JP7422365B2 - 外来抗原レセプター遺伝子導入細胞の製造方法 - Google Patents
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Description
(1)材料細胞のTCR遺伝子のC領域のエンハンサーと、V領域のプロモーターの間に、両者の距離を縮めるように、外来のTCR/CAR遺伝子を含む遺伝子を導入する(図2-1)。
(a)上流から順に、TCR遺伝子座のV領域プロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(b)材料細胞へ(a)のベクター上のV領域プロモーター配列から第2の組換え酵素標的配列までを含む配列をノックインする工程、および
(c)(b)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程を含む、抗原レセプター遺伝子導入のための材料細胞の製造方法である。
工程(a)
上流から順に、TCR遺伝子座のV領域プロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットをノックインするための「薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクター」を準備する。本態様において、上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを構築し、次いで薬剤耐性遺伝子カセットの上流にVプロモーター配列を含むノックイン用ターゲティングベクターを構築する。
薬剤耐性遺伝子カセットノックイン用ターゲティングベクターを、材料細胞のTCR遺伝子座へ相同組換えによりノックインする。ノックインは公知の方法にて行えば良く、例えばエレクトロポレーション法により行うことができる。
相同組換えに成功した材料細胞は、導入されたプロモーターの働きにより薬剤耐性遺伝子1が発現する。このため、相同組換えに成功した材料細胞を、薬剤耐性遺伝子1が耐性を有する薬剤の存在下で選択することができる。また、ターゲティングベクターの3’アームの下流にマーカー遺伝子を組み込んだ場合、5’アーム配列と3’アーム配列の薬剤耐性遺伝子カセットを含まない、いわゆる外側の部分が導入された材料細胞においては、マーカーとなる例えば細胞毒素が発現し、細胞は生存できない。よって、生存細胞を選択することによって、薬剤耐性カセットのノックインに成功した細胞を選択することができる。選択された材料細胞をさらにPCR法にて確認して、V領域プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットがノックインされている細胞のみを選択してもよい。
(B)TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを、TCR/CAR遺伝子導入用材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を適用して、材料細胞ゲノムに導入された薬剤耐性遺伝子カセットの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる部分を、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列と交換する工程、
(C)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(D)第2の組換え酵素を(C)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
再構成済TCRまたはCAR遺伝子の導入にはまず、上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来のTCR遺伝子またはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRカセット交換ベクターを準備する。
TCR/CAR導入用材料細胞へ、TCRカセット交換ベクターを導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させる。第1の組換え酵素を作用させるには、例えば第1の組換え酵素発現ベクターとともに、TCRカセット交換ベクターを導入する。第1の組換え酵素発現ベクターの発現によって、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列(i)とTCRカセット交換ベクター上の標的配列(i)、薬剤耐性遺伝子カセット上の標的配列(ii)とTCRカセット交換ベクター上の標的配列(ii)それぞれ同士の間での組換えが促進される。その結果、薬剤耐性遺伝子カセット上の第1の組換え酵素の標的配列(i)と(ii)で挟まれる部分が、TCRカセット交換ベクター上の同配列部分で挟まれる部分と交換される。
カセット交換が生じた材料細胞においては、第2の薬剤耐性遺伝子が発現する。従って、第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下でカセット交換後の材料細胞を培養することによって、カセット交換に成功した細胞を選択することができる。
選択された細胞へ、第2の組換え酵素を作用させる。第2の組換え酵素を作用させるには、例えば第2の組換え酵素の発現ベクターを当該選択された細胞へ導入すればよい。
T細胞以外の細胞のTCR遺伝子座では遺伝子再構成が起こらないため、TCR遺伝子は発現することがない。従って遺伝子導入には再構成済TCR遺伝子またはCAR遺伝子を用いる。材料細胞として多能性幹細胞等のT細胞以外の細胞を用いた場合、再構成済TCR遺伝子またはCAR遺伝子を発現させるためには、T細胞へ分化させる必要があり、分化させたT細胞は細胞療法に用いることができる。多能性幹細胞のT細胞への分化誘導方法としては例えばTimmermans et al., Journal of Immunology, 2009, 182: 6879-6888、Nishimura T et al, 2013, Cell Stem Cell 114-126、WO 2013176197 A1、 WO 2011096482 A1およびWOに記載の方法が例示される。Rag1遺伝子あるいはRag2遺伝子を欠失させることにより、TCRの再構成を抑制してもよい。Rag1遺伝子とRag2遺伝子については、どちらか一方を欠失させるだけでよい。
(2)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(1)の配列をノックインする工程、
(3)(2)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
(4)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来のTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(5)TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを(3)で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列と交換する工程、
(6)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(7)第2の組換え酵素を(6)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む外来のTCRまたはCAR遺伝子が導入された細胞の製造方法を提供する。
(1)上流から順に、TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(2)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(1)の配列をノックインする工程、
(3)(2)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
(4)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来の既知TCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、既知TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(5)既知TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを(3)で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、既知TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列と交換する工程、
(6)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
を含む方法により既知TCRまたはCAR遺伝子が導入された細胞を得、さらに
(7)得られた細胞をT細胞へと分化誘導する工程、
(8)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、所望のTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、所望のTCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(9)所望のTCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを(7)で得られたT細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、所望のTCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる既知TCRまたはCAR遺伝子配列と交換する工程、および
(10)第2の組換え酵素を(9)で得られた細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程。
KOD-Plus-Neo(Toyobo,KOD-401)、Amaxa(登録商標)Cell Line Nucleofector(登録商標)Kit V (Lonza,VACA-1003)、Gibson assembly master mix (New England Biolabs (NEB), E2611S)、 Gateway (登録商標)LRクロナーゼTMII酵素ミックス(Thermo Fisher Scientific, 11791-020)、Hygromycin B Gold(InvivoGen,ant-hg-1)、ピューロマイシン二塩酸塩(Wako,160-23151)、ガンシクロビル(Wako,078-04481、PE/Cy7 anti-human TCRα/β(BioLegend,306719)、APC Mouse Anti-Human CD3 (BD Pharmingen,557597)を用いた。
また、ベクターとしてpBRBlII-AscI_FRTPGKpacΔtkpA_AscIを用いた。
Jurkat細胞は、ヒト白血病細胞由来のT細胞株である。TCR遺伝子が放射線照射によって破壊された株(J.RT3-T3.5)を用いた(J. Exp. Med. 160. 1284-1299. 1984)。
薬剤耐性カセットベクターとして、図3Gに示すような、Cre組換え酵素の認識配列であるlox2272配列(5’-ATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTAT-3’(配列番号1))、マウスのホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)遺伝子のプロモーター配列(pPGK)、その下流にハイグロマイシン耐性遺伝子(Hygror)、PGK遺伝子のポリアデニル化配列(pA)をつなげ、その下流にlox2272とは異なるCreによる認識配列であるloxP配列(5’-ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT-3’(配列番号2))、ピューロマイシン耐性遺伝子とヘルペスウイルスチミジンキナーゼのキナーゼドメイン(ΔTK)との融合遺伝子(PurorΔTK)、pA配列、酵母の組換え酵素Flippase(FLP)の認識配列であるfrt配列をつなげた形でプラスミドを構築した。
プライマーの配列は以下の通りである。
Primer1:5’-GCGGTGGCGGCCGCTATAACTTCGTATAAAGTATCCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTT-3’(配列番号3),
primer2:5’-GGGGATCCACTAGTTCTAGACGAAAGGCCCGGAGATGAGGA-3’(配列番号4),
primer3:5’-CTCCGGGCCTTTCGTGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3’(配列番号5),
primer4:5’-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATCAACTATGAAACATTATCATA-3’(配列番号6)
primer5:5’-ATTATACGAAGTTATCCACCGAGTACAAGCCCACGGTG-3’(配列番号7),
primer6:5’-GGGGATCCACTAGTTGAAGTTCCTATACTTTCTAGA-3’(配列番号8)
5’アームおよび3’アームとプロモーターDNA断片の取得
ヒトT細胞受容体β(TCRβ)Dβ2遺伝子(TCRDβ2)の約110bp上流の位置からさらに上流約1.6kbpの位置までのDNA断片を5’アーム、TCRDβ2の上流約50 bpの位置から下流に約1.6kbpの位置までのDNA断片を3’アームとした(図4A)。各DNA断片は、Jurkat細胞のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRで増幅した。内在性のV遺伝子プロモーターとして、本例ではTCRβV20-1遺伝子のプロモーター(Vβ20-1プロモーター)を用いた。Vβ20-1プロモーターには、第一エクソン内の翻訳開始点直前から上流に約1.6kbpまでのDNA断片を、Jurkat細胞のゲノムDNAを鋳型として、下記のプライマーを用いてPCRで増幅した。(図4B)。
Primer5’-1:5’-CTCCACCGCGGTGGCGGCCGCCTTCAAAAGCTCCTTCTGTTGT-3’(配列番号9)
Primer3’-1:5’-ATGATGCGGCCGCTAGCCTTGGAAAAGACAAAGGCAGT-3’(配列番号10)
Primer5’-2:5’-AGGAATTCGATATCATTTAAATGAGGGGGACTAGCAGGGAGGA-3’ (配列番号11)
Primer3’-2:5’-TCGACGGTATCGATATTTAAATCCCCGAAAGTCAGGACGTTG-3’(配列番号12)
F:5’-GCTAGCGGCCGCATCATGAGACCATCTGTACCTG-3’ (配列番号13)
R:5’-ATACGAAGTTATAGCTAGTCTTCCGTGATGGCCTCACACCA-3’(配列番号14)
TCRβ遺伝子座Dβ2領域への薬剤耐性遺伝子カセットノックイン(KI)ターゲティングベクターの構築
薬剤耐性遺伝子ノックイン(KI)-Jurkat細胞の単離
A:5’-CACCGAGGTTAGTCTGACTGTGTG-3’(配列番号15),
B:5’-AAACCACACAGTCAGACTAACCTC-3’ (配列番号16)
C:5’-CACCCTGCCGCTGCCCAGTGGTTG-3’ (配列番号17)
D:5’-AAACCAACCACTGGGCAGCGGCAG-3’ (配列番号18)
のオリゴヌクレオチドをAとB(ベクター1)、CとD(ベクター2)の組み合わせでアニールしたものを、制限酵素BbsIで切断したプラスミドpX460に導入して作製した。
TCRは、個々のT細胞のもつα鎖とβ鎖の固有の組み合わせにより、特定の抗原/HLA複合体を特異的に認識する。本実施例では、後に細胞に導入するTCRのα鎖とβ鎖の組み合わせを厳密に維持するために、内在性のTCRα鎖遺伝子をCRISPR/Cas9システムにより破壊した。
E:5’-CACCGAGAATCAAAATCGGTGAAT-3’(配列番号19)
F:5’-AAACATTCACCGATTTTGATTCTC-3’(配列番号20)
のオリゴヌクレオチドEとFをアニールさせて、制限酵素BbsIで切断したpX330プラスミドに導入して作製した。
使用したPCRプライマーは、以下のとおりである。PCR産物の配列の解析は、forward primerで行った。
Forward primer:5’-CCTTGTCCATCACTGGCATC-3’(配列番号21)
Reverse primer:5’-AAAGTCAGATTTGTTGCTCCA-3’(配列番号22)
TCRはα鎖とβ鎖からなるヘテロ二量体であり、機能的なTCRを発現させるにはα鎖とβ鎖の両方を発現させる必要がある。通常そのような場合は、α鎖とβ鎖の遺伝子をゲノム中の別々の位置に導入し発現させるが、本システムでは外来遺伝子をTCRDβ2領域のみに導入するので、2つの遺伝子を単一の部位から発現させなくてはならない。それを実現する方法としては、Internal ribosome entry site(IRES)と、自己開裂型の2Aペプチドの2つの方法が主に用いられている。IRESは1本のmRNAから2本のポリペプチドが出来るが、その2つの間で分子数に偏りがでる可能性がある。一方、2Aペプチドは1本のmRNAから1本のポリペプチドが生成され、それが切断により2つの分子となるので、2つの分子数比は1対1となる。本実施例では、約22アミノ酸からなる2Aペプチドを利用することにより、α鎖とβ鎖遺伝子の両方をTCRDβ2領域より同時に発現させた。2Aペプチドには何種類かあるが(p2A、T2A、E2A、F2Aなど)、その中で切断効率がよいと言われているp2Aペプチドを用いた。p2Aペプチドで連結したα鎖とβ鎖はTCRα-p2A-TCRβあるいは、TCRβ-p2A-TCRαと記述する。
Primer1:5’-AAGGAACCAATTCAGTCGACCACCATGCTGCTGCTTCTGCTGCTT-3’(配列番号23)
Primer2:5’-CTCCTCCACGTCTCCAGCCTGCTTCAGCAGGCTGAAGTTAGTAGCTCCGCTTCCGCCTCTGGAATCCTTTCTCTT-3’(配列番号24)
Primer3:5’-TGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTATGATGATATCCTTGAGAGTT-3’(配列番号25)
Primer4:5’-TCGAGTGCGGCCGCGAATTCTCAGCTGGACCACAGCCGCAG-3’(配列番号26)
Frt配列とPGKプロモーター配列が互い近傍に位置するプラスミド(pBRBlII-AscI_FRTPGKpacΔtkpA_AscI)を鋳型に用いて、PCR法でfrt-PGKプロモーターDNA断片を増幅した(図8A)。Primer1は、Frt配列の一部に加え、制限酵素NheIとXhoIの認識配列、lox2272配列、およびpBluescriptSK(-)ベクターの配列-1(図8B)と同一の配列をもち、primer2は、PGKプロモーター配列の一部に加え、loxP配列、ベクターの配列-2と同一の配列をもつ(図8A,B)。pBluescriptSK(-)べクター(図8B)の配列-1と配列-2は制限酵素(KpnIとSacI)認識配列の外側である。Primer1とprimer2を用いて得られたPCR産物を、制限酵素KpnIとSacIで切断したベクターとGibson assembly法で連結し、Frt-PGKベクターを作製した(図8C)。
attR1配列、クロラムフェニコール耐性遺伝子、ccdb遺伝子およびattR2配列からなる遺伝子カセット(RfAカセット)をCSIV-TRE-RfA-CMV-KTベクターから制限酵素NheIとXhoIによって切り出し、図8D~図8Gの要領で、制限酵素NheIとXhoIによって切断したFtr-PGKべクター(図9A)にDNAリガーゼによって連結し、プレカセット交換ベクター1を構築した(図9B)。べクター(pCAG-EGxxFP)をXhoIで切断してウサギβ-globin遺伝子のポリA付加配列を単離し(図9C)、XhoIで切断したプレカセット交換ベクター1に導入し、プレカセット交換ベクター2を構築した(図9D)。さらに、プレカセット交換ベクター2をNheIで切断し、PCR法で増幅したヒトポリペプチド鎖伸長因子α(EF1α)遺伝子の第一イントロン、あるいはニワトリβ-アクチン(CAG)遺伝子プロモーターのイントロン部分(図9E)をGibson assembly法で連結した(図9F)。イントロンをlox2272の直後にもつプレカセット交換べクターを、プレカセット交換べクター3とした。
EF1α遺伝子のイントロン:
F:5’-TATACGAAGTTATCGCTAGCGGTTTGCCGCCAGAACACAG-3’(配列番号27)
R:5’-TACAAACTTGTGATGCTAGCGTAGTTTTCACGACACCTGA-3’(配列番号28)
CAGプロモーター中のイントロン部分:
F:5’-TATACGAAGTTATCGCTAGCGCCCCGGCTCTGACTGACCG-3’(配列番号29)
R:5’-TACAAACTTGTGATGCTAGCGACAGCACAATAACCAGCAC-3’(配列番号30)
PCRは、KOD-Plus-Neoで、1)95℃,3min→2)98℃,10sec→3)50~60℃,30sec→4)68℃,1~3minで行い2)~4)を30~35サイクル行った。
プレカセット交換ベクター3(図9F,図10上段)とTCRドナーベクター(図7E,図10中段)を混合して、GatewayRLRクロナーゼTMII酵素ミックス(Thermo Fisher Scientific,11791-020)のマニュアルに従って反応を行った。この反応では、attRとattLの間で組換えが起こり、attR1とattR2で挟まれる部分とattL1とattL2で挟まれる部分が入れ替わる(図10)。結果として、TCRカセット交換ベクター(図10下段)を得た。本実施例では、CAGプロモーター由来のイントロンをもつプレカセット交換ベクター3を用いた。
図13の結果では、TCRが発現する集団と発現しない集団が存在する。FLPの作用によりfrtではさまれる領域が欠失した細胞と、欠失が起こらなかった細胞が混在していた可能性が考えられる。そこで、ガンシクロビルを用いて、欠失し損ねた細胞(FLPによる組換えが失敗した細胞)の除去を試みた。通常、Jurkat細胞のようなヒトの細胞にはガンシクロビルは作用しない(図14A)。それに対し、PurorΔTKが存在する細胞内ではガンシクロビルは、ΔTKによってリン酸化されると核酸のアナログとなって、その結果、DNA複製を阻害して細胞増殖の停止、あるいは細胞死を引き起こす(図14B)。12μMガンシクロビル/培養液で5日間培養した後TCRおよびCD3の細胞膜上での発現をFACSで解析した。その結果、TCRを発現しない細胞はほとんど認められなかった(図15)。TCRを発現していなかった細胞集団は、FLPによる組換えが起きていなかったと考えられる。
Stem Fit(登録商標) AK02N(TAKARA, AJ100)、Y-27632 (Wako, 257-00511)、Vitronectin (Thermo Fisher, A14700)、Hygromycin(Invivogen, ant-hg-1)、lipofectamine(登録商標)(Thermo Fisher, 11668027)、Opti-MEM(登録商標) (Thermo Fisher, 31985070)、KOD-FX (TOYOBO, KFX-101)を用いた。
ヒトiPS細胞としては、253G1(理研、ヒト皮膚細胞由来)を用いた。
2)相同組換えによるヒトiPS細胞TCRβ遺伝子座Dβ2領域への薬剤耐性遺伝子カセットのノックイン
薬剤耐性遺伝子ノックイン(KI)-iPS細胞の単離
細胞へのべクター導入はリポフェクション法を用いた。リポフェクションは、lipofectamine(登録商標)(Thermo Fisher, 11668027) のマニュアルにしたがって実施した。Opti-MEM(登録商標) (Thermo Fisher, 31985070)培地にベクターとlipofectamineを懸濁後、細胞と混合しベクターを細胞に導入した。
A:5’-CACCCTGCCGCTGCCCAGTGGTTG-3’ (配列番号31)
B:5’-AAACCAACCACTGGGCAGCGGCAG-3’ (配列番号32)
のオリゴヌクレオチドをAとBの組み合わせでアニールしたものを、制限酵素BbsIで切断したプラスミドpX330に導入して作製した。
Primer Forward (1)5’-ACGGCTGAAATCTCCCTAACCC-3’(配列番号33)
Primer Reverse (2)5’-TACTTCCATTTGTCACGTCCTG-3’(配列番号34)
Primer Forward (3)5’-CCTGCTGCAACTTACCTCC-3’(配列番号35)
Primer Reverse (4)5’-GGGGACCGAGGGGCTGGAAG-3’(配列番号36)
それぞれのプライマーの配列部位を図16(A)および(B)に示した。PCR産物の電気泳動の結果を図16(C)に示す。図16(C)において、1、2、3はクローン番号を示す。2および3は正しくノックインに成功したクローンであることが確認できた。ポジティブコントロール(PC)はKI-Jurkat細胞、WTiPSはノックイン前のiPS細胞のゲノムDNAをそれぞれ用いた。
実施例3では、遺伝子再構成の起きていないTCRβ遺伝子座V領域のVβ20-1遺伝子からTCRC領域のCβ2遺伝子までの約180kbpにわたる領域を欠失させた細胞株を樹立した。樹立方法の概略を図20に示す。材料細胞としてはJurkat細胞株の亜種で、再構成したTCRβ遺伝子が変異によって発現しなくなったJ.RT3-T3.5 Jurkat 細胞株(以下Jurkat β mutant)(Ohashi et al, Science 316. 606-609. 1985)を用いた。
Jurkat β mutant細胞のゲノムDNAのTCRVβ20-1遺伝子の翻訳開始点より30 bp ~ 80 bp下流の領域、およびTCRCβ2遺伝子エキソン1内において、それぞれ2カ所ずつ一本鎖切断(ニック)を導入してゲノムDNAを切断した(図20上段の縦線)。ゲノムDNAの切断のため、4つのCRISPR/Cas9nベクター(下記材料参照)とEGFP発現ベクターを共に、エレクトロポレーション法でJurkat β mutantに導入した。
Vβ20-1側
A:5’-CACCGGTAGAAGGAGGCTTATACC-3’(配列番号37)
B:5’-AAACGGTATAAGCCTCCTTCTACC-3’(配列番号38)
C:5’-CACCGGGTGGGCATGTGCGTGTGT-3’(配列番号39)
D:5’-AAACACACACGCACATGCCCACCC-3’(配列番号40)
Cβ2側
E:5’-CACCGCAAACACAGCGACCTCGGGT-3’(配列番号41)
F:5’-AAACACCCGAGGTCGCTGTGTTTGC-3’(配列番号42)
G:5’-CACCAGAGATCTCCCACACCCAAA-3’(配列番号43)
H:5’-AAACTTTGGGTGTGGGAGATCTCT-3’ (配列番号44)
CRISPR/Cas9nベクターが多く導入された細胞では、ゲノムの切断がより高効率で起こると期待できる。よって、ベクターを特に多く取り込んだ細胞群をソーティングにより選抜し、クローン化した。そのために、遺伝子導入から2日後に、遺伝子導入効率の指標となるEGFPの発現レベルが特に高い細胞群を、セルソーターを用いて直接、96-wellプレートに1 wellあたり1細胞となるよう播種して培養した(クローン化)(図21A)。Jurkat β mutant細胞の生存を維持するために、96-wellプレートには予め1 x 105個のB6マウス胸腺細胞を播種しておいた。培養開始4 ~5週間後に各クローンよりゲノムDNAを抽出して、Vβ20-1領域とCβ2領域が連結しているかPCR法により解析した。PCR法に用いたプライマーは下に示す。Forwardプライマーは、Vβ20-1遺伝子翻訳開始点の約140 bp上流に、reverseプライマーはCβ2遺伝子エキソン1の直後の配列に対応する(図18B)。CRISPR/Cas9nベクターの導入により切断が予想される部位の近傍同士で連結が起きた場合、およそ500 bpのDNA断片がPCRで増幅される。PCR反応物を電気泳動で解析した結果、クローン#10、#11、#16および#17でVβ20-1領域とCβ2領域の連結が示唆された(図21C)。クローン#10に関して、PCR法による増幅で得たDNA断片の配列を解析すると、Vβ20-1領域とCβ2領域が6 bpのDNAを介して連結していることが確認された(図21D)。これにより、約180 kbpにわたる領域が欠失してVβ20-1領域とCβ2領域が連結したJurkat β mutant株が樹立された。また、他のクローンでも、Vβ20-1領域とCβ2領域の連結が、DNA配列の解析から確認された。
Forwardプライマー:5’-GTCATGGGCAAAGATTACCAC-3’(配列番号45)
Reverseプライマー:5’-GGTAGCTGGTCTCACCTAATC-3’(配列番号46)
ヒトiPS細胞(非T細胞由来、遺伝子再構成未)にカセットデッキ配列をリポフェクションでノックインし、薬剤選択後、コロニーピックアップによりクローニングを行なうことで枠型となるiPS細胞(カセットデッキノックインiPS細胞: cKI-iPSC)を樹立した。
iPS細胞はリポフェクション実施前日にプレート上へ播種した。iPS細胞へ、上記割合のCrispr-CAS9およびガイドRNA発現ベクターとノックイン用ターゲティングベクターとの混合物を、リポフェクションにて形質移入した。Opti-MEMとベクターと試薬を懸濁後、iPS細胞上へ添加し、4-6時間後に培地交換を行った。
2日後よりハイグロマイシンを用いて下記の通りの最終濃度で薬剤選択を行なった。相同組換えにより薬剤耐性遺伝子カセットをゲノムDNAに取り込んだ細胞では、PGKプロモーターの作用により第1の薬剤耐性遺伝子であるハイグロマイシン耐性遺伝子が発現する(第2の薬剤耐性遺伝子であるピューロマイシン耐性遺伝子はここでは発現しない)そのため、まず、ハイグロマイシン入り培養液を用いて、薬剤耐性遺伝子カセットをゲノム中に取り込んだクローンを選択した(ポジティブセレクション)。
Day 1: 培地交換
Day 2: ハイグロマイシン 25μg/ml
Day 3: ハイグロマイシン 40μg/ml
Day 4 - 6: ハイグロマイシン50μg/ml
Day 7: iPSCコロニーピックアップ
薬剤選択後に残存したiPS細胞コロニーをピックアップ後に、5つのクローンを樹立した。各クローンからDNAを採取し、目的のクローンを確認するためにPCRを行なった。薬剤耐性遺伝子KIターゲッティングベクターの5’アーム配列と3’アーム配列の外側のベクター部分がランダムインテグレーションによりゲノムDNA内に取り込まれた細胞は、ジフテリア毒素(DTA)が細胞内で生成されるため生存できず、取り除かれる(ネガティブセレクション)。次に、そのようにして選択された細胞(クローン)の中から、Vβ20-1プロモーターからfrtまでの薬剤耐性遺伝子カセット部分をTCRDβ2遺伝子座に取り込んだクローンをPCR法で同定した。以上により、Dβ2領域にVβ20-1プロモーターと薬剤耐性遺伝子カセットが導入されたクローン(cKI-iPSC)を選択した。
1)で導入されたカセットベクターの下流には、2つ目のプロモーターがあり、交換に成功したiPS細胞はその下流のピューロマイシン耐性遺伝子がワークする。この機構により、TCR/CARカセット交換成功iPS細胞はピューロマイシンに耐性を示す。そこで、薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション2日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、ピューロマイシンを用いた薬剤選択が、iPS細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 5×104 cells /ウェル
Day 3: ピューロマイシン 180ng/ml
Day 4: ピューロマイシン 150ng/ml
Day 5-9: 培地交換
Day10: iPSCコロニーピックアップ
薬剤選択後に残存したiPS細胞コロニーをピックアップ後に、4つのクローンを樹立した。各クローンからDNAを採取し、目的のクローンを確認するためにPCRを行なった。5’アーム配列上流とカセットベクターのCAGイントロン配列とを挟む5’側確認プライマーと3’アーム配列下流とのベクター内のEF1αプロモーター上を挟む3’側確認プライマーを用いた。バンドをともに検出できた株をカセット交換TCRノックイン細胞(exTCR-KI-iPSC)として樹立した。
細胞をシングルセル化し、上記細胞数を、OptiMEMとプラスミドベクターと混合して100μlとし、エレクトロポレーションを行なった。エレクトロポレーション後、直ちに6ウェルプレートに播種し、培養した。
2)で樹立されたカセットベクターの下流には、チミジンキナーゼがワークしており、ガンシクロビル(GCV)が細胞内で有毒化するため、GCVとの共培養で細胞は死滅する。この機構を用いて、GCV薬剤を用い下記の最終濃度で選択した。薬剤開始は、エレクトロポレーション2日後にその細胞を回収し、細胞数を揃えて再播種した翌日より開始した。これは、GCV用いた薬剤選択が、iPS細胞の場合は、その細胞密度により効きが著しくことなるからである。
Day 1: 培地交換
Day 2: 細胞再播種 1×105 cells /ウェル
Day 3-13: GCV 5μg/ml
Day 14: iPSCコロニーピックアップ
薬剤選択後に残存したiPS細胞コロニーをピックアップ後に、2つのクローンを樹立した。各クローンからDNAを採取し、目的のクローンを確認するためにPCRを行なった。除去部位にあるEF1αプロモーター部位と3’arm下流を挟むプライマーを用いて行ったPCRの結果を図24に示す。カセット交換に成功したTCR-KI-iPS細胞では、PurorΔTK部位のバンドが確認できなくなった。(図24下、Bレーン)
実施例4の方法でNY-ESO1特異的TCRをノックインしたiPS細胞を得た。得られたiPS細胞よりT細胞を分化誘導し、得られた再生CTLを用いてがん細胞株の殺傷能力を検証した。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、実施例4の方法にてNY-EOS1特異的TCRをノックインして得たiPS細胞から誘導したCTL細胞である。NY-EOS1-KI-iPS細胞からのCTLの誘導は、WO 2017/179720(US20190161727)に記載の方法にて行った(本文献は引用により本願に含まれる)。すなわち、iPS細胞をCD4CD8ダブルポジティブ細胞であるT細胞前駆体へと誘導し、次いでCD4CD8ダブルポジティブ細胞を単離する。単離されたCD4CD8ダブルポジティブ細胞をさらにCD8シングルポジティブ細胞へと誘導した。CD8抗原がCD8α鎖とCD8β鎖のヘテロ接合型であるCD8シングルポジティブT細胞が得られた(図25)。
参照用として、WT1-TiPS細胞由来再生CTL細胞を用いた。該細胞はWT1特異的TCRを有するT細胞からiPS細胞を誘導し、得られたiPS細胞から誘導されたCTL細胞である。抗原特異的TCRを有するT細胞からiPS細胞の誘導はWO 2016/010155(US20170267972)に記載の方法に準じた。抗原特異的TCRを有するiPS細胞から当該抗原特異性を維持したCTLの誘導は、上記と同様の方法にて行った
Luciferase導入U266(多発性骨髄腫細胞株, NY-ESO1+, HLA-A02+)、Bright-Glo (Promega)およびGlomax (Promega)を用いた。
A0201を有しかつNY-ESO-1を発現している多発性骨髄腫細胞株U266に対する、NY-ESO1特異的TCRをノックインしたiPS細胞から誘導された、再生CTLの細胞障害活性を評価した。比較として、同細胞に対するWT1-TiPS細胞由来再生CTLの細胞障害活性を同時に調べた。再生CTLとU266細胞株を0:1、1:3、1:1、3:1、9:1の割合で混合後、37℃5%CO2の環境下で6時間培養を行った。その後、Annexin V陽性細胞の割合で、細胞傷害活性を評価した。結果を図26に示す。
NY-ESO1-TCR-KI-iPS細胞由来再生CTLは、U266細胞株に対して細胞数依存的に細胞傷害活性を示した。WT1-TiPS細胞由来再生CTL細胞にはそのような活性はほとんど認められなかった。
実施例1(図11)と同様の方法により、薬剤耐性遺伝子カセットノックインベクターをTCRDβ2領域にノックインした後に、TCR1遺伝子を薬剤耐性遺伝子カセットと交換することで導入したJurkat細胞を得た。TCR1遺伝子として、WT1抗原を認識するTCR(KM#3-3)のα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子を用いた。図27に本実施例のJurkat-TCR1細胞のTCRβ遺伝子座DJ領域の模式図を示す。
次いでJurkat-TCR1細胞のTCR1遺伝子を以下に示す方法で、TCR2遺伝子と入れ替えた。で、TCR2遺伝子はNYESO1抗原を認識するTCRのα鎖とβ鎖をp2Aペプチド遺伝子で繋いだ合成遺伝子である。
以上より、T細胞株Jurkat細胞中で、外来性に導入されたTCR遺伝子が、別のTCR遺伝子と交換可能であることが示された。
プライマー1, 5’-GGCAGCTACATCCCTACCTT-3’ (配列番号47)
プライマー2, 5’-CCACTTTGCTGTCTTGGCCTT-3’(配列番号48)
プライマー3, 5’-AATCATCGTGCCCTCCCGCTA-3’(配列番号49)
プライマー4, 5’-TCAGCCACCTACCTCTGTGT-3’(配列番号50)
Claims (24)
- T細胞受容体(TCR)の再構成が生じていない材料細胞へ、TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるよう外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子を導入する工程を含む、抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。
- (1)T細胞受容体の再構成が生じていない材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座を、上流から順に
TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、
薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子、
TCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列
を含み、かつ前記TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるよう改変して外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞を提供する工程、
(2)前記薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子を、外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子と交換する工程
を含む、請求項1記載の方法。 - 前記TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーの間の距離が8~50kbpである、請求項1または2記載の方法。
- 材料細胞が、多能性幹細胞である、請求項1から3いずれかに記載の方法。
- 外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子の導入を、Recombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法あるいはゲノム編集法にて行う、請求項1~4いずれかに記載の方法。
- 材料細胞ゲノムのT細胞受容体(TCR)遺伝子座に、上流から順に
TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、
薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子、および
TCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列
を有し、前記TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列と、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子の間に、組換え酵素の標的配列(i)を有し、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子と前記TCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列の間に組換え酵素の標的配列(ii)を有し、前記TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離にある、外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。 - 既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子を有している、請求項6記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。
- 材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座に、上流から順にTCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、およびTCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列を有し、前記TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離にある、外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞。
- 前記TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーの間の距離が8~50kbpである、請求項6から8いずれかに記載の材料細胞。
- 材料細胞ゲノムTCR遺伝子座が、材料細胞TCRα鎖またはβ鎖である請求項6~9いずれかに記載の材料細胞。
- 材料細胞ゲノムTCR遺伝子座において、薬剤耐性遺伝子あるいはレポーター遺伝子もしくは既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子が導入されている遺伝子座以外のTCRα鎖およびTCRβ鎖が欠損されている、請求項10記載の材料細胞。
- 材料細胞が多能性幹細胞である、請求項6~11いずれかに記載の材料細胞。
- (a)上流から順に、第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(b)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(a)で準備したベクターを、TCR遺伝子座のV領域のプロモーターとTCR遺伝子座のC領域のエンハンサーが、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能が発揮される距離となるようにノックインする工程、
(c)(b)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、を含む、請求項8~12いずれかに記載の材料細胞の製造方法。 - 工程(b)において、材料細胞ゲノムの再構成されていないTCR遺伝子座の1のV領域プロモーター配列の下流に、当前記V領域プロモーター配列より下流にあるV領域とDJ領域と置換するよう(a)で準備したベクターをノックインする、請求項13記載の方法。
- 工程(a)のベクターが、さらにTCR遺伝子座V領域のプロモーター配列を最上流に有しており、工程(b)において、前記ベクターを材料細胞ゲノムTCR遺伝子座のDJ領域に、前記ベクターに含まれるTCR遺伝子座V領域のプロモーターと、材料細胞のTCR遺伝子座C領域のエンハンサー間が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能が発揮される距離にとなるようにノックインする、請求項13記載の方法。
- 工程(a)のベクターが、さらにTCR遺伝子座C領域のエンハンサー配列を最下流に有しており、工程(b)において、当前記ベクターを材料細胞ゲノムTCR遺伝子座のV領域に、前記材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座のV領域のプロモーターと、前記ベクターに含まれるTCR遺伝子座C領域のエンハンサー間の距離が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるようにノックインする、請求項14記載の方法。
- (A)請求項8に記載の材料細胞を準備する工程、
(B)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(C)前記TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを前記材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列を、材料細胞中の第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる第1の薬剤耐性遺伝子と交換(カセット交換)する工程、
(D)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(E)第2の組換え酵素を(D)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来抗原レセプター遺伝子が導入された細胞の製造方法。 - (1)上流から順に、TCR遺伝子座V領域のプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(i)、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列下で発現するよう連結された第1の薬剤耐性遺伝子、(i)と相違する第1の組換え酵素の標的配列(ii)、第2の薬剤耐性遺伝子、および第2の組換え酵素の標的配列を含む薬剤耐性遺伝子カセットを含むベクターを準備する工程、
(2)材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座へ(1)のベクターを、ベクター中のTCR遺伝子座V領域のプロモーターと、材料細胞ゲノムのTCR遺伝子座C領域のエンハンサー間の距離が、その間に挟まれる遺伝子の発現制御機能を発揮する距離となるようにノックインする工程、
(3)(2)で得られた細胞を第1の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤の存在下で培養する工程を含む、薬剤耐性遺伝子カセットのノックインに成功した細胞を選択する工程、
(4)上流から順に第1の組換え酵素の標的配列(i)、外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子、第2の組換え酵素の標的配列、材料細胞で発現可能なプロモーター配列、および第1の組換え酵素の標的配列(ii)を含む、TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを準備する工程、
(5)TCRまたはCAR遺伝子カセット交換ベクターを(3)で選択された薬剤耐性カセットがノックインされた材料細胞へ導入し、同時に第1の組換え酵素を作用させることによって、TCRまたはCAR遺伝子カセットベクターの第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる配列を、材料細胞中の第1の組換え酵素の標的配列(i)(ii)に挟まれる第1の薬剤耐性遺伝子と交換(カセット交換)する工程、
(6)第2の薬剤耐性遺伝子が耐性を有する薬剤にて、カセット交換に成功した細胞を選択する工程、
(7)第2の組換え酵素を(6)で選択された細胞に作用させて、第2の組換え酵素の標的配列で挟まれる第2の薬剤耐性遺伝子部分を除去する工程
を含む、外来の抗原レセプター遺伝子を導入した細胞の製造方法。 - 外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子が、再構成済TCR遺伝子である、請求項17または18記載の方法。
- 外来の再構成済みTCR遺伝子が、再構成済TCRα鎖およびTCRβ鎖の両方を含む、請求項19記載の方法。
- 請求項17~20いずれかに記載の方法にて外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子が導入された細胞を得、得られた細胞をT細胞へと分化誘導する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
- 請求項8~12いずれかに記載の外来の抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をT前駆細胞またはT細胞へと分化誘導する工程、外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子を、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて前記分化誘導されたT前駆細胞またはT細胞のゲノムTCR遺伝子座のV領域のプロモーター配列とC領域のエンハンサー配列の間に導入する工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
- 請求項8~12いずれかに記載の外来抗原レセプター遺伝子を導入するための材料細胞をT前駆細胞またはT細胞へと分化誘導する工程、ゲノム編集法あるいはRecombinase-mediated Cassette Exchange(RMCE)法にて前記分化誘導されたT前駆細胞またはT細胞の既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子を外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子と入れ替える工程、および既知再構成済みTCRまたはCAR遺伝子に特異的な抗体またはテトラマーを用いて外来の再構成済みTCRまたはCAR遺伝子との入れ替えに成功していない細胞を除く工程を含む、細胞療法用細胞の製造方法。
- 細胞療法が、外来の再構成済みTCRまたはCARが特異的に結合する抗原を発現している患者における免疫関連疾患の治療のために行われる、請求項21~23いずれかに記載の製造方法。
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