在执行至少包括染色和溶剂交换的一组载玻片加工操作之后，将固定许多载玻片的载玻片盘运输到自动盖片机工作站；

在将许多载玻片固定在载玻片盘中空间上共平面的、基本水平的位置的同时，使用自动盖片机工作站用单独的各个盖玻片将固定在载玻片盘中的许多载玻片盖片，从而使得载玻片上的盖玻片彼此隔开；以及

从自动盖片机工作站上取出固定了盖片的载玻片的载玻片盘；

其中，所述载玻片加工操作包括将预定量的苏木精溶液分配至标本；从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；将预定量的碱性溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

55.用于自动处理生物标本的装置，其包括：

至少一个将许多载玻片固定在基本水平的位置的载玻片盘，其中所述生物标本位于所述载玻片上；

一个或多个工作站，其容纳所述载玻片盘并且对固定在所述载玻片盘中的所述许多载玻片执行一个或多个载玻片加工操作；

将所述载玻片盘移入和移出所述一个或多个工作站的运输机；

与所述一个或多个工作站流体连通的流控技术构件，其向所述一个或多个工作站供应试剂；

与所述一个或多个工作站和所述流控技术构件流体连通的气动构件；

其中，所述气动构件向所述一个或多个工作站和所述流控技术构件供应真空和/或压缩气体；以及

与所述运输机、所述一个或多个工作站、所述流控技术构件和所述气动构件电连通的控制构件，其中所述控制构件在处理所述生物标本期间使所述装置的部件的功能协调；

其中所述***被这样进行配置以使得在应用染色剂和应用复染剂之间不分配酸性溶液。

56.权利要求55的***，其中所述***适合于将预定量的苏木精溶液分配至标本；从所述标本至少部分地除去所述苏木精溶液；将预定量的碱性溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述碱性溶液；将预定量的至少一种额外的溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述至少一种额外的溶液；将预定量的伊红染色溶液分配至所述标本；从所述标本至少部分地除去所述伊红溶液；和将预定量的酸性溶液分配至所述标本。

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