JP7436067B2

JP7436067B2 - ナノ低分子ペプチドｆｇ及びその眼底血管疾患の治療用薬物又は予防用薬物の調製への使用

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Publication number: JP7436067B2
Application number: JP2022135522A
Authority: JP
Inventors: 波胡; 亜男李; 浩王; 磊王
Original assignee: 武漢夫図生物科技有限公司
Priority date: 2021-08-29
Filing date: 2022-08-29
Publication date: 2024-02-21
Anticipated expiration: 2042-08-29
Also published as: US11795200B2; CN115010790A; CN115010790B; JP2023035974A; EP4141018A1; US20230102129A1

Description

本発明は生物医薬の分野に属し、具体的には、ナノ低分子ペプチドＦＧ及びその眼底血管疾患の治療や予防用薬物の調製への応用に関する。

糖尿病性網膜症（ＤＲ）は、糖尿病に最も一般的で最も深刻な合併症であり、ＤＲの主な病理学的変化は、網膜血管の過剰新生と漏出であり、中核なメカニズムは、局所的な低酸素により、血管新生促進因子の「過量」放出を誘導し、硝子体液内に血管新生促進因子を多く蓄積させ、血管を「過剰」に新生するように誘導するということであるが、これらの新生血管壁は完全ではなく、漏出が増加し、黄斑浮腫、網膜剥離を起こし、失明につながる。以上のメカニズムに対して、現在、ＤＲの治療は、主に、（１）レーザー光凝治療、（２）硝子体切除術、（３）血管新生阻害薬の硝子体注射の３種類に分けられ、レーザー光凝治療は、周辺の視野を犠牲して中央視野を保持する「棄車保帥」の治療法であり、徐々に血管新生阻害薬の硝子体注射で代替され、ＶＥＧＦ－Ａが血管新生及び漏出に重要な役割を果たすため、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦの硝子体内注射は糖尿病黄斑浮腫と増殖性糖尿病網膜症の臨床治療に広く用いられ、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療は臨床患者に多くのメリットをもたらすが、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦに関する治療には以下のボトルネックとなる問題が存在する。

１、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療の有効率が低い：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療を受けた患者の３０％のみが有効であり、これらの患者のａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療に対する反応性が低く、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ注射を単独して頻繁的に行っても、黄斑浮腫が持続的に発生する。

２、潜在的な侵害性が高い：（１）反復注射投薬によって、感染、白内障形成、硝子体出血が併発することで、病状を悪化させ、網膜剥離や失明を加速する可能性がある。（２）ＶＥＧＦはニューロンに対して保護効果を有し、ＶＥＧＦのレベルを低すぎるように下げる場合、神経毒性が起こり、網膜萎縮を起こし、視力を失う恐れがある。

３、注射技術への要求が高い：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療は硝子体注射を必要とする侵襲的治療方式であり、一部の患者は鏡下で操作する必要があるため、基幹病院で展開して普及しにくく、しかし、ＤＲ患者が多く、有効な治療を受けられない患者も多い。

４、抗体類薬物のコストが高い：ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療が有効な黄斑浮腫患者に関して、有効性が一時的なものに過ぎず、浮腫を抑えるために、月１回注射し、さらに頻繁的に注射する必要があり、治療期間が数年と長く、一般的な家族では耐えにくく、家族や社会に重い経済的負担をもたらす。

５、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦに対応する阻害ターゲットが単一である：ＶＥＧＦファミリーは、ＶＥＧＦ１２１、１６５、１８１等を含み、異なる細胞において異なる抗体を有し、結合ターゲットが複数あり、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦの調製には、相対的に最も有効な結合部位を選択し、他の結合部位を無視し、これにより、ＶＥＧＦは、一部の患者において、他の結合部位を介して有効な作用を発揮することができ、これは、３０％だけのａｎｔｉ－ＶＥＧＦの有効性につながる可能性があり、そして、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ薬物の限界だけでなく、抗体類薬物に共通の欠陥でもある。

６、ｓＳｅｍａ４Ｄは血管新生促進、漏出に重要な役割を果たす：出願人は、１１４例の糖尿病網膜病（ＤＲ）の眼房水検体に対してプロテインチップ分析を行い、２７５種類のタンパク質をスクリーニングしたところ、１４０ＫＤＳｅｍａ４Ｄ断片の特異性が高く発現され、且つ房水におけるｓＳｅｍａ４Ｄのレベルが高いほど、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療の有効性が低いことを発見し、同時に、以下のことが発見され、つまり、（１）Ｓｅｍａ４Ｄをノックアウトしたマウスの網膜新生血管モデル（ＯＩＲモデル）において、病理学的血管新生が顕著に減少し、ストレプトゾトシンで誘導した糖尿病マウスモデル（ＳＴＺモデル）において、血管外漏出が顕著に低下する。（２）ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄの一回注射とａｎｔｉ－ＶＥＧＦの相乗治療効果は、単一のａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療よりも顕著に高い。（３）漏出減少の面で、ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄの複数回注射はａｎｔｉ－ＶＥＧＦ治療よりも高い。以上の結果によると、ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄは、ａｎｔｉ－ＶＥＧＦと比べて、治療上の優位性を有することが検証される。つまり、ｓＳｅｍａ４Ｄのレベルの低減は、眼底血管新生及び漏出を阻害するための治療に有効なターゲットであり、しかし、現在、臨床的には、複数の受容体拮抗薬を使用すれば、互いの免疫メカニズムを励起し、効果を低くし又は副作用を増加させる可能性があるというジレンマがある。

本発明の目的は、分子式がＸ－ＦＦＶＬＫ－ＫＮＫＡＡＫＧであり、前記ＸがＣ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８である人工合成型のナノ低分子ペプチドを提供することである。

本発明の別の目的は、人工合成型のナノ低分子ペプチドの眼底血管疾患の治療や予防用薬物の調製への応用を提供することである。

人工合成型のナノ低分子ペプチドであって、その分子式はＸ－ＦＦＶＬＫ－ＫＮＫＡＡＫＧであり、前記ＸはＣ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８であり、ＸがＣ_１６である時の構造式は以下のとおりである。

上記人工合成型のナノ低分子ペプチドの眼底血管疾患の治療や予防用薬物の調製への応用であって、前記眼底血管疾患は、眼底血管新生による疾患、眼底病理学的血管外漏出による疾患、周皮細胞の遷移による疾患、内皮細胞の遷移又は漏出による疾患を含むが、これらに限定されない。

以上に記載の応用において、前記薬物の投与形態は、薬学的に許容可能な全ての投与形態であり、錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤、粉剤又は滴剤等を含むが、これらに限定されない。

１．本発明が提供するナノ低分子ペプチドは、非侵襲的で、安全で、有効であると共に、操作しやすい点眼薬の形態で投薬可能であり、現在、臨床薬物を侵襲的に硝子体に反復して注射しなければならないという技術的ボトルネックを打ち破る。

２．本発明が提供するナノ低分子ペプチドは、受容体を特異的に選択してｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質を内包することができ、これによって、ｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを効果的に低減し、それを任意の受容体と結合できないようにし、抗体類薬物阻害ターゲットが単一であるという欠陥が解消される。

３．該ナノ低分子ペプチド分子（ＦＧ）は構造が簡単な非タンパク質類製品であり、抗体類薬物と混合して使用可能であり、相互間の免疫反応を発生させず、複数の血管新生促進分子を低減する役割を果たした。

４．該ナノ低分子ペプチド分子（ＦＧ）は、現在、臨床的に応用される抗体類薬物の質量の百分の一であり、質量の面でも顕著な優位性を有する。１分子量が小さく、点眼でき、ペプチド自体が異なる。

５．該ナノ低分子ペプチド分子（ＦＧ）の作用時間は抗体薬物と比べて顕著な優位性を有し、患者に投薬する回数を低減し、臨床治療上のボトルネックを打ち破れる。

６．該ナノ低分子ペプチド分子（ＦＧ）は調製しやすく、調製コストが低く、治療費を大幅に低減することができる。且つ関連するメカニズムが明らかになる。

ナノ低分子ペプチドＦＨとＦＧの分子構造概略図である。ナノ低分子ペプチドＦＨとＦＧの一部の物理化学的性質である。ＦＨ、ＦＧナノ顆粒のＣＤスペクトルと動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルであり、中心の図は動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトルであり、左側はＦＨのＣＤスペクトル図であり、右側はＦＧのＣＤスペクトル図である。ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減可能であり、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れることを示す概略図である。Ａ：ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧは、純粋な培地システムにおいてｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減することができ、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れる。Ｂ：ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧを内皮細胞に添加することで、ｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減することができ、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れる。ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがＯＩＲモデルの眼底血管新生を顕著に阻害できることを示す概略図である。Ａにおいて、免疫蛍光染色結果によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが眼底病理学的血管新生を顕著に阻害することができる。Ｂは、免疫蛍光染色結果によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが眼底病理学的血管新生を顕著に阻害できることを示す統計図である。ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがＳＴＺモデルの眼底血管外漏出を顕著に阻害できることを示す概略図である。Ａにおいて、エバンスブルー漏出試験結果によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが眼底病理学的血管外漏出を顕著に阻害できる。Ｂは、エバンスブルー漏出試験結果によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが眼底病理学的血管外漏出を顕著に阻害できることを示す統計図である。ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが内皮細胞の遷移、漏出を顕著に阻害することを示す概略図である。Ａ－Ｂ：ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験とスクラッチ試験によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがｓＳｅｍａ４Ｄの内皮細胞遷移促進作用を遮断できることが実証される。Ｅ：ＴＥＥＲとフルオレセイン漏出試験によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがｓＳｅｍａ４Ｄの内皮細胞漏出促進作用を遮断できることが実証される。ナノ低分子ペプチドＦＨが周皮細胞の遷移を顕著に阻害することを示す概略図である。Ａにおいて、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがｓＳｅｍａ４Ｄの周皮細胞遷移促進作用を遮断できることが実証される。Ｂは、ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験によると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがｓＳｅｍａ４Ｄの周皮細胞遷移促進を遮断できることを示す統計図である。ナノ低分子ペプチドＦＨが点眼薬の形態で硝子体液に入ってｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを低減することを示す図である。Ａにおいて、小動物生体イメージングによると、ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが点眼薬の形態でマウス硝子体液に入ることが実証される。Ｂにおいて、Ｅｌｉｓａによると、ＦＨ、ＦＧ点眼薬が硝子体液内のｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを低減できることが発見される。

以下に、具体的な実施例と組み合わせて本発明をさらに説明する。本発明に記載の技術的解決手段は、特に説明されていない限り、本分野の一般的な解決手段である。前記試薬又は材料は、特に説明されていない限り、いずれも商業的供給源から由来する。本発明のｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質は、Ｓｅｍａ４Ｄに対して酵素切除を行った後の遊離Ｓｅｍａ４Ｄタンパク質であり、即ち、ｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質であり、Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ会社から購入される。本発明の実施例におけるＦＨ配列中のＣ_１６は、さらにＣ_１８又はＣ_１４又はＣ_１２に置換されてもよく、本発明は、Ｃ_１６を例としてその効果を説明するが、簡素化するために、上記の他の長さの炭素鎖に置換されても、本発明の技術的効果を得ることができる。

本発明の実施例におけるＦＧ配列中のＣ_１６は、さらにＣ_１８又はＣ_１４又はＣ_１２に置換されてもよく、本発明はＣ_１６を例として説明するが、簡素化するために、上記の他の長さの炭素鎖に置換されても、本発明の技術的効果を得ることができる。

実施例１：
ナノ低分子ペプチドＦＨとＦＧの分子構造は以下のとおりであり、直接商業的に合成可能である。

実施例２：
ナノ顆粒ＦＨ、ＦＧの特徴づけ及び細胞毒性：
まず、濃度が２０μＭのＦＧとＦＨナノ顆粒溶液を調製し、調製方法では、ＦＧ（又はＦＨ）を０．０１ｍｍｏｌ計り、１ｍＬのＤＭＳＯ溶液に溶解し、その後、５倍希釈し、濃度を２ｍＭにし、母液Ａとする。母液Ａを１０μＬ取って１ｍＬの水に迅速に添加し、ボルテックス振盪を３０秒行い、ナノ顆粒溶液を得る。次に、試料を調製する。ＦＧ（又はＦＨ）溶液１０ｕｌを取り出して銅メッシュに滴下し、５分間経過後、濾紙で余計な溶液を吸い取る。１０μＬの酢酸ウラニル染色剤を滴下し、５分間経過後、濾紙で余計な染色剤を吸い取る。１０マイクロリットルの脱イオン水で１回洗浄する。試料を一晩真空乾燥する。最後に、ＨＴ－７７００透過型電子顕微鏡（日本東京日立会社）上に置いて、透過型電子顕微鏡によって観察を行う。縮尺は２００ｎｍである。

ＦＨ、ＦＧナノ顆粒のＣＤスペクトル：
室温で、光路長１ｍｍのＣＤ分光計（ＪＡＳＣＯ－１５００、日本東京）を使用してＦＨ、ＦＧナノ粒子（２０μＭ）を収集するＣＤスペクトルである。解像度１．０ｎｍ、走査速度３００ｎｍ／分で、１９０と３００ｎｍの間に測定を行う。毎回の測定に、３つのスペクトルを収集して平均値を取る。

結果は、図２に示すとおりであり、ＣＤスペクトル測定したところ、ＦＨ、ＦＧナノ粒子（２０μＭ、Ｈ_２Ｏに０．５％ジメチルスルホキシドを含有する）に誘導するｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質がない場合、２００ｎｍでのシグナルは負の値であり、ランダムコイル構造であることを示し、ｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質を添加して誘導した後に、２００ｎｍでのシグナルが正の値であり、且つ２２０ｎｍでのシグナルが負の値であり、βシート層折り畳み構造に変換されることを示す。

ＦＨ、ＦＧナノ粒子の動的光散乱（ＤＬＳ）スペクトル：
２５℃でｚｅｔａｓｉｚｅｒ（ＮａｎｏＺＺ９０、イギリスマルバーン）を用いてＦＨ、ＦＧナノ粒子の粒径とζ電位を測定する。

結果は図２に示すとおりであり、ＦＨ、ＦＧナノ粒子の粒径がそれぞれ５４．４３±２．８ｎｍ、５７．６７±２．６ｎｍであり、ＦＨ、ＦＧナノ粒子の電荷がそれぞれ＋４０．４ｍＶ、＋４４．８ｍＶである。

ＣＣＫ８法で検出したところ、１２、１４、３６時間時に、２０μＭのナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧは、内皮細胞（マウス脳微小血管初代内皮細胞）に毒性作用を与えない。

実施例３：
ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧは、ｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減することができ、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れる。
１）ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧは、純粋な培地システムにおいてｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減することができ、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れる。
それぞれナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧ、ＤＭＳＯ、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）を培地（培地におけるｓＳｅｍａ４Ｄが１６００ｎｇ／ｍＬである）に添加し、ＦＨ、ＦＧの最終濃度を２０μＭにし、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）（ＢＭＡ－１２、即ち、ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄ）の最終濃度を２μｇ／μＬにし、等体積ＤＭＳＯを添加して対照とし、それぞれ培養プレートを３７℃で１２、２４、３６、４８時間静置させ、培地を収集し、ＥＬＩＳＡ試薬キット（上海遠慕科技有限公司）で上澄みにおけるＳｅｍａ４Ｄタンパク質の発現量を検出する。

結果は図３のＡに示すとおりであり、結果によると、２４時間時に、ＦＨ、ＦＧ、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）はいずれもｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減することができ、３６時間時に、ＦＨ、ＦＧはｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減できるが、ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４ＤがｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減できず、同一の作用時間内に、ＦＨの作用強度はＦＧよりも高い。

２）ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧを内皮細胞（マウス脳微小血管初代内皮細胞）に添加することで、ｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを持続的に低減することができ、持続時間の面で抗体薬物よりも明らかに優れる。
６ウェル細胞培養プレートに内皮細胞を均一に接種し、３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータで２４時間培養し、それぞれナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧ、ＤＭＳＯ、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）を培地（培地におけるｓＳｅｍａ４Ｄが１６００ｎｇ／ｍＬである）に添加し、ＦＨの最終濃度を２０μＭにし、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）の最終濃度を２μｇ／μＬにし、等体積ＤＭＳＯを添加して対照とし、それぞれ培養プレートをインキュベータで１２、２４、３６、４８時間培養し、細胞培地を収集して遠心分離し、上澄みを取り、ＥＬＩＳＡ試薬キット（上海遠慕科技有限公司）で上澄みにおけるｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質の発現量を検出する。

結果は図３のＢに示すとおりであり、結果によると、２４時間時に、ＦＨ、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）はいずれもｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減することができ、３６時間時に、ＦＨはｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減できるが、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）がｓＳｅｍａ４Ｄの濃度を低減できず、同一の作用時間内に、ＦＨの作用強度はＦＧよりも高い。

実施例４：
共焦点でナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがＯＩＲモデルの眼底血管新生を顕著に阻害できることを検出する。
試験群（ＯＩＲ）：３－４ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスが出産した後、生後７日目のベイビーマウスと共に７５％酸素含有の酸素室に入れ、生後１２日目に、ベイビーマウスとメスマウスを取り出したすぐに、ベイビーマウスを麻酔し、その後、硝子体に２ｎｍｏｌＦＨ、２ｎｍｏｌＦＧ、１μｇＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）（ＢＭＡ－１２、即ち、ａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄ）を注射し、等体積のＤＭＳＯを対照とし、継続的に正常の空気中で５日飼育し、生後１７日目のベイビーマウスを麻酔し、生理食塩水を心臓に灌注した後、眼球を分離して固定し、ＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４で染色して４℃で一晩放置し、スプレッドで撮影する。

対照群（Ｎｏｒｍａｌ）：生まれたベイビーマウスであり、正常酸素の条件下で成長させ、生後１７日目のマウスを麻酔し、生理食塩水を心臓に灌注した後、眼球を取り、網膜を剥離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４で染色して４℃で一晩放置し、スプレッドで撮影する。

結果は図４のＡに示すとおりであり、レーザー共焦点で網膜血管新生を検出し、ＩｍａｇｅＪで網膜新生血管クラスタ面積の網膜面積に占める割合、即ち新生血管の割合を統計し、結果によると、ＦＨ、ＦＧは異常な血管の網膜総面積に占めるパーセントを低減し、ＦＨ、ＦＧ治療がＯＩＲモデルマウスの眼底血管新生を阻害でき、その治療効果がＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）に相当することを示し、図４のＢから分かるように、ＦＨの治療効果は最高である。

実施例５：
エバンスブルー漏出試験でナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧがＯＩＲモデルの眼底血管外漏出を顕著に阻害できることを検出する。
試験群（ＯＩＲ）：３－４ヶ月齢のＣ５７ＢＬ／６メスマウスが出産した後、生後７日目のベイビーマウスと共に７５％酸素含有の酸素室に入れ、生後１２日目に、ベイビーマウスとメスマウスを取り出したすぐに、ベイビーマウスを麻酔し、その後、硝子体に２ｎｍｏｌＦＨ、ＦＧ、１μｇＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）を注射し、等体積のＤＭＳＯを対照とし、継続的に正常空気中で５日飼育し、生後１７日目のベイビーマウスを麻酔し、生理食塩水を心臓に灌注した後、眼球を分離して固定し、ＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４で染色して４℃で一晩放置し、スプレッドで撮影する。
対照群（Ｎｏｒｍａｌ）：生まれたベイビーマウスであり、正常酸素の条件下で成長させ、生後１７日目のマウスを麻酔し、生理食塩水を心臓に灌注した後、眼球を取り、網膜を剥離し、４％パラホルムアルデヒドで固定し、３‰トリトンで破膜し、１５％ロバ血清でブロッキングした後、ＩｓｏｌｅｃｔｉｎＢ４で染色して４℃で一晩放置し、染色した網膜を４リーフを有する花弁状にせん断し、スライドガラスに平に広げ、蛍光顕微鏡で撮影する。

結果は図５に示すとおりであり、結果によると、ＦＨ、ＦＧは異常な血管の網膜総面積に占めるパーセントを低減し、ＦＨ、ＦＧ治療がＯＩＲモデルマウスの眼底血管外漏出を阻害でき、その治療効果がａｎｔｉ－Ｓｅｍａ４Ｄに相当することを示す。

実施例６：
ナノ低分子ペプチドＦＨが内皮細胞遷移、漏出を顕著に阻害する。
１）ナノ低分子ペプチドＦＨが内皮細胞の遷移（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験）を顕著に阻害する。
マウス脳微小血管初代内皮細胞を０．５％ＥＣＭで４－６時間飢餓させ、２４ウェルのｔｒａｎｓｗｅｌｌセル（８μｍ）の上層にマウス脳微小血管内皮細胞を接種し、セルにＦＨ（２０μＭ）、ＦＧ（２０μＭ）、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）（２μｇ／μＬ）を含有する１％ＥＣＭ培地（培地におけるｓＳｅｍａ４Ｄが１６００ｎｇ／ｍＬである）を添加し、等体積ＤＭＳＯを添加して対照とし、３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータで２４時間インキュベートし、２４時間後、セル底面の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡下でセル底面に貫入する内皮細胞をカウントする。

結果は図６のＡとＢに示すとおりであり、２４時間時に、ＦＨ、ＦＧはｓＳｅｍａ４Ｄで誘導した内皮細胞遷移を顕著に阻害でき、ＦＨ、ＦＧが内皮細胞遷移を阻害する効果はＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）よりも高い。

２）ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが内皮細胞の漏出（ＴＥＥＲ試験）を顕著に阻害する。
２４ウェルのｔｒａｎｓｗｅｌｌセル（０．４ｕｍ）の上層に一層のフィブロネクチンを先にコーティングし、室温で１時間インキュベートし、コーティングした後にマウス脳微小血管内皮細胞を接種し、細胞が満たすように５日培養した後、培地（培地におけるｓＳｅｍａ４Ｄが１６００ｎｇ／ｍＬ）内でそれぞれＦＨ（２０μＭ）、ＦＧ（２０μＭ）、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）（２μｇ／μＬ）を添加し、等体積ＤＭＳＯを添加して対照とし、ＥＣＭをブランク対照とし、３６時間インキュベートした後、細胞膜貫通抵抗測定器を使用してその抵抗値を測定する。

結果は図６のＣに示すとおりであり、３６時間時に、ＦＨ、ＦＧはｓＳｅｍａ４Ｄで誘導した内皮細胞の漏出を明らかに阻害でき、ＦＨ、ＦＧ効果がＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）に相当する。

実施例７：
ナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが周皮細胞の遷移（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ試験）を顕著に阻害する。
マウス初代脳微小血管周皮細胞（周皮細胞）を０．５％ＰＭで４－６時間飢餓させ、２４ウェルのｔｒａｎｓｗｅｌｌセル（８μｍ）の上層に周皮細胞を接種し、セルにＦＨ（２０μＭ）、ＦＧ（２０μＭ）、Ｓｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）（２μｇ／μＬ）を含有する培地（培地におけるｓＳｅｍａ４Ｄが１６００ｎｇ／ｍＬである）を添加し、等体積ＤＭＳＯを添加して対照とし、３７℃ ５％ＣＯ_２インキュベータで３６時間インキュベートし、３６時間後、セル底面の細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定し、クリスタルバイオレットで染色した後、顕微鏡下でセル底面に貫入する周皮細胞をカウントする。

結果は図７に示すとおりであり、３６時間時に、ＦＨ、ＦＧはｓＳｅｍａ４Ｄで誘導した周皮細胞の遷移を明らかに阻害でき、ＦＨが周皮細胞の遷移を阻害する効果はＳｅｍａ４Ｄ中和抗体（ＢＭＡ－１２）よりも高い。

実施例８：
１）小動物生体イメージングでナノ低分子ペプチドＦＨ、ＦＧが点眼薬、硝子体注射の形態でマウスの硝子体液に入ることが実証される。
１０μＬのＦＨとＦＧ点眼薬（濃度が２０μＭ、溶媒が人工涙液）をマウス（８週齢のＣ５７オスマウス）の眼球面に滴下し、１時間おきに１回滴下し、３回目点眼した１時間後に、マウスを麻酔すると共に心灌流を行い、マウスの眼球を取り出し、眼球表面の結合組織を切り出し、且つＰＢＳ溶液で眼球を複数回洗浄し、眼球表面のナノ点眼薬を除去する。眼球を小動物イメージング装置（発射波長５３５ｎｍ、励起波長４９０ｎｍ）に置いて画像を撮影する。

マウス（８週齢のＣ５７オスマウス）を４．３％抱水クロラール（０．０１ｍｌ／ｇ）で麻酔した後、抗生物質眼薬水（レボフロキサシン点眼薬）、眼球表面用麻薬（ベノキシネート塩酸塩点眼薬）を術前に点眼し、マウスの頭の位置を調整し、マウス眼球の角膜縁を水平に維持し、インスリン注射針を使用して角膜縁の後ろの１ｍｍで小口を開け、続いてｈａｍｉｌｔｏｎの３３Ｇ注射器で小口に沿って硝子体腔内に１μｌのナノ薬物ＦＨ（２０μＭ）、ＦＧ（２０μＭ）又は溶媒を注入し、針の先端を垂直に入れ、その後、傾斜させて注射し、針を０．５－１ｍｉｎ残した後、迅速に抜き出し、術後、抗生物質眼薬水で３日点眼し、感染を予防する。

結果は図８のＡに示すとおりである。

２）ＥｌｉｓａでＦＨ、ＦＧ点眼薬が硝子体液内のｓＳｅｍａ４Ｄのレベルを低減できることを検出する。
本実施例において、８週齢のＣ５７オスマウスを使用し、各群で、５匹のマウス試験結果の平均値であるデータ点を１０個取る。

２０μＭのＦＨとＦＧ点眼薬（溶媒が人工涙液）１０μＬを朝晩で１回マウスの眼球表面に滴下し、３日点眼した後、マウスを麻酔すると共に心灌流を行い、その後、マウスの眼球を取り出し、且つＰＢＳ溶液で眼球を複数回洗浄し、眼球面のナノ点眼薬を除去し、眼球の水分を濾紙で吸い抜き、硝子体液を放出して収集する。ＥＬＩＳＡ試薬キット（上海遠慕科技有限公司）で硝子体液におけるｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質の発現量を検出する。

対照群に同一体積のＰＢＳ溶液を滴下し、ビヒクル群に同一体積の人工涙液（思然）を滴下する。

結果は図８のＢに示すとおりであり、ＦＨとＦＧはいずれも滴剤として調製することができ、点眼の方式で硝子体液におけるｓＳｅｍａ４Ｄタンパク質の発現量を低減することができる。

［付記］
［付記１］
分子式がＸ－ＦＦＶＬＫ－ＫＮＫＡＡＫＧであり、前記ＸはＣ_１２、Ｃ_１４、Ｃ_１６、Ｃ_１８である、人工合成型のナノ低分子ペプチド。

［付記２］
付記１に記載のナノ低分子ペプチドの眼底血管疾患の治療や予防用薬物の調製への応用。

［付記３］
前記疾患は眼底血管の新生による疾患である、付記２に記載の応用。

［付記４］
前記疾患は眼底病理学的血管外漏出による疾患である、付記２に記載の応用。

［付記５］
前記疾患は周皮細胞の遷移による疾患である、付記２に記載の応用。

［付記６］
前記疾患は内皮細胞の遷移又は漏出による疾患である、付記２に記載の応用。

［付記７］
付記１に記載のナノ低分子ペプチドを薬物活性成分として、薬学的に許容可能な投与形態のいずれかに調製することを特徴とする、付記２に記載の応用。

［付記８］
前記投与形態は錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤、粉剤又は滴剤であることを特徴とする、付記７に記載の応用。

Claims

分子式がＸＦＦＶＬＫＫＮＫＡＡＫＧであり、
前記Ｘは、

からなる群より選択される炭素鎖である、人工合成型のナノ低分子ペプチド。
請求項１に記載のナノ低分子ペプチドの眼底血管疾患の治療用薬物又は予防用薬物の調製への使用。
前記疾患は眼底血管の新生による疾患である、請求項２に記載の使用。
前記疾患は眼底病理学的血管外漏出による疾患である、請求項２に記載の使用。
前記疾患は周皮細胞の遷移による疾患である、請求項２に記載の使用。
前記疾患は内皮細胞の遷移又は漏出による疾患である、請求項２に記載の使用。
請求項１に記載のナノ低分子ペプチドを薬物活性成分として、薬学的に許容可能な投与形態のいずれかに調製することを特徴とする、請求項２に記載の使用。
前記投与形態は錠剤、カプセル、顆粒剤、注射剤、粉剤又は滴剤であることを特徴とする、請求項７に記載の使用。