JP7410652B2 - フィブリノゲンの定量方法 - Google Patents
フィブリノゲンの定量方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7410652B2 JP7410652B2 JP2019076180A JP2019076180A JP7410652B2 JP 7410652 B2 JP7410652 B2 JP 7410652B2 JP 2019076180 A JP2019076180 A JP 2019076180A JP 2019076180 A JP2019076180 A JP 2019076180A JP 7410652 B2 JP7410652 B2 JP 7410652B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- fibrinogen
- magnetic particle
- particle motion
- quantitative
- motion signal
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 title claims description 285
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 title claims description 285
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 title claims description 283
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 95
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims description 222
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 152
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 claims description 72
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 48
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 47
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 47
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 44
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 43
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims description 40
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 40
- 238000011002 quantification Methods 0.000 claims description 27
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 21
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical group CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 108010073651 fibrinmonomer Proteins 0.000 claims description 16
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 14
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 10
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 6
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 claims description 4
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 4
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 claims description 4
- 239000003002 pH adjusting agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 3
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 claims description 3
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 claims description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 120
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 120
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 66
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 59
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Natural products NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 37
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 37
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 23
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 18
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 16
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 14
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 12
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 12
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 11
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 8
- 108090000778 Platelet factor 4 Proteins 0.000 description 7
- 102000004211 Platelet factor 4 Human genes 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 7
- 239000008137 solubility enhancer Substances 0.000 description 7
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 6
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 5
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 4
- 229920000728 polyester Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000012779 reinforcing material Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 description 4
- XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 6-chloro-2-n,2-n-diethylpyrimidine-2,4-diamine Chemical compound CCN(CC)C1=NC(N)=CC(Cl)=N1 XZIIFPSPUDAGJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L calcium chloride dihydrate Chemical compound O.O.[Cl-].[Cl-].[Ca+2] LLSDKQJKOVVTOJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 229940035044 sorbitan monolaurate Drugs 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000772006 Bombus ignitus Venom serine protease Bi-VSP Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical class [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N D-iditol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Chemical class 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Chemical class 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940052299 calcium chloride dihydrate Drugs 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 239000000535 fibrinogen concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 2
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 2
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000012417 linear regression Methods 0.000 description 2
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229920013716 polyethylene resin Polymers 0.000 description 2
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 2
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 description 2
- 230000008023 solidification Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 1
- JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N (4s)-4-[[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-aminopropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]acetyl]amino]-5-[[2-[[(2s)-3-carboxy-1-[[(2s)-1-[[1-[[(2s)-1-[[(2s)-4-carboxy-1-[[2-[[2-[[2-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-4-(diaminomethylideneamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)CC1=CC=CC=C1 JWICNZAGYSIBAR-LEEGLKINSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AROWPPGHDIHREK-DIKIOFHXSA-N 2-aminoacetic acid (2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid (2S)-2-amino-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoic acid (2S)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N AROWPPGHDIHREK-DIKIOFHXSA-N 0.000 description 1
- UTURQDSLWLTXIM-FOIRCHMTSA-N 2-aminoacetic acid (2S)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid (2S)-pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound NCC(O)=O.OC(=O)[C@@H]1CCCN1.OC(=O)[C@@H]1CCCN1.OC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N UTURQDSLWLTXIM-FOIRCHMTSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- 101800000974 Fibrinopeptide A Proteins 0.000 description 1
- 102400000525 Fibrinopeptide A Human genes 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010022901 Heparin Lyase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 1
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 1
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 1
- WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N Trioxochromium Chemical compound O=[Cr](=O)=O WGLPBDUCMAPZCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L calcium lactate Chemical compound [Ca+2].CC(O)C([O-])=O.CC(O)C([O-])=O MKJXYGKVIBWPFZ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001527 calcium lactate Substances 0.000 description 1
- 229960002401 calcium lactate Drugs 0.000 description 1
- 235000011086 calcium lactate Nutrition 0.000 description 1
- GUPPESBEIQALOS-UHFFFAOYSA-L calcium tartrate Chemical compound [Ca+2].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O GUPPESBEIQALOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001427 calcium tartrate Substances 0.000 description 1
- 235000011035 calcium tartrate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000423 chromium oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000002542 deteriorative effect Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000010419 fine particle Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 108010017446 glycyl-prolyl-arginyl-proline Proteins 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N iron;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Fe].[Fe] YOBAEOGBNPPUQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000007561 laser diffraction method Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 1
- 229960005337 lysine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N phenyl 3-chloropropanoate Chemical compound ClCCC(=O)OC1=CC=CC=C1 RAFRTSDUWORDLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 229920006267 polyester film Polymers 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012802 pre-warming Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229950008679 protamine sulfate Drugs 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000790 scattering method Methods 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- WTWSHHITWMVLBX-DKWTVANSSA-M sodium;(2s)-2-aminobutanedioate;hydron Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CC(O)=O WTWSHHITWMVLBX-DKWTVANSSA-M 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 1
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 1
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本発明は、フィブリノゲン定量乾燥試薬を用いたフィブリノゲンの定量方法に関する。
フィブリノゲンの定量は、プロトロンビン時間、活性化部分トロンボプラスチン時間とともに、血液凝固能の異常・正常を調べる検査であり、臨床現場、特に臨床検査室で広く実施されている。近年、周術期医療および周産期医療において、フィブリノゲン定量の重要性があらためて指摘されている。危機的大量出血では、血液中のフィブリノゲン濃度が大幅に低減する。そのため、患者の血液中フィブリノゲン濃度を調べ、150mg/dL未満であれば、患者の生命維持のために、新鮮凍結血漿あるいはフィブリノゲン濃縮製剤が投与される。また、新鮮凍結血漿或いはフィブリノゲン濃縮製剤を投与した後も血液中フィブリノゲン濃度が正常範囲に戻ったか否か、を確認する必要がある。処置後に血液中のフィブリノゲン濃度が正常範囲に達していない場合には、患者の生命維持のためにさらなる処置が必要となるため、この測定には特に迅速性が求められる。周術期医療および周産期医療においては、フィブリノゲン定量はこのような目的に使用されるため、より迅速に、確度高く血液中フィブリノゲン濃度を調べることのできるシステムが望まれていた。
トロンビン試薬溶液を用いたフィブリノゲン定量方法で一般的に使用されているのは、Clauss VAによって見出されたトロンビン時間法（Clauss VA：Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens, ActaHaematologica,17,237-246,1957)である。該トロンビン時間法は、過剰量のトロンビンによるフィブリノゲンのフィブリンへの変換速度が主としてフィブリノゲン濃度に依存することを利用したものである。
該定量方法は、血漿を任意の緩衝液に希釈し、この希釈液を予備加温後、トロンビンを含む試薬溶液を加えて凝固時間を測定し、得られた凝固時間を予め作成された検量線でフィブリノゲン濃度に換算する方法である。該定量方法での凝固時間とは、トロンビン試薬溶液を添加してから終点までの時間を指す。該終点は、濁度上昇を検知する光学的測定あるいは粘度上昇を検知する物理学的測定で検出される。
この定量方法およびこの定量方法に用いられるトロンビン試薬は広く世の中に受け入れられ、臨床検査室にて実施されている。しかしながら、凍結乾燥されたトロンビン試薬を使用時毎に精製水等で復元しなければならないこと（復元した溶液は長期の保存に耐えられない）、全血を遠心分離して血漿化しなくてはならないこと、血漿を希釈液で希釈しなくてはならないこと、血漿希釈液を予備加温しなければならないこと等、測定するまでに時間を要し、なおかつ工程が多いという点で、該定量方法は、周術期および周産期での使用に必ずしも適した定量方法とは言えなかった。
前出のフィブリノゲン定量方法を改善したものとして、トロンビンを含有した乾燥試薬を用いてフィブリノゲンを定量する方法が挙げられる。その方法は、特開平０６－０９４７２５号公報（特許第２７７６４８８号）、及び特開平０６－１４１８９５号公報（特許第２９８０４６８号）に示されている。該定量法に用いられるトロンビンを含有した乾燥試薬は、トロンビン試薬溶液に磁性粒子を添加し、該混合液を反応スライドに一定量分注し、その後、凍結乾燥したものである。
該乾燥試薬を用いた定量方法は、試料を試薬に添加後、所定の間隔で振動磁場と静止永久磁場の組合せをかけて、該乾燥試薬中に含有された磁性粒子を運動させ、該磁性粒子の運動シグナルを散乱光の変化量として捉え、その経時的変化から終点を検出するところに特徴がある。試料を添加してから該終点までの時間を凝固時間とし、得られた凝固時間を予め作成された検量線でフィブリノゲン濃度に換算する方法である。
この方法が使用できる分析装置を例示すると、製品名CG02N（株式会社エイアンドティー販売）等が挙げられる。上記装置の場合は、0.5秒間隔で振動磁場と静止永久磁場の組合せがかけられ、同間隔で磁性粒子運動シグナルがモニターされる。
上記装置を利用する場合、磁性粒子の運動シグナルの経時変化は、乾燥試薬中の粘度変化に逆対応（逆相関）する。終点は、磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点として検出される。検体を添加してから直後に得られる磁性粒子運動シグナルのピーク値は、乾燥試薬中の構成成分が全部溶解した点、乾燥試薬の粘度が最小値となる点である。ここで、運動シグナルのピーク値をXとし、それから任意の時間経過した時点のシグナル値をYとすると、シグナル強度の減衰が（X-Y）×100／X（％）となった時点の粘度上昇は、粘度の最小値に対してX／Y倍となった点に相当する。即ち、磁性粒子の運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点は、粘度が検体を添加してからの粘度の最小値に対して1.43倍に上昇した点に相当する。
特開平０６－１４１８９５号公報（特許第２９８０４６８号）では、上記技術を、トロンビン活性を有する蛋白及び磁性粒子を含有してなるフィブリノゲン定量乾燥試薬と検体を混合し、その凝固時間を測定することにより検体中のフィブリノゲンを定量する方法において、該乾燥試薬の粘度がその最小値に対して1.05倍～2.00倍に上昇した点を終点とし、検体を添加してから該終点までの時間を凝固時間とすることを特徴とするフィブリノゲンの定量方法と表現されている。
この方法は、凍結乾燥されたトロンビン試薬を使用時毎に精製水等に復元しなくてもよく、希釈した検体を予備加温しなくても良いという点から有用な方法である。しかしながら、この定量方法は、血漿および全血検体を専用希釈液で希釈しなければならず、周術期医療および周産期医療で用いる定量方法としては必ずしも十分ではない点もあった。
特開平０６－０９４７２５号公報（特許第２７７６４８８号）に示されているトロンビンを含有した乾燥試薬でフィブリノゲンを定量した場合、無希釈血漿や無希釈全血を測定した時、得られる凝固時間が極端に短縮してしまい、血液中フィブリノゲン濃度に対応する凝固時間を検出することができない。そのため、血液中フィブリノゲン濃度に対応する凝固時間を得るためには、得られる凝固時間を延長させなければならなかった。
Clauss VA：Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens, Acta Haematologica, 17, 237-246, 1957.
本発明者らは、乾燥試薬の溶解性を向上させるためにアミノ酸またはその塩もしくは糖類を含有させ、トロンビン反応を強く進めるために高活性のトロンビンまたは高活性のトロンビン様タンパクを含有させ、フィブリンモノマーの自然会合を阻害するためにフィブリンモノマー会合阻害剤を含有させたフィブリノゲン定量乾燥試薬を完成させた（特願２０１８－２２９９１９号）。特願２０１８－２２９９１９号では、凝固時間の再現性を悪化させずに延長した凝固時間を得られることが記載されている。
しかしながら、本発明者らが、上記特願２０１８－２２９９１９号に記載の乾燥試薬を、前出の特開平６－１４１８９５(特許２９８０４６８号)の定量方法に適用したところ、無希釈血漿を測定した場合は正しく定量できるものの、無希釈全血を測定した場合はヘマトクリット補正しても正しく定量できない場合があることが判明した。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、これは、無希釈全血を測定する場合、検体のヘマトクリット値の違いによる血漿成分量の変動だけではなく、各検体の粘度の違いによってフィブリノゲン定量乾燥試薬の溶解性が変動することによるものと考えられる。そして、無希釈全血を測定する場合、起点（凝固反応開始点：凝固時間0秒の点）を規定しないと正しくフィブリノゲン定量できないことが判明した。これは従来技術において認識されていなかった問題点である。
本発明が解決しようとする課題は、上記の問題を少なくとも部分的に解決することである。より具体的には、本発明が解決しようとする課題は、周術期医療および周産期医療での使用に耐えうる新しい技術、即ち、フィブリノゲン定量乾燥試薬を用いて、血漿検体または全血検体の希釈操作を必要とせず、且つ、正確に定量できるフィブリノゲン定量法を提供することである。
本発明者らは、上記技術課題を解決すべく鋭意研究を行ってきた。その結果、フィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加した後、得られる磁性粒子運動シグナルを解析することにより起点（凝固反応開始点：凝固時間0秒の点）を求めることができることを見出した。具体的には、起点は、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を複数算出し、その比が一定の範囲内で一定時間保たれた区間の任意の点として検出できることを見出し、本発明を完成した。
本発明は、以下の実施形態を包含する。
[１] フィブリノゲン定量方法であって、
(i)磁性粒子を含有したフィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加する工程、
(ii)検体の添加後に、試薬中の磁性粒子を運動させ、磁性粒子運動シグナルをモニタリングする工程、及び
(iii)前記工程(ii)でモニタリングされた磁性粒子運動シグナルについて、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を複数算出する工程、
を含み、
前記の一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で一定時間保たれた区間の中の任意の点を起点とし、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点の中の任意の点を終点とし、起点から終点までの時間を凝固時間とする、
前記フィブリノゲン定量方法。
[２] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.1秒～2秒から選択される一定の時間間隔である、実施形態１に記載のフィブリノゲン定量方法。
[３] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.5秒、1秒、1.5秒または2秒間隔である、実施形態１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[４] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が1秒間隔である、実施形態１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[５] 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.2である、実施形態１に記載のフィブリノゲン定量方法。
[６] 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.1である、実施形態２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[７] 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間区間が1.5秒間である、実施形態１～６のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[８] 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間区間の先頭の点が起点である、実施形態１～７のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[９] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20～30％減衰した点の中の任意の点を終点とする、実施形態１～８のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[１０] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点を終点とする、実施形態９に記載のフィブリノゲン定量方法。
[１１] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20％減衰した点を終点とする、実施形態９に記載のフィブリノゲン定量方法。
[１２] 実施形態１～１１のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法を実行するための、プログラム。
[１３] 実施形態１２に記載のプログラムを記録した、情報記録媒体。
[１４] 実施形態１２に記載のプログラムが組込まれた、又は実施形態１３に記載の情報記録媒体が格納された、フィブリノゲン定量測定装置。
[１] フィブリノゲン定量方法であって、
(i)磁性粒子を含有したフィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加する工程、
(ii)検体の添加後に、試薬中の磁性粒子を運動させ、磁性粒子運動シグナルをモニタリングする工程、及び
(iii)前記工程(ii)でモニタリングされた磁性粒子運動シグナルについて、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を複数算出する工程、
を含み、
前記の一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で一定時間保たれた区間の中の任意の点を起点とし、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点の中の任意の点を終点とし、起点から終点までの時間を凝固時間とする、
前記フィブリノゲン定量方法。
[２] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.1秒～2秒から選択される一定の時間間隔である、実施形態１に記載のフィブリノゲン定量方法。
[３] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.5秒、1秒、1.5秒または2秒間隔である、実施形態１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[４] 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が1秒間隔である、実施形態１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[５] 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.2である、実施形態１に記載のフィブリノゲン定量方法。
[６] 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.1である、実施形態２に記載のフィブリノゲン定量方法。
[７] 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間区間が1.5秒間である、実施形態１～６のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[８] 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間区間の先頭の点が起点である、実施形態１～７のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[９] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20～30％減衰した点の中の任意の点を終点とする、実施形態１～８のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法。
[１０] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点を終点とする、実施形態９に記載のフィブリノゲン定量方法。
[１１] 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20％減衰した点を終点とする、実施形態９に記載のフィブリノゲン定量方法。
[１２] 実施形態１～１１のいずれかに記載のフィブリノゲン定量方法を実行するための、プログラム。
[１３] 実施形態１２に記載のプログラムを記録した、情報記録媒体。
[１４] 実施形態１２に記載のプログラムが組込まれた、又は実施形態１３に記載の情報記録媒体が格納された、フィブリノゲン定量測定装置。
本発明により、試薬の調製や検体の希釈操作を必要とせず、迅速且つ正確なフィブリノゲン定量を可能ならしめる。
ある実施形態において、本発明は、周産期および周術期での使用に耐えうるフィブリノゲン定量方法を提供する。またある実施形態において、本発明は、(i)磁性粒子を含有したフィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加する工程、(ii)検体の添加後に、試薬中の磁性粒子を運動させ、磁性粒子運動シグナルをモニタリングする工程、及び(iii)前記工程(ii)でモニタリングされた磁性粒子運動シグナルについて、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を算出する工程、を含む、フィブリノゲン定量方法を提供する。一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比は、複数算出することができる。このとき、前記の一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で一定時間保たれた区間の中の任意の点を起点とし、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点の中の任意の点を終点とし、起点から終点までの時間を凝固時間とすることができる。工程(ii)及び(iii)は同時に行ってもよい。
本明細書において、磁性粒子運動シグナルとは、工程(ii)において、検体の添加後に所定の間隔で振動磁場と静止永久磁場の組合せをかけて、試薬中に含有された磁性粒子を運動させ、光を当てた時の散乱光の変化量をいう(本明細書においてSnと表記することがある)。本明細書では、便宜上、試薬添加の時点に観測する磁性粒子運動シグナルをS0とする。
本明細書において、磁性粒子運動シグナルをモニターする時刻とは、磁性粒子運動シグナルを測定する時間点をいう（本明細書においてmmnと表記することがある）。また図面において、磁性粒子運動シグナルをモニターする時刻を、黒塗の丸記号にて表記することがある。本明細書では、便宜上、磁性粒子運動シグナルをモニターする時刻として、試料添加の時点を、0秒とする（mm0）。なお、これは基準を設けるための単なる便宜に過ぎず、最終的に本発明の方法により凝固時間が算出される限り、試料添加の時点を、例えば－5秒等と適当に設定してもよい。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナルのモニタリングは連続的に行ってもよく、又は断続的に行ってもよい。
本明細書において、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期とは、磁性粒子運動シグナルのモニタリングを行う周期、すなわち磁性粒子運動シグナルのモニタリングを行う時間間隔をいう。例えば磁性粒子運動シグナルS0、S1、S2、S3、S4・・・をモニターする時刻をmm0、mm1、mm2、mm3、mm4、・・・とすると、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は、（mm1－mm0）、（mm2－mm1）、（mm3－mm2）、（mm4－mm3）、・・・と表すことができる。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は一定とすることができる。別の実施形態では、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期を変化させてもよい。磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期を図面において矢印記号にて表記することがある（←→）。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は、0.1秒～2秒から選択され得る。
本発明の方法では、工程(iii)において、工程(ii)のモニタリングされた磁性粒子運動シグナルについて、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を算出する。本明細書において、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻とは、磁性粒子運動シグナルの比を算出するタイミングのことをいう（本明細書においてmrnと表記することがある）。また図面において、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻を、白抜きの丸記号にて表記することがある。本発明の測定装置で例示すると、試料添加時の磁性粒子運動シグナルが測定され（S0）、次いで第2の磁性粒子運動シグナル（S1）が測定された時点で、（S1／S0）という磁性粒子運動シグナルの比が算出可能となる。このような、磁性粒子運動シグナルの比が算出可能となった時点を、本明細書では、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻という。実際には装置が計算処理を行うため若干の時間差があり、S1が測定された時点と、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻mr1とは、厳密には異なる。しかしながら、本明細書では便宜上、磁性粒子運動シグナルの比が算出可能となった時点を、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻とする。なお、これはS1が測定された時点で、すなわち磁性粒子運動シグナルの比が算出可能となった時点で、直ちに装置が磁性粒子運動シグナルの比を算出しなければならないことを意味するものではない。例えば本発明の装置は、S0、S1が測定された後、すなわち磁性粒子運動シグナルの比が算出可能となった後、当該測定シグナルを一時的にメモリに保持し、次いで所定時間後に、磁性粒子運動シグナルの比を算出してもよい。
本明細書において、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期とは、磁性粒子運動シグナルの比を算出する周期、すなわち、任意の第１の磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻と任意の第２の磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻との間の時間間隔をいう。例えば、磁性粒子運動シグナルをモニターする時刻を、mm0、mm1、mm2、mm3、mm4、・・・とし、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻を、mr1、mr2、mr3、mr4・・・とし、mm1＝mr1、mm2＝mr2、mm3＝mr3、mm4＝mr4・・・とすると、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期は、（mr2－mr1）、（mr3－mr2）、（mr4－mr3）・・・と表すことができる。図面において、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期を、白抜きの太い矢印記号にて表記することがある。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期は一定とすることができる。別の実施形態では、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期を変化させてもよい。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期は、0.1秒～2秒から選択され得る。
本発明の方法において、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期と、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期とは、同一であってもよく、又は異なってもよい。例えばある実施形態では、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期と、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期とを、共に、0.5秒とし得るが本発明はこれに限らない。例えば別の実施形態では、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期を0.1秒とし、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期を0.5秒とし得るが本発明はこれに限らない。
本明細書において、磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔とは、S2／S1というシグナル比を算出する場合、S1をモニターした時刻からS2をモニターした時刻までの時間間隔をいう。例えば磁性粒子運動シグナルをモニターする時刻を、mm0、mm1、mm2、mm3、mm4、・・・とし、mm0でモニターされる磁性粒子運動シグナルをS0、mm1でモニターされる磁性粒子運動シグナルをS1、mm2でモニターされる磁性粒子運動シグナルをS2、mm3でモニターされる磁性粒子運動シグナルをS3、mm4でモニターされる磁性粒子運動シグナルをS4、・・・とし、磁性粒子運動シグナルの比を算出する時刻を、mr1、mr2、mr3、mr4、・・・とし、mm1＝mr1、mm2＝mr2、mm3＝mr3、mm4＝mr4とし、mr1で算出されるシグナル比がS1／S0、mr2で算出されるシグナル比がS2／S1、mr3で算出されるシグナル比がS3／S2、mr4で算出されるシグナル比がS4／S3とすると、磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は、（mm1－mm0）、（mm2－mm1）、（mm3－mm2）、（mm4－mm3）等となる。図面において磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔を、黒塗の太矢印記号にて表記することがある。なお、S0とS1との間に、（S1／S0）というシグナル比の算出に用いられなかった、別のシグナルが存在してもかまわない。すなわちある実施形態において、測定点（測定シグナル）を、全て計算に用いる必要はない。本発明の方法において、磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は一定とする。即ち、前出の例で説明すると、（mm1－mm0）＝（mm2－mm1）＝（mm3－mm2）＝（mm4－mm3）・・・と表すことができる。ある実施形態において、磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は、0.1秒～2秒から選択される一定の時間間隔、例えば0.5秒、1秒、1.5秒または2秒間隔であり、好ましくは1秒間隔である。
本発明に使用するフィブリノゲン定量試薬としては、高活性のトロンビンまたは高活性のトロンビン様タンパク、磁性粒子、ヘパリン中和剤、フィブリンモノマー会合阻害剤、カルシウム塩、アミノ酸またはその塩もしくは糖類を含有するフィブリノゲン定量乾燥試薬が挙げられる。
フィブリノゲン定量乾燥試薬の調製方法を例示すれば、まず、フィブリンモノマー会合阻害剤、およびアミノ酸またはその塩もしくは糖類を含有した緩衝液を作製後、高活性のトロンビンまたは高活性のトロンビン様タンパクを該緩衝液に溶解し、次いで、該溶解液に磁性粒子を添加して最終溶液とした後、該最終溶液を任意の反応スライドに一定量分注し、凍結後、凍結乾燥する方法が採用できる。緩衝液はヘパリン中和剤及び／又は消泡剤をさらに含みうる。
上記調製方法において使用する反応スライドは、フィブリノゲン測定時、フィブリノゲン定量乾燥試薬内の粘度上昇を磁性粒子の運動シグナルの減衰として光学的にモニターできる反応スライドであれば、特に限られるものではない。例示すると、図１および図２に示すような反応スライドが挙げられる。図１は、反応スライドを上方から見た図である。図１の点線で囲んだ部分が、フィブリノゲン定量乾燥試薬を調製するための最終溶液の分注口と試料添加口とからなる反応セル部である。反応セル部の構造の詳細の図２に示す。まず、白色のポリエステル板Ｃにまず、透明色のポリエステル板Ｂを貼合わせ、次に、貼り合わせた透明色のポリエステル板Ｂの上にさらに透明色のポリエステル板Ａを貼り合わせて反応セル部を構成する。まず、界面活性剤水溶液を図１に示す分注口から充填し、吸引除去することにより、Ｄの部分を親水化する。その後、フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液を該分注口から注入することで、Ｄの部分に該最終溶液が充填される。この種の反応スライドを使用した場合、通常上記のフィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液を20～30μL分注することができる。このような磁性粒子を用いたフィブリノゲンの定量方法については、例えば特許文献２を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
図１に示すような反応スライドのことを、本明細書においてドライ試薬カードということがある。すなわち、ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、ドライ試薬カードに適用することができる。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬の乾燥試薬層は、好ましくは、（i）検体滴下後すみやかに溶解する。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬の乾燥試薬層は、好ましくは、（ii）試薬間で、溶解速度に差がないか、又は実質的に差が無い。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬の乾燥試薬層は、好ましくは、（iii）耐衝撃性（衝撃耐性ともいう）を有する。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、好ましくは、（iv）乾燥試薬層が均一である。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、好ましくは、（v）前記（i）～（iv）を満たすために添加する物質が反応に影響を及ぼさないか、又は実質的に反応に影響を及ぼさない。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、（i）～(v)の全てを満たす。
以下に述べるフィブリノゲン定量乾燥試薬中の各構成成分の含量は、特に断りがない限り、図1および図2に示した反応スライドに分注する最終溶液1mL当たりの重量および活性を示す。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、
(i)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、
(ii) 磁性粒子、
(iii) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(iv) カルシウム塩、
(v) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(vi) 乾燥試薬層補強材、及び
(vii) pH調整剤（pH緩衝剤）
を必須成分として含む。別の実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、さらに任意成分として、ヘパリン中和剤及び／又は消泡剤を含み得る。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、無希釈の血漿又は全血検体を測定するためのものである。
(i)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、
(ii) 磁性粒子、
(iii) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(iv) カルシウム塩、
(v) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(vi) 乾燥試薬層補強材、及び
(vii) pH調整剤（pH緩衝剤）
を必須成分として含む。別の実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、さらに任意成分として、ヘパリン中和剤及び／又は消泡剤を含み得る。ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、無希釈の血漿又は全血検体を測定するためのものである。
本明細書において「無希釈の全血」とは、採血された後の全血サンプルに、さらに希釈緩衝液を添加するなどの希釈操作を行っていない、全血をいう。したがって採血時に、採血管に含まれるクエン酸などにより血液が希釈されたとしても（このような血液を一般的にクエン酸加全血という）、採血後の全血に対して特段の希釈操作が行われていなければ、それは本明細書にいう無希釈の全血に該当するものとする。したがって無希釈の全血には、希釈操作の行われていないクエン酸加全血や、ヘパリン加全血が包含される。また本明細書において「無希釈の血漿」とは、無希釈の全血を遠心して得られる上清であって、さらに希釈緩衝液を添加するなどの希釈操作を行っていない、血漿をいう。したがって無希釈の血漿には、希釈操作の行われていないクエン酸加血漿や、ヘパリン加血漿が包含される。なお本明細書において、無希釈と未希釈は同義とする。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質を含む。本明細書において、トロンビン活性を有するタンパク質をトロンビン様タンパク質ということがある。本明細書において、トロンビン活性とは、(i)フィブリノゲンのフィブリンモノマーへの変換、及び(ii)カルシウムイオンの存在下での、第XIII因子の、XIIIaへの活性化、の両方の反応を進めることができる活性をいう。また、このような活性を有するタンパク質をトロンビン活性を有するタンパク質という。ただし、これはある単一のタンパク質が前記の(i)及び(ii)の反応の両方を進めなければならないことを意味するものではない。すなわち、特定の実施形態では、トロンビン活性として、(i)フィブリノゲンのフィブリンモノマーへの変換反応を進める第１タンパク質と、(ii)第XIII因子のXIIIaへの活性化反応を進める第２タンパク質との混合物を使用することができる。第1タンパク質の例としては、ヘビトロンビン（ヘビ由来トロンビン様酵素）が挙げられる。第２タンパク質は、第XIII因子のAサブユニットのN末端から数えて37番目のアルギニンと38番目のグリシンの間を特異的に切断する作用を持つタンパク質が考えられる。トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質としては、ウシトロンビン、ヒトトロンビン並びにそれらの組換え体が挙げられるが、これに限らない。ある実施形態において、トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質は、ウシトロンビンであり得る。ウシトロンビンは凍結乾燥品として一般に市販され容易に入手できるものを使用しうる。また、トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質としては、ヘビトロンビン（ヘビ由来トロンビン様酵素）と第XIII因子のAサブユニットのN末端から数えて37番目のアルギニンと38番目のグリシンの間を特異的に切断する作用を持つタンパク質との組み合わせが挙げられるが、これに限らない。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるトロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質の活性は特に限定されないが、ウシトロンビン活性量としては、例えば100～500NIHU／1mL最終溶液の範囲で選べば良いが、150～400NIHU／1mL最終溶液の範囲が好適である。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、磁性粒子を含む。フィブリノゲン定量乾燥試薬に用いる磁性粒子としては、公知のものを何ら制限なく使用することができる。磁性粒子としては、例えば、四三酸化鉄粒子、三二酸化鉄粒子、鉄粒子、コバルト粒子、ニッケル粒子、酸化クロム粒子等が挙げられるが、これに限らない。ある実施形態では、磁性粒子は四三酸化鉄の微粒子であり得る。すなわち特定の実施形態では、得られる磁性粒子の運動シグナルの強度の点で四三酸化鉄の微粒子が好適に使用される。磁性粒子の粒子径は、特に限定されないが、平均粒子径0.05～5μm、0.1～3.0μm、例えば0.25～0.5μmとすることができるが、これに限らない。ある実施形態では、磁性粒子は、平均粒子径が0.1～3.0μmのものであり得る。本明細書において平均粒子径とは、特に断らない限り、レーザー回折・散乱法により決定した粒度分布における積算値50%での粒径（D50）をいう。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有される磁性粒子の量は、特に限定されず、例えば4～40mg／1mL最終溶液の範囲が好適である。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、任意成分として、ヘパリン中和剤を含み得る。ヘパリン中和剤としては、公知のものを何ら制限なく使用することができ、例えばポリブレン、硫酸プロタミン、およびヘパリナーゼ等が挙げられるがこれに限らない。ある実施形態において、ヘパリン中和剤としては、保存安定性の良さ、価格面からポリブレンを好適に使用することができる。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるヘパリン中和剤の量としては、適宜設定すればよく、特に制限されない。ある実施形態においてヘパリン中和剤としてポリブレンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるポリブレン量は、例えば50～300μg／1mL最終溶液の範囲が好適である。
フィブリノゲン定量乾燥試薬は、フィブリンモノマー会合阻害剤を含む。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含まれるフィブリンモノマー会合阻害剤としては、公知のものを何ら制限なく使用することができる。フィブリンモノマー会合阻害剤としては、例えば、GPRP（グリシン－プロリン－アルギニン－プロリン）ペプチドおよびその誘導体、例えばGPRP-アミド、GHRP（グリシン－ヒスチジン－アルギニン－プロリン）ペプチドおよびその誘導体、例えばGHRP-アミド等が挙げられるが、これに限らない。別の実施形態では、フィブリンモノマー会合阻害剤はGPRPA（グリシン－プロリン－アルギニン－プロリン－アラニン）ペプチドおよびその誘導体、例えばGPRPA-アミドであり得る。ある実施形態では、フィブリンモノマー会合阻害剤としては、フィブリノゲンに対する親和性の面でGPRPペプチドおよびその誘導体が好適である。該ペプチドは、フィブリノゲンにトロンビンが反応し、フィブリンゲンのα鎖からフィブリノペプチドAの遊離によって露出されるknob ‘A’のアナログであり、該ペプチドがknob ‘A’の代わりにγ鎖に存在するhole ‘a’ に結合することにより、フィブリンモノマーの会合を阻害する（John WW：Mechanisms of fibrin polymerization and Clinical implications, Blood, 121(10), 1712-1719, 2013)。
フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるフィブリンモノマー会合阻害剤の量としては、適宜設定すればよく、特に制限されない。フィブリンモノマー会合阻害剤としてGPRPアミドを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるGPRPアミドの量としては、100～300μg／1mL最終溶液の範囲が好適である。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、カルシウム塩を含む。該乾燥試薬に用いるカルシウム塩は、公知のものが何ら制限なく使用できる。例えば、無機酸とカルシウムとの塩として、塩化カルシウム、亜硝酸カルシウム、硫酸カルシウム、および炭酸カルシウム等が挙げられる。また、有機酸とカルシウムとの塩としては、乳酸カルシウムおよび酒石酸カルシウム等が挙げられる。ある実施形態では、カルシウム塩として、塩化カルシウムが好適である。フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるカルシウム塩の量は、適宜設定すればよく、特に制限されない。カルシウム塩として塩化カルシウム・2水和物を用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させる塩化カルシウム・2水和物量は、0.2～2mg／1mL最終溶液の範囲が好適である。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、乾燥試薬層溶解性向上剤を含む。乾燥試薬層溶解性向上剤としては、アミノ酸またはその塩もしくは糖類が挙げられる。用いられるアミノ酸またはその塩もしくは糖類としては、中性アミノ酸若しくはその塩、酸性アミノ酸若しくはその塩、塩基性アミノ酸若しくはその塩、単糖類及び多糖類のいずれを使用しても良い。代表的な酸性アミノ酸若しくはその塩としては、グルタミン酸、グルタミン酸ナトリウム、アスパラギン酸、アスパラギン酸ナトリウム等が挙げられる。代表的な中性アミノ酸またはその塩としては、グリシン、グリシン塩酸塩、アラニン等が挙げられる。代表的な塩基性アミノ酸またはその塩としては、リジン、リジン塩酸塩、アルギニン等が挙げられる。さらに、単糖類としては、グルコース、フルクトース等が挙げられる。また、多糖類としては、ショ糖、乳糖、デキストリン等が挙げられる。そのうち、フィブリノゲン定量乾燥試薬に試料を添加した際の試薬の溶解性が良好な点、得られる磁性粒子の運動シグナルの再現性が良好な点、および耐衝撃性が良好な点から、グリシンが最も好ましい。すなわち、ある実施形態において、乾燥試薬層溶解性向上剤はグリシンであり得る。
フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させる乾燥試薬層溶解性向上剤、例えばアミノ酸またはその塩もしくは糖類の量は、適宜設定すればよく、特に制限されない。ある実施形態において、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、１．５重量％以上、１．６重量％以上、１．７重量％以上、１．８重量％以上、１．９重量％以上、２．０重量％以上、２．１重量％以上、２．２重量％以上、２．３重量％以上、２．４重量％以上、２．５重量％以上、２．６重量％以上、２．７重量％以上、２．８重量％以上、２．９重量％以上、３．０重量％以上、３．１重量％以上、３．２重量％以上、３．３重量％以上、３．４重量％以上、３．５重量％以上、３．６重量％以上、３．７重量％以上、３．８重量％以上、３．９重量％以上、４．０重量％以上、４．１重量％以上、４．２重量％以上、４．３重量％以上、４．４重量％以上、４．５重量％以上、４．６重量％以上、４．７重量％以上、４．８重量％以上、４．９重量％以上、例えば５．０重量％とすることができる。ある実施形態において、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、５．０重量％以下、４．９重量％以下、４．８重量％以下、４．７重量％以下、４．６重量％以下、４．５重量％以下、４．４重量％以下、４．３重量％以下、４．２重量％以下、４．１重量％以下、４．０重量％以下、３．９重量％以下、３．８重量％以下、３．７重量％以下、３．６重量％以下、３．５重量％以下、３．４重量％以下、３．３重量％以下、３．２重量％以下、３．１重量％以下、３．０重量％以下、２．９重量％以下、２．８重量％以下、２．７重量％以下、２．６重量％以下、２．５重量％以下、２．４重量％以下、２．３重量％以下、２．２重量％以下、２．１重量％以下、２．０重量％以下、１．９重量％以下、１．８重量％以下、１．７重量％以下、１．６重量％以下、例えば１．５重量％とすることができる。本明細書において、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は下限値と上限値とを、前記のいずれかの値に設定した、あらゆる組合せを包含する。例えばある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は１．５～５．０重量％、２．０～５．０重量％、２．５～５．０重量％、３．０～５．０重量％、３．５～５．０重量％、４．０～５．０重量％、４．５～５．０重量％、１．５～４．５重量％、２．０～４．５重量％、２．５～４．５重量％、３．０～４．５重量％、３．５～４．５重量％、４．０～４．５重量％、１．５～４．０重量％、２．０～４．０重量％、２．５～４．０重量％、３．０～４．０重量％、３．５～４．０重量％、１．５～３．５重量％、２．０～３．５重量％、２．５～３．５重量％、３．０～３．５重量％、１．５～３．０重量％、２．０～３．０重量％、２．５～３．０重量％、１．５～２．５重量％、２．０～２．５重量％、又は１．５～２．０重量％とし得る。ある実施形態において、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は１．５～４．０重量％の範囲が好適である。別の実施形態において、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は２．０～３．０重量％の範囲が好適である。無希釈血漿を測定する場合は、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、上記の範囲、例えば１．５％～４．０重量％とすることができる。無希釈全血を測定する場合は、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、上記の範囲、例えば１．５重量％以上とすることができる。例えば無希釈全血を測定する場合において、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いるとき、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、１．５～５．０重量％、１．５～４．５重量％、例えば１．５～４．０重量％とすることができる。無希釈血漿でも無希釈全血でも測定可能とする場合には、乾燥試薬層溶解性向上剤としてグリシンを用いる場合、フィブリノゲン定量乾燥試薬に含有させるグリシン量は、これらの範囲の種々の組み合わせでもよい。なお、本明細書において重量％は、特に断らない限り、最終溶液における濃度、すなわち終濃度である。
ある実施形態において、フィブリノゲン定量乾燥試薬は、pH緩衝剤（pH調整剤ともいう）を含む。凍結乾燥に先立ち、トロンビン活性を有するタンパク、磁性粒子、ヘパリン中和剤、フィブリンモノマー会合阻害剤、カルシウム塩、乾燥試薬層溶解性向上剤を含有させる緩衝液は、pH=6.0～8.0の間で緩衝作用があるものであれば特に限定されない。ある実施形態においてpH調整剤（pH緩衝剤）は、試薬のpHをpH6.0～pH8.0、例えばpH約7.35やpH約7.5に調整するものであり得る。緩衝剤としては、例示すれば、40mM HEPES緩衝液（pH=7.35）または40mM Tris-HCl緩衝液（pH=7.5）等が好適なものとして挙げられる。
ある実施形態において、本発明に係るフィブリノゲン定量乾燥試薬は、乾燥試薬層補強材を含む。乾燥試薬層補強材としては、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミンなどが挙げられるが、これに限らない。該定量乾燥試薬に含有させる乾燥試薬層補強材の量は、乾燥試薬層補強材としてウシ血清アルブミンを使用する場合、0.6～2.0mg／1mL最終溶液の範囲が好適である。
ある実施形態において、本発明に係るフィブリノゲン定量乾燥試薬は、任意成分として、消泡剤を含み得る。消泡剤としては、ソルビタンモノラウレート、シリコーン系消泡剤、ポリプロピレングリコール系消泡剤が挙げられるが、これに限らない。該定量乾燥試薬に含有させる消泡剤の量は、消泡剤としてソルビタンモノラウレートを使用する場合、約０．００１～約０．０１０重量％の範囲が好適である。
上記の成分を含む緩衝液溶液の乾燥方法は、フィブリノゲン定量乾燥試薬の溶解性、得られる磁性粒子の運動シグナルの強度、再現性の点から凍結乾燥法が好ましい。風乾による乾燥では、試薬の溶解性が悪いため、磁性粒子の運動シグナルが弱く終点の検知が難しい。また、風乾試薬の場合、たとえ終点を見いだせたとしても終点から求められる凝固時間がフィブリノゲン濃度に対応しない場合も生じうる。
凍結および凍結乾燥法は特に限定されない。例示すると、フィブリノゲン定量乾燥試薬用最終溶液を図１に示した分注口から反応スライドに分注した後、該反応スライドを－40℃以下に保温したフリーザーに一昼夜保管して凍結する、または棚温を－40℃以下にした凍結乾燥機に該反応スライドをセットし、一昼夜保管して凍結する、あるいは、該反応スライドを液体窒素で瞬間凍結する等の一般的な凍結方法が使用できる。また、凍結した反応スライドの凍結乾燥法も特に限定されない。凍結乾燥法を例示すると、凍結した反応スライドを真空状態で－30℃から－20℃まで24時間で直線的に温度上昇させた後、次いで、－20℃から30℃まで20時間で直線的に温度上昇させ、最後に30℃で3時間保った後、乾燥空気で真空解除する方法が挙げられる。
上記凍結乾燥後のフィブリノゲン定量乾燥試薬は、直ちに、除湿された環境下で、アルミフィルムで密封することが好ましい。該除湿された環境は特に制限されないが、22～27℃の室温で相対湿度を35％以下とした環境が好ましい。また、アルミフィルムの仕様は特に制限されないが、ポリエステルフィルム（厚さ12μｍ）、ポリエチレン樹脂（厚さ15μｍ）、アルミニウム箔（厚さ9μｍ）、ポリエチレン樹脂（厚さ20μｍ）、ポリエチレンフィルム（厚さ30μｍ）をACコート剤で接着させた5層構造のアルミフィルム（厚さ86μｍ）が望ましい。該アルミフィルムでフィブリノゲン定量乾燥試薬全体を包容し、熱溶着で密封する。フィブリノゲン定量乾燥試薬は、それを用いてフィブリノゲン定量するまで、密封された状態で冷蔵保存することが好ましい。
本発明の定量方法において、磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲は、特に制限されない。例えば磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲は1.0±0.05～1.0±0.2の範囲、例えば1.0±0.2、1.0±0.19、1.0±0.18、1.0±0.17、1.0±0.16、1.0±0.15、1.0±0.14、1.0±0.13、1.0±0.12、1.0±0.11、1.0±0.1、1.0±0.09、1.0±0.08、1.0±0.07、1.0±0.06、1.0±0.05とすることができる。ある実施形態では磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲は1.0±0.05～1.0±0.15の範囲が好適であるが、特に好適なのは、得られる凝固時間の再現性が良い点から、1.0±0.1である。別の言い方をすれば、磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲は0.8～1.2の範囲、0.81～1.19の範囲、0.82～1.18の範囲、0.83～1.17の範囲、0.84～1.16の範囲、0.85～1.15の範囲、0.86～1.14の範囲、0.87～1.13の範囲、0.88～1.12の範囲、0.89～1.11の範囲、0.9～1.1の範囲、0.91～1.09の範囲、0.92～1.08の範囲、0.93～1.07の範囲、0.94～1.06の範囲、0.95～1.05の範囲等とすることができるが、特に好適なのは、得られる凝固時間の再現性が良い点から、0.9～1.1の範囲である。
本発明の定量方法において、磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間（区間）は、特に制限されない。例えば磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間（区間）は、例えば1～5秒間、1～4秒間、1～3秒間、5秒間、4.5秒間、4秒間、3.5秒間、3秒間、2.5秒間、2秒間、1.5秒間、1秒間等とすることができるがこれに限らない。ある実施形態では、磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間（区間）は1～3秒間が好適であるが、特に好適なのは、得られる凝固時間の再現性が良い点から、1.5秒間である。
本発明の定量方法において、起点とは、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比を複数モニターし、その比が一定の範囲内に一定時間保たれた区間の中の任意の点を指す。一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比は連続的に又は断続的にモニターしうる。特定の実施形態では、起点を、一該比が一定の範囲内に一定時間保たれた区間の中の先頭とすることができる。別の実施形態では、起点を、一該比が一定の範囲内に一定時間保たれた区間の中の先頭の点以外の点、例えば該比が一定の範囲内に一定時間保たれた区間の内の第２の点、第３の点又は第４の点等とすることもできる。このような実施形態も本質的に本発明に包含される。なお、本明細書において、起点とは、試料添加後のシグナルの初期的なばらつきを回避するために、本発明の方法により規定される便宜上の起点であり、例えば表中ではこれを凝固時間0(sec)の点として説明するが、これは実際にその時点からでなければ凝固反応が全く開始しないことを意味するものではない。
本発明の定量方法に関し、ピーク値とは、特に断らない限り、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値のことをいい、これは起点以降の磁性粒子運動シグナルのうちで最大のものである。これは従来技術から把握されるピーク値とは異なるものである。すなわち、特開平０６－１４１８９５号公報（特許第２９８０４６８号）に示されている方法では、単純に、測定された全シグナル中のうちで最大のものがピーク値とされていた。しかしながら、本発明者らが、特願２０１８－２２９９１９号に記載の乾燥試薬を、特開平６－１４１８９５(特許２９８０４６８号)の定量方法に適用したところ、試料添加後の測定初期に磁性粒子運動シグナルが大きくばらつき、全測定シグナル中の最大値をピーク値としたのでは正しくフィブリノゲンを定量できない場合があった。そこで本発明は、起点を規定し、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値を正しく把握することにより、無希釈検体についてのフィブリノゲンをより正確に定量するものである。
本発明の定量方法において、終点とは、上記方法で求めた起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点の中の任意の点を指す。例えば該起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値を100%とすると、磁性粒子運動シグナルがその70%に相当するシグナル値であれば、本明細書ではこれを30%減衰した点という。例えば終点は、該起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点、10～45％減衰した点、15～40％減衰した点、20～35％減衰した点、20～30％減衰した点、例えば20％減衰した点、25％減衰した点、30％減衰した点とすることができるが、これに限らない。特に好適なのは、得られる凝固時間の再現性が良い点から、磁性粒子運動シグナルのピーク値から30％減衰した点である。ある実施形態では、測定する血液が無希釈全血であるか無希釈血漿であるかに応じて、終点を定める条件を使い分けることができる。すなわち、例えば測定する血液が無希釈全血である場合は終点を該起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20％減衰した点とし、例えば測定する血液が無希釈血漿である場合は終点を該起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点とすることができる。使い分けるそれぞれの終点は、上記の該起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点から適宜選択し得る。なお、本明細書において、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値とは、起点以降に測定された磁性粒子運動シグナルのうちで最大のシグナル（Ｃ）をいい、これには起点自身も含まれうる。すなわち、起点における磁性粒子運動シグナルが起点以降に測定された磁性粒子運動シグナルのうちで最大のシグナルであれば、それが起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値となる。
本発明にいう凝固時間とは、上記起点から上記終点までの時間を指す。すなわち本発明のフィブリノゲン定量方法において凝固時間は上記起点から上記終点までの時間として算出される。得られる凝固時間は、フィブリノゲン濃度に相関している。本発明のフィブリノゲン定量法を適用できる装置を例示すると、製品名CG02N（株式会社エイアンドティ―製）等が挙げられるが、使用可能な装置はこれに限らない。
CG02Nは従来のフィブリノゲン定量方法（特開平０６－１４１８９５号公報（特許第２９８０４６８号））に適した装置であり、検体をフィブリノゲン定量乾燥試薬に添加後、0.5秒間隔で振動磁場と静止永久磁場の組合せがかけられ、同間隔で磁性粒子運動シグナルがモニターされる。該装置を用いて本発明のフィブリノゲン定量方法を行うには、これらに加え、例えば特定の実施形態では、１秒間隔の磁性粒子運動シグナル比を連続的に算出し、その比が1.0±0.1の範囲内で1.5秒間保たれた区間の先頭の点を起点として検出することができる。このとき、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値から所定の値、例えば5～50%から選択される値、例えば30％減衰した点を終点とし、起点から終点までの時間を凝固時間として算出することができる。ただしこれは一例であって本発明はこれに限らない。
これらの演算処理を含めた一連の動作は、プログラム又はソフトウエアにより該装置を制御して行ってもよい。プログラム又はソフトウエアは装置に組込まれたものでもよく、情報記録媒体に記録されたものでもよい。ある実施形態において本発明は、本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するためのプログラム又はソフトウエアを提供する。ある実施形態において本発明は、本発明のプログラム又はソフトウエアが記録された情報記録媒体を提供する。ある実施形態において本発明は、本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するプログラム若しくはソフトウエアが組込まれた又は該情報記録媒体が格納された、フィブリノゲン定量測定装置を提供する。ある実施形態において、本発明のフィブリノゲン定量測定装置は、CG02N装置に本発明のプログラムを組み込んだものを包含する。
表1に、本発明のフィブリノゲン定量方法を用いて任意の全血検体を測定した例を示す。該方法では、検体を添加した直後から0.5秒間隔で磁性粒子運動シグナルがモニターされる。すなわち、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は0.5秒である。そして、1秒間隔の磁性粒子運動シグナル比が連続して計算される。換言すれば磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は1秒である。即ち、（モニター時間1.0秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間0秒の磁性粒子運動シグナル）、（モニター時間1.5秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間0.5秒の磁性粒子運動シグナル）、（モニター時間2.0秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間1.0秒の磁性粒子運動シグナル）・・・というように計算される。その比が1.0±0.1の範囲で1.5秒間保たれる区間は、モニター時間5.0～6.5秒の区間である。その先頭の点はモニター時間5.0秒の時であるので、その点を起点（凝固反応開始点：凝固時間0秒の点）とすることができる。起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値は、モニター時間7.0秒時の2726cである。起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％低い磁性粒子運動シグナルは1908cと計算される。即ち、終点は磁性粒子運動シグナルが1908cとなる点であり、凝固時間は20.1秒と計算される。磁性粒子運動シグナル1908cは計算値であるため、それに対応するモニター時間及び１秒間隔での磁性粒子運動シグナルの比は表中に示されていない。すなわち、本発明の方法により得られる凝固時間は、実際の測定点（実際のモニター時間）のいずれかであることを要しない。
なお、本発明のフィブリノゲン定量方法は上記に限らない。磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期と磁性粒子運動シグナル比の算出周期と磁性粒子シグナル比の算出に用いる時間間隔は、全て同一であってもよく（例えば図７参照）又は異なってもよい（例えば図８、９参照）。また、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は一定であってもよく（例えば図７、８、９参照）又は変化してもよい（例えば図１０参照）。また、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期及び磁性粒子運動シグナル比の算出周期は一定であってもよく（例えば図７、８、９参照）、又は変化してもよい（例えば図１１参照）。また、磁性粒子運動シグナルの比の算出は、連続的に求めてもよく（例えば図７、８参照）、断続的に求めてもよく（例えば図９参照）、連続的に算出した後、断続的に算出してもよく（例えば図１２参照）、又は、断続的に算出した後、連続的に算出してもよい（例えば図１３参照）。磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期、磁性粒子運動シグナルの比の算出周期、及び磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は種々の条件とし得る。ただし検量線を作成する条件と、検体を測定する条件とは同じ条件とすることが好ましい。本明細書の記載から明らかとなる他の種々の実施形態もまた本発明に包含される。
該凝固時間を利用してのクエン酸加血漿中のフィブリノゲン定量法は特に限定されない。代表的な例を示すと、まず、フィブリノゲン濃度が既知で且つ濃度の異なる3種類のクエン酸加血漿を試料として上記の方法で測定し、それぞれのクエン酸加血漿に対応する凝固時間を得た後、それを基に検量線を予め作成しておく。次いで、任意のクエン酸加血漿を試料として上記の方法で測定し、凝固時間を得た後、前出の作成した検量線を使用して任意のクエン酸加血漿のフィブリノゲン濃度を見出す方法が挙げられる。該方法に使用される検量線はY軸をLN（フィブリノゲン濃度）とし、X軸をLN（凝固時間）とした直線回帰式が好適である。得られる直線回帰式は、一次式（Y＝A×X＋B）となり、任意のクエン酸加血漿のフィブリノゲン濃度は、一次式の傾き（A）と切片（B）に基づいて、下記の式で算出される。
[数１]
任意のクエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度＝eB ×（凝固時間）A
[数１]
任意のクエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度＝eB ×（凝固時間）A
検体中フィブリノゲン濃度は、通常、クエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度として表現される。全血検体は血漿成分だけではなく血球成分が含まれているため、全血検体を試料としてフィブリノゲン定量する場合には、該検体のヘマトクリット値を考慮する必要がある。つまり、全血検体を試料とする場合は、全血測定で得られた凝固時間から換算されたフィブリノゲン濃度に対しヘマトクリット補正式で補正を行い、検体中フィブリノゲン濃度を算出する必要がある。また、クエン酸加全血の場合は、クエン酸ナトリウム溶液１容に対して全血９容を添加・混和して測定試料が得られるのに対して、ヘパリン加全血の場合は、ヘパリンナトリウムあるいはヘパリンリチウムの粉末に対して全血を添加・混和して測定試料が得られるので、適用するヘマトクリット補正式は、クエン酸加全血の場合とヘパリン加全血の場合とで異なる。具体的には、クエン酸加全血を試料とした場合の検体中フィブリノゲン濃度は、以下の補正式で算出される。
[数２]
検体中フィブリノゲン濃度
＝クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値×0.9））
[数２]
検体中フィブリノゲン濃度
＝クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値×0.9））
又、ヘパリン加全血を試料とした場合の検体中フィブリノゲン濃度は、以下の補正式で算出される。
[数３]
検体中フィブリノゲン濃度
＝ヘパリン加全血におけるフィブリノゲン濃度×0.9×（100／（100－ヘマトクリット値））
[数３]
検体中フィブリノゲン濃度
＝ヘパリン加全血におけるフィブリノゲン濃度×0.9×（100／（100－ヘマトクリット値））
なお、クエン酸加全血を測定試料とし、クエン酸加全血を用いてヘマトクリット値を求めた場合の検体中フィブリノゲン濃度は、以下の補正式で算出される。
[数４]
検体中フィブリノゲン濃度
＝クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値））
[数４]
検体中フィブリノゲン濃度
＝クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値））
本発明の方法を用いてフィブリノゲンを定量した結果と従来のClauss法でのフィブリノゲンを定量した結果とは極めて良く一致する。さらに、再現性も好成績が得られ、無希釈全血を試料とした場合でも、信頼性のある定量を可能ならしめた。また無希釈血漿を試料とした場合でも、信頼性のある定量が可能である。
本発明を一般的に説明に説明してきたが、以下の具体的な実施例を参照することによりさらに理解できる。ここに示す実施例は説明の目的だけのものであり、特記しない限り限定の意図は有しない。
[実施例１ 本発明のフィブリノゲン定量方法を用いた凝固時間測定]
まず、特願２０１８－２２９９１９号に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬を以下の方法で作製した。
10mM CaCl2・2H2O、2.0（wt/v）％グリシン、160μg/mLポリブレン、1.2mg/mLウシ血清アルブミン、0.005（wt/v）％ソルビタンモノラウレート、および200μg/mL GPRPamideを含有させた40mM HEPES緩衝液（pH 7.35）をウシトロンビン凍結乾燥品（オリエンタル酵母製）に添加し、溶解させて、333NIHU/mLのトロンビン活性を有する試薬液を得た。該試薬液35ｍLに対して、四三酸化鉄（製品名AAT-03；平均粒子径0.35μｍ；戸田工業製）0.47gを添加し、懸濁させて、最終溶液を得た。該最終溶液25μLを図１に示す反応スライドに分注した。該反応スライドを－40℃に保温したフリーザーに一昼夜保管して凍結した。次いで、凍結した反応スライドを凍結乾燥した。凍結乾燥の条件は、真空状態で－30℃から－20℃まで24時間で直線的に温度上昇させた後、－20℃から30℃まで20時間で直線的に温度上昇させ、最後に30℃で3時間保った後、乾燥空気で真空解除する方法で行った。凍結乾燥試薬は、直ちに除湿された環境下で、アルミフィルムに密封した。
まず、特願２０１８－２２９９１９号に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬を以下の方法で作製した。
10mM CaCl2・2H2O、2.0（wt/v）％グリシン、160μg/mLポリブレン、1.2mg/mLウシ血清アルブミン、0.005（wt/v）％ソルビタンモノラウレート、および200μg/mL GPRPamideを含有させた40mM HEPES緩衝液（pH 7.35）をウシトロンビン凍結乾燥品（オリエンタル酵母製）に添加し、溶解させて、333NIHU/mLのトロンビン活性を有する試薬液を得た。該試薬液35ｍLに対して、四三酸化鉄（製品名AAT-03；平均粒子径0.35μｍ；戸田工業製）0.47gを添加し、懸濁させて、最終溶液を得た。該最終溶液25μLを図１に示す反応スライドに分注した。該反応スライドを－40℃に保温したフリーザーに一昼夜保管して凍結した。次いで、凍結した反応スライドを凍結乾燥した。凍結乾燥の条件は、真空状態で－30℃から－20℃まで24時間で直線的に温度上昇させた後、－20℃から30℃まで20時間で直線的に温度上昇させ、最後に30℃で3時間保った後、乾燥空気で真空解除する方法で行った。凍結乾燥試薬は、直ちに除湿された環境下で、アルミフィルムに密封した。
上記のフィブリノゲン定量乾燥試薬を使用し、本発明のフィブリノゲン定量方法を用いて任意の全血検体を測定した。この方法では、検体を添加した直後から0.5秒間隔で磁性粒子運動シグナルをモニターした。すなわち、磁性粒子運動シグナルのモニタリング周期は0.5秒である。そして、1秒間隔の磁性粒子運動シグナル比を連続して計算した。換言すれば磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔は1秒である。即ち、（モニター時間1.0秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間0秒の磁性粒子運動シグナル）、（モニター時間1.5秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間0.5秒の磁性粒子運動シグナル）、（モニター時間2.0秒の磁性粒子運動シグナル）／（モニター時間1.0秒の磁性粒子運動シグナル）・・・というように計算を行った。その比が1.0±0.1の範囲で1.5秒間保たれる区間は、モニター時間5.0～6.5秒の区間であった。その先頭の点はモニター時間5.0秒の時であるので、その点を起点（凝固反応開始点：凝固時間0秒の点）とした。起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値は、モニター時間7.0秒時の2726cである。起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％低い磁性粒子運動シグナルは1908cと計算された。即ち、終点は磁性粒子運動シグナルが1908cとなる点であり、凝固時間は20.1秒と計算された。結果を表２に示す。
[実施例２ 無希釈全血を試料とし、フィブリノゲン定量乾燥試薬を使用したときの従来のフィブリノゲン定量方法（特許2980468号の定量法）と本発明のフィブリノゲン定量法（本発明）との比較]
フィブリノゲン定量乾燥試薬は上記のとおり調製した。
先ず、従来の定量法（特許2980468号の定量法）での検量線を算出した。検量線の算出は、以下のように行った。304mg/dLのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィブリノゲン欠乏血漿（Clinisys Associates社製）とを使用して37～304mg/dLまでのヒト血漿7種類の希釈系列を調製した。次いで、血液凝固分析装置CG02N（株式会社エイアンドティー販売）に上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、希釈系列の検体を25μL添加して、各々の検体の凝固時間を求めた。最後に、Y軸をLN（フィブリノゲン濃度）とし、X軸をLN（凝固時間）としてデータをプロットし、回帰式を求めることで、従来の定量法での検量線を算出した。
フィブリノゲン定量乾燥試薬は上記のとおり調製した。
先ず、従来の定量法（特許2980468号の定量法）での検量線を算出した。検量線の算出は、以下のように行った。304mg/dLのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィブリノゲン欠乏血漿（Clinisys Associates社製）とを使用して37～304mg/dLまでのヒト血漿7種類の希釈系列を調製した。次いで、血液凝固分析装置CG02N（株式会社エイアンドティー販売）に上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、希釈系列の検体を25μL添加して、各々の検体の凝固時間を求めた。最後に、Y軸をLN（フィブリノゲン濃度）とし、X軸をLN（凝固時間）としてデータをプロットし、回帰式を求めることで、従来の定量法での検量線を算出した。
その結果、従来の定量法での検量線は、
[数５]
LN（フィブリノゲン濃度）＝－0.8223×LN（凝固時間）＋7.4718
となった（図３）。
[数５]
LN（フィブリノゲン濃度）＝－0.8223×LN（凝固時間）＋7.4718
となった（図３）。
上記検量線式から、フィブリノゲン濃度換算式を以下の式とした。
[数６]
ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.4718×（凝固時間）-0.8223
[数６]
ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.4718×（凝固時間）-0.8223
次いで、本発明の定量法における検量線を算出した。検量線の算出は、以下のように行った。304mg/dLのフィブリノゲンを含有するヒト血漿と、フィブリノゲン欠乏血漿（Clinisys Associates社製）とを使用して37～304mg/dLまでのヒト血漿7種類の希釈系列を調製した。次いで、血液凝固分析装置CG02N（株式会社エイアンドティー製）に上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のソフトウエアを組み込み、希釈系列の検体を25μL添加して、各々の検体の凝固時間を求めた。最後に、Y軸をLN（フィブリノゲン濃度）とし、X軸をLN（凝固時間）としてデータをプロットし、回帰式を求めることで、本発明の定量法における検量線を算出した。
その結果、本発明の定量法における検量線は、
[数７]
LN（フィブリノゲン濃度）＝－0.7636×LN（凝固時間）＋7.2234
となった（図４）。
[数７]
LN（フィブリノゲン濃度）＝－0.7636×LN（凝固時間）＋7.2234
となった（図４）。
上記検量線式から、フィブリノゲン濃度換算式を以下の式とした。
[数８]
ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636
[数８]
ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636
健常人一人からクエン酸ナトリウム真空採血管（2mL仕様）7本を用いて採血し、クエン酸加全血14mLを得た。該採血管7本を4℃、3000rpm、15min遠心した。遠心した採血管7本のうち3本を残し、4本の採血管から上清（血漿）を1mLずつ分取し、PP容器に分注することにより、クエン酸加血漿Aを4mL得た。残した採血管3本のうち1本に対してクエン酸加血漿Aを2.80mL添加した後、密栓して転倒混和することで、クエン酸加全血Bを得た。また、残した採血管3本のうち1本に対してクエン酸加血漿Aを0.40mL添加した後、密栓して転倒混和することで、クエン酸加全血Cを得た。また、残した採血管3本のうち1本に対して0.56mL上清（血漿）を除去した後、密栓して転倒混和することで、クエン酸加全血Dを得た。
クエン酸加全血B、クエン酸加全血C、およびクエン酸加全血Dのヘマトクリット値を血球計数装置MYTHIC22(J)（株式会社エイアンドティー販売）で測定した。その結果、クエン酸加全血Bは15％、クエン酸加全血Cは30％、クエン酸加全血Dは50％であった。
まず、従来の定量法（特許2980468号）で、クエン酸加血漿A、クエン酸加全血B、クエン酸加全血C、クエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度を調べた。
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、血漿測定モードにした後、クエン酸加血漿Aを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を前出の換算式（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.4718×（凝固時間）-0.8223）を使用して、従来の定量法でのクエン酸加血漿Aのフィブリノゲン濃度を求めた。
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Bを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、従来の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数９]
従来の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－15））
[数９]
従来の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－15））
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Cを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、従来の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数１０]
従来の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－30））
[数１０]
従来の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－30））
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Dを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、従来の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数１１]
従来の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－50））
[数１１]
従来の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－50））
次いで、本発明の定量法で、クエン酸加血漿A、クエン酸加全血B、クエン酸加全血C、クエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度を調べた。
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、血漿測定モードにした後、クエン酸加血漿Aを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を前出の換算式（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）を使用して、本発明の定量法でのクエン酸加血漿Aのフィブリノゲン濃度を求めた。
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Bを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、本発明の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数１２]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－15））
[数１２]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Bのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－15））
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Cを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、本発明の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数１３]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－30））
[数１３]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Cのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－30））
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、全血測定モードにした後、クエン酸加全血Dを25μL添加して、凝固時間を求めた。それを5回行った。得られた凝固時間を上記と同じ換算式でフィブリノゲン濃度に換算した。さらに、以下の式より、本発明の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度を求めた。
[数１４]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－50））
[数１４]
本発明の定量法でのクエン酸加全血Dのフィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－50））
さらに、クエン酸加血漿AをClauss法で定量した。Clauss法でのフィブリノゲンの定量は、試薬をデータファイ・フィブリノゲン（シスメックス製）とし、測定装置をKC4デルタ（Tcoag Ireland Ltd製）として、データファイ・フィブリノゲンの添付文書に示された方法で定量した。5回測定し、その平均値224mg/dLをClauss法でのクエン酸加血漿Aのフィブリノゲン濃度とした。結果を以下に示す。
表３に従来の定量法での測定結果、表４に本発明の定量法での測定結果を示す。特異性を、Clauss法で求めたクエン酸加血漿Aのフィブリノゲン濃度（224mg/dL）に対する回収率で評価した。ヘマトクリット値の高サンプルの方が粘度は高い。表３では、高粘度の全血Ｄについて、血漿Ａと比較して全体的に値が高めである。すなわち、表３の結果から、従来の定量法では、ヘマトクリット値が高い全血検体の場合、正確にフィブリノゲン濃度が定量できないが、本発明の定量法では、ヘマトクリット値が高い全血検体でも正確にフィブリノゲン濃度が定量できていることが明白である。
[実施例３ Clauss法でのフィブリノゲン定量値と本発明の定量法によるフィブリノゲン定量値との相関性]
クエン酸加血漿104検体を用い、Clauss法でフィブリノゲンを定量した結果と本発明の定量法でフィブリノゲンを定量した結果との相関性を調べた。本発明の定量法でのフィブリノゲン定量は、以下の方法で行った。
クエン酸加血漿104検体を用い、Clauss法でフィブリノゲンを定量した結果と本発明の定量法でフィブリノゲンを定量した結果との相関性を調べた。本発明の定量法でのフィブリノゲン定量は、以下の方法で行った。
CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、血漿測定モードにした後、クエン酸加血漿を25μL添加して、凝固時間を求めた。得られた凝固時間を前出の換算式
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）を使用して、
フィブリノゲン濃度に換算し、本発明の定量法でのフィブリノゲン濃度とした。
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）を使用して、
フィブリノゲン濃度に換算し、本発明の定量法でのフィブリノゲン濃度とした。
Clauss法でのフィブリノゲンの定量は、試薬をヒーモスアイエルFib・CXL（LSIメデイエンス製）とし、測定装置をSTACIA（LSIメデイエンス製）として実施した。ヒーモスアイエルFib・CXLの添付文書に示された方法で定量した。
図５にClauss法でのフィブリノゲン定量値と本発明の定量法でのフィブリノゲン定量値との相関図を示した。図５より、本発明の定量法でのフィブリノゲン定量値はClauss法でのフィブリノゲン定量値と良く一致しており、相関性が高いことは明白である。
[実施例４ 本発明の方法を使用して、測定試料をクエン酸加血漿とした場合のフィブリノゲン定量値と測定試料をクエン酸加全血とした場合のフィブリノゲン定量値との相関性]
クエン酸加全血80検体に対して、本発明の定量法でフィブリノゲン定量した結果と同一検体を遠心して得たクエン酸加血漿80検体に対して、本発明の定量法でフィブリノゲン定量した結果との相関性を調べた。
クエン酸加全血80検体に対して、本発明の定量法でフィブリノゲン定量した結果と同一検体を遠心して得たクエン酸加血漿80検体に対して、本発明の定量法でフィブリノゲン定量した結果との相関性を調べた。
まず、クエン酸加全血80検体のヘマトクリット値を血球計数装置MYTHIC22(J)（株式会社エイアンドティー販売）にてそれぞれ求めた。次いで、CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、全血測定モードにした後、クエン酸加全血を25μL添加して、各々の検体の凝固時間を求めた。得られた凝固時間を前出の換算式
[数１５]
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）
を使用して、フィブリノゲン濃度に換算した。
[数１５]
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）
を使用して、フィブリノゲン濃度に換算した。
最後に、以下の式により、測定試料をクエン酸加全血とした場合の検体中フィブリノゲン濃度を求めた。
[数１６]
検体中フィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値））
[数１６]
検体中フィブリノゲン濃度
＝換算したフィブリノゲン濃度×（100／（100－ヘマトクリット値））
上記の測定が終了したクエン酸加全血80検体を4℃,3000rpm,15min遠心し、上清を採取することで、クエン酸加血漿80検体を得た。次いで、CG02Nに上記フィブリノゲン定量乾燥試薬をセットし、ただし本発明のフィブリノゲン定量方法を実行するソフトウエアを組み込み、血漿測定モードにした後、クエン酸加血漿を25μL添加して、各々の検体の凝固時間を求めた。得られた凝固時間を前出の換算式
[数１７]
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）
を使用して、フィブリノゲン濃度に換算した。換算したフィブリノゲン濃度を、測定試料をクエン酸加血漿とした場合の検体中フィブリノゲン濃度とした。
[数１７]
（ある検体種中のフィブリノゲン濃度＝e7.2234×（凝固時間）-0.7636）
を使用して、フィブリノゲン濃度に換算した。換算したフィブリノゲン濃度を、測定試料をクエン酸加血漿とした場合の検体中フィブリノゲン濃度とした。
図６に本発明の定量方法を使用して、測定試料をクエン酸加血漿とした場合のフィブリノゲン定量値と測定試料をクエン酸加全血とした場合のフィブリノゲン定量値との相関図を示した。図６より、本発明の方法を使用した時、測定試料をクエン酸加全血とした場合のフィブリノゲン定量値は測定試料をクエン酸加血漿とした場合のフィブリノゲン定量値と良く一致しており、相関性が高いことは明白である。
本発明によりフィブリノゲンを無希釈にて定量測定することができる。
本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
Ａ 透明樹脂板
Ｂ 透明樹脂板
Ｃ 白色樹脂板
Ｄ 試薬充填部
Ｂ 透明樹脂板
Ｃ 白色樹脂板
Ｄ 試薬充填部
Claims (14)
- フィブリノゲン定量方法であって、以下の工程(i)、(ii)及び(iii)、すなわち、
(i)磁性粒子を含有したフィブリノゲン定量乾燥試薬に検体を添加する工程、
ここで、前記フィブリノゲン定量乾燥試薬は、
(A)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、
(B) 磁性粒子、
(C) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(D) カルシウム塩、
(E) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(F) 乾燥試薬層補強材、及び
(G) pH調整剤（pH緩衝剤）
を含有するフィブリノゲン定量乾燥試薬であり、
該トロンビン活性は、(a)フィブリノゲンのフィブリンモノマーへの変換、及び(b)カルシウムイオンの存在下での、第XIII因子の、XIIIaへの活性化、の両方の反応を進めることができる活性である、
(ii)検体の添加後に、試薬中の磁性粒子を運動させ、磁性粒子運動シグナルをモニタリングする工程、
ここで磁性粒子運動シグナルは、本工程(ii)において、検体の添加後に所定の間隔で振動磁場と静止永久磁場の組合せをかけて、試薬中に含有された磁性粒子を運動させ、光を当てた時の散乱光の変化量である、
及び
(iii)前記工程(ii)でモニタリングされた磁性粒子運動シグナルについて、一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比、すなわち一定の時間間隔で隔てられたある時刻における磁性粒子運動シグナルと別の時刻における磁性粒子運動シグナルとの比を複数算出する工程、
を含み、
前記の一定の時間間隔の磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で一定時間保たれた区間の中の任意の点を起点とし、起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して5～50％減衰した点の中の任意の点を終点とし、起点から終点までの時間を凝固時間とする、前記フィブリノゲン定量方法。 - 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.1秒～2秒から選択される一定の時間間隔である、請求項１に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が0.5秒、1秒、1.5秒または2秒間隔である、請求項１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比の算出に用いる時間間隔が1秒間隔である、請求項１または２に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.2である、請求項１に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比の一定の範囲が1.0±0.1である、請求項２に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲内で保たれる時間区間が1.5秒間である、請求項１～６のいずれか１項に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 磁性粒子運動シグナル比が一定の範囲で保たれる時間区間の先頭の点が起点である、請求項１～７のいずれか１項に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20～30％減衰した点の中の任意の点を終点とする、請求項１～８のいずれか１項に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して30％減衰した点を終点とする、請求項９に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 起点以降の磁性粒子運動シグナルのピーク値に対して20％減衰した点を終点とする、請求項９に記載のフィブリノゲン定量方法。
- 請求項１～１１のいずれか１項に記載のフィブリノゲン定量方法を実行するための、プログラム。
- 請求項１２に記載のプログラムを記録した、情報記録媒体。
- 請求項１２に記載のプログラムが組込まれた、又は請求項１３に記載の情報記録媒体が格納された、フィブリノゲン定量測定装置。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019076180A JP7410652B2 (ja) | 2019-04-12 | 2019-04-12 | フィブリノゲンの定量方法 |
| PCT/JP2019/047592 WO2020116556A1 (ja) | 2018-12-07 | 2019-12-05 | フィブリノゲン測定試薬 |
| US17/311,131 US20220120768A1 (en) | 2018-12-07 | 2019-12-05 | Reagent for measuring fibrinogen |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2019076180A JP7410652B2 (ja) | 2019-04-12 | 2019-04-12 | フィブリノゲンの定量方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2020173203A JP2020173203A (ja) | 2020-10-22 |
| JP7410652B2 true JP7410652B2 (ja) | 2024-01-10 |
Family
ID=72831234
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2019076180A Active JP7410652B2 (ja) | 2018-12-07 | 2019-04-12 | フィブリノゲンの定量方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP7410652B2 (ja) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002519635A (ja) | 1998-06-25 | 2002-07-02 | カルディオバスキュラ ダイアグノスティクス，インク． | エカリンと磁性粒子を含む乾式化学試薬を用いてフィブリノーゲンアッセイを行う方法 |
| US20030044871A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Pharmanetics Incorporated | Coagulation assay reagents containing lanthanides and a protein C assay using such a lanthanide-containing reagent |
| WO2009026164A1 (en) | 2007-08-17 | 2009-02-26 | The General Hospital Corporation | Magnetic resonance-based viscometers and methods |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE4014655A1 (de) * | 1990-05-08 | 1991-11-14 | Behringwerke Ag | Peptidamide, verfahren zu deren herstellung und diese enthaltende mittel als fibrin/thrombin-gerinnungsinhibitoren |
| DE4133946A1 (de) * | 1991-10-14 | 1993-04-15 | Behringwerke Ag | Funktioneller test und reagenz zur bestimmung von fibrinogen |
| JP2980468B2 (ja) * | 1992-11-12 | 1999-11-22 | 株式会社トクヤマ | フィブリノゲンの定量方法 |
| US5670329A (en) * | 1993-05-28 | 1997-09-23 | Cardiovascular Diagnostics, Inc. | Method and analytical system for performing fibrinogen assays accurately, rapidly and simply using a rotating magnetic field |
| JP3236206B2 (ja) * | 1995-12-19 | 2001-12-10 | 株式会社トクヤマ | 血液凝固時間測定用乾燥試薬 |
-
2019
- 2019-04-12 JP JP2019076180A patent/JP7410652B2/ja active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002519635A (ja) | 1998-06-25 | 2002-07-02 | カルディオバスキュラ ダイアグノスティクス，インク． | エカリンと磁性粒子を含む乾式化学試薬を用いてフィブリノーゲンアッセイを行う方法 |
| US20030044871A1 (en) | 2001-08-27 | 2003-03-06 | Pharmanetics Incorporated | Coagulation assay reagents containing lanthanides and a protein C assay using such a lanthanide-containing reagent |
| WO2009026164A1 (en) | 2007-08-17 | 2009-02-26 | The General Hospital Corporation | Magnetic resonance-based viscometers and methods |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2020173203A (ja) | 2020-10-22 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6300793B2 (ja) | 血漿及び全血中のトロンビン産生と血餅強度との同時測定 | |
| KR100351602B1 (ko) | 정확,신속및간결한피브리노겐분석을위한개선된방법및분석시스템 | |
| US6448024B1 (en) | Method, reagent, cartridge, and device for determining fibrinogen | |
| JP5628409B2 (ja) | 試験液の凝固特性を測定するための組成物 | |
| CN108761104A (zh) | 凝血激活剂及其应用 | |
| Pieters et al. | Glycaemic control improves fibrin network characteristics in type 2 diabetes–a purified fibrinogen model | |
| JP2010518371A (ja) | 被験液の凝固特性の測定における診断用組成物及びその使用 | |
| US10935559B2 (en) | Methodologies and reagents for detecting fibrinolysis and hyperfibrinolysis | |
| US20050015000A1 (en) | Method and device for analysing a liquid | |
| US20030044871A1 (en) | Coagulation assay reagents containing lanthanides and a protein C assay using such a lanthanide-containing reagent | |
| Seregina et al. | The hemostasis system in children with hereditary spherocytosis | |
| WO2021246096A1 (ja) | フィブリノゲン測定方法 | |
| JP7410652B2 (ja) | フィブリノゲンの定量方法 | |
| WO2020116556A1 (ja) | フィブリノゲン測定試薬 | |
| WO2003085400A1 (en) | Onset of force development as a marker of thrombin generation | |
| JP2980468B2 (ja) | フィブリノゲンの定量方法 | |
| Barrowcliffe | Monitoring haemophilia severity and treatment: new or old laboratory tests? | |
| JP4824261B2 (ja) | ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターアンタゴニストの簡易薬剤監視法 | |
| JP7359538B2 (ja) | フィブリノゲン測定試薬 | |
| CN109884327A (zh) | 功能性纤维蛋白原激活剂检测及其应用 | |
| Görlinger et al. | Whole blood assay: thromboelastometry–basics | |
| JP3095608B2 (ja) | 血液凝固時間測定乾燥試薬 | |
| WO2014194922A1 (ru) | Набор для измерения параметров системы гемостаза в образце крови или ее компонентов | |
| RU2698206C1 (ru) | Набор реагентов для диагностики степени нейровоспаления | |
| OGWENO | THE EFFECTS OF CRYSTALLOID SOLUTIONS ON THE HUMAN BLOOD COAGULATION SYSTEM |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20220408 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230530 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230727 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230928 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231212 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231222 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7410652 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |