JP7359538B2 - フィブリノゲン測定試薬 - Google Patents
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Description
[1] (i)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、
(ii) 磁性粒子、
(iii) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(iv) カルシウム塩、
(v) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(vi) 乾燥試薬層補強材、及び
(vii) pH緩衝剤
を含む、無希釈の全血又は血漿検体を測定するための、フィブリノゲン定量用のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[2] トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質がウシトロンビンである、実施形態1に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[3] 磁性粒子が四三酸化鉄である、実施形態1又は2に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[4] フィブリンモノマー会合阻害剤がGPRP-アミド、又はGHRP-アミドである、実施形態1~3のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[5] カルシウム塩が塩化カルシウム二水和物である、実施形態1~4のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[6] 乾燥試薬層溶解性向上剤がグリシンである、実施形態1~5のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[7] グリシンを、1.5~4.0重量%最終溶液にて含む、実施形態6に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[8] 乾燥試薬層補強材がウシ血清アルブミンである、実施形態1~7のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[9] pH緩衝剤がHEPES-水酸化ナトリウムである、実施形態1~8のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[10] さらにヘパリン中和剤、及び/又は消泡剤を含む、実施形態1~9のいずれかに記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
[11] ヘパリン中和剤がポリブレンである、及び/又は消泡剤がソルビタンモノラウレートである、実施形態10に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
(i)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、
(ii) 磁性粒子、
(iii) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(iv) カルシウム塩、
(v) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(vi) 乾燥試薬層補強材、及び
(vii) pH調整剤(pH緩衝剤)
を必須成分として含む。別の実施形態において、本発明に係るフィブリノゲン定量乾燥試薬は、さらに任意成分として、ヘパリン中和剤及び/又は消泡剤を含み得る。ある実施形態において、本発明に係るフィブリノゲン定量乾燥試薬は、無希釈の血漿又は全血検体を測定するためのものである。
任意のクエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度=eB ×(凝固時間)A
検体中フィブリノゲン濃度
=クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×(100/(100-ヘマトクリット値×0.9))
検体中フィブリノゲン濃度
=ヘパリン加全血におけるフィブリノゲン濃度×0.9×(100/(100-ヘマトクリット値))
検体中フィブリノゲン濃度
=クエン酸加全血におけるフィブリノゲン濃度×(100/(100-ヘマトクリット値))
10mM CaCl2・2H2O、2.0(wt/v)%グリシン、80μg/mLポリブレン、1.2mg/mLウシ血清アルブミン、0.005(wt/v)%ソルビタンモノラウレート、および150μg/mL GPRP-アミドを含有させた40mM HEPES緩衝液(pH 7.35)をウシトロンビン凍結乾燥品(オリエンタル酵母製)に添加し、溶解させて、300NIHU/mLのトロンビン活性を有する試薬液を得た。該試薬液35mLに対して、四三酸化鉄(製品名AAT-03;平均粒子径0.35μm;戸田工業製)0.47gを添加し、懸濁させて、最終溶液を得た。該最終溶液25μLを図1に示す反応スライドに分注した。該反応スライドを-40℃に保温したフリーザーに一昼夜保管して凍結した。次いで、凍結した反応スライドを凍結乾燥した。凍結乾燥の条件は、真空状態で-30℃から-20℃まで24時間で直線的に温度上昇させた後、-20℃から30℃まで20時間で直線的に温度上昇させ、最後に30℃で3時間保った後、乾燥空気で真空解除する方法により行った。凍結乾燥試薬は、直ちに除湿された環境下で、アルミフィルムに密封した。
フィブリノゲン定量乾燥試薬を実施例1の凍結乾燥試薬とし、フィブリノゲンを定量する装置として血液凝固分析装置CG02N((株)エイアンドティー製)を使用して、得られる血漿中フィブリノゲン濃度の特異性と再現性を調べた。
任意のクエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度=e7.01×(凝固時間)-0.7606
ヒト血漿51検体を用い、Clauss法で定量した結果と本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬でフィブリノゲンを定量した結果との相関性を調べた。Clauss法によるフィブリノゲンの定量は、試薬をデータファイ・フィブリノゲン(シスメックス製)とし、測定装置をKC4デルタ(商標)(Tcoag Ireland Ltd製)として、データファイ・フィブリノゲンの添付文書に示された方法により定量した。
クエン酸加全血51検体に対して、本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬でフィブリノゲン定量した結果と同一検体を遠心して得たクエン酸加血漿51検体に対して、本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬でフィブリノゲン定量した結果との相関性を調べた。また、本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬として以下の組成のものを用いた:
160μg/mL ポリブレン
2.5 (wt/v) % グリシン
10mM CaCl2・2H2O
1.2 mg/mL ウシ血清アルブミン
0.005(wt/v)% ソルビタンモノラウレート
200μg/mL GPRP-アミド
40mM HEPES緩衝液(pH 7.35)
333NIHU/mL ウシトロンビン
任意のクエン酸加血漿中のフィブリノゲン濃度=e7.22×(凝固時間)-0.7636
フィブリノゲン定量乾燥試薬中のグリシン含有量の効果を、クエン酸加血漿およびクエン酸加全血の凝固時間とその同時再現性で調べた。まず、実施例4と同様の試薬組成を使用し、ただし試薬組成のうち、グリシン濃度を0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%、4.5%又は5.0%とした凍結乾燥試薬をそれぞれ作製した。次いで、CG02Nにて、フィブリノゲン濃度181mg/dLのクエン酸加血漿をそれぞれの凍結乾燥試薬を用いて5回連続で測定し、得られる凝固時間と5回連続測定のCV値を記録した。
本発明のフィブリノゲン定量乾燥試薬と特許第3469909号に記載された試薬組成に準じて作製した凍結乾燥試薬との性能比較を行った。
比較例の試薬組成:
15μg/mL ポリブレン
10mM CaCl2・2H2O
1.0 (wt/v) % ウシ血清アルブミン
0.08 (wt/v) % ポリエチレングリコール6000
200μg/mL 凝集抑制剤(GPRP-アミド)
50mM Tris緩衝液(pH8.0)
50IU/mL ウシトロンビン
110mM NaCl
本明細書において言及された文献はいずれも、参照によりその全内容を本明細書に組み入れる。
B 透明樹脂板
C 白色樹脂板
D 試薬充填部
Claims (11)
- (i)トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質、ここで該トロンビン活性は、(a)フィブリノゲンのフィブリンモノマーへの変換、及び(b)カルシウムイオンの存在下での、第XIII因子の、XIIIaへの活性化、の両方の反応を進めることができる活性である、
(ii) 磁性粒子、
(iii) フィブリンモノマー会合阻害剤、
(iv) カルシウム塩、
(v) 乾燥試薬層溶解性向上剤、
(vi) 乾燥試薬層補強材、並びに
(vii) pH緩衝剤
を含む、無希釈の血漿又は全血検体を測定するための、フィブリノゲン定量用のフィブリノゲン定量乾燥試薬。 - トロンビン又はトロンビン活性を有するタンパク質がウシトロンビンである、請求項1に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- 磁性粒子が四三酸化鉄である、請求項1又は2に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- フィブリンモノマー会合阻害剤がGPRP-アミド、又はGHRP-アミドである、請求項1~3のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- カルシウム塩が塩化カルシウム二水和物である、請求項1~4のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- 乾燥試薬層溶解性向上剤がグリシンである、請求項1~5のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- グリシンを、1.5~4.0重量%最終溶液にて含む、請求項6に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- 乾燥試薬層補強材がウシ血清アルブミンである、請求項1~7のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- pH緩衝剤がHEPES-水酸化ナトリウムである、請求項1~8のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- さらにヘパリン中和剤、及び/又は消泡剤を含む、請求項1~9のいずれか1項に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
- ヘパリン中和剤がポリブレンである、及び/又は消泡剤がソルビタンモノラウレートである、請求項10に記載のフィブリノゲン定量乾燥試薬。
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