CN109776656B

CN109776656B - 一种用于抑制血管新生的多肽tin7n及其应用

Info

Publication number: CN109776656B
Application number: CN201910030074.2A
Authority: CN
Inventors: 许元生; 宋燕; 张时群; 苏博雅; 汤宇晴
Original assignee: Link Health Group
Current assignee: Link Health Group
Priority date: 2019-01-11
Filing date: 2019-01-11
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2039-01-11
Also published as: CN109776656A

Abstract

本发明公开了一种多肽TIN7N，其氨基酸序列是与SEQ ID NO.1相比具有13/16以上序列一致性的氨基酸序列；以及多肽TIN7N或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防血管新生引起的疾病的药物中的用途；本发明还公开了一种用于治疗血管新生引起的疾病的药物组合物，其包含多肽TIN7N、或多肽TIN7N在药学上接受的盐，以及药学上接受的载体。与现有的抑制血管新生的药物相比，具有以下优点：(1)多肽TIN7N长16个氨基酸，具有易于合成、成本低廉；(2)多肽TIN7N具有显著的抑制血管新生的作用；(3)多肽TIN7N在水中的溶解性较好，易于通过注射给药。

Description

一种用于抑制血管新生的多肽TIN7N及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，尤其是一种用于抑制血管新生的多肽TIN7N及其应用。

背景技术

血管新生(angiogenesis)是指新生血管的形成、发展及增长。一般而言，血管新生受到严格的调控，主要是通过诱导血管形成的因子(如血管内皮生长因子VEGF等)和抑制因子间的微妙平衡来调控。当这一平衡状态被打破时，通常会造成病理性血管新生。血管新生是一个动态的、多步骤的过程，现在已知多种疾病与血管新生紊乱相关，如癌症、眼部血管异常、感染、心血管疾病以及损伤等，故研究血管新生抑制剂具有重要意义。血管新生的主要过程包括血管基底膜降解，血管内皮细胞的激活、增殖、迁移，以芽生方式在原有血管基础上重构新的血管和血管网，这一过程主要由可溶性血管生成刺激因子诱导，如VEGF。

新生毛细血管的形成是许多疾病发展和扩散的关键所在，包括肿瘤、炎症性疾病和一些眼部综合征。新生血管性眼病是眼科难治性疾病，也是很多眼病致盲的重要原因，例如新生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、脉络膜疾病或玻璃体疾病和眼外伤等。年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)是一种与年龄相关的、视网膜色素上皮细胞和神经视网膜退行性变造成的不可逆性视力下降或丧失的疾病。全球约有3000万AMD患者，每年约有50万人因此致盲。随着我国经济发展及人口老龄化的加剧，AMD在我国发病率呈逐年上升的趋势，我国有500多万AMD患者，已成为我国第三大致盲原因。AMD是中央区视网膜慢性进展性疾病，临床上主要分为萎缩型(干性)与渗出型(湿性)两大类：萎缩型AMD常表现为双眼视力进行性下降，可见黄斑区色素紊乱，脉络膜毛细血管萎缩和玻璃膜疣的形成。渗出型主要特点是有脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)的形成，以及所引起的渗出、出血、机化、瘢痕等一系列病理改变。10％的AMD为新生血管渗漏型(即湿性)，但其引起的失明却占到90％。近年来，对于血管新生的基础和临床研究已取得了较大进展，在新生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、脉络膜疾病或玻璃体疾病和眼外伤等新生血管生成相关性疾病中，通过减少新生血管形成，可以达到控制疾病发展、改善临床症状的效果。

肿瘤的生长与转移依赖于血管新生，血管新生是肿瘤细胞生长、增殖、转移不可或缺的重要条件之一。在无血管新生的情况下，肿瘤细胞团块靠扩散方式从周围环境获得充足的营养和氧气，但此时肿瘤体积很少超过1mm³～2mm³。1971年，Folkman首次提出“肿瘤生长和转移是血管依赖性的，阻断肿瘤血管生成是遏止肿瘤生长的有效策略”，在此理论基础上进行的研究使抗血管生成药物进入临床，并在肿瘤治疗方面取得较好疗效。

目前血管新生相关疾病的治疗靶标主要是VEGF，常见的治疗药物主要是抗VEGF抗体(例如贝伐单抗)或融合蛋白、化疗药物等。但这些药物价格昂贵，在医药领域对于新型的抑制血管新生药物仍然存在较大需求。多肽是生物制药领域非常有潜力的一类候选物，其具有结构简单、免疫原性低、易于合成、成本低廉等优点。因此，能够抑制血管新生的多肽在治疗癌症、眼部血管异常、感染、心血管疾病以及损伤等方面具有广泛的应用前景。

发明内容

基于上述问题，本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种能够抑制血管新生的多肽，其可用于治疗与血管新生有关的疾病。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案包括以下几个方面：

在第一个方面，本发明提供了一种多肽TIN7N，所述多肽TIN7N的氨基酸序列是与SEQ ID NO.1相比具有13/16以上序列一致性的氨基酸序列。优选地，所述多肽TIN7N的氨基酸序列是与SEQ ID NO.1相比具有14/16或15/16序列一致性的氨基酸序列。应当说明的是，本发明的多肽TIN7N的氨基酸序列包括但不限于与SEQ ID NO.1相比具有13/16以上序列一致性的氨基酸序列，还可以是与SEQ ID NO.1相比具有9/16～12/16序列一致性的氨基酸序列，只要该多肽具有抑制血管新生的功能即可，则均落在本发明的保护范围中。

优选地，所述多肽TIN7N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在第二个方面，本发明提供了上述的多肽TIN7N或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防血管新生引起的疾病的药物中的用途。

优选地，所述盐为醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、草酸盐或酒石酸盐。更优选地，所述盐是醋酸盐。

优选地，所述血管新生引起的疾病为眼病或肿瘤。

优选地，所述眼病为新生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、脉络膜疾病或玻璃体疾病。更优选地，所述视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或视网膜动脉闭塞。更优选地，所述脉络膜疾病是湿性老年黄斑病变。

优选地，所述肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤。

在第三个方面，本发明提供了一种用于治疗血管新生引起的疾病的药物组合物，所述药物组合物包括上述的多肽TIN7N、或所述多肽TIN7N在药学上接受的盐，以及药学上接受的载体。需要说明的是，血管新生引起的疾病为眼病或肿瘤；优选地，所述眼病为新生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、脉络膜疾病或玻璃体疾病；更优选地，所述视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或视网膜动脉闭塞；更优选地，所述脉络膜疾病是湿性老年黄斑病变；优选地，所述肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤。

优选地，所述载体是水或胶体溶液。

优选地，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。

优选地，所述药物组合物是通过注射给药；更优选地，所述注射给药包括玻璃体注射、皮下注射或静脉注射。

与现有的抑制血管新生的药物相比，本发明的多肽TIN7N具有以下优点：

(1)多肽TIN7N长16个氨基酸，具有易于合成、成本低廉；

(2)在细胞体外实验中，多肽TIN7N可以抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)的血管形成和迁移，在斑马鱼血管新生模型中，多肽TIN7N可以抑制眼部新生血管的形成，因此，本发明的多肽TIN7N具有显著的抑制血管新生的作用；

(3)多肽TIN7N在水中的溶解性较好，易于通过注射给药。

附图说明

图1为PBS、TIN7N(100μg/ml)、贝伐单抗(100μg/ml)抑制人HUVEC细胞血管形成的显微镜照片；

图2为PBS、TIN7N、贝伐单抗抑制人HUVEC细胞血管形成结果的柱形图；

图3为PBS、TIN7N(100μg/ml)、贝伐单抗(100μg/ml)抑制人HUVEC细胞的Transwell照片；

图4为PBS、TIN7N、贝伐单抗抑制人HUVEC细胞的Transwell柱形图；

图5为生理盐水、TIN7N(1ng/尾)、贝伐单抗(250ng/尾)处理斑马鱼眼部血管增生模型的眼部血管照片；

图6为生理盐水、TIN7N、贝伐单抗处理斑马鱼眼部血管增生模型的眼部血管面积统计结果图；

图7为生理盐水、TIN7N、贝伐单抗处理斑马鱼眼部血管增生模型的病理图片。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。应当指出的是，对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出许多变化和改进，这些都属于本发明的保护范围。如无特别说明，本申请中的实验方法均为常规方法。如无特别说明，本申请中的试剂浓度均为质量浓度。

实施例1 多肽TIN7N的合成

多肽TIN7N(SEQ ID NO:1)采用常规固相工艺合成，合成的肽纯度＞98％。

实施例2 人脐静脉内皮细胞(HUVEC细胞)血管形成

原代培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Human umbilical vein endothelialcells)，加入3μg/ml、10μg/ml、30μg/ml、100μg/ml、300μg/ml和1000μg/ml的TIN7N处理，培养于Matrigel基质胶，4～6小时后，观察血管形成情况并计数，以PBS作为阴性对照，100μg/ml贝伐单抗作为阳性对照。

结果如图1和2所示，由图中可以看出，与阴性对照PBS相比，TIN7N对HUVEC的血管形成具有明显的抑制作用(*：p<0.05；**：p<0.01)，并且量效关系显著。

实施例3 Transwell检测细胞迁移能力

收集实施例2中的不同药物处理的细胞，计数1×10⁵个细胞，用无血清培养基重悬，加入Transwell细胞培养板的小室上室，在下室加入600μl完全培养基。在37℃、5％的CO₂环境下孵育12～48小时后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4％多聚甲醛固定20mins，PBS洗涤一次，结晶紫染色10mins，PBS洗涤一次，显微镜下观察细胞是否穿过小孔，如有穿过终止其他实验组，并拍照统计。

由图3、4可以看出，TIN7N可以剂量依赖的抑制HUVEC的迁移作用(**：p<0.01)。

实施例4 对斑马鱼眼部血管增生模型的作用

采用六水合氯化钴处理受精后1天(1dpf)的Fli-1品系转基因血管荧光斑马鱼，建立斑马鱼眼部血管增生模型。眼部血管增生模型斑马鱼随机分为11组，每组30尾于六孔板中，分注射给予TIN7N(剂量为1、3、10和30ng/尾剂量)、阳性对照贝伐单抗250ng/尾，同时设置正常对照组(正常斑马鱼，注射生理盐水)和模型对照组(注射生理盐水)。28℃培养箱孵育5天后，每组随机取10条斑马鱼，在荧光显微镜下观察斑马鱼眼部血管、拍照并保存图片。用高级图像处理软件尼康NIS-Elements D 3.10进行图像分析，计算斑马鱼眼部血管面积(S)，以眼部血管面积的统计学意义分别评价TIN7N对氯化钴诱发的斑马鱼眼部血管增生的抑制作用。统计学处理结果用mean±SE表示，对斑马鱼眼部血管增生的抑制作用计算公式如下：

统计学分析采用方差分析和Dunnett’s T-检验进行统计学分析，p<0.05表明具有显著性差异。

每试验组另各取10条斑马鱼，取眼部组织用4％多聚甲醛固定，经过脱水、包埋、切片和染色得到H&E染色切片，进行组织病理学检查。

荧光观察结果如图5和图6所示，阳性对照贝伐单抗组中，斑马鱼眼部血管面积明显小于模型对照组眼部血管面积(p<0.001)，对眼部血管增生的抑制作用为94％，表明贝伐单抗对斑马鱼眼部血管增生具有明显的抑制作用。剂量为1、3、10和30ng/尾的TIN7N对眼部血管增生抑制作用分别为91％、48％、58％和57％，与模型对照组比较差异均非常显著(p<0.001)。以上结果表明，在远低于贝伐单抗浓度(250ng/尾)的情况下，TIN7N对斑马鱼眼部血管增生具有显著的抑制作用。

病理结果如图7所示，模型对照组斑马鱼眼部组织病理学检查可见色素上皮层较正常对照组变薄，色素上皮层、视感视锥层和外核层三层视网膜结构模糊、紊乱，表明模型建立成功。阳性对照药贝伐单抗组斑马鱼眼部组织病理学检查显示色素上皮层厚度恢复正常，色素上皮层、视感视锥层和外核层三层视网膜结构清晰，表明贝伐单抗对眼部血管增生的斑马鱼视网膜结构有明显改善作用。剂量为1ng/尾的TIN7N斑马鱼眼部组织病理学检查显示色素上皮层厚度恢复正常，色素上皮层、视感视锥层和外核层三层视网膜结构清晰，剂量为3和10ng/尾的TIN7N斑马鱼眼部组织病理学检查显示色素上皮层厚度以及色素上皮层、视感视锥层和外核层三层视网膜结构较模型对照组均有所恢复，表明TIN7N对受损的视网膜有明显的改善。

由上述实施例的结果可知，本发明所提供的多肽TIN7N在体外可以抑制HUVEC细胞的血管形成和迁移，在斑马鱼血管新生模型中可以抑制眼部新生血管的形成，因此，多肽TIN7N具有显著的抑制血管新生的作用，可以用于治疗血管新生相关疾病，如眼病或肿瘤等，具有非常明显的临床应用价值。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州领晟医疗科技有限公司

<120> 一种用于抑制血管新生的多肽TIN7N及其应用

<130> 2019

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Gly Glu Ser Leu Thr Ile Asn Cys Val Phe Thr Asp Ser Ser Cys Gly

1 5 10 15

Claims

1.一种多肽TIN7N，其特征在于，所述多肽TIN7N的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的多肽TIN7N或其药学上可接受的盐在制备治疗和/或预防血管新生引起的疾病的药物中的用途。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述盐为醋酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、磷酸盐、硝酸盐、草酸盐或酒石酸盐。

4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述盐是醋酸盐。

5.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，所述血管新生引起的疾病为眼病或肿瘤。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述眼病为新生血管性角膜疾病、视网膜疾病、虹膜疾病、脉络膜疾病或玻璃体疾病。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或视网膜动脉闭塞。

8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述脉络膜疾病是湿性老年黄斑病变。

9.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为原发性肿瘤或继发性肿瘤。

10.一种用于治疗血管新生引起的疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1所述的多肽TIN7N、或所述多肽TIN7N在药学上接受的盐，以及药学上接受的载体。

11.根据权利要求10所述的药物组合物，其特征在于，所述载体是水或胶体溶液。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述胶体溶液为透明质酸凝胶。