JP7410030B2 - 高められた加水分解酵素活性を有する大麦 - Google Patents
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Description
・HvHRT遺伝子中にHvHRT機能の低下をもたらす変異を有する;および/または
・GAREボックス中に変異を含む変異体α-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・GAREボックス中に変異を含む、または配列TAACAAAを有する変異体α-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・HvHBL12遺伝子中にHvHBL12機能の低下をもたらす変異を有する;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスが配列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)を含み、1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Xは任意のヌクレオチドでよく、nは0または1、mは0~20の範囲の整数である;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;
・WRKY38遺伝子中にWRKY38機能の低下をもたらす変異を有する。
本明細書で使用される場合、それが使われる文脈に応じて、「a」は、1つ(1種)または1つ(1種)を超える、を意味し得る。
本明細書で使用される場合、用語のα-アミラーゼは、デンプンなどのα-結合多糖内のα結合の加水分解を触媒できる酵素を意味する。α-アミラーゼは通常、EC3.2.1.1に分類される酵素である。α-アミラーゼは、アルファ-アミラーゼとしても知られる。
α-アミラーゼ遺伝子の配列の例は、Mascherら(2017)により発表された大麦ゲノムプロジェクトから入手可能である。
・(TGACR(X)mYTGRCC)、式中、RはGまたはA、YはCまたはT、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGACR(X)mTTGACC)、式中、RはGまたはA、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGACR(X)mTTGAC)、式中、RはGまたはA、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGAC(C)n(X)mYTGRCC)、式中、RはGまたはA、YはCまたはT、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGAC(C)n(X)mCTGRCC)、式中、RはGまたはA、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGAC(C)n(X)mYTGGCC)、式中、YはCまたはT、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数であり;または
・(TGAC(C)n(X)mCTGACC)、式中、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数であり;
・(TGAC(C)n(X)mTTGGCC)、式中、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数であり;
・(TGAC(C)n(X)mTTGATC)、式中、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数である。
前述のように、mは0~20の範囲の整数であってよく、好ましくはmは0~10の範囲の整数であり、さらにより好ましくはmは0~6の範囲の整数である。
・TGACGGTCGTATTGACC(配列番号31);
・TGACAGTGGTATTGGCC(配列番号32);
・TGACAGTGGTACTGGCC(配列番号33);
・GTGACAGTGGTATTGGCC(配列番号34);
・TGACGGTCGTATTGATC(配列番号35);
・TGACCGTCGTATTGATC(配列番号36);および
・TTGACTTGATC(配列番号37)。
・変異導入したGAREボックスのみ(GAREボックス(TAACARA)のヌクレオチドの1つが置換または欠失されている)、および/または
・配列TAACAAAを有するGAREボックス;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスのみ(標準的タンデム型リピートW-ボックス(TGAC(C)n(X)mTTGACC)の内の1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートW-ボックス配列のいずれかを有し得る)。
・変異導入したGAREボックスのみ(GAREボックス(TAACARA)のヌクレオチドの1つが置換または欠失されている)、および/または
・配列TAACAAAを有するGAREボックス;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスのみ(標準的タンデム型リピートW-ボックス(TGAC(C)n(X)mTTGACC)の内の1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートW-ボックス配列のいずれかを有し得る)。
・変異導入したGAREボックスのみ(ヌクレオチドTAACARAの1つまたは複数が置換または欠失されている)、
・配列TAACAAAを有するGAREボックス、
・非標準タンデム型リピートW-ボックスのみ(標準的タンデム型リピートW-ボックス(TGAC(C)n(X)mTTGACC)の内の1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、例えば、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスは本明細書で上記した非標準タンデム型リピートW-ボックス配列のいずれかを有し得る)。
大麦遺伝子HvREPRESSOR OF TRANSCRIPTION(HvHRT)の完全長タンパク質生成物は、一時的な発現後に、植物細胞で試験した場合、種々の異なるプロモーターに対して転写性リプレッサーとして機能する。これらのまさに人工的状況では、HRTの一時的な発現は、異なるα-アミラーゼプロモーター(Amy2およびAmy1)の制御下ではレポーター遺伝子の発現低下に繋がるが、同様に、構成的CaMV 35Sプロモーター由来の発現低下にも繋がる。Amy2プロモーターの抑制は、この系ではより強力であることが明らかになった(Raventos et al.1998)。HRTは、いわゆる「GARE(GA応答配列)ボックス」に結合し、これを遮断する。GAREボックスはまた、α-アミラーゼ遺伝子発現の推定アクチベーター、HvGAMybの結合部位でもある(Gubler et al.1995)。
一実施形態では、本発明は、HRT機能の低下に繋がる、および特にHRT機能の完全喪失に繋がるHRT遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。HRT機能の低下は、mRNAレベルまたはタンパク質レベルに基づきHRTの発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型HvHRT遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のHvHRT mRNAのレベルに比べて、大麦植物が50%未満、好ましくは25%未満、およびさらにより好ましくは10%未満の変異体または野生型HvHRT mRNAを含む場合、大麦植物はHRT機能が低下すると考えられる。野生型HvHRT遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が5%未満、好ましくは1%未満の変異体または野生型HvHRT mRNAを含む場合、大麦植物はHRT機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体HvHRTは、mRNAコード領域に変異を有する変異導入したHvHRT遺伝子によりコードされたmRNAである。HvHRT mRNAは、配列番号2またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするRNAであり、野生型HvHRT遺伝子は、配列番号2またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号2と少なくとも95%の配列同一性を共有する。一実施形態では、HRT機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量RT-PCRにより測定し多場合、検出可能な変異体または野生型HvHRT mRNAを含み得ない。
野生型HvHRT遺伝子を有すること以外は同じ遺伝子型である大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入に比べて、所与の大麦植物に対する前記レポーター構築物の遺伝子導入後に、少なくとも10%、例えば、少なくとも25%のルシフェラーゼの増加は、HRT機能の低下がある前記大麦植物を示す。
・NLS1:配列番号2のR276~R292
・NLS2:配列番号2のR527~R530
・HRTdb1:配列番号2のV302~R331
・HRTdb2:配列番号2の:L463~E491
・HRTdb3:配列番号2のV509~A539
大麦遺伝子HvHBL12は、以前に報告されてこなかった。大麦栽培品種Haruna Nijo由来のHvHBL12遺伝子のコード配列は、本明細書では配列番号5として提供される。この配列によりコードされるHvHBL12タンパク質の配列は、本明細書では配列番号6として提供される。追加のコード配列は、Haruna Nijoから入手可能であるが、この配列は、コドン216に停止コドンを有する。発明者らは、これは、非機能性コピーであると考えている。HvHBL12の2つの配列は、受入番号AK376953.1およびAK361212.1として、NCBIデータベースに寄託された。この配列は、配列番号6に比較して、N141D、M142VおよびE184Dを含む種々の多型を含むタンパク質をコードする。配列番号6のポリペプチド、ならびに多型N141D、M142VおよびE184Dのいずれかを有する配列番号6のポリペプチドは、すべて、本明細書では野生型HvHBL12タンパク質と見なされる。
一実施形態では、本発明は、HvHBL12機能の低下に繋がる、および特にHvHBL12機能の完全喪失に繋がるHvHBL12遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。HvHBL12機能の低下は、mRNAレベルまたはタンパク質レベルに基づきHvHBL12の発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型HvHBL12遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のHvHBL12 mRNAのレベルに比べて、大麦植物が50%未満、好ましくは25%未満、およびさらにより好ましくは10%未満の変異体または野生型HvHBL12 mRNAを含む場合、大麦植物はHvHBL12機能が低下すると考えられる。野生型HvHBL12遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が5%未満、好ましくは1%未満の変異体または野生型HvHBL12 mRNAを含む場合、大麦植物はHvHBL12機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体HvHBL12は、mRNAコード領域に変異を有する変異導入したHvHBL12遺伝子によりコードされたmRNAである。HvHBL12 mRNAは、配列番号6またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするRNAであり、野生型HvHBL12遺伝子は、配列番号6またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号6と少なくとも95%の配列同一性を共有する。一実施形態では、HvHBL12機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量RT-PCRにより測定した場合、検出可能な変異体または野生型HvHBL12 mRNAを含み得ない。
・ホメオボックスドメイン:配列番号6のアミノ酸26~79
・ホメオボックス関連ロイシンジッパー:配列番号6のアミノ酸81~122
・C末端部分:配列番号6のアミノ酸228~250
・配列番号6の、または多型N141D、M142VまたはE184Dの1つまたは複数を有する配列番号6のアミノ酸26~79;または
・配列番号6の、または多型N141D、M142VまたはE184Dの1つまたは複数を有する配列番号6のアミノ酸81~122;または
・配列番号6の、または多型N141D、M142VまたはE184Dの1つまたは複数を有する配列番号6のアミノ酸228~250。
大麦遺伝子HvWRKY38の完全長タンパク質生成物は、タンデム型リピートW-ボックスに結合することにより転写性リプレッサーとして機能すると考えられる。HvWRKY38は、グループII WRKY転写因子のメンバーであり、1つのみのWRKYドメインを含む。Zouら(2008)は、HvWRKY38およびBPBFがAmy32bの転写リプレッサーとして機能し得ることを示唆している。
一実施形態では、本発明は、HvWRKY38機能の低下に繋がる、および特にHvWRKY38機能の完全喪失に繋がるHvWRKY38遺伝子中の変異を有する大麦植物を提供する。HvWRKY38機能の低下は、mRNAレベルまたはタンパク質レベルに基づきHvWRKY38の発現レベルを測定することにより決定され得る。一実施形態では、野生型HvWRKY38遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物中のHvWRKY38 mRNAのレベルに比べて、大麦植物が50%未満、好ましくは25%未満、およびさらにより好ましくは10%未満の変異体または野生型HvWRKY38 mRNAを含む場合、大麦植物はHvWRKY38機能が低下すると考えられる。野生型HvWRKY38遺伝子を含むこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、大麦植物が5%未満、好ましくは1%未満の変異体または野生型HvWRKY38 mRNAを含む場合、大麦植物はHvWRKY38機能を完全喪失すると考えられ得る。前記変異体HvWRKY38は、mRNAコード領域に変異を有する変異導入したHvWRKY38遺伝子によりコードされたmRNAである。HvWRKY38 mRNAは、配列番号11もしくは配列番号12またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードするRNAであり、野生型HvWRKY38遺伝子は、配列番号11もしくは配列番号12またはその機能的ホモログのポリペプチドをコードする遺伝子である。前記機能的ホモログは、好ましくは、配列番号11もしくは配列番号12と少なくとも95%の配列同一性を共有する。 一実施形態では、HvWRKY38機能が完全喪失した大麦植物は、従来の定量RT-PCRにより測定した場合、検出可能な変異体または野生型HvWRKY38 mRNAを含み得ない。
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸200~206
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸63(Leu)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸70(Val)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸77(Leu)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸84(Val)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸91(Leu)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸220(Cys)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸226(Cys)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸250(His)
・配列番号11または配列番号12のアミノ酸252(His)
本発明によるHRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中に変異を有する大麦植物は、任意の育種系統または栽培品種または変種を含む、種Hordeum vulgare(オオムギ)の任意の植物であり得る。
本発明は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異を有する大麦植物を提供する。このような大麦植物の1つの大きな利点は、α-アミラーゼ活性の増大である。特に、前記大麦植物は、発芽中の早期に穀粒中のα-アミラーゼ活性の増加があり得る。
本発明は、2つ以上の変異を含む大麦植物を提供する。従って、本発明の大麦植物は、1つまたは複数の次の変異を含み得る:
・1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「α-アミラーゼプロモーター中に変異を有するα-アミラーゼおよび大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・HvHRT遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「HRT遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・HvHBL12遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「HvHBL12遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
・HvWRKY38遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「WRKY38遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異。
上記した1つまたは複数の変異に加えて、大麦植物は、機能的LOX-1の完全喪失をもたらすLOX-1コード遺伝子中の変異も含み得る。
前記変異は、例えば、国際公開第2005/087934号に記載のいずれかの変異であり得る。例えば、大麦植物は、未成熟停止コドンを含むLOX-1をコードする遺伝子を含み得、前記コドンは、国際公開第2005/087934号の配列番号2の塩基番号3572~3574またはスプライス部位変異に対応し、前記変異は、国際公開第2005/087934号の配列番号2の塩基番号2311に対応する。
本発明は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された植物生成物に関する。
本発明は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された麦芽も提供する。前記麦芽は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異を有する大麦植物から作製された緑麦芽またはキルン乾燥麦芽であり得る。前記変異は、本明細書で上記のいずれかの変異であり得る。
(a)大麦植物、特に、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ;
(b)前記大麦穀粒を浸麦するステップ;
(b)前記大麦穀粒を発芽させるステップ;および
(c)前記発芽亜大麦穀粒を、好ましくはキルン乾燥により乾燥するステップ。
(a)大麦植物、特に、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に変異を有する大麦植物の穀粒を用意するステップ;
(b)前記大麦穀粒を浸麦するステップ;
(b)前記大麦穀粒を発芽させるステップ。
a.前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも1つのステップであって、1時間当たり、少なくとも2LのO2/kg大麦穀粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ;および
b.前記大麦穀粒を空気中でインキュベーションする少なくとも1つのステップ。
本発明は、大麦ベース飲料ならびにそれを作製する方法を提供し、大麦植物は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異、を有する。本発明はまた、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異を有する大麦植物の穀粒の水性抽出物も提供する。前記水性抽出物は、例えば、緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製され得る。
a.大麦植物の穀粒を用意するステップであって、前記大麦植物が、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に変異、例えば、本明細書に記載のいずれかの変異を有するステップ;
b.大麦穀粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが前記穀粒を水溶液中で長くても72時間インキュベーションすることを含むステップ;
c.前記発芽穀粒を細かく粉砕し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦穀粒がステップb)とc)との間で常に20%未満の含水量にならないことが前提である、ステップ;
d.前記粉砕発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
本発明はまた、大麦ベース飲料およびこのような飲料の製造方法も提供し、飲料は、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物から作製される。
(i)本発明による大麦植物の穀粒および/または本発明による大麦植物の穀粒から作製された緑麦芽および/またはキルン乾燥麦芽を用意するステップ、
(ii)前記穀粒および/または前記緑麦芽および/または前記キルン乾燥麦芽の水性抽出物を、例えば、本明細書で上記した水性抽出物作製セクションで記載のように、作製するステップ、
(iii)前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
a.前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ;
b.水性抽出物を冷却するステップ;
c.前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ;
本発明の方法は、1種または複数の追加の化合物を加えるステップを含み得る。前記追加の化合物は、例えば、風味化合物、保存剤、機能性成分、染料、甘味剤、pH調整剤または塩であり得る。pH調整剤は、例えば、緩衝剤またはリン酸などの酸であり得る。
1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中に、変異、例えば、本明細書で記載のいずれかの変異、を含む大麦植物は、任意の有用な方法で作製され得る。
・複数の大麦植物または大麦穀粒を、例えば、照射または化学処理、例えば、アジ化ナトリウムによる処理により、ランダム変異誘発に供するステップ;
・所望の変異(例えば、1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中、HRT遺伝子中、HBL12遺伝子中、および/またはWRKY38遺伝子中の変異)を有する大麦植物または大麦穀粒を特製するステップ。
・大麦植物またはその一部を、例えば、NaN3などの化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
・本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
本発明は、例えば、次の項目で定められる通りであり得る。
1.高α-アミラーゼ活性を有する大麦植物またはその一部であって、
・HvHRT遺伝子中にHvHRT機能の低下をもたらす変異を有する;および/または
・GAREボックス中に変異を含む変異体α-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・GAREボックス中に変異を含む、または配列TAACAAAを有する変異体α-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1つのα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・HvHBL12遺伝子中にHvHBL12機能の低下をもたらす変異を有する;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスが配列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)を含み、1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Xは任意のヌクレオチドでよく、nは0または1、mは0~20の範囲の整数である;および/または
・非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
・WRKY38遺伝子中にWRKY38機能の低下をもたらす変異を有する、大麦植物またはその一部。
2.大麦植物またはその一部であって、
a.HvHRT遺伝子中に、配列番号2の1つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子をもたらす変異、または少なくともHvHRT遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、HvHRT遺伝子のコード領域が配列番号2のポリペプチドをコードする;および/または
b.GAREボックス中に変異を含む変異体α-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
c.配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
d.GAREボックス中に変異を含む、または配列TAACAAAを有する変異体α-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
e.HvHBL12遺伝子中に、配列番号6の1つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子をもたらす変異、または少なくともHvHBL12遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、HvHBL12遺伝子のコード領域が配列番号6のポリペプチドをコードする;および/または
f.非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスが配列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)を含み、1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Xは任意のヌクレオチドでよく、nは0または1、mは0~20の範囲の整数である;および/または
g.非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
h.WRKY38遺伝子中に、配列番号11および配列番号12の両方に存在する1つまたは複数のアミノ酸を欠く変異体WRKY38タンパク質をコードする変異体WRKY38遺伝子をもたらす変異、または少なくともWRKY38遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、WRKY38遺伝子のコード領域が配列番号11または配列番号12のポリペプチドをコードする、大麦植物またはその一部。
3.項目1または2に記載の大麦植物であって、HvHRT遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
4.項目3に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物:
・少なくとも配列番号2のアミノ酸527~530に対応するアミノ酸を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を生ずる変異。
・HvHRT遺伝子の欠失を生ずる変異。
5.項目3または4に記載の大麦植物であって、変異がHvHRT遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
6.項目3~5のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異がHvHRT遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
7.項目3~6のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号2のアミノ酸463~491を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
8.項目3~7のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号2のアミノ酸509~539を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
9.項目3~8のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号2の少なくとも21個の最C末端アミノ酸、例えば、少なくとも85個の最C末端アミノ酸などの少なくとも39個の最C末端アミノ酸、例えば、少なくとも100個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
10.項目3~9のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号2の118個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
11.項目3~10のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号2の多くても526個のN末端アミノ酸、例えば、配列番号2の多くても462個のN末端アミノ酸などの配列番号2の多くても508個のN末端アミノ酸、好ましくは配列番号2の多くても431個のN末端アミノ酸を含むHvHRTのN末端フラグメントを含む短縮HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
12.項目3~11のいずれか1項に記載の大麦植物であって、コドン1~431のいずれか1つに未成熟停止コドンを有する変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
13.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1の431に未成熟停止コドンを有する変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
14.項目3~13のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含み、前記変異体HvHRTタンパク質が配列番号2のW431stop変異を有する、大麦植物。
15.項目3~14のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1のHvHRTコード配列のヌクレオチド1293のG→A変異を含む変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
16.項目3~15のいずれか1項に記載の大麦植物であって、受入番号NCIMB43270でNCIMBに寄託された大麦植物またはその子孫である、大麦植物。
17.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1の170に未成熟停止コドンを有する変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
18.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含み、前記変異体HvHRTタンパク質が、配列番号2のW170stop変異を有する、大麦植物。
19.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1のHvHRTコード配列のヌクレオチド510のG→A変異を含む変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
20.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1の371に未成熟停止コドンを有する変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
21.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子を含み、前記変異体HvHRTタンパク質が、配列番号2のW371stop変異を有する、大麦植物。
22.項目3~12のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号1のHvHRTコード配列のヌクレオチド1113のG→A変異を含む変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
23.項目3~22のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号4のポリペプチドをコードする変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
24.項目3~23のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号3のコード配列を含む変異体HvHRT遺伝子を含む、大麦植物。
25.項目3~24のいずれか1項に記載の大麦植物であって、野生型HvHRT遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、10%未満の変異体または野生型HvHRT mRNAを含み、HvHRT mRNAが配列番号2のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするRNAであり、野生型HvHRT遺伝子が配列番号2のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号2に対し少なくとも95%の配列同一性を共有する、大麦植物。
26.項目2~25のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvHRT遺伝子中の変異が、HvHRT機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
27.項目1~26のいずれか1項に記載の大麦植物であって、GAREボックス中に変異を含む変異体α-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を含み、ヌクレオチドTAACARAの1つが置換または欠失されている、大麦植物。
28.項目1~27のいずれか1項に記載の大麦植物であって、前記変異体α-アミラーゼプロモーターを含む、少なくとも3種のα-アミラーゼ遺伝子などの少なくとも2種のα-アミラーゼ遺伝子、例えば、少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
29.項目1~28のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも5種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
30.項目1~29のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも7種のα-アミラーゼ遺伝子などの少なくとも6種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
31.項目1~30のいずれか1項に記載の大麦植物であって、高収率を有する春大麦変種である、大麦植物。
32.項目1~31のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列TAACAAAのGAREボックスを含むamy2クラスター中に、少なくとも2種などの少なくとも1種の、例えば、少なくとも3種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
33.項目27~32のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvHRT遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目3~26のいずれか1項に記載の変異である、大麦植物。
34.項目3~33のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、少なくとも16U/gのα-アミラーゼ活性を有する、大麦植物。
35.項目3~34のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、少なくとも150U/gなどの少なくとも140U/g、例えば、少なくとも170U/gなどの少なくとも160U/gのα-アミラーゼ活性を有するが、ただし、外皮なしであるか、または発芽の開始の前に大麦穀粒から少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
36.項目3~35のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、少なくとも35mU/gなどの少なくとも30mU/g、例えば、少なくとも40mU/gの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
37.項目1または2に記載の大麦植物であって、HvHBL12遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
38.項目37に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物:
a.配列番号6の1つまたは複数のアミノ酸またはそれと少なくとも95%の配列同一性を共有するその機能的ホモログを欠く変異体HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子を生ずる変異。
b.HvHBL12遺伝子の欠失を生ずる変異。
39.項目37または38に記載の大麦植物であって、変異がHvHBL12遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
40.項目37~39のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異がHvHBL12遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
41.項目37~40のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号6またはそれと少なくとも95%の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも20個の最C末端アミノ酸などの少なくとも10個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
42.項目37~41のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号6またはそれと少なくとも95%の配列同一性を共有するその機能的ホモログの少なくとも22個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
43.項目37~42のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号6またはそれと少なくとも95%の配列同一性を共有するその機能的ホモログの多くても228個のN末端アミノ酸を含むHvHBL12のN末端フラグメントを含む短縮HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
44.項目37~43のいずれか1項に記載の大麦植物であって、コドン1~228のいずれか1つに未成熟停止コドンを有する変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
45.項目37~44のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号5の228に未成熟停止コドンを有する変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
46.項目37~45のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異体HvHBL12タンパク質をコードする変異体HvHBL12遺伝子を含み、前記変異体HvHBL12タンパク質が、配列番号6のW228stop変異を有する、大麦植物。
47.項目37~46のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号5のHvHBL12コード配列のヌクレオチド684のG→A変異を含む変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
48.項目37~47のいずれか1項に記載の大麦植物であって、受入番号NCIMB43271でNCIMBに寄託された大麦植物またはその子孫である、大麦植物。
49.項目37~48のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号9の、または多型N141D、M142VまたはE184Dの1つまたは複数を有する配列番号9のポリペプチドをコードする変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
50.項目37~49のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号8のコード配列を含む変異体HvHBL12遺伝子を含む、大麦植物。
51.項目37~50のいずれか1項に記載の大麦植物であって、野生型HvHBL12遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、10%未満のHvHBL12 mRNAを含み、HvHBL12 mRNAが配列番号6のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするRNAであり、野生型HvHRT遺伝子が配列番号6のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号6に対し少なくとも95%の配列同一性を共有する、大麦植物。
52.項目37~51のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvHBL12遺伝子中の変異が、HvHBL12機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
53.項目37~52のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvHRT遺伝子中に、項目3~26のいずれか1項に記載の変異をさらに有し、および/または項目27~32のいずれか1項に記載の少なくとも1つのα-アミラーゼ遺伝子をさらに含む、大麦植物。
54.項目1または2に記載の大麦植物であって、HvWRKY38遺伝子中に変異を有する、大麦植物。
55.項目54に記載の大麦植物であって、変異が下記である、大麦植物:
a.配列番号11または配列番号12のアミノ酸200~206、220、226、250および/また252の少なくとも1つを欠く変異体HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を生ずる変異。
b.HvWRKY38遺伝子の欠失を生ずる変異。
56.項目54または55に記載の大麦植物であって、変異がHvWRKY38遺伝子中に未成熟停止コドンを導入する、大麦植物。
57.項目54~56のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異がHvWRKY38遺伝子のスプライス部位中の変異である、大麦植物。
58.項目54~57のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号11または配列番号12のアミノ酸200~206を欠く変異体HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
59.項目54~58のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号11または配列番号12の少なくとも102個の最C末端アミノ酸、例えば、少なくとも128個の最C末端アミノ酸などの少なくとも104個の最C末端アミノ酸、例えば、少なくとも134個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
60.項目54~59のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも配列番号11または配列番号12の少なくとも154個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
61.項目54~60のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号11または配列番号12の多くても251個のN末端アミノ酸、例えば、配列番号11または配列番号12の多くても225個のN末端アミノ酸などの配列番号11または配列番号12の多くても249個のN末端アミノ酸、例えば、配列番号11または配列番号12の多くても219個のN末端アミノ酸、好ましくは配列番号11または配列番号12の多くても199個のN末端アミノ酸を含むHvWRKY38のN末端フラグメントを含む短縮HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
62.項目54~61のいずれか1項に記載の大麦植物であって、コドン1~200のいずれか1つに未成熟停止コドンを有する変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
63.項目54~62のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号10のコドン1~200のいずれか1つに未成熟停止コドンを有する変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
64.項目54~63のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号10の200に未成熟停止コドンを有する変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
65.項目54~64のいずれか1項に記載の大麦植物であって、変異体HvWRKY38タンパク質をコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含み、前記変異体HvWRKY38タンパク質が、配列番号11または12のW200stop変異を有する、大麦植物。
66.項目54~65のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号10のHvWRKY38コード配列のヌクレオチド600のG→A変異を含む変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
67.項目54~66のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号14のポリペプチド、またはアミノ酸98がMetである配列番号14のポリペプチドをコードする変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
68.項目54~67のいずれか1項に記載の大麦植物であって、配列番号13のコード配列を含む変異体HvWRKY38遺伝子を含む、大麦植物。
69.項目54~68のいずれか1項に記載の大麦植物であって、野生型HvWRKY38遺伝子を含むが、それ以外は同じ遺伝子型である大麦植物に比べて、10%未満の変異体または野生型HvWRKY38 mRNAを含み、HvWRKY38 mRNAが配列番号11または12のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードするRNAであり、野生型HvWRKY38遺伝子が配列番号11または12のポリペプチドまたはその機能的ホモログをコードする遺伝子であり、前記機能的ホモログが配列番号11または12に対して少なくとも95%の配列同一性を共有する、大麦植物。
70.項目54~69のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvWRKY38遺伝子中の変異が、HvWRKY38機能の完全喪失を引き起こす変異である、大麦植物。
71.項目54~70のいずれか1項に記載の大麦植物であって、HvHRT遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目3~26のいずれか1項に記載の変異であり、および/または項目27~32のいずれか1項に記載の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子をさらに含み、および/またはHvHBL12遺伝子中に変異をさらに有し、前記変異が項目37~52のいずれか1項に記載の変異である、大麦植物。
72.項目1~71のいずれか1項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも5種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
73.項目1~72のいずれか1項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも7種などの少なくとも6種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
74.項目1~73のいずれか1項に記載の大麦植物であって、高収率を有する春大麦変種である、大麦植物。
75.項目1~74のいずれか1項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むamy2クラスター中に、少なくとも2種などの少なくとも1種の、例えば、少なくとも3種のα-アミラーゼ遺伝子を含む、大麦植物。
76.項目1~75のいずれか1項に記載の大麦植物であって、非標準タンデム型リピートW-ボックスが、下記からなる群より個別に選択される、大麦植物:
・(TGACR(X)mYTGRCC);
・(TGACR(X)mTTGACC);
・(TGACR(X)mTTGAC);
・(TGAC(C)n(X)mYTGRCC);
・(TGAC(C)n(X)mCTGRCC)
・(TGAC(C)n(X)mYTGGCC);
・(TGAC(C)n(X)mCTGACC);
・(TGAC(C)n(X)mTTGGCC);および
・(TGAC(C)n(X)mTTGATC);
式中、RはGまたはA、YはCまたはT、nは0または1、mは、0~20の範囲の整数である。
77.項目1~76のいずれか1項に記載の大麦植物であって、mは0~10の範囲の整数である、大麦植物。
78.項目1~77のいずれか1項に記載の大麦植物であって、mは0~6の範囲の整数である、大麦植物。
79.項目1~78のいずれか1項に記載の大麦植物であって、1種または複数のα-アミラーゼ遺伝子が、次の配列から個別に選択される非標準タンデム型リピートW-ボックスを含む、大麦植物:
・TGACGGTCGTATTGACC;
・TGACAGTGGTATTGGCC;
・TGACAGTGGTACTGGCC;
・GTGACAGTGGTATTGGCC;
・TGACGGTCGTATTGATC;
・TGACCGTCGTATTGATC;および
・TTGACTTGATC。
80.項目1~79のいずれか1項に記載の大麦植物であって、amy1_1クラスターを含み、少なくとも1つのα-アミラーゼプロモーターが、配列TTGATCを含む非標準タンデム型リピートW-ボックスを含む、大麦植物。
81.項目1~80のいずれか1項に記載の大麦植物であって、amy1_1クラスターを含み、少なくとも1つのα-アミラーゼプロモーターが、配列CTGACGGTCGTATTGATC(配列番号72)を含む非標準タンデム型リピートW-ボックスを含む、大麦植物。
82.項目1~81のいずれか1項に記載の大麦植物であって、図11Aの「HENZ-43 amy1_1」として示される配列を含むamy1_1クラスターを含む、大麦植物。
83.項目37~82のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、少なくとも110U/gなどの少なくとも100U/gのα-アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
84.項目37~83のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、少なくとも20mU/gの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、前記発芽の開始の前に、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の外皮が取り除かれていることが前提である、大麦植物。
85.項目1~84のいずれか1項に記載の大麦植物であって、発芽の開始の48時間後、前記変異を有さないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物のα-アミラーゼ活性の少なくとも110%などの少なくとも105%、例えば、少なくとも150%などの少なくとも120%、例えば、少なくとも170%のα-アミラーゼ活性を有する、大麦植物。
86.項目1~85のいずれか1項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の収率の少なくとも90%の収率を有する、大麦植物。
87.項目1~86のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも40gなどの少なくとも38gのTKWを有する、大麦植物。
88.項目1~87のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも60%w/wなどの少なくとも55%w/wのデンプン含量を有する、大麦植物。
89.項目1~88のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも9.5%w/wのタンパク質含量を有する、大麦植物。
90.項目1~89のいずれか1項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の高さの少なくとも90%の高さを有する、大麦植物。
91.項目1~90のいずれか1項に記載の大麦植物であって、前記変異を含まないこと以外は同じ遺伝子型である大麦植物の穂の数/m2の少なくとも90%の穂の数/m2を有する、大麦植物。
92.項目1~91のいずれか1項に記載の大麦植物であって、穂発芽を起こさない、大麦植物。
93.項目1~92のいずれか1項に記載の大麦植物であって、規則的な水の噴霧を20日間受けた穀粒の発芽比率が、前記噴霧を受けず、成熟時に収穫された同じ種類の大麦植物の穀粒の発芽比率と同じまたはそれより大きい、大麦植物。
94.項目1~93のいずれか1項に記載の大麦植物であって、大麦植物の前記一部が穀粒である、大麦植物。
95.項目1~94のいずれか1項に記載の大麦植物であって、本質的に生物学的方法により得られているとは限らない、大麦植物。
96.項目1~95のいずれか1項に記載の大麦植物であって、次のステップを含む方法により作製された大麦植物、または次のステップを含む方法により作製された植物の子孫である、大麦植物:
・大麦植物またはその一部を、例えば、NaN3などの化学的変異誘発剤で変異誘発するステップ、
・本明細書で記載のいずれかの変異を有する大麦植物を選択するステップ。
97.項目1~96のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも3つなどの少なくとも2つの次の変異または特定を含む、大麦植物:
a.HvHRT遺伝子中にHvHRT機能の低下に繋がる変異を有する;および/または
b.GAREボックス中に変異を含む変異体α-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
c.配列TAACAAAのGAREボックスを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
d.GAREボックス中に変異を含む、または配列TAACAAAを有する変異体α-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
e.HvHBL12遺伝子中にHvHBL12機能の低下に繋がる変異を有する;および/または
f.非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む少なくとも4種のα-アミラーゼ遺伝子を有し、前記非標準タンデム型リピートW-ボックスが配列(TGAC(C)n(X)mTTGACC)を含み、1つまたは複数の特定のヌクレオチドが置換または欠失されており、Xは任意のヌクレオチドでよく、nは0または1、mは0~20の範囲の整数である;および/または
g.非標準タンデム型リピートW-ボックスを含むα-アミラーゼプロモーターを含む、amy2クラスター中の少なくとも1種のα-アミラーゼ遺伝子を有する;および/または
h.WRKY38遺伝子中にWRKY38機能の低下に繋がる変異を有する。
98.項目1~97のいずれか1項に記載の大麦植物であって、少なくとも3つなどの少なくとも2つの次の変異を含む、大麦植物:
a.1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「α-アミラーゼプロモーター中に変異を有するα-アミラーゼおよび大麦植物」で記載のいずれかの変異、
b.HvHRT遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「HRT遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
c.HvHBL12遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「HvHBL12遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異、
d.HvWRKY38遺伝子中の変異、例えば、上記本明細書のセクション「WRKY38遺伝子中に変異を有する大麦植物」で記載のいずれかの変異。
99.項目1~98のいずれか1項に記載の大麦植物であって、1種または複数の追加の遺伝子、例えば、1つまたは複数の次の変異を含む、大麦植物:
a.機能的LOX-1の完全喪失をもたらすLOX-1コード遺伝子中の変異
b.機能的LOX-2の完全喪失をもたらすLOX-2コード遺伝子中の変異
c.機能的MMTの完全喪失をもたらすMMTコード遺伝子中の変異
d.CslF6コード遺伝子中の変異で、前記変異遺伝子は、低減したCslF6活性を有する変異体CslF6タンパク質をコードする。
100.項目1~99のいずれか1項に記載の大麦植物またはその一部を含むまたはそれから作製された、植物生成物。
101.項目100に記載の植物生成物であって、大麦粉、緑麦芽およびキルン乾燥麦芽からなる群より選択される、植物生成物。
102.項目100または101に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽およびキルン乾燥麦芽である、植物生成物。
103.項目100~102に記載の植物生成物であって、粉砕緑麦芽または粉砕キルン乾燥麦芽である、植物生成物。
104.項目100または101に記載の植物生成物であって、大麦粉である、植物生成物。
105.項目100に記載の植物生成物であって、前記大麦植物の穀粒からおよび/または前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製した麦汁である、植物生成物。
106.項目100に記載の植物生成物であって、前記大麦植物またはその一部から作製された飲料である、植物生成物。
107.項目106に記載の飲料であって、前記大麦植物の穀粒からおよび/または前記大麦植物の処理した穀粒を含む緑麦芽またはキルン乾燥麦芽から作製される、飲料。
108.項目106または107に記載の飲料であって、ビールである飲料。
109.緑麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法:
(i)項目1から99のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ;
(ii)前記穀粒を浸麦するステップ;
(iii)所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ。
110.キルン乾燥麦芽の作製方法であって、次記のステップを含む方法:
(i)項目1から99のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ;
(ii)前記穀粒を浸麦するステップ;
(iii)所定の状態下で浸麦穀粒を発芽させるステップ。
(iv)前記発芽穀粒を乾燥するステップ。
111.飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法:
(i)項目1~99のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒および/または項目102または103に記載の緑麦芽またはキルン乾燥麦芽を用意するステップ;
(ii)前記穀粒および/または前記麦芽の水性抽出物を作製するステップ、
(iii)前記水性抽出物を飲料に処理するステップ。
112.水性抽出物の製造方法であって、次記のステップを含む方法:
a.項目1~99のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ;
b.大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップは、前記穀粒を穀粒が少なくとも30%の含水量を有するまで水溶液中でインキュベーションすることを含み、1時間当たり、少なくとも2LのO2/(kg乾燥重量大麦粒)を、前記水溶液中を通過させるステップ;および
c.前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップb)とc)との間で常に20%未満の含水量にならないことが前提である、ステップ;
d.前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ。
113.項目112に記載の方法であって、大麦の穀粒が発芽の全ステップ中で水溶液中に浸漬される、方法。
114.項目112または113に記載の方法であって、発芽ステップが下記を含む方法:
i.前記穀粒を水溶液中でインキュベーションする少なくとも1つのステップであって、1時間当たり、少なくとも2LのO2/kg大麦粒乾燥重量を前記水溶液中に通過させるステップ;および
ii.前記大麦粒を空気中でインキュベーションする少なくとも1つのステップ。
115.項目112~114のいずれか1項に記載の方法であって、1時間当たり、1kgの大麦粒乾燥重量当たり、少なくとも3L、より好ましくは少なくとも4L、さらにより好ましくは少なくとも5L、またさらにより好ましくは少なくとも6LのO2を前記水溶液中に通過させる、方法。
116.項目112~115のいずれか1項に記載の方法であって、前記O2がガス混合物内に含まれ、ガス混合物が大気である、方法。
117.項目112~116のいずれか1項に記載の方法であって、発芽の全ステップが72時間を超えない、より好ましくは、60時間を超えない、さらにより好ましくは、54時間を超えない、方法。
118.項目112~117のいずれか1項に記載の方法であって、大麦は皮麦であり、方法は、水溶液中で前記穀粒をインキュベーションする前に、少なくとも一部の前記外皮を取り除くステップを含む、方法。
119.飲料の製造方法であって、次記のステップを含む方法:
(i)項目112~118のいずれか1項に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ;
(ii)前記抽出物を飲料に処理するステップ。
120.項目119に記載の方法であって、ステップ(iii)が次記ステップを含む方法:
a.前記水性抽出物を、任意選択で、ホップまたはホップ抽出物の存在下で加熱するステップ;
b.水性抽出物を冷却するステップ;
c.前記水性抽出物を酵母で発酵させ、それにより、発酵飲料を製造するステップ。
121.項目119または120に記載の方法であって、飲料がビールである、方法。
122.高α-アミラーゼ活性を有する大麦植物を作製する方法であって、次のステップを含む方法。
a)大麦穀粒を用意するステップ;および
b)前記大麦穀粒をランダムに変異誘発させ、それにより、少なくとも1つの大麦穀粒中に少なくとも1つの次の変異を導入するステップ:
・HvHRT遺伝子中の変異、
・1つまたは複数のα-アミラーゼプロモーター中の変異、
・HvHBL12遺伝子中の変異、
・WRKY38遺伝子中の変異;
c)少なくとも1つの前記変異を有する大麦穀粒またはその子孫を選択するステップ。
123.項目122に記載の方法であって、変異が、項目3~26、27~32、37~52、54~70および72~82の内のいずれか1つの項目で定義されている通りである、方法。
本発明はさらに以下の実施例で説明されるが、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例1
大麦遺伝子HvHRTは、大麦ゲノムバージョン2012で、ID# MLOC_51005(栽培品種Morex)またはID# AK362734(栽培品種Haruna Nijo)のCDSとして、およびmorex_コンティグ_368180(栽培品種Morex)のゲノムDNAとして示される(IBSC,2012)。大麦ゲノムバージョン2017(Mascher et al.,2017)では、HvHRTは、CDSおよびID# HORVU2Hr1G035630によるタンパク質配列として示される。大麦ゲノムバージョン2017では、HvHRTは、染色体2H上の位置150.902.998bp~150.911.087bpに位置している。大麦ゲノムバージョン2017では、HvHRTは、転写2のエフェクターとして注釈が付いている。大麦ゲノムバージョン2012では、HvHRTは、3つのエクソン中で構成されている。元の配列は、ID#AJ001317.1でNCBIに寄託された。
オオムギ転写リプレッサー、HRTの遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体のddPCRベーススクリーニング
国際出願第PCT/EP2017/065516号に記載の方法を用いて、HvHRT遺伝子中に特定の変異を有する大麦植物を特定した。
コード配列配列番号1のヌクレオチド位置1293のHvHRTの変異体アレルと野性型アレルとの間を特に区別するユニークなddPCRアッセイを設計した。前述で概略を述べたように、大麦HvHRTのいくつかの遺伝子配列を利用でき、この実施例で使用したddPCRアッセイは、栽培品種Himalaya、ジェンバンク番号NCBI:AJ001317.1のゲノム配列をベースにした。変異体検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置1293にA塩基を含んだ。参照検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置1293にG塩基を含んだ。2つの近傍プライマーを設計して、コード配列中のヌクレオチド1293の周辺のゲノム配列を増幅した。
HvHRT座位に特異的な次のプライマーおよびプローブを設計した:
-標的特異的順方向プライマー(配列番号15):
5’-CACGAAGATGAGCCTTG-3’;
-標的特異的逆方向プライマー(配列番号16):
5’-TTGGCTGATTTCTGTGC-3’;
-変異体特異的検出プローブ(配列番号17):
5’-AAGTGATTTGAGCGGCT-3’ 6-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識;
-参照特異的検出プローブ(配列番号18):
5’-AGGAAGTGGTTTGAGCG-3’ ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)で標識。
次のステップは、ライブラリーが所望の変異導入穀物を含むかどうかの判定であった。スクリーニングは、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065516号のWS3および実施例3~7に記載されているようにし、次の詳細事項も加えて実施した:
-376個のサブプール(GLP#1~GLP#376と命名)(合わせて、約120,000変異導入大麦植物に相当)に対し、スクリーニングを実施した。
遺伝子変異を有する個別の大麦粒は、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065516号のWS4(p.69~72)および実施例8~15に記載されているようにし、下記の連続的に順序付けた詳細事項を含めて実施して、特定した。
1.HvHRT特異的ddPCRアッセイを用いたGT#1~GT#94由来のgDNAの分析に基づいて、4500個の穀粒のGLP#64[要請試料gDNA(GT#64)に対応する]は、目的の遺伝子変異を有する1つまたは複数の穀粒を含むであろうことが高い確率で考えられた。
2.FGLP#64は、GLP#64から96x12個の穀粒試料を連続的に除去することにより確立された。各12個の穀粒分割量を1枚の薬包紙上に置いた後、2~3mm深さの孔を胚乳中にあけるための1.6mmドリルを備えた彫刻機(Marathon-3,Saeyang Microtech)を同時に用いて、1対の鉗子で連続的に固定した。回転運動により、粉末を胚乳から穀粒およびまわりの薬包紙の上端まで移動させた。12個の穿孔穀粒試料をマイクロタイタープレートの別の2mLのウェルに置き、穿孔大麦粒PDGLP#64の二次的サブプールを得た。それぞれ12個の穿孔大麦粒由来の粉末を含む96個の粉末試料を、穿孔穀粒と一致する試料ナンバリングシステムを保持している1.5mLのマイクロタイタープレート(PFGLP#64)の別のウェルに移した。
3.次に、NucleoSpin 96 Plant II kit(Macherey-Nagel)の説明書に詳細に記載されている半自動化DNA抽出方法を用いて、PFGLP#64のgDNAの抽出を行った。従って、マイクロタイタープレートの各ウェルは、12穀粒の粉末由来のgDNAを含んだ。
4.PFGLP#64由来のgDNAを上述のように分析した。データは、ソフトウェアQuantaSoft(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて分析した。閾値は、2Dプロットを用いて決定し、チャネル1振幅およびチャネル2振幅に対しそれぞれ3700および2500に設定した。存在比率の個別の値の比較は、PFGLP#64の1つのウェルが、変異体穀粒を含むことを示した。ウェルC04は、3.92%の存在比率を示し、ヘテロ接合の変異体PDGLP#64の存在を示した。
5.PDGLP#64のウェルC04由来の12個全ての穀粒が発芽した。12個全ての小植物由来の葉物質は回収され、REDExtract(Sigma Aldrich)を用いて、DNA抽出に供された。葉試料由来のgDNAを上述のように分析した。データは、ソフトウェアQuantaSoft(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて分析した。閾値は、2Dプロットを用いて決定し、チャネル1振幅およびチャネル2振幅に対しそれぞれ3700および2500に設定した。PDGLP#64のウェルC04由来の1つの小植物は、45%の存在比率を示し、ヘテロ接合変異体の存在を確証した。前記植物由来の種子を増殖させ、子孫を交配させてホモ接合植物を得た。ホモ接合植物を増殖させてその物質を増やした。変異ホモ接合の植物をHENZ-2と命名した。
ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種が栽培品種Planetの大麦であったこと以外は、大麦変異体HENZ-2aは、基本的に、実施例2Aに記載されているようにして得た。同じプライマーおよびプローブを使用した。
HENZ-2大麦変異体植物ならびに対照ホモ接合大麦植物は圃場で増殖された。対照ホモ接合の植物は、実施例2Aに記載のヘテロ接合変異体の交配から得られ、この対照ホモ接合植物は配列番号2のHvHRTをコードする野生型HvHRT遺伝子を含む。従って、対照ホモ接合の植物は、それらがHvHRT遺伝子変異を有さないこと以外は、HENZ-2と同一であると考えられる。
結果を下表1に示す。
種子生存率の直接低下に繋がるために、穂発芽は極めて望ましくない。穂発芽実験を実施し、大麦変異体HENZ-2の穂発芽の程度を評価した。対照として、栽培品種Paustianおよび栽培品種Flagshipの野生型大麦の穂発芽を測定した。栽培品種Flagshipの大麦は、高レベルの穂発芽を有することが知られている。実験を次のように実施した。HENZ-2、PaustianおよびFlagshipを圃場の相互に近接した個々の区画で成長させた。穀物成熟時に、各区画の一部を収穫した(収穫1)。1時間当たり10分間、1日当たり12時間を、10日間にわたり、植物上に水を噴霧することにより、残りの区画の領域を灌漑し、その後、各区画領域の一部を収穫した(収穫2)。残りの区画の領域に対し、同じ灌漑計画をさらに10日間適用した後、収穫した(収穫3)。収穫の次の日に、3種全ての収穫物に対し、発芽試験を開始した。100個の穀粒を9.5cmのペトリ皿中の濾紙上に置き、3mlまたは5mlの水を加えることにより、発芽試験を実施した。3日間のインキュベーション後に、発芽した穀粒の比率を計数し、発芽穀粒%として得た。収穫1と収穫2との間で発芽比率の低下がある大麦品種は、穂発芽があったと考えられ、一方、収穫1から収穫2および3の間で発芽比率が同じ、または増加がある大麦品種は、穂発芽を起こさないと考えられる。結果を表2に示す。
Diff*は、第1と第3との収穫の平均発芽比率の間の差異を%で示す。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-2大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Paustian由来の穀粒物質を、標準的発芽試験で発芽させた:
・Pfeuffer grain sorterを用いて、穀粒をサイズで選別し、2.5および2.8mmより大きい穀粒を使用した。
〇 100個の全粒を90mmのペトリ皿中の2枚のWhatman定性濾紙(グレード1、85mm、カタログ番号1001-085)上に置き、4mlの蒸留水を加えた。
〇 別の100個の全粒を90mmのペトリ皿中の2枚のWhatman定性濾紙(グレード1、85mm、カタログ番号1001-085)上に置き、8mlの蒸留水を加えた(高水条件)。
・ペトリ皿を閉じて、湿潤クロスで覆った暗色ボックス中、20℃で貯蔵した。
・4mlのペトリ皿を24時間、48時間および72時間後にチェックし、発芽穀物(小根出現)をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
・8mlのペトリ皿を72時間後にチェックし、発芽穀物(小根出現)をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-2大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Paustian由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065498号の実施例1に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた:200gの大麦粒(乾燥重量)をタンク中、1mMのGA含有水で覆って48時間インキュベーションし、同時に、1kg乾燥重量の大麦粒当たり90L/h空気流量を供給した。発芽中、24時間および48時間後に、穀粒含水量を測定し、結果を図2に示す。HENZ-2は両方の事例で、野生型に比べて、より高い穀粒含水量であり、高い発芽を示した。
酵素活性分析の前に、発芽穀粒試料をタングステンカーバイド粉砕リング(Foss10004463)、ニッケルメッキインペラ(Foss10002666)および1mmの出口スクリーン(Foss10001989)を備えた標準的Foss Cyclotechミル(Foss,Denmark)を用いて粉砕した。発芽大麦粒の酵素活性の全ての測定は、試料の粉砕の48時間後以内に行われた。
発芽穀粒のα-アミラーゼ活性は、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末をベースにした。α-アミラーゼ活性の測定のためのアッセイは、標準的実験装置を用いるMegazymeからのCeralpha kitを利用した。α-アミラーゼ活性の計算を含む、製造業者のプロトコル(K-CERA 01/12)に従ってアッセイを実施した。
発芽穀粒のβ-アミラーゼ活性を測定する場合、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末を作製した。β-アミラーゼ活性アッセイは、MegazymeのBetamyl kit(K-BETA3)と共に提供された推奨条件に従った。
発芽穀粒の限界デキストリナーゼ活性を測定するために、上記のセクション「試料作製」で記載のように、粉末を作製した。限界デキストリナーゼ活性は、Megazymeからの、Limit Dextrizymeキット、T-LDZ1000を用いて測定した。活性測定を含むアッセイは、製造業者のプロトコル(T-LDZ1000 07/9)に従って実施した。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-2大麦変異体植物および大麦植物栽培品種Paustian由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065498号の実施例9に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた:200gの大麦粒を、国際出願第PCT/EP2017/065498号の実施例8に記載されているように、1分間剥皮を行った。続けて、剥皮した大麦粒をタンクに移し、0.01%のH2O2、消泡剤204、1mMのGA3を含む500mlの水で覆い、90L/hの空気を通気下、24時間インキュベーションした。これは、100mlの水当たり、18L/hの空気に相当する。過剰水は排水され、穀粒は90L/hの空気の通気下、24時間インキュベーションされた。α-アミラーゼ、β-アミラーゼおよび限界デキストリナーゼの活性は、発芽の24時間および48時間後に、実施例4で記載の標準的Megazymeアッセイを用いて測定された。加えて、これら補酵素の、EBC19標準(Institute Francais De La Brasserie Et De La Malterie(IFBM,France)から得た)に従って作製された麦芽中の活性も測定された。結果を、図5に示す。HENZ-2物質は、全ての試験した酵素の有意により高い活性を示し、高発芽を示した。HENZ-2に対し測定した活性は、EBC19標準さえも超えた。
HENZ-10の名称の大麦変異体は、下記に記載のように特定および単離された。HENZ-10は、HBL12タンパク質の翻訳中に未成熟STOPコドンを生ずる大麦遺伝子HvHBL12中のヌクレオチド置換を有する。アミノ酸交換は、トリプトファン228からSTOPへの交換である(W228Stop)。変異体バックグラウンドは、裸麦変種である(本明細書では、「Hull-less1」とも呼ばれる)。裸麦植物は通常、皮麦品種に比べて、発芽中に、より高いα-アミラーゼ活性を有する。変異体のHvHBL12遺伝子のコード配列は、本明細書で配列番号8として提供され、一方、変異体HvHBL12遺伝子によりコードされる変異体タンパク質の配列は、配列番号9として提供される。
HvHBL12の遺伝子中に特定の変異を有する大麦変異体のddPCRベーススクリーニング
国際出願第PCT/EP2017/065516号に記載の方法を用いて、特定の変異を有する大麦植物を特定した。
野性型コード配列(ジェンバンク番号NCBI:JX878491.1)中のヌクレオチド位置684のHvHBL12の変異体アレルと野性型アレルとの間を特に区別するユニークなddPCRアッセイを設計した。HvHBL12に対するわずかに異なる配列が利用可能であり、ddPCRアッセイを、ジェンバンク番号NCBI:JX878491.1に基づいて設計した。変異体検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置684にA塩基を含んだ(配列番号5のヌクレオチド684に対応する)。参照検出プローブは、コード配列に相補的であり、ヌクレオチド位置684にG塩基を含んだ。2つの近傍プライマーを設計して、コード配列中のヌクレオチド684の周辺のゲノム配列を増幅した。
HvHBL12座位に特異的な次のプライマーおよびプローブを設計した:
-標的特異的順方向プライマー(配列番号19):
5’-GTCGTCGTTCCCGTT-3’;
-標的特異的逆方向プライマー(配列番号20):
5’-CTGCAGGTCTGCTCC-3’;
-変異体特異的検出プローブ(配列番号21):
5’-ACTCGAGCTGACCGT-3’ 6-カルボキシフルオレセイン(FAM)で標識;
-参照特異的検出プローブ(配列番号22):
5’-CTCGAGCTGGCCGT-3’ ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)で標識。
次のステップは、ライブラリーが所望の変異導入穀物を含むかどうかの判定であった。スクリーニングは、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065516号のWS3(p.67~69)および実施例3~7に記載されているようにし、次の詳細事項も加えて実施した:
-約120,000変異導入大麦植物に相当する、合計376個のサブプール(GLP#1~GLP#376と命名)を用いて、スクリーニングを実施した。
-各サブブール由来の1つの5μLのgDNA試料(GT#1~GT#376と命名)を作製した。gDNA試料GT#283~GT#376をマイクロタイタープレートの個別のウェルに加えた。各ウェルは、17μlのPCR反応混合物も含んでいた。各ウェルをピペッティングによる下層での吸引と上層での吐出により完全に混合した。
遺伝子変異を有する個別の大麦粒は、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065516号のWS4(p.69~72)および実施例8~15に記載されているようにし、下記の連続的に順序付けた詳細事項を含めて実施して、特定した。
6.HvHBL12特異的ddPCRアッセイを用いたGT#283~GT#376由来のgDNAの分析に基づいて、4500個の穀粒のGLP#291[陽性試料gDNA(GT#291)に対応する]は、目的の遺伝子変異を有する1つまたは複数の穀粒を含むであろうことが高い確率で考えられた。
7.FGLP#291は、GLP#291から96x12個の穀粒試料を連続的に除去することにより確立された。各12個の穀粒分割量を1枚の薬包紙上に置いた後、2~3mm深さの孔を胚乳中にあけるための1.6mmドリルを備えた彫刻機(Marathon-3,Saeyang Microtech)を同時に用いて、1対の鉗子で連続的に固定した。回転運動により、粉末を胚乳から穀粒およびまわりの薬包紙の上端まで移動させた。12個の穿孔穀粒試料をマイクロタイタープレートの別の2mLのウェルに置き、穿孔大麦粒PDGLP#291の二次的サブプールを得た。それぞれ12個の穿孔大麦粒由来の粉末を含む96個の粉末試料を、穿孔穀粒と一致する試料ナンバリングシステムを保持している1.5mLのマイクロタイタープレート(PFGLP#291)の別のウェルに移した。
8.次に、NucleoSpin96 Plant II kit(Macherey-Nagel)の説明書に詳細に記載されている半自動化DNA抽出法を用いて、PFGLP#291のgDNAの抽出を行った。従って、マイクロタイタープレートの各ウェルは、12穀粒の粉末由来のgDNAを含んだ。
9.PFGLP#291由来のgDNAを上述のように分析した。データは、ソフトウェアQuantaSoft(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて分析した。閾値は、2Dプロットを用いて決定し、チャネル1振幅およびチャネル2振幅に対しそれぞれ4000および1500に設定した。12.5%、4.42%および7.3%の存在比率を示すマイクロタイタープレートの3つの個別のウェル(E03、E11、G01)を特定し、全てが3つの独立したウェル中のPDGLP#291の3つの個別の変異体の存在を示した。
10.PDGLP#291のウェルG01由来の12個全ての穀粒が発芽した。12個全ての小植物由来の葉物質は回収され、REDExtract(Sigma Aldrich)を用いて、DNA抽出に供された。葉試料由来のgDNAを上述のように分析した。データは、ソフトウェアQuantaSoft(バージョンv1.7、Bio-Rad)を用いて分析した。閾値は、2Dプロットを用いて決定し、チャネル1振幅およびチャネル2振幅に対しそれぞれ6000および2000に設定した。PDGLP#291のウェルH01由来の1つの小植物は、96.9%の存在比率を示し、ホモ接合変異体の存在を確証した。前記植物を増殖させてその物質を増やした。変異ホモ接合の植物をHENZ-10と命名した。
ランダム変異誘発ライブラリーの作製に使用した大麦栽培品種が栽培品種Planetの大麦であったこと以外は、大麦変異体HENZ-61は、基本的に、実施例7Aに記載されているようにして得た。同じプライマーおよびプローブを使用した。
HENZ-10大麦変異体植物およびHull-less1大麦植物は、圃場中の区画で類似の条件下、栽培された。平均植物高さを含む種々の農学的特徴を特定した。HENZ-10大麦変異体植物は、目視検査では健全であるように見えた。5つの圃場試験区中の区画当たりの選択植物の底部(第1の節間の開始部、根の直ぐ上)から穂の先端(大麦の穂を直立に保持した)までの植物高さを測定することにより、平均植物高さを測定した。結果を、図10に示す。興味深いことに、HENZ大麦変異体植物と親Hull-less1大麦植物との間で、植物高さの差異は観察されなかった。
HENZ-61大麦変異体植物ならびに栽培品種Planetの野生型大麦植物は、圃場で個別に、しかし、近くの区画で増殖された。収率、1000穀粒の穀粒重量(TKW)、デンプン含量(デンプン)、タンパク質含量(タンパク質)、植物高さおよび穂/m2は、上記実施例3Aで記載のように測定した。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-10大麦変異体植物およびHull-less1大麦植物由来の穀粒物質を、以下のペトリ皿中の標準的発芽試験で発芽させた:
・Pfeuffer grain sorterを用いて、穀粒をサイズで選別し、2.5および2.8mmより大きい穀粒を使用した。
・100個の全粒を90mmのペトリ皿中の2枚のWhatman定性濾紙(グレード1、85mm、カタログ番号1001-085)上に置き、4mlの蒸留水を加えた。
・別の100個の全粒を90mmのペトリ皿中の2枚のWhatman定性濾紙(グレード1、85mm、カタログ番号1001-085)上に置き、8mlの蒸留水を加えた。
・ペトリ皿を閉じて、湿潤クロスで覆った暗色ボックス中、20℃で貯蔵した。
・4mlのペトリ皿を24時間、48時間および72時間後にチェックし、発芽穀物(小根出現)をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
・8mlのペトリ皿を72時間後にチェックし、発芽穀物(小根出現)をペトリ皿から取り出し、発芽穀粒の数を記録した。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-10大麦変異体植物およびHull-less1大麦植物由来の穀粒物質を、震盪機上の水を満たした三角フラスコ中、室温で48時間発芽させた。48時間後に、ddPCRおよび示した遺伝子に特異的なプライマーとプローブを用いて、α-アミラーゼ(amy1_1およびamy1_2)、限界デキストリナーゼ(LD)、α-グルコシダーゼ97(AGL97)およびβ-グルカナーゼ2Aおよび2B(BGL2AおよびBGL2B)の遺伝子発現を測定した。結果を、図7に示す。BGL2Bの配列は、受入番号HORVU1Hr1G057680.1で利用可能である。HENZ-10物質は、全ての試験した遺伝子の発現が増大し、そのHull-less1野生型親に比べて、高発芽を示した。Hull-less1大麦では、例えば、早期の高α-アミラーゼにより示されるように、多くの野生型皮麦栽培品種に比べて、胚乳改変がより早期に開始されることに留意されたい。従って、HENZ-10は、Hull-less1に比べて、全ての試験した遺伝子の増大した発現を示すことに留意すべきである。従って、Hull-less1が早期の高α-アミラーゼを既に有しているにもかかわらず、HENZ-10はそれでも、さらに高いα-アミラーゼ活性を有する。
類似の条件下の圃場で成長させたHENZ-10大麦変異体およびHull-less1大麦植物由来の穀粒物質を、基本的に、国際出願第PCT/EP2017/065498号の実施例1に記載されているような水を有するタンク中で、下記の詳細事項を加えて、発芽させた:200gの大麦粒(乾燥重量)をタンク中、1mMのGA含有水で覆って48時間インキュベーションし、同時に、90L/h空気流量を供給した。α-アミラーゼ(amy1_1およびamy1_2)、限界デキストリナーゼ(LD)およびβ-グルカナーゼ2A(BGL2A)の遺伝子発現を、示した遺伝子に特異的なプライマーおよびプローブを用いて、ddPCRにより48時間後測定した。実施例20で記載の遺伝子発現用の一般的ddPCRプロトコルを用いた。結果を、図8に示す。HENZ-10物質は、全ての試験した遺伝子の有意により高い発現を示し、野生型Hull-less1大麦に比べて、高発芽を示した。
HENZ-50と呼ばれる大麦植物を、基本的に上記実施例2Aで記載のようにして特定および単離した。HENZ-50は、コード配列中に未成熟STOPを含む遺伝子を生ずる大麦遺伝子WRKY38中のヌクレオチド置換を有する。従って、HENZ-50は、HvWRKY38(配列番号10)のコード配列のヌクレオチド600のG→A変異を有する。大麦栽培品種Ingrid由来のWRKY38のコード配列は、本明細書で配列番号10として提供される。大麦由来の2つの異なる野生型ポリペプチド配列WRKY38は、配列番号11および配列番号12として提供される。HENZ-50大麦植物は、大麦遺伝子HvWRKY38中に未成熟STOP(W200Stop)を生じさせる点変異を有する。変異は、WKRYモチーフのシグネチャ配列WRKYGQK(配列番号11または12のaa200~206)の開始点に位置する。HENZ-50の変異体HvWRKY38遺伝子は、配列番号14の配列を有する変異体HvWRKY38タンパク質をコードする。
標的特異的順方向プライマー(配列番号23)
5’-CTCAGCCTGGTGGTG-3’
標的特異的逆方向プライマー(配列番号24)
5’-TGTCCTTGGTCACCTTC-3’
変異体特異的検出プローブ(配列番号25)
5’-CCAATGACGCAAGTACG-3’ FAMで標識
参照物質特異的検出プローブ(配列番号26)
5’-TACCAATGGCGCAAGTA-3’ HEXで標識。
大麦変異体HENZ-50および野生型大麦の栽培品種Planetをデンマークの温室中、類似の条件下で成長させた。100個の穀粒のそれぞれを、100mlの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、250rpmの振盪機上に置いた250mlの三角フラスコ中で発芽させる。発芽中、穀粒はH2O中に常に浸漬される。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給されない。
HENZ-43と呼ばれる大麦植物を、基本的に上記実施例2Aで記載のようにして特定および単離した。HENZ-43は、amy1_1クラスターの大麦α-アミラーゼ遺伝子のプロモーター中にヌクレオチド置換を有する。変異は、タンデム型リピートW-ボックスの変異を生じ、これにより次の配列の非標準タンデム型リピートW-ボックスをもたらす:TGACGGTCGTATTGATC(配列番号35)。換言すれば、HENZ-43では、amy1_1遺伝子の野生型TTGACC配列がTTGATCに改変された。図11Aは、種々の野生型α-アミラーゼプロモーターの部分配列と、HENZ-43変異体のamy1_1クラスターの大麦α-アミラーゼ遺伝子との間の整列を示す。
標的特異的順方向プライマー(配列番号27)
5’-AAACAGAGGTTGAGGATAAC-3’
標的特異的逆方向プライマー(配列番号28)
5’-GCCTTCGCCTTCCAT-3’
変異体特異的検出プローブ(配列番号29)
5’-AGGCACCGATCAATACG-3’ FAMで標識
参照物質特異的検出プローブ(配列番号30)
5’-AAGGCACCGGTCAATAC-3’ HEXで標識。
HENZ-43大麦変異体植物ならびに栽培品種Planetの野生型大麦植物は、圃場で個別に、しかし、近くの区画で増殖された。収率、1000穀粒の穀粒重量(TKW)、デンプン含量(デンプン)、タンパク質含量(タンパク質)、植物高さおよび穂/m2は、上記実施例3Aで記載のように測定した。
HENZ-53およびHENZ-54と呼ばれる2種の大麦植物を、基本的に上記実施例2Aで記載のようにして特定および単離した。
標的特異的順方向プライマー(配列番号73)
5’- GTCAGCTACTGGGAGTATT-3’
標的特異的逆方向プライマー(配列番号74)
5’- TCTTCGCGACGACAC-3’
変異体特異的検出プローブ(配列番号75)
5’-TGCATGAAATAAACTGCAGA-3’ FAM(商標)で標識
参照物質特異的検出プローブ(配列番号76)
5’-TGCATGGAATAAACTGCAG-3’ HEX(商標)で標識。
標的特異的順方向プライマー(配列番号77)
5’-TGCTAATCCAAGCAAACG-3’
標的特異的逆方向プライマー(配列番号78)
5’-TTTGTGGACAGATTTTTGGA-3’
変異体特異的検出プローブ(配列番号79)
5’-AGCCTGACAAACCAGTG-3’ FAM(商標)で標識
参照物質特異的検出プローブ(配列番号80)
5’-AAGCCTGGCAAACCAG-3’ HEX(商標)で標識。
大麦変異体HENZ-2、野生型大麦の栽培品種Paustian、大麦変異体HENZ-10および野生型大麦Hull-less1大麦を類似の条件下、ニュージーランドの圃場で成長させた。それぞれの大麦由来の100個の穀粒を、100mlの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、250rpmの振盪機上に置いた250mlの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はH2O中に常に浸漬された。100mlの水当たり、9L/hの空気流量の空気を水中に導入した。穀粒を水中、通気下で48時間または72時間インキュベーションした。
大麦変異体HENZ-10および野生型大麦Hull-less1を類似の条件下、ニュージーランドの圃場で成長させた。それぞれの大麦由来の100個の穀粒を、100mlの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、250rpmの振盪機上に置いた250mlの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はH2O中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
大麦変異体HENZ-2a、大麦変異体HENZ-54、大麦変異体HENZ-43および野生型大麦の栽培品種Planetを類似の条件下、デンマークの温室で成長させた。それぞれの大麦由来の100個の穀粒を、100mlの脱イオン水を満たし、パラフィンで密封し、250rpmの振盪機上に置いた250mlの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はH2O中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
HENZ-2変異体大麦および実施例3Aで記載の類似の条件で成長させた対照ホモ接合の大麦植物から穀粒を得た。
類似の条件下、デンマークの温室で成長させた大麦変異体HENZ-2a、大麦変異体HENZ-54、大麦変異体HENZ-43および野生型大麦の栽培品種Planet由来の穀粒物質を使用した。100個の穀粒を、100mlのH2Oを満たし、パラフィンで密封し、250rpmの振盪機上に置いた250mlの三角フラスコ中で発芽させた。発芽中、穀粒はH2O中に常に浸漬された。フラスコ中の空気は別にして、空気は供給しなかった。
遺伝子発現を標準的方法を用いてddPCRにより測定した。より具体的には、RNAは通常、最初にトリゾール(Qiagen #15596026)プロトコルを用いて、続けて、Aurum(商標)Total RNA Mini Kit(Bio-Rad #7326820)で洗浄して、凍結乾燥穀粒粉末(約50mg)から抽出した。Bio-RadのiScript(商標)cDNA Synthesis Kit(#1708891)を用いてcDNAを合成した。
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Claims (11)
- 大麦植物またはその一部であって、
HvHRT遺伝子中に、少なくとも配列番号2の118個の最C末端アミノ酸を欠く変異体HvHRTタンパク質をコードする変異体HvHRT遺伝子をもたらす変異、または少なくとも前記HvHRT遺伝子のコード領域の欠失をもたらす変異を有し、前記HvHRT遺伝子のコード領域が配列番号2のポリペプチドをコードし、前記大麦植物の一部が、穀粒、胚芽、発芽穀粒、葉、茎、根、花、粉砕大麦植物または粉砕大麦穀粒である、大麦植物またはその一部。 - コドン1~431のいずれか1つに未成熟停止コドンを有する変異体HvHRT遺伝子を含む、請求項1に記載の大麦植物。
- 配列番号1のHvHRTコード配列のヌクレオチド1293のG→A変異を含む変異体HvHRT遺伝子を含む、請求項1または2のいずれか1項に記載の大麦植物。
- 発芽の開始の48時間後、少なくとも100U/gのα-アミラーゼ活性を有するが、ただし、発芽の開始の前に外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項1~3のいずれか1項に記載の大麦植物。
- 発芽の開始の48時間後、少なくとも20mU/gの限界デキストリナーゼを有するが、ただし、前記発芽の開始の前に、外皮なしであるかまたは少なくとも一部の前記外皮が取り除かれていることが前提である、請求項1~4のいずれか1項に記載の大麦植物。
- 2つ以上の変異または請求項1に記載の特性を含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の大麦植物。
- 大麦粉、緑麦芽、およびキルン乾燥麦芽からなる群より選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の大麦植物を含む、またはそれから作製された植物生成物。
- 粉砕緑麦芽または粉砕キルン乾燥麦芽である、請求項7に記載の植物生成物。
- 水性抽出物の製造方法であって、
a.請求項1~6のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒を用意するステップ;
b.大麦粒を発芽ステップに供し、それにより、発芽穀粒を得るステップであって、前記発芽ステップが、前記穀粒が少なくとも30%の含水量を有するまで水溶液中で前記穀粒をインキュベーションすることを含み、1時間当たり、少なくとも2LのO2/(kg乾燥重量大麦粒)を、前記水溶液中を通過させるステップ;および
c.前記発芽穀粒を微粉化し、同時に、前記発芽穀粒が少なくとも20%の含水量を有するステップであって、ただし、前記大麦粒がステップb)とc)との間で常に20%未満の含水量にならないことが前提である、ステップ;
d.前記微粉化発芽穀粒の水性抽出物を作製し、それにより、大麦の水性抽出物を製造するステップ、
を含む、方法。 - 飲料の製造方法であって、
(i)請求項9に記載の方法により水性抽出物を作製するステップ;
(ii)前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。 - 飲料の製造方法であって、
i.請求項1~6のいずれか1項に記載の大麦植物の穀粒および/または麦芽から水性抽出物を作製するステップ、
ii.前記抽出物を飲料に処理するステップ、
を含む、方法。
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