WO2022059780A1 - ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法 - Google Patents

ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法 Download PDF

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良輔 五ノ坪
光次郎 大澤
泰道 等
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Definitions

  • the present invention introduces a T cell receptor obtained from a T cell population that is reactive with a tumor-related antigen into non-T non-B cells or iPS cells derived from monospheres or T cells, and is antigen-specific.
  • T cells play a central role in the immune response to foreign pathogens such as bacteria or viruses or abnormal cells such as cancer cells. Therefore, it is considered that the functional deterioration of T cells contributes to pathogen infection and the development of cancer.
  • T cell replacement therapy or regenerative therapy for a patient having a disease caused by a decrease in T cell function can be an extremely effective means for improving or treating the pathological condition of the disease in the patient.
  • T cell replacement therapy for infectious diseases or cancer specifically recognizes antigens possessed by foreign pathogens such as bacteria or viruses or abnormal cells such as cancer cells. It is known that a high therapeutic effect can be obtained by using T cells. On the other hand, it is difficult to secure a sufficient amount of T cells, and exhaustion of T cells such as a decrease in proliferative ability in T cells and a decrease in immune response to antigens such as target cells becomes obstacles in T cell replacement therapy. ing.
  • iPS cells artificial pluripotent stem cells
  • Cell replacement therapy has been proposed. Since the T cell receptor (TCR) for recognizing the target antigen is formed by gene rearrangement of the genome, the TCR gene possessed by the T cell before reprogramming is conserved in the iPS cell in which the T cell is reprogrammed. Has been done. Therefore, by using T cells specific to the target antigen as a raw material for producing iPS cells, it is possible to produce regenerated T cells exhibiting the same antigen specificity as the original T cells. (Patent Document 1 and Non-Patent Document 1).
  • Non-Patent Document 2 Strict antigen specificity is required for safe and efficient T cell replacement therapy.
  • Patent Document 2 It has been reported that in regenerated T cells obtained from T cells via iPS cells as described above, the frequency of appearance of T cells having the same gene rearrangement pattern as the original T cells is not necessarily high.
  • Patent Document 2 It has also been reported that CD8 ⁇ regenerated T cells obtained from human T cells via iPS cells lose antigen specificity due to additional rearrangement of the TCR ⁇ chain gene at the CD4 / CD8 double positive stage.
  • Nishimura T et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation.
  • Minagawa A et al. Enhancing T cell receptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy.
  • iPS-T cells regenerated T cells
  • iPS-T cells regenerated T cells
  • tumor cells or tumor tissues can be used. It is important to ensure the safety and efficacy of iPS-T cell replacement therapy in the treatment of cancer.
  • iPS-T cell replacement therapy when the onset or recurrence of cancer is detected, it is important to start iPS-T cell replacement therapy promptly in order to improve the treatment results.
  • An object of the present invention is to provide a method for rapidly producing an iPS-T cell into which an antigen-specific TCR has been introduced and an iPS-T cell produced by the above method. Further, the present invention relates to iPS-T cells produced by the above method, a cancer prophylactic or therapeutic agent containing the iPS-T cells as an active ingredient, a pharmaceutical composition containing the iPS-T cells, and the pharmaceutical composition. The purpose is to provide a method of preventing or treating cancer using a substance.
  • T cell clones (5-10 clones) recognize antigens using different TCRs even for one antigen epitope.
  • the possibility that the clone differentiated to iPS-T cells is a T cell clone having the optimum TCR to damage the target is also the individual difference of the subject who collects the cells for producing iPS-T cells or iPS. -Affected by T cell production batches.
  • TCR pools with antigen specificity from a T cell population that is reactive to tumor-related antigens, from non-T non-B cells or iPS cells or T cells established from monospheres.
  • iPS-T cells By introducing TCR into established iPS cells, iPS-T cells can be produced, and by selecting iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells in advance, the quality of regenerated T cells can be homogenized and The production period can be shortened, and at the same time, the iPS-T cells can be rapidly produced by adjusting the timing of acquisition of the TCR pool and establishment of iPS cells, and the TCR pool and the non-T non-T CR pool.
  • the origin of B cells or monospheres or T cells may be the same individual or a separate body, and have completed the present invention.
  • a method for producing regenerated T cells via iPS cells. [2] (1) T cells obtained from a subject are brought into contact with a tumor-related antigen, and T cell receptor ⁇ -chains and ⁇ -chains are added to each single cell from the T cell population that is reactive with the tumor-related antigen.
  • the process of preparing the cDNA to be encoded (2) Peripheral blood mononuclear cells of the subject from which B cells and T cells have been removed are initialized into iPS cells, and the resulting iPS cell to T cell differentiation efficiency The process of selecting iPS cell clones with high (3) A step of introducing the cDNA into the iPS cell clone, a hematopoietic stem cell differentiated from the iPS cell clone, an immature T cell differentiated from the hematopoietic stem cell, or a mature T cell differentiated from the immature T cell, and (4).
  • a method for producing regenerated T cells via iPS cells. [3] (1) T cells obtained from a subject to which a tumor-related antigen has been administered are brought into contact with the tumor-related antigen, and T cell reception is performed for each single cell from a T cell population that is reactive with the tumor-related antigen.
  • Steps to prepare cDNAs encoding body ⁇ and ⁇ chains, respectively (2) Peripheral blood mononuclear cells of the subject from which B cells and T cells have been removed are initialized into iPS cells, and the resulting iPS cell to T cell differentiation efficiency The process of selecting iPS cell clones with high (3) A step of introducing the cDNA into the iPS cell clone, a hematopoietic stem cell differentiated from the iPS cell clone, an immature T cell differentiated from the hematopoietic stem cell, or a mature T cell differentiated from the immature T cell, and (4).
  • a method for producing regenerated T cells via iPS cells. [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the implementation of the step (2) precedes the implementation of the step (1) or is parallel to the implementation of the step (1). [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the subjects in the steps (1) and (2) are the same individual. [6] 1 Method.
  • the step of selecting T cells that do not show an allo reaction to the cells derived from the subject in the step (2) from the T cells into which the cDNA obtained in the step (4) has been introduced is included in [6].
  • the method described. [8] Further, the step of selecting the cDNA encoding the T cell receptor that does not induce an allo reaction to the cells derived from the subject in the step (2) from the cDNA prepared in the step (1) is included in [6].
  • the method described. [9] The method according to [7] or [8], wherein the cell derived from the subject is a peripheral blood mononuclear cell.
  • the tumor-related antigen is selected from the group consisting of GPC3, WT1, XAGE1, LMP2, NY-ESO-1, EB virus antigen and neoantigen, and peptide fragments thereof. the method of. [11]
  • the tumor-related antigen is EYILSLEEL (SEQ ID NO: 1), which is an HLA-A24-binding GPC3 peptide, FVGEFFTDV (SEQ ID NO: 2), which is an HLA-A2 binding GPC3 peptide, or a mixture thereof, [1] to [9]. ]
  • EYILSLEEL SEQ ID NO: 1
  • FVGEFFTDV SEQ ID NO: 2
  • step (3) the introduction of the cDNA into the iPS cell clone, the hematopoietic stem cell differentiated from the iPS cell clone, the immature T cell differentiated from the hematopoietic stem cell, or the mature T cell differentiated from the immature T cell is performed.
  • the method according to [12], wherein the non-viral vector is a transposon vector.
  • the transposon vector is a piggyBac® vector.
  • step (4) the step of differentiating the iPS cell clone, the hematopoietic stem cell or the immature T cell into which the cDNA has been introduced into mature T cells and proliferating the mature T cells is a step of performing feeder cells and PHA ( The method according to any one of [1] to [14], which is carried out in the presence of phytohemagglutinin), in the presence of Retronectin® and anti-CD3 antibody, or in the presence of anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody. [16] The method according to [15], wherein the feeder cells are autologous or allogeneic peripheral blood mononuclear cells.
  • iPS-T cells regenerated T cells
  • non-T peripheral blood mononuclear cells
  • T cells and B cells collected from a subject to be treated for cancer
  • iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells are selected in advance. Therefore, it is possible to secure a sufficient amount of iPS-T cells required for treatment according to the timing required for treatment.
  • iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monospheres or T cells hematopoietic stem cells differentiated from the iPS cell clones, immature T cells differentiated from the hematopoietic stem cells or the immature T cells.
  • TCR TCR antigen Specificity
  • iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells are selected and used, so that the yield and degree of differentiation vary between iPS-T cell production batches, and the cells are used. It is possible to minimize the influence of individual differences of the subjects to be collected on the quality and the like of the obtained iPS-T cells. In addition, it becomes possible to efficiently produce T cells having a TCR that recognizes an antigen and efficiently kills a target.
  • the cDNA encoding the TCR is prepared for each single cell from the T cell population having genetic diversity, it is possible to prepare a cDNA group having various antigen specificities. .. Also, to generate and store non-T non-B cell or monocyte or T cell-derived iPS cell clones prior to or in parallel with the preparation of the cDNA encoding the antigen-specific TCR. Compared with the method of sequentially performing these, iPS-T cells can be produced in a short period of time.
  • iPS-T cell replacement therapy it is specific to the expressed antigen against the antigen change or the development of treatment resistance of the tumor or the recurrence of the cancer in the cancer patient to be treated. It is possible to quickly prepare various iPS-T cells.
  • the subject from which the T cells used for preparing the cDNA encoding the TCR are collected is the same individual as the subject who is a cancer patient to be treated by iPS-T cell replacement therapy. May be separate from each other. Therefore, it is possible to prepare a TCR pool corresponding to various antigens, and it is possible to select a TCR having optimal antigen specificity for each cancer patient.
  • the upper partial diagram shows a step of isolating a tumor-related antigen X-specific TCR gene and a step of verifying antigen-specific reactivity
  • the lower partial diagram shows a step of producing a TCR gene-introduced iPS cell.
  • the step of producing regenerated T cells from the iPS cells shows the outline of the process of producing the regenerated T cell from the non-T non-B cell of peripheral blood or the iPS cell which reprogrammed a monocyte.
  • the "T cell” obtained from a subject is a cell expressing an antigen receptor called a T cell receptor (TCR) on the cell surface.
  • TCR includes a heterodimer consisting of an ⁇ chain and a ⁇ chain, and a heterodimer consisting of a ⁇ chain and a ⁇ chain.
  • T cells having a TCR consisting of an ⁇ chain and a ⁇ chain are called ⁇ type T cells, and T cells having a TCR consisting of a ⁇ chain and a ⁇ chain are called ⁇ type T cells.
  • the T cells of the present invention are preferably CD3 / ⁇ type T cells, but may be CD3 / ⁇ type T cells.
  • the TCR of T cells in the present invention is a gene-introduced one.
  • the "T cell population” refers to the above-mentioned T cell population in which the gene sequence of the T cell receptor (TCR) that recognizes an antigen is diverse as a whole. Therefore, T cells collected from a living body are a T cell population having specificity for various antigens. In the T cells existing in the living body, each T cell has a different TCR gene sequence due to the random recombination of the TCR gene when the T progenitor cell develops and differentiates in the thymus, and for all antigens. It is possible to provoke an immune response.
  • TCR T cell receptor
  • the TCR possessed by an individual T cell is determined by the antigen or peptide sequence that each specifically recognizes, but by considering the T cell as a population, the T cell population immunizes a variety of antigens. Can be understood. Therefore, the T cell population collected from a living body is a T cell population having genetic diversity in that sense.
  • the "tumor-related antigen” is an antigen that is specifically or non-specifically expressed in a tumor, and is an antigen derived from a protein that is overexpressed in tumor cells and a variant thereof, an antigen derived from a tumor virus, and the like. Certain differentiation antigens and novel tumor-related antigens (neoantigens) due to gene mutations and splice abnormalities.
  • a tumor-related antigen may be referred to as a tumor antigen.
  • it is a protein antigen, it may be a peptide fragmented from this (peptide fragment).
  • Antigens expressed specifically or non-specifically to tumors include WT1, GPC3, XAGE1, MUC1, MUC5AC, MUC6, EGFRvIII, HER-2 / neu, MAGE A3, MAGE A1, telomerase, PRAME, SSX2 / 4, PSCA. , CTLA-4, gp100, GD2, GD3, fucosyl GM1, GM3, sLe (a), glycolipid F77, mesotelin, PD-L1, trp1, trp2, CD19, CD20, CD22, ROR1, CD33, c-Met, p53.
  • Viral antigens include inactivated viruses such as inactivated HBV and HPV, and proteins derived from various viruses such as EBV LMP1, EBV LMP2, EBNA (EBV nuclearantigen), HPV E1, HPV E2, HPV E6, HPV E7, and HBV. Examples thereof include, but are not limited to, HBs, HTLV-1Tax and HBZ (HTLV-1bZIPFactor).
  • the tumor-related antigen can be selected from the group consisting of GPC3, WT1, XAGE1, LMP2, NY-ESO-1, EB virus antigen and neoantigen, and peptide fragments thereof.
  • the tumor-related antigen is EYILSLEEL, which is an HLA-A24-binding GPC3 peptide, FVGEFFTDV, which is an HLA-A2-restricted GPC3 peptide, or a mixture thereof.
  • amino acids are represented by abbreviations in the conventional one-letter notation.
  • T cells are tumor-related presented to major histocompatibility complex (MHC) class I or class II on antigen-presenting cells. It means that T cells have a reaction caused by selectively binding / joining to an epitope peptide derived from an antigen via TCR, and in binding / joining of T cells to something other than the epitope peptide, the T cells It means that no reaction occurs.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the T cell response resulting from binding / conjugation to an epitope peptide derived from a tumor-related antigen presented in MHC class I or class II via the TCR is cytotoxic, IFN- ⁇ and granzyme production, T. Expression of cell activation markers and activation of transcription factors such as NF-AT can be mentioned.
  • T cells are collected from a subject who is a cancer patient or a non-cancer patient.
  • the subject from which the T cells are collected may be a cancer patient who has been, is currently, or will be vaccinated with the cancer vaccine, and is not vaccinated with the cancer vaccine. It may be a non-cancer patient.
  • One or more cancer vaccines may be administered.
  • a cancer vaccine is a composition of a cancer or tumor-specific protein or peptide that is derived from the cancer or the tumor-related antigen and contains a vaccine antigen for inducing a cancer or tumor-specific immune response.
  • Cancer vaccines usually include an adjuvant to enhance the specific immune response induced by the vaccine antigen.
  • the T cells are preferably ⁇ T cells.
  • the source of T cells is preferably, but not limited to, peripheral blood because of its low invasiveness.
  • Other preferred sources are cancer or tumor tissue, lymph nodes or other tissues or organs, or blood, umbilical cord blood, lymph, tissue fluid (interstitial fluid, interstitial fluid and interstitial fluid), body cavity fluid (abdominal fluid). , Chest fluid, heart sac fluid, cerebrospinal fluid, joint fluid and atriointerstitial fluid) and all sources in the body.
  • preferred T cells are tumor tissue-derived T cells. Tumor tissue-derived T cells are usually tumor-infiltrating T cells.
  • the cancer of the cancer patient is ovarian cancer, hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, malignant black color. It is selected from tumor, non-small cell lung cancer, cervical cancer, glioblastoma, prostate cancer, neuroblast tumor, chronic lymphocytic leukemia, papillary thyroid cancer, colon cancer or B-cell non-hodgkin lymphoma.
  • the cancer is preferably hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma.
  • iPS cells are preferably produced by reprogramming non-T non-B cells or monocytes or T cells, but are not limited to non-T non-B cells or monocytes or T cells.
  • Non-T non-B cell means a mononuclear cell that is not classified as a T cell and is not classified as a B cell.
  • non-T non-B cells or monocytes can be prepared by collecting as peripheral blood mononuclear cells of a subject and then removing T cells and B cells contained in the mononuclear cells. Peripheral blood mononuclear cells can be isolated from whole human blood with a mononuclear cell isolation solution.
  • Examples of the mononuclear cell separation solution include Lymphoprep (registered trademark).
  • B cells such as CD19, CD20, CD22 or B cell receptors
  • T cells such as CD3, CD4 or CD8.
  • the antibody may be utilized to use magnetic beads such as, for example, flow cytometry or MACS® beads.
  • T cells can be isolated from whole human blood with a mononuclear cell isolation solution.
  • Examples of the mononuclear cell separation solution include Lymphoprep (registered trademark). Purification of T cells can be performed by utilizing the surface antigens of T cells, CD3, CD4 or CD8, or T cell receptors. Magnetic beads such as, for example, flow cytometry or MACS® beads may be used.
  • iPS cells can preferably be induced by introducing a cell reprogramming factor into non-T non-B cells or monocytes or T cells.
  • cell reprogramming factors include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, klf4, klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERAs, and ECAT15-2.
  • cell reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • these cell reprogramming factors from the viewpoint of efficiently establishing iPS cells, Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc (so-called Yamanaka 4 factors) are used as the non-T non-B cells or monocytes. Alternatively, it is preferably introduced into T cells.
  • the method for introducing a cell reprogramming factor into the non-T non-B cell or monocyte or T cell is not particularly limited, and a method known in the art can be adopted.
  • the gene encoding the cell reprogramming factor for example, cDNA
  • the gene encoding the cell reprogramming factor is introduced into the non-T non-B cell or monosphere. It is inserted into an expression vector containing a promoter that functions in spheres or T cells, and the expression vector is subjected to non-T by infection, lipofection method, liposome method, calcium phosphate co-precipitation method, DEAE dextran method, microinjection method or electroporation method.
  • the cell reprogramming factor can be introduced into non-B cells or monospheres or T cells.
  • the cell reprogramming factor is in the form of a protein and the protein is introduced into the non-T non-B cells or monospheres or T cells, a method using a protein transfer reagent or a method using a protein transfer domain fusion protein. , Electroporation method and microinjection method.
  • mRNA messenger RNA
  • a method using an mRNA introduction reagent and a method of adding the mRNA to the culture medium are available. Can be mentioned.
  • the expression vector used for gene transfer by infection examples include viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, and Sendai virus, and animal cell expression plasmids, but insertion mutations are unlikely to occur.
  • viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpesvirus, and Sendai virus
  • animal cell expression plasmids but insertion mutations are unlikely to occur.
  • the gene encoding the cell reprogramming factor is transferred to the non-T non-B cell or monosphere or T cell using Sendai virus. It is preferable to introduce it.
  • Examples of the promoter used in the expression vector used when introducing the gene encoding the cell reprogramming factor into non-T non-B cells or monospheres or T cells include SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, and the like. Examples include the RSV promoter, HSV-TK promoter, ubiquitin promoter and the like. These promoters may be capable of controlling the expression of a gene inserted downstream of the promoter depending on the presence or absence of a drug such as tetracycline.
  • the expression vector can include an enhancer, a poly A addition signal, a selectable marker gene (for example, a neomycin resistance gene), an SV40 origin of replication, and the like.
  • the culture medium used for culturing iPS cells obtained by reprogramming non-T non-B cells or monocytes or T cells is not particularly limited, but the culture medium used for culturing animal cells is used as the basal culture medium. It can be prepared by adding cytokines for maintaining the undifferentiated ability of iPS cells.
  • the basal culture medium include Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and Ham.
  • IMDM Isove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • cytokines include bFGF, and the concentration thereof in the culture medium is, for example, 1 to 100 ⁇ g / mL (preferably 50 ⁇ g / mL).
  • the method for culturing iPS cells may be adhesive culture or suspension culture, but adhesive culture is preferable.
  • the method for isolating iPS cells include a method of physically isolating with a cell scraper or the like, a dissociation solution having protease activity, a dissociation solution having collagenase activity, or a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (for example,).
  • An isolation method using Accutase (registered trademark), Accumax (registered trademark), etc.) can be mentioned.
  • the iPS cells are preferably 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 4 cells / cm 2 , 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 5 cells / cm 2 or 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10.
  • the number of passages may be any number as long as the required amount of iPS cells is obtained, preferably 1 to 5 times or 5 to 10 times.
  • the produced iPS cells consist of a large number of iPS cell clones.
  • the colony pickup method is not particularly limited, but a method using a pipette man under a microscope, a limiting dilution method, a method using a fully automatic colony picker, and the like are used.
  • the obtained iPS cell clone may form a master cell bank after expansion culture.
  • the "master cell bank" composed of the iPS cell clones is a single pool of iPS cell clones that is dispensed and accumulated in an independent cell storage container.
  • cryopreserve iPS cell clones In the master cell bank, it is preferable to cryopreserve iPS cell clones. Methods of cryopreserving cells are well known to those of skill in the art. For example, the cultured iPS cell clones are collected, washed with a buffer solution or a culture solution, the number of cells is counted, concentrated by centrifugation or the like, and suspended in a frozen medium (for example, a culture solution containing 10% DMSO). After turbidity, it can be cryopreserved at low temperature.
  • the master cell bank of the present invention can be stored in any facility or storage that can be cryopreserved. In the case of cryopreservation, the storage temperature is not particularly limited as long as it is a temperature suitable for storing cells. For example, ⁇ 20 ° C., ⁇ 80 ° C. and ⁇ 120 to -196 ° C. are mentioned, but ⁇ 150 ° C. or lower is preferable.
  • “Differentiation efficiency” refers to the hematopoietic stem cells, immature T cells, and mature T cells in all surviving cells at each stage of differentiation from iPS cells to hematopoietic stem cells, from hematopoietic stem cells to immature T cells, and from immature T cells to mature T cells. Refers to the abundance ratio. Identification of differentiated cells at each stage of differentiation can be performed by FACS analysis of surface markers. The efficiency of differentiation into hematopoietic stem cells is the proportion of CD34 / CD43 double positive cells in all viable cells, and the efficiency of differentiation into immature T cells is the proportion of CD4 / CD8 double positive cells or CD5 positive cells in all viable cells. Also, the efficiency of differentiation into mature T cells is shown as the proportion of cells in all surviving cells in which all of the CD8 ⁇ , CD8 ⁇ , TCR ⁇ and TCR ⁇ chains are positive.
  • “High differentiation efficiency” or “good / good differentiation efficiency” means that the proportion of CD34 / CD43 double positive cells, which are hematopoietic stem cells, is 5 to 15% or more in the differentiation of iPS cells into hematopoietic stem cells. It means that the ratio of CD4 / CD8 double positive cells or CD5 positive cells, which are immature T cells, is 10% or more or 50% or more, respectively, in the differentiation from hematopoietic stem cells to immature T cells; In the differentiation from immature T cells to mature T cells, it means that the proportion of cells in which all of the CD8 ⁇ chain, CD8 ⁇ chain, TCR ⁇ chain and TCR ⁇ chain are positive is 50% or more.
  • the regenerated T cells of the present invention preferably first differentiate the iPS cell clone into hematopoietic stem cells, then differentiate the hematopoietic stem cells into immature T cells, and finally the immature T cells into CD8 single positive T cells. It is produced by differentiating into mature T cells.
  • the "hematopoietic stem cell” is a cell capable of differentiating into blood cell lineage cells such as lymphocytes, eosinophils, neutrophils, basophils, erythrocytes and megakaryocytes. It should be noted that hematopoietic stem cells and hematopoietic progenitor cells (HPC) are not distinguished and refer to the same cells unless otherwise specified. Hematopoietic stem cells / progenitor cells are recognized, for example, by the fact that the surface antigens CD34 and CD43 are double positive.
  • the "immature T cell” is a T cell that expresses TCR ⁇ chain and ⁇ chain from the stage of T cell in which both TCR ⁇ chain and ⁇ chain are not expressed, and CD8 single via CD4 / CD8 double positive cell. Refers to T cells at each stage up to positive cells.
  • the immature T cells are preferably CD8 ⁇ chain / ⁇ chain double positive.
  • the "mature T cell” refers to a T cell that expresses a TCR ⁇ chain and a ⁇ chain and reaches a CD8 single positive cell via a CD4 / CD8 double positive cell.
  • CD8 ⁇ chain / ⁇ chain double positive is preferable.
  • Hematopoietic stem cells are preferably produced by culturing iPS cells in a culture medium supplemented with vitamin Cs.
  • vitamin Cs refers to L-ascorbic acid and its derivatives
  • L-ascorbic acid derivatives means those that are converted to vitamin C by an enzymatic reaction in the living body.
  • L-ascorbic acid includes, for example, vitamin C phosphate, ascorbic acid glucoside, ascorbic ethyl, vitamin C ester, ascorbyl tetrahexyldecanoate, ascorbic stearate and ascorbic acid-2 phosphate-6 palmitic acid.
  • the derivative of L-ascorbic acid is preferably vitamin C phosphate, and examples thereof include phosphate-L ascorbic acid salt such as sodium phosphate-L ascorbic acid or magnesium phosphate-L-ascorbic acid.
  • Vitamin Cs are contained, for example, in a culture solution at a concentration of 5 to 500 ⁇ g / mL.
  • the culture medium used for producing hematopoietic stem cells is not particularly limited, but can be prepared by using the culture medium used for culturing animal cells as the basal culture medium and adding vitamin C or the like to it.
  • the basal culture medium include Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and H12 culture medium.
  • IMDM Isove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • H12 culture medium H12 culture medium.
  • Examples include liquid, RPMI 1640 culture medium, Fischer's culture medium, Neurobasal Medium (Life Technologies), StemPro34 (Life Technologies) and a mixed culture medium thereof.
  • the culture broth may contain serum or may be serum-free.
  • the basal culture medium may be, for example, albumin, insulin, transferase, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothiolglycerol, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins. , Growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the culture medium used for the production of hematopoietic stem cells includes BMP4 (Bonemorphogenetic protein 4), VEGF (vascular endothelial growth factor), bFGF (basic fibroblast growth factor), SCF (stem cell factor), TPO (thrombopoietin), and FLT3L (FLT3L).
  • Cytokines selected from the group consisting of Flt3 ligand) may be further added. These concentrations are, for example, 1-100 ng / mL for BMP4, 1-100 ng / mL for VEGF, 1-100 ng / mL for bFGF, and 10-100 ng / mL for SCF.
  • TPO is 1 to 100 ng / mL
  • FLT3L is 1 to 100 ng / mL.
  • TGF ⁇ inhibitor may be added to the culture medium of hematopoietic stem cells.
  • TGF ⁇ inhibitor is a small molecule inhibitor that interferes with the signal transduction of the TGF ⁇ family, for example, SB431542 and SB202190 (RK Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline). , NPC30345, SD093, SD908 and SD208 (Scios), and LY2109761, LY364947 and LY580276 (Lilly Research Laboratories), and the concentration added to the culture solution is preferably 0.5 to 100 ⁇ M.
  • iPS cells are C3H10T1 / 2 (Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010) or heterologous stromal cells (Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2): It may be co-cultured with feeder cells such as 367-77).
  • the method for culturing iPS cells at the time of producing hematopoietic stem cells may be adhesive culture or suspension culture, but suspension culture is preferable.
  • iPS cells can be subjected to suspension culture after releasing colonies cultured to 80% confluence with respect to the dish used, dissociating them into single cells.
  • a method for isolating iPS cells for example, a method of physically isolating with a cell scraper or the like, a dissociation solution having protease activity and collagenase activity (for example, Accutase® and Accumax®), or An isolation method using a dissociation solution having collagenase activity can be mentioned.
  • Floating culture is to culture cells in a non-adherent state to the culture vessel.
  • the suspension culture is not particularly limited, but is a culture vessel that has not been artificially treated (for example, a coating treatment with an extracellular matrix or the like) for the purpose of improving adhesion to cells, or artificially suppresses adhesion. It can be carried out using a culture vessel which has been treated (for example, coated with polyhydroxyethyl methacrylate (po1y-HEMA) or a nonionic surfactant (Pluronic F-127, etc.)).
  • po1y-HEMA polyhydroxyethyl methacrylate
  • Pluronic F-127 nonionic surfactant
  • Hematopoietic stem cells can also be prepared from cyst-like structures (also referred to as iPS-sac) obtained by culturing iPS cells.
  • cyst-like structure also referred to as iPS-sac
  • the "cyst-like structure” is a three-dimensional sac-like (with space inside) structure derived from iPS cells, which is formed by an endothelial cell population or the like and contains hematopoietic stem cells inside. be.
  • the temperature conditions for culturing to produce hematopoietic stem cells from iPS cells are not particularly limited, but are, for example, about 37 ° C to about 42 ° C, preferably about 37 ° C to about 39 ° C. Further, the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of hematopoietic stem cells and the like.
  • the number of culture days is not particularly limited as long as hematopoietic stem cells can be obtained, but for example, at least 6 days or more, 7 days or more, 8 days or more, 9 days or more, 10 days or more, 11 days or more, 12 days or more, 13 days or more, Or 14 days or more, preferably 14 days.
  • the long culture period is not a problem in the production of hematopoietic stem cells.
  • the cells may be cultured under low oxygen conditions, and in one embodiment of the present invention, the low oxygen conditions include, for example, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5% or less. Oxygen concentration is mentioned.
  • CD4 / CD8 double positive T cells are T cells that are both positive for surface antigens CD4 and CD8 (CD8 + CD4 + ), and T cells are positive for surface antigens CD3 and CD45.
  • CD4 / CD8 double positive T cells can be identified as cells positive for CD4, CD8, CD3 and CD45.
  • CD4 / CD8 double positive T cells can be induced to differentiate into CD4 single positive cells or CD8 single positive cells.
  • CD4 / CD8 double positive T cells can be produced by a method comprising culturing hematopoietic stem cells in a culture medium supplemented with a p38 inhibitor and / or SDF-1.
  • P38 inhibitor is defined as a substance that inhibits the function of p38 protein (p38MAP kinase).
  • p38 inhibitors include, but are not limited to, chemical inhibitors of p38, dominant negative variants of p38, or nucleic acids encoding them.
  • Chemical inhibitors of p38 include SB203580 (4- (4-fluorophenyl) -2- (4-methylsulfonylphenyl) -5- (4-pyridyl) -1H-imidazole) and its derivatives, SB202190 (4-).
  • the p38 inhibitor is added to the culture medium, for example, in the range of about 1 ⁇ M to about 50 ⁇ M.
  • Dominant negative variants of p38 include p38T180A, which is a point mutation of threonine at position 180 located in the DNA binding region of p38 to alanine, and p38Y182F, which is a point mutation of tyrosine at position 182 of p38 to phenylalanine in humans and mice. Can be mentioned.
  • SDF-1 (Stromal cell-derived factor 1) is not only SDF-1 ⁇ or its mature form, but also isoforms such as SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ , SDF-1 ⁇ or SDF-1 ⁇ , or them. It may be a mature form of the above, or it may be a mixture of any proportions thereof and the like. Preferably SDF-1 ⁇ is used. SDF-1 may also be referred to as CXCL-12 or PBSF.
  • SDF-1 may be substituted, deleted and / or added with one or several amino acids in its amino acid sequence as long as it has activity as a chemokine, and similarly, sugar chains may be substituted or deleted. And / or may be added.
  • SDF-1 may be of a mammal, eg, a non-human mammal such as a monkey, sheep, cow, horse, pig, dog, cat, rabbit, rat, or mouse.
  • GenBank registration number: NP_954637 can be used as human SDF-1 ⁇
  • a protein registered with GenBank registration number: NP_000600 can be used as SDF-1 ⁇ .
  • SDF-1 a commercially available product may be used, a product purified from nature may be used, or a product manufactured by peptide synthesis or a genetic engineering method may be used. SDF-1 is added to the culture medium, for example, in the range of about 10 ng / mL to about 100 ng / mL.
  • the culture medium used for producing the CD4 / CD8 double positive T cells is not particularly limited, but the culture medium used for culturing animal cells is used as the basal culture medium, and p38 inhibitor and / or SDF-1 is more preferable. It can be prepared by adding vitamin Cs.
  • the types of vitamin C used in the production of CD4 / CD8 double positive T cells are as described above, for example, and the concentration of vitamin C is, for example, 5 to 200 ⁇ g / mL.
  • basal culture medium examples include Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and Ham. , RPMI 1640 culture medium, Fischer's Neurobasal Medium culture medium (Life Technologies), and a mixed culture solution thereof. Serum may be added to the culture broth, or serum-free.
  • IMDM Isove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham Ham.
  • RPMI 1640 culture medium Fischer's Neurobasal Medium culture medium (Life Technologies), and a mixed culture solution thereof. Serum may be added to the culture broth, or serum-free.
  • basal culture solutions include, for example, albumin, insulin, transferase, selenium, fatty acids, trace elements, 2-mercaptoethanol, thiolglycerols, lipids, amino acids, L-glutamine, non-essential amino acids, vitamins, growth factors. , Low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, and one or more substances selected from cytokines and the like.
  • Cytokines selected from the group consisting of SCF, TPO (thrombopoietin), FLT3L and IL-7 may be further added to the culture medium used for producing CD4 / CD8 double positive T cells. These concentrations are, for example, 10-100 ng / mL for SCF, 1O-200 ng / mL for TPO, 1-100 ng / mL for FLT3L, and 1-100 ng / mL for IL-7. Is.
  • Hematopoietic stem cells may be adherently cultured or suspension-cultured, but adherent culture is preferable.
  • the culture vessel may be coated and used.
  • coating agents include Matrigel (Niwa A, et al. PLoS One. 6 (7): e22261, 2011), collagen, gelatin, laminin, heparan sulfate proteoglycan, retronectin, Fc-DLL4 or entactin, and combinations thereof. Can be mentioned.
  • the culture temperature conditions for culturing hematopoietic stem cells for producing CD4 / CD8 double positive T cells are not particularly limited, but are preferably about 37 ° C to about 42 ° C, preferably about 37 ° C to about 39 ° C, for example. Is more preferable. Further, the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD4 / CD8 double positive T cells and the like. As long as CD4 / CD8 double positive T cells can be obtained, the number of culture days is not particularly limited, but for example, at least 10 days or more, 12 days or more, 14 days or more, 16 days or more, 18 days or more, 20 days or more, 22 days or more. , Or 23 days or more, preferably 23 days.
  • the obtained CD4 / CD8 double positive T cells may be isolated and used, or may be used as a cell population containing other cell types.
  • isolation methods well known to those of skill in the art can be used. For example, a method of labeling with an antibody against CD4, CD8, CD3 and / or CD45 and isolation using a flow cytometer, or a method of purification using an affinity column on which a desired antigen is immobilized can be mentioned.
  • CD8 single positive T cells that is, mature T cells, are cells (CD8 + CD4- ) positive for the surface antigen CD8 among T cells, and are also called cytotoxic T cells. Since T cells can be recognized by being positive for the surface antigens CD3 and CD45, CD8 single positive T cells can be identified as cells positive for CD8, CD3 and CD45 and negative for CD4. ..
  • CD8 single positive T cells can be produced by a method including a step of culturing CD4 / CD8 double positive T cells in a culture medium supplemented with a corticohormonal agent.
  • the corticosteroid agent is preferably a glucocorticoid or a derivative thereof, and examples thereof include cortisone acetate, hydrocortisone, fludrocortisone acetate, prednisolone, triamcinolone, methylprednisolone, dexamethasone, betamethasone, or vecromethasone propionate.
  • the corticosteroid agent is dexamethasone. Its concentration in the culture medium is, for example, 1 to 100 nM.
  • the culture medium used for producing CD8 single positive T cells is not particularly limited, but can be prepared by using the culture medium used for culturing animal cells as the basal culture medium and adding an corticohormonal agent to it.
  • the basal culture medium include Isove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) culture medium, Medium 199 culture medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) culture medium, ⁇ MEM culture medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) culture medium, and H12 culture medium.
  • IMDM Isove's Modified Dulbecco's Medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • H12 culture medium examples include liquid, RPMI 1640 culture medium, Fischer's Neurobasal Medium culture medium (Life Technologies), and a mixed culture medium thereof. Serum may be added to the culture broth, or serum-free.
  • the basal culture solution may be, for example, albumin, insulin, transferase, selenium, fatty acid, trace element, 2-mercaptoethanol, thiolglycerol, monothiolglycerol, lipid, amino acid, L-glutamine, non-essential amino acid, etc. It may also contain one or more substances selected from vitamins, growth factors, low molecular weight compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, cytokines and the like.
  • the culture medium used for producing CD8 single positive T cells preferably further contains anti-CD3 antibodies, vitamin Cs, or cytokines.
  • cytokine examples include IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 and the like.
  • the anti-CD3 antibody is not particularly limited as long as it is an antibody that specifically recognizes CD3, and examples thereof include an antibody produced from an OKT3 clone.
  • the concentration of the anti-CD3 antibody in the culture medium is, for example, 10 to 1000 ng / mL.
  • the vitamin Cs used for producing CD8 single positive T cells are, for example, those described above, and can be used under the same conditions as described above.
  • the concentration of cytokines used for the production of CD8 single positive T cells in the culture medium is, for example, 10 to 1000 U / mL for IL-2 and 1 to 100 ng / mL for IL-7.
  • the temperature conditions for culturing CD4 / CD8 double positive T cells for producing CD8 single positive T cells are not particularly limited, but are preferably about 37 ° C to about 42 ° C, preferably about 37 ° C to about 38 ° C, for example. About ° C is more preferable.
  • the culture period can be appropriately determined by those skilled in the art while monitoring the number of CD8 single positive T cells and the like. As long as CD8 single positive T cells can be obtained, the number of culture days is not particularly limited, but is, for example, at least 1 day or more, 2 days or more, 3 days or more, 4 days or more, or 5 days or more, preferably 3 days. ..
  • the cDNA encoding the TCR ⁇ chain and the ⁇ chain for each single cell.
  • the T cells collected from the subject are a T cell population having genetic diversity as a whole, but the antigen or peptide sequence recognized by the TCR of each T cell has been determined, and the antigen of each T cell has been determined. The specificity is different. It is preferable to prepare the cDNA for each single cell in order to select the TCR that is optimal for each tumor-related antigen, that is, highly responsive to each tumor-related antigen.
  • T cells obtained from the subject are preferably cultured and proliferated with the tumor-related antigen of interest.
  • a single cell may be isolated from a T cell population that responds to the tumor-related antigen used by a cell sorter or the like using an activation marker.
  • the activation marker cell surface CD137 is preferable.
  • Known techniques for isolating human T cells include, for example, flow cytometry using antibodies against T cell surface markers such as CD3 and CD137 and cell sorters. Gene cloning can be performed from the obtained single T cells using the PCR method to amplify the cDNAs encoding the TCR ⁇ chain and ⁇ chain, respectively.
  • MHC Dextramer® registered trademark
  • Single cell sorting with a cell sorter can be performed.
  • the MHC dextraner is a compound composed of a dextran polymer skeleton in which MHC and a fluorescent dye molecule are bound.
  • MHC tetramers may be used in place of the MHC dextramers.
  • the MHC tetramer is a complex of an antigenic peptide and an MHC molecule converted into a tetramer by biotin and avidin.
  • CD8-positive T cells specific for a tumor antigen obtained from peripheral blood or the like are cultured in the presence of the antigen and proliferated, and then CD3 / CD137 double positive cells are simply generated by a cell sorter. One cell can be sorted.
  • a cell population that binds to an MHC dexstramer that forms a complex with an antigenic peptide can be single-cell sorted by a cell sorter.
  • RNA can be extracted from the obtained single cell, and the TCR gene pair (TCR ⁇ chain gene and TCR ⁇ chain gene) can be isolated by the PCR method using the cDNA obtained by the reverse transcription reaction. Sequence analysis can be performed on isolated TCR gene pairs, and the type of tumor antigen-reactive T cells (TCR repertoire) and its frequency of appearance can be analyzed.
  • PCR fragments amplified using the isolated TCR cDNA as a template can be incorporated into a viral or non-viral vector (transposon vector) using, for example, the Gibson assembly system.
  • a gene in which an isolated TCR ⁇ chain gene and a TCR ⁇ chain gene are linked via a T2A sequence is bound to the downstream of the ubiquitin promoter, and further downstream to the IRES (internal ribosome entry site) sequence.
  • IRES internal ribosome entry site
  • a marker gene such as EGFR (EGFRt, truncated EGFR) excluding the ligand binding site and the intracellular domain or CD19 lacking the intracellular domain is ligated, and this construct is integrated into a viral vector or a non-viral vector.
  • a viral vector and a non-viral vector can be used, but a non-viral vector is preferable.
  • the non-viral vector the piggyBac® vector is preferable among the transposon vectors.
  • the transposon method is a next-generation gene transfer method that is cheaper and safer than the conventional viral vector method.
  • a method for introducing a cDNA pair encoding a TCR ⁇ chain and a ⁇ chain into the mature T cell differentiated from a T cell a method using a viral vector, a method using a non-viral vector, or replacement of TCR using a genome editing technique is used. Any of these can be adopted.
  • virus vector examples include viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus and Sendai virus, and animal cell expression plasmids, with retrovirus or lentivirus being preferred.
  • viral vectors such as lentivirus, retrovirus, adenovirus, adeno-associated virus, herpes virus and Sendai virus, and animal cell expression plasmids, with retrovirus or lentivirus being preferred.
  • a spin infection method or the like When a non-viral vector is used, the transposon method is preferable.
  • the CRISPR / Cas9 method, the CRISPR / MAD method and the CRISPR / CAS3 method may be used to replace the TCR using the genome editing technique.
  • Examples of the method for introducing a gene of a non-viral vector or the method for introducing a guide RNA and donor DNA for genome editing include a lipofection method, a liposome method, a calcium phosphate co-precipitation method, a DEAE dextran method, a microinjection method and an electroporation method. .. PCR products can also be introduced directly into cells without the use of vectors. It is preferable to use an electroporation method for cell transfer of a transposon vector or PCR product. As the electroporation device, the gene transfer device ExPERT® system (MaxCyte) is preferable.
  • the promoter used in the expression vector used when introducing the cDNA pair into the cell examples include EF1 ⁇ promoter, SR ⁇ promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV promoter, RSV promoter, HSV-TK promoter, ubiquitin promoter and the like. Can be mentioned. These promoters may be capable of controlling the expression of a gene inserted downstream of the promoter depending on the presence or absence of a drug such as tetracycline.
  • the expression vector can include an enhancer, a poly A addition signal, a selectable marker gene (for example, a neomycin resistance gene), an SV40 origin of replication, and the like.
  • the iPS cell clone into which the cDNA pair has been introduced, the hematopoietic stem cell differentiated from the iPS cell clone, the immature T cell differentiated from the hematopoietic stem cell, or the mature T cell differentiated from the immature T cell is the above-mentioned culture medium.
  • culture conditions such as culture solution composition and culture temperature, regenerated T cells expressing TCR consisting of ⁇ chain and ⁇ chain encoded by the cDNA pair can be obtained.
  • feeder cells are preferably autologous or allogeneic peripheral blood mononuclear cells.
  • Autologous means that the subject from which the peripheral blood mononuclear cells and the iPS cell clone are derived is the same, and “allogeneic” means that the peripheral blood mononuclear cells and the iPS cell clone are derived from. It means that the subjects who do this are different.
  • TCRV ⁇ analysis kit BECKMAN COULTER: Catalog No. IM-3497. Since marker genes such as EGFRt (truncated EGFR) and CD19t (truncated CD19) are incorporated into the vector, the expression of TCR ⁇ chain and ⁇ chain can be inferred by analyzing the expression of the marker gene.
  • the iPS cell clone, the hematopoietic stem cell, the immature T cell or the mature T cell may form a master cell bank after expansion culture.
  • master cell bank means that the iPS cell clone, the hematopoietic stem cell, the immature T cell or the mature T cell is dispensed into a separate cell storage container for each single pool of a single clone. It is an accumulation. Usually, it is preferable to proliferate the cells within a range that does not change the properties of the cells and dispense them into a plurality of cell storage containers.
  • the cells stored in the master cell bank are cells that are used as a starting material for introducing the TCR gene or CAR gene and producing regenerated T cells, and the required number of cells are produced from the master cell bank for each production of the regenerated T cells.
  • the cell storage container containing the cells can be taken out. Therefore, the regenerated T cells of the present invention can be repeatedly supplied with the same quality.
  • a master cell bank it is preferable to cryopreserve the cells dispensed into the cell storage container.
  • Methods of cryopreserving cells are well known to those of skill in the art. For example, a single clone of expanded-cultured cells is collected, washed with buffer or culture medium, the number of cells is counted, concentrated by centrifugation or the like, and frozen medium (for example, culture medium containing 10% DMSO). After suspending in, it can be cryopreserved at low temperature.
  • a master cell bank can be constructed by accumulating 200 to 1000 cell storage containers containing 1 ⁇ 10 6 to 10 7 cells per cell in a cell storage container stocker or the like.
  • the master cell bank of the present invention can be stored in any facility or storage that can be cryopreserved.
  • the storage temperature is not particularly limited as long as it is a temperature suitable for storing cells.
  • ⁇ 20 ° C., ⁇ 80 ° C. and ⁇ 120 to -196 ° C. are mentioned, but ⁇ 150 ° C. or lower is preferable.
  • the number of TCR pairs corresponding to tumor-related antigens is said to be 5 to 10 per epitope, and each TCR pair is predicted to have different susceptibility to point mutation variants of tumor-related antigens. There is. Therefore, for example, even when a point mutation occurs in a tumor-related antigen, there is a high possibility that there is a TCR capable of recognizing the epitope, and preparation of antigen-specific regenerated T cells for the point mutation variant is also possible. Can be done quickly.
  • TCRs that respond to those tumor-related antigens can be started from already acquired iPS cells having a high differentiation potential into T cells or differentiated cells derived from the iPS cells, regenerated T cells can be rapidly produced. It is possible.
  • T cells from the TCR acquisition source The T cells that are the source of the TCR pair corresponding to the tumor-related antigen are preferably collected from peripheral blood. If it is necessary to administer the tumor-related antigen to the subject in advance in order to cause tumor-related antigen-specific T cells to appear in the peripheral blood, collect the T cells from the peripheral blood after administering the tumor-related antigen to the subject. Is preferable. Examples of such tumor-related antigens include GPC3. On the other hand, if tumor-specific T cells are present in the peripheral blood even without administration of the tumor-related antigen, the tumor is transferred from the peripheral blood without administration of the tumor-related antigen, for example, using an MHC dextramer. T cells specific for the relevant antigen may be isolated. Examples of such tumor-related antigens include WT1, NYESO-1, and EBV antigens.
  • T cells collected from the subject's peripheral blood after or without administration of the tumor-related antigen to the subject are preferably in vitro in any case.
  • cell isolation using an activation marker can be performed. If the frequency of tumor-related antigen-specific T cells appearing in peripheral blood is extremely high, in vitro stimulation with the tumor-related antigen may not be performed.
  • T cells for obtaining a TCR pair can be collected in advance at any time independently of the treatment time of the regenerated T cell replacement therapy, the regenerated T cell replacement therapy can be started promptly. ..
  • the pharmaceutical composition containing the regenerated T cells of the present invention can be used for treating a cancer treatment target.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by a method commonly used in the field of pharmaceutical technology, for example, the method described in the Japanese Pharmacopoeia.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain a pharmaceutically acceptable additive. Examples of the additive include a cell culture solution, a physiological saline solution, an appropriate buffer solution (for example, a phosphoric acid-based buffer solution), and the like.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be produced by suspending regenerated T cells in a physiological saline solution, an appropriate buffer solution (for example, a phosphoric acid-based buffer solution), or the like. It is preferable to contain, for example, 1 ⁇ 10 7 or more cells as a single dose so that the desired therapeutic effect is exhibited. A more preferred cell content is 1 ⁇ 10 8 or more, more preferably 1 ⁇ 10 9 or more. The cell content can be appropriately adjusted in consideration of the sex, age, body weight, condition of the affected area, cell condition and the like of the administration subject.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain dimethyl sulfoxide (DMSO), serum albumin and the like for the purpose of protecting the cells.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • the pharmaceutical composition of the present invention contains other components (eg, carriers, excipients, disintegrants, buffers, emulsifiers, suspensions, soothing agents, stabilizers, preservatives, preservatives) that are acceptable for the formulation. , Physiological saline, etc.) may be contained.
  • the pharmaceutical composition containing the regenerated T cells of the present invention as an active ingredient can be cryopreserved.
  • the storage temperature is not particularly limited as long as it is a temperature suitable for storing cells.
  • ⁇ 20 ° C., ⁇ 80 ° C. and ⁇ 120 to -196 ° C. are mentioned, but ⁇ 150 ° C. or lower is preferable.
  • cells are preferably stored in suitable containers such as freezing vials and freezing bags. Procedures for minimizing the risk of cell damage during freezing and thawing of regenerated T cells are well known to those of skill in the art.
  • the T cells are recovered from the culture solution, washed with a buffer solution or a culture solution, the number of cells is counted, and then concentrated by centrifugation or the like to be concentrated in a frozen medium (for example,). After suspending in a culture medium containing 10% DMSO), it is stored at low temperature and cryopreserved.
  • Regenerated T cells may be stored as individual clones or as a mixture of each clone.
  • the pharmaceutical composition containing the regenerated T cells of the present invention contains, for example, 5 ⁇ 10 4 to 9 ⁇ 10 10 regenerated T cells per container such as a freezing vial and a freezing bag, but of the target cancer. It can be changed according to the type, administration target, administration route, and the like.
  • Examples of the route of administration of the pharmaceutical composition containing the regenerated T cells of the present invention include infusion, intratumoral injection, intraarterial injection, portal vein injection, intraperitoneal administration and the like.
  • the route of administration is not limited to these as long as the regenerated T cells, which are the active ingredients in the pharmaceutical composition of the present invention, are delivered to the affected area.
  • the administration schedule may be a single dose or multiple doses. As the period of the multiple administration, for example, a method of repeating the administration once every 2 to 4 weeks, a method of repeating the administration once every 6 months to 1 year, and the like can be adopted.
  • the sex, age, body weight, pathological condition, etc. of the target patient can be taken into consideration.
  • the pharmaceutical composition containing the regenerated T cells of the present invention is used for the prevention or treatment of cancer in a cancer patient, if the TCR on the regenerated T cells is allogeneic, the allo in the body of the cancer patient. In order to avoid the reaction, a pharmaceutical composition containing regenerated T cells introduced with TCR that does not show an allo reaction to normal cells of a cancer patient is used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is used for the prevention or treatment of cancer.
  • Cancers include ovarian cancer, hepatoblastoma, hepatocellular carcinoma, gastric cancer, esophageal cancer, pancreatic cancer, renal cell carcinoma, breast cancer, malignant melanoma, non-small cell lung cancer, cervical cancer, and glue. Examples include, but are not limited to, blastoma, prostate cancer, neuroblastoma, chronic lymphocytic leukemia, papillary thyroid cancer, colon cancer, and B-cell non-hodgkin lymphoma.
  • the administration time of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine is not limited.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine may be administered to the administration subject at the same time, or may be administered at different times.
  • the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine may be formulated separately, or may be a combination drug in which both are mixed.
  • the dose of the pharmaceutical composition and the cancer vaccine of the present invention may be the same as the dose clinically used, and can be appropriately selected depending on the disease, the subject of administration, the route of administration, the combination with the drug, and the like.
  • the administration form of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine is not particularly limited, and finally both the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine may be administered.
  • Such administration forms are, for example, (1) individual administration of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine with a time lag by the same route of administration, and (2) different of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine. Examples thereof include simultaneous administration by an administration route, and (3) individual administration of the pharmaceutical composition of the present invention and a cancer vaccine with different administration routes.
  • the following excellent effects can be obtained.
  • (1) The dose can be reduced as compared with the case where the pharmaceutical composition of the present invention or the cancer vaccine is administered alone.
  • a long treatment period can be set by administration of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine.
  • (3) The therapeutic effect can be sustained by administration of the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine, and (4) the anticancer effect can be achieved by the combined use with the pharmaceutical composition of the present invention and the cancer vaccine.
  • a synergistic effect in antitumor effect can be obtained.
  • cytotoxic T cells against GPC3 are isolated from the peripheral blood of a hepatoblastoma patient to whom a cancer peptide vaccine (for example, a cancer vaccine containing GPC3) has been administered, and used for T cell replacement therapy.
  • TCR can be prepared.
  • TCRs prepared in advance from others who are separate from the patients targeted for T cell replacement therapy are introduced during the production of non-T non-B cells or monocyte-derived autologous regenerated T cells of the plurality of patients. It can be a TCR.
  • the obtained regenerated T cells maintain antigen specificity for GPC3 and have antigen-specific cytotoxicity for cancer cells (tumors) expressing GPC3 in the plurality of patients.
  • the method of the present invention and the regenerated T cells produced by the method of the present invention can be used to obtain a pharmaceutical composition containing regenerated T cells that is effective against cancer.
  • FIG. 1 shows a manufacturing process of regenerated T cells of the present invention.
  • Peripheral blood mononuclear cells of a cancer patient (subject) treated by administration of tumor antigen X peptide (Fig. 1- (1')) were collected, and the TCR gene was collected from T cells that specifically responded to tumor antigen X. was isolated (Fig. 1- (2')).
  • a TCR gene expected to have a higher therapeutic effect was selected based on the frequency of appearance of the TCR gene and the tumor antigen-specific binding ability (FIG. 1- (3')).
  • TCR repertoire In order to obtain a sufficient therapeutic effect, it is important to acquire many types of TCR (TCR repertoire).
  • iPS cells were produced from non-T non-B cells or monocytes in the peripheral blood of the patient (FIGS. 1- (1) and (2)).
  • iPS cell clones having good differentiation efficiency from the obtained iPS cells to T cells were selected (Fig. 1- (3)). By this selection, it was confirmed that the variation in the induction efficiency to T cells due to the difference in iPS cell clones was remarkably reduced, and the robustness and efficiency of the production of regenerated T cells were improved.
  • the above-mentioned selected TCR gene group that reacts specifically with a tumor antigen is expressed in the iPS cell clone with the above-mentioned efficiency of differentiation into T cells (Fig. 1- (4)), and matures for each selected TCR gene. Differentiation and proliferation into T cells were performed (Fig. 1- (5)).
  • the mature T cells are tumor antigen-specific cytotoxic T cells and are regenerated T cells. These regenerated T cells are administered to cancer patients (Fig. 1- (6)).
  • a step of producing iPS cells (FIGS. 1- (1) to (3)) and a step of acquiring a TCR gene that reacts with tumor antigen X (FIGS. 1- (1') to (3'). )
  • FIGS. 1- (1') to (3'). Can be performed in parallel, so that these steps can be completed in a shorter period of time (about 55 days) as compared with the case where these steps are sequentially performed.
  • the tumor antigen X-specific TCR gene was isolated and the antigen-specific reactivity was verified (see the upper partial view of FIG. 2).
  • Peripheral blood mononuclear cells were collected from the peripheral blood of a cancer patient (subject) whose tumor antigen X-reactive T cells were amplified in the peripheral blood after peptide administration treatment for the tumor antigen was performed (Fig. 2- (1)). did.
  • Tumor antigen X peptide is added to the obtained peripheral blood mononuclear cells, and after amplification culture of CD8-positive cytotoxic T cells that react with tumor antigen X is performed, the activity of reacting with tumor antigen X by a cell sorter.
  • TCR gene pairs (TCR ⁇ chain gene and TCR ⁇ chain gene) are isolated from the isolated single cells by single cell PCR, sequence analysis is performed on the isolated TCR gene pairs, and types of tumor antigen X-reactive T cells are performed. (TCR antigen) and its frequency of appearance were analyzed (Fig. 2- (3)). The isolated TCR gene pair was expressed in a TCR gene-deficient T cell line incorporating a reporter gene to reconstruct the TCR gene complex (Fig. 2- (4)).
  • the reactivity (antigen-specific reactivity) between the reconstructed TCR gene complex and the cells expressing HLA presenting the tumor antigen X peptide was verified (FIG. 2- (5)). That is, the T cell line expressing the TCR gene pair and the HLA expressing the target tumor antigen X peptide are co-cultured, but the expressed TCR and the HLA presenting the tumor antigen X peptide are co-cultured. Upon antigen-specific binding, the TCR gene signal is activated and the reporter gene integrated downstream of the target gene promoter is expressed. Then, the reporter gene activity was measured, and the antigen-specific reactivity was verified by evaluating the binding of the tumor antigen-specific TCR.
  • TCR gene pairs showing specific reactivity to tumor antigen X are selected, and non-T non-B cells or monocyte-derived iPS cells (M), which will be described later, are selected.
  • M monocyte-derived iPS cells
  • TCR gene-introduced iPS cells and regenerated T cells was performed as follows (see the lower partial view of FIG. 2).
  • iPS cells were prepared from the peripheral blood mononuclear cells of the cancer patient (Fig. 2- (2'). ).
  • the M-iPS cells described in the figure are iPS cells that are not derived from T cells, and are cells that have not undergone gene rearrangement of the TCR gene.
  • M-iPS cell lines having good differentiation efficiency into T cells were selected (FIG. 2- (3')).
  • a tumor antigen X-specific TCR gene (both TCR ⁇ chain gene and TCR ⁇ chain gene, see Fig. 2- (3)) was introduced into the selected M-iPS cell line using a transposon (Fig.). 2- (6) and FIG. 3), M-iPS cells expressing the TCR gene using a cell sorter (MACSQuant Tyto® cell sorter, Miltenyi Biotec) using the expression of the marker molecule CD19 as an index.
  • the strain (TCR-iPS cell line) was selected.
  • hematopoietic stem progenitor cells were induced using the embryoid body method, and differentiation was induced into mature T cells via immature T cells by a stepwise differentiation induction method that mimics T cell development in vivo. ..
  • FIG. 4 shows the analysis results of the regenerated T cells using the cell surface antigen marker by the flow cytometer.
  • the expression of CD45 + TCR ⁇ + CD3 + CD4 - CD8 ⁇ + which is observed in mature cytotoxic T cells in vivo, was confirmed. It was also found that the CD8-positive cells specifically bind to the HLA fragment (Antigen-X binding) presenting the tumor antigen X peptide.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of telomeres (index of rejuvenation), which is a cell senescence marker, for regenerated T cells mediated by iPS cells of the present invention.
  • the iPS cells (C) prepared from the tumor antigen-specific T cells are about three times as long as the telomeres of the patient's peripheral blood mononuclear cells (A) and the tumor antigen-specific T cells (B) before regeneration.
  • the tumor antigen-specific regenerated T cells (D) of the present invention had about twice the telomere length, and recovery of the telomere length was confirmed in C and D. That is, in the regenerated T cells of the present invention, improvement of cell aging is suggested.
  • regenerated T cells mediated by iPS cells of the present invention For regenerated T cells mediated by iPS cells of the present invention, the expression of PD-1 and TIGIT molecules, which are one of the cell exhaustion markers related to immune checkpoints, was stained with anti-TIGIT antibody and anti-PD-1 antibody, and flow cytometer was used. was analyzed by. For comparison, pre-regeneration tumor antigen-specific T cells were also analyzed. The results are shown in FIG. It was confirmed that the regenerated T cells of the present invention had significantly reduced expression of PD-1 and TIGIT molecules as compared with the tumor antigen-specific T cells before regeneration. Therefore, it is suggested that the regenerated T cells of the present invention have high cytotoxic activity.
  • Cytokine production ability analysis which is an important index of cytotoxicity performance, was performed. Cytotoxic T cells (CD8 ⁇ chain / ⁇ chain double positive cells) and regenerated T cells of the present invention in peripheral blood mononuclear cells collected from healthy subjects were used as PMA (Phorbol 12-Myristate 13-Acetate) and ionomycin (Ionomycin). ) Stimulated and produced IL-2 and IFN- ⁇ amounts were compared. The results are shown in FIG. It was confirmed that the number of cells producing IL-2 and IFN ⁇ was significantly increased in the regenerated T cells of the present invention as compared with the cytotoxic T cells obtained from healthy subjects.
  • PMA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate
  • Ionomycin ionomycin
  • the antigen-specific cytotoxic activity of the regenerated T cells of the present invention was evaluated.
  • HLA-A24 expressing cell lines (target cells) were cultured in the presence or absence of antigen X peptide to prepare antigen X peptide expressing cells or antigen X peptide non-expressing cells, respectively.
  • the regenerated T cells of the present invention and these target cells were co-cultured, and the cytotoxic activity of the regenerated T cells with respect to the target cells was measured.
  • the cell number ratios of regenerated T cells to target cells during co-culture were 20: 1, 10: 1 and 5: 1. The results are shown in FIG.
  • the regenerated T cells of the present invention did not show cytotoxic activity against antigen X peptide non-expressing cells (open circles), but showed cytotoxic activity against antigen X peptide expressing cells (closed circles). The activity was enhanced in response to an increase in the number of regenerated T cells relative to the target cells.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated from peripheral blood collected from patients who had completed immunization with the GPC3 peptide using a mononuclear cell separation solution Lymphoprep®.
  • the obtained peripheral blood mononuclear cells were cultured in a culture medium containing an HLA-restricted GPC3 peptide having a matching HLA type for about 12 days.
  • Cells activated with the GPC3 peptide were fractionated using a cell sorter (MACSQuant Tyto® cell sorter, Miltenyi Biotec) as a CD3 / CD137 double positive cell population.
  • GPC3-responsive T cells activated and proliferated with the GPC3 peptide were stained with antibodies against the T cell marker CD3 and the T cell activation marker CD137, fractionated using a cell sorter, and single. It was a cell.
  • RNA was extracted from the obtained single cell, and T cell receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain cDNAs were isolated and amplified using the RT-PCR method.
  • T cell receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain cDNA pairs were obtained from a single cell of multiple GPC3-responsive T cells. The gene sequences of the obtained T cell receptor ⁇ chain and ⁇ chain were determined, and the TCR repertoire was analyzed.
  • iPS cell clone Mononuclear cells were isolated from peripheral blood collected from patients with hepatocellular carcinoma or hepatoblastoma before or after administration of the GPC3 peptide using a mononuclear cell separation solution Lymphoprep®. From the obtained mononuclear cells, CD19 / CD20-positive B cells and CD3 / CD4 / CD8-positive T cells were removed using FACS or MACS beads to obtain non-T non-B cells or monocytes.
  • Sendai virus (CytoTune® 2.0) and SV40Tag-encoded Sendai virus (CytoTune® 2.0) carrying Yamanaka 4 factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc) in the obtained non-T non-B cell or monocyte cell population.
  • the virus was infected with a MOI (multiplicity of infection) of 5 to 20.
  • the SV40 may be excluded.
  • the obtained iPS cells consist of a large number of iPS cell clones. Therefore, colony pickup was performed and cloned. All cloned iPS cells were cryopreserved. The cloned iPS cells were cultured in a differentiation medium for about 10 days to induce hematopoietic stem cells, and CD34 / CD43 double positive hematopoietic stem cells were isolated. The isolated hematopoietic stem cells were cultured for about 21 days on a plate coated with FcDLL4, which is a fusion protein of the DLL4 protein and the Fc region of immunoglobulin, to induce differentiation into T cells.
  • FcDLL4 is a fusion protein of the DLL4 protein and the Fc region of immunoglobulin
  • the frequency of immature cytotoxic T cells obtained after culturing for the above 21 days was verified by the CD8 ⁇ chain / ⁇ chain double positive rate, and the clone with the highest frequency of appearance of CD8 ⁇ chain / ⁇ chain double positive cells was selected.
  • the production of iPS cell clones is preferably completed by the time the immunization of the cancer patient (subject) with the GPC3 peptide is completed in order to rapidly perform T cell replacement therapy.
  • iPS cell clones with good differentiation efficiency into T cells are expanded and cultured in iPS cell maintenance medium for 2 weeks, then dispensed into a cell storage container and cryopreserved to construct a master cell bank. did.
  • T cell receptor ⁇ -chain and ⁇ -chain with confirmed GPC3 antigen specificity for iPS cell clones derived from non-T non-B cells or monocytes with good differentiation efficiency into T cells obtained in Example 3.
  • a piggyBac vector having a gene encoding the above was introduced using the electroporation method.
  • iPS cells expressing the target T cell receptor ⁇ chain and ⁇ chain were isolated by a cell sorter using the expression of the marker molecule CD19 as an index.
  • the isolated iPS cells were cultured in a differentiation medium for about 10 days to induce CD34 / CD43 double-positive hematopoietic stem cells, and isolated by a cell sorter.
  • the isolated blood stem cells were cultured on a plate coated with FcDLL4 for about 21 days to induce differentiation into T cells.
  • Immature T cells with double positive CD8 ⁇ chain / ⁇ chain obtained after the above 21-day culture were isolated and purified using a cell sorter. Immature T cells were then co-located as PHA (phytohemagglutinin) and feeder cells in the presence of peripheral blood mononuclear cells, in the presence of Retronectin® and anti-CD3 antibody, or in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. It was cultured and induced into mature cytotoxic T cells. These stimuli were given more than once. The performance of the obtained T cells was confirmed by the cytotoxic activity, IFN- ⁇ production and antigen binding ability of GPC3-specific target cells.
  • PHA phytohemagglutinin
  • TCR gene into mature T cells differentiated from iPS cell clones From the non-T non-B cell or monocyte-derived iPS cell clones obtained in Example 3 having good differentiation efficiency into T cells, to mature T cells differentiated via hematopoietic stem cells and immature T cells.
  • a gene (cDNA) encoding a GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain was introduced using the piggyBac system in the same manner as in Example 4.
  • FIG. 9 shows the results of analysis of the phenotype of mature T cells derived from gene-introduced iPS cells using a flow cytometer.
  • “No EP” is the analysis result of the mature T cell used for gene transfer and expressing the WT1 antigen-specific T cell receptor ⁇ chain ⁇ chain; “EGFP”.
  • EGFP enhanced green fluorescent protein
  • TCR-CD19 is a GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene, intracellular defective type.
  • the analysis result of the mature T cell into which the piggyBac vector incorporating the human CD19 gene and the transposon vector was introduced is shown.
  • TCR-CD19 mature T cells derived from iPS cells represented by "TCR-CD19"
  • TCR-CD19 in addition to the expression of the intracellular defective human CD19 gene, which is a tracer gene integrated into the CD3 gene and piggyBac vector, GPC3 antigen-specific T cell receptor Binding to the GPC3 peptide / HLA complex (GPC3-Dex) recognized by the ⁇ chain and ⁇ chain was detected. That is, the GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ expressed on the cells by introducing the GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene into mature T cells derived from iPS cells using the piggyBac system.
  • GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ expressed on the cells by introducing the GPC3 antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene into mature T cells derived from iPS cells using the piggyBac system.
  • the chain ⁇ chain functions as a molecule that recognizes the GPC3 peptide / HLA complex (GPC3-Dex). Therefore, a novel tumor-related antigen (neoantigen) and other tumor-related antigen-specific T cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain genes should be used as the T-cell receptor ⁇ -chain ⁇ -chain gene to be introduced into mature T cells derived from iPS cells. It was shown that mature T cells derived from iPS cells that recognize these antigens can be produced.
  • FIG. 10 shows a method for selecting iPS cell clones having high differentiation efficiency into T cells in the step of producing regenerated T cells from iPS cells reprogrammed with peripheral blood T cells.
  • Mononuclear cells are isolated from the peripheral blood of subjects infected with EBV (Epstein-Barr virus), and the isolated mononuclear cells are stimulated with the EBV antigen in vitro to obtain a CD8-positive T cell population that recognizes the EBV antigen. Isolated.
  • EBV Epstein-Barr virus
  • Yamanaka 4 factors (Oct3 / 4, Sox2, Klf4 and c-Myc) and SV40T antigen were introduced into the isolated CD8-positive T cell population using a Sendai virus vector to obtain an iPS cell population.
  • the iPS cell clones were separated from the obtained iPS cell population, the ability to differentiate into T cells was examined for each clone, and the iPS cell clones having high differentiation efficiency into T cells were selected.
  • T cells that recognize the EBV antigen are cells that are unlikely to cause an allo reaction even when allogeneic transplantation is performed.
  • iPS cell clones selected as cells having high differentiation efficiency into T cells, and regenerated T cells were performed.
  • the method for producing cells is shown.
  • the iPS cell clones derived from CD8-positive T cells that recognize EBV antigens and have high differentiation efficiency into T cells are ⁇ 2M genes and CIITA genes involved in the expression of MHC class I and MHC class II, and natural killer (NK) cells.
  • the PVR gene involved in the activation of NK cells and the Rag2 gene involved in the rearrangement of T cell receptors were deleted using CRISPR / Cas9, while ⁇ 2 ⁇ / binding peptide / HLA, which is an inhibitory ligand for NK cells.
  • -E fusion gene HLA-E *
  • HLA-E * was expressed to obtain iPS cells that were not attacked by host T cells and NK cells.
  • cells are expressed after in vivo administration by expressing a suicide gene such as drug-induced caspase-9 and / or a specific marker gene (EGFR (epidermal growth factor receptor), CD19, CD20, etc.). It can also be removed.
  • the regenerated T cells differentiated and proliferated from iPS cells are host T cells for producing regenerated T cells for cancer treatment, and a master cell bank may be constructed from the host T cells.
  • the host T cells can be used as a material for producing regenerated T cells into which a TCR gene or a CAR (chimeric antigen receptor) gene has been introduced. Since these host T cells are T cells that recognize the EBV antigen, they are unlikely to cause an allo reaction even if they are transferred into a living body.
  • "Host T cells” are used as starting materials for the production of prophylactic or therapeutic agents for cancers containing regenerated T cells as an active ingredient, although the cells themselves are not used to treat patients. Means T cells.
  • FIG. 12 shows a method for producing regenerated T cells that recognize cancer antigens from the host T cells.
  • T cell receptor ⁇ chains that recognize reconstituted EBV antigens by gene replacement by genome editing using CRISPR / Cas9 and T cells that recognize cancer antigens, respectively. It was replaced with a T2a-mediated conjugate of the receptor ⁇ chain and the T cell receptor ⁇ chain.
  • the T cell receptor ⁇ chain that recognizes the EBV antigen was removed by genome editing using CRISPR / Cas9.
  • FIG. 12 it was possible to produce regenerated T cells that recognize cancer antigens.
  • FIG. 13 collectively describes the methods shown in FIGS. 10 to 12.
  • Regenerated T cells iPS-T cells
  • iPS-T cells Regenerated T cells
  • peripheral blood T cells have been reprogrammed
  • T cells into which a TCR gene or CAR gene has been introduced.
  • Universal iPS cells have very low immunogenicity, so they do not cause rejection in patients with any type of MHC (Major Histocompatibility Complex).
  • Universal iPS cells can be produced by knocking out MHC class I or MHC class II molecules and expressing a ligand that suppresses NK cells.
  • a viral vector used for producing T cells used in conventional T cell replacement therapy or regeneration therapy may be used.
  • iPS-T cells as a starting material, it becomes possible to produce desired T cells as an active ingredient of a preventive or therapeutic agent for cancer in a short period of time.

Abstract

【課題】ｉＰＳ細胞クローンまたはｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、未熟Ｔ細胞もしくは成熟Ｔ細胞に対して抗原特異的Ｔ細胞受容体を導入することによる、再生Ｔ細胞を製造する方法の提供。 【解決手段】１：被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、２：被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、３：単一細胞ごとの前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および、４：工程３において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。

Description

ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法
　本発明は、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に由来するｉＰＳ細胞に対して、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から得られるＴ細胞受容体を導入し、抗原特異的な再生Ｔ細胞を製造する方法、前記方法により製造された再生Ｔ細胞、前記再生Ｔ細胞を有効成分とする、がんの予防または治療剤、前記再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物および前記医薬組成物を使用するがんの予防または治療方法に関する。
　Ｔ細胞は、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞に対する免疫応答において中心的な役割を果たしている。このため、Ｔ細胞の機能低下は、病原体感染やがんの発生に寄与すると考えられている。Ｔ細胞の機能低下に起因する疾患を有する患者に対するＴ細胞の補充療法または再生療法は、患者における疾患の病態改善や治療に極めて有効な手段となり得る。
　ヒトおよびマウスを用いた研究において、感染症またはがんに対してＴ細胞補充療法を行う場合、細菌もしくはウイルス等の外来病原体またはがん細胞等の異常な細胞が有する抗原を特異的に認識するＴ細胞を用いることにより、高い治療効果が得られることが知られている。一方で、Ｔ細胞を十分量確保することが難しいこと、またＴ細胞における増殖能の低下および標的細胞等の抗原に対する免疫反応の低下などのＴ細胞の疲弊化がＴ細胞補充療法における障害となっている。
　Ｔ細胞補充療法における上記の障害を克服するため、抗原特異的なＴ細胞から人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立し、増殖させた後、Ｔ細胞へ分化させた再生Ｔ細胞を用いるＴ細胞補充療法が提案されている。標的抗原を認識するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、ゲノムの遺伝子再構成により形成されるため、Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞には、初期化前のＴ細胞が持つＴＣＲ遺伝子が保存されている。したがって、ｉＰＳ細胞を製造するための原料として、標的抗原に対して特異的なＴ細胞を使用することにより、元のＴ細胞と同じ抗原特異性を示す再生Ｔ細胞を製造することが可能である（特許文献１および非特許文献１）。
　厳密な抗原特異性は、安全かつ効率的なＴ細胞補充療法に必要である。しかしながら、上記のようにＴ細胞からｉＰＳ細胞を経由して得られた再生Ｔ細胞において、元のＴ細胞と同じ遺伝子再構成パターンを有するＴ細胞の出現頻度は必ずしも高くないことが報告されている（特許文献２）。また、ヒトＴ細胞からｉＰＳ細胞を経由して得られたＣＤ８αβ再生Ｔ細胞が、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ段階でのＴＣＲα鎖遺伝子の追加的な再構成により、抗原特異性を失うことも報告されている（非特許文献２）。
ＷＯ２０１１／０９６４８２号パンフレット ＷＯ２０１３／１７６１９７号パンフレット
Nishimura T, et al. Generation of rejuvenated antigen-specific T cells by reprogramming to pluripotency and redifferentiation. Cell Stem Cell. 2013; 12:114-126. Minagawa A, et al. Enhancing T cell receptor stability in rejuvenated iPSC-derived T cells improves their use in cancer immunotherapy. Cell Stem Cell. 2018; 23: 850-858.
　ｉＰＳ細胞を介して製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）を用いるがん治療において、腫瘍細胞または腫瘍組織に存在する標的抗原を特異的に認識するｉＰＳ－Ｔ細胞を使用することは、がん治療におけるｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法の安全性および有効性を担保する上で重要である。また、がんの発症またはがんの再発が検出された場合、速やかにｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を開始することが、治療成績を向上させるために重要である。
本発明は、抗原特異的ＴＣＲを導入したｉＰＳ－Ｔ細胞を迅速に製造する方法および前記方法により製造されたｉＰＳ－Ｔ細胞を提供することを目的とする。さらに本発明は、前記方法により製造されたｉＰＳ－Ｔ細胞、前記ｉＰＳ－Ｔ細胞を有効成分とする、がんの予防または治療剤、前記ｉＰＳ－Ｔ細胞を含有する医薬組成物および前記医薬組成物を使用するがんの予防または治療方法を提供することを目的とする。
　最近の研究で、１つの抗原エピトープに対しても、複数のＴ細胞クローン（５～１０クローン）がそれぞれ異なるＴＣＲを用いて抗原を認識していることが明らかになっている。現時点では、患者から得られた細胞からｉＰＳ－Ｔ細胞を得るまでの過程において、抗原特異的なすべてのＴ細胞クローンを維持することは極めて難しい。ｉＰＳ－Ｔ細胞まで分化したクローンが、標的を傷害するのに最適なＴＣＲを有するＴ細胞クローンである可能性についても、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造するための細胞を採取する被験者の個体差またはｉＰＳ－Ｔ細胞の製造バッチによって影響を受ける。
　また現状では、患者から得られた細胞由来のｉＰＳ細胞クローンを用いてｉＰＳ－Ｔ細胞を製造する場合、その製造に要する期間は長期にわたる。ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を、それが必要な患者に速やかに提供するためには、製造期間の短縮が大きな課題となっている。
　本発明者らは、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から抗原特異性を持つ種々のＴＣＲプールを取得できること、非Ｔ非Ｂ細胞または単球から樹立したｉＰＳ細胞またはＴ細胞から樹立したｉＰＳ細胞にＴＣＲを導入することにより、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造することができること、予めＴ細胞への分化効率の良いｉＰＳ細胞クローンを選択することにより、再生Ｔ細胞の品質の均一化および製造期間の短縮ができること、同時に前記ＴＣＲプールの取得およびｉＰＳ細胞の樹立のタイミングを調整することにより、前記ｉＰＳ－Ｔ細胞の製造を迅速に行うことができること、ならびに前記ＴＣＲプールおよび前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞の起源が同一個体または別個体であってもよいことを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明の目的は、以下の発明により達成される。
　〔１〕
　（１）被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
　〔２〕
　（１）被験者から得られるＴ細胞を腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
　〔３〕
　（１）腫瘍関連抗原が投与された被験者より得られるＴ細胞を前記腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
　〔４〕
　工程（２）の実施が、工程（１）の実施に先行する、または工程（１）の実施と並行する、〔１〕～〔３〕のいずれかに記載の方法。
　〔５〕
　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
　〔６〕
　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（２）における被験者が、がんの予防または治療対象である、〔１〕～〔４〕のいずれかに記載の方法。
　〔７〕
　さらに、工程（４）において得られる前記ｃＤＮＡが導入されたＴ細胞から、工程（２）における被験者に由来する細胞に対してアロ反応を示さないＴ細胞を選別する工程を含む、〔６〕に記載の方法。
　〔８〕
　さらに、工程（１）で調製されたｃＤＮＡから、工程（２）における被験者に由来する細胞に対してアロ反応を誘導しないＴ細胞受容体をコードするｃＤＮＡを選別する工程を含む、〔６〕に記載の方法。
　〔９〕
　被験者に由来する前記細胞が、末梢血単核球である、〔７〕または〔８〕に記載の方法。
　〔１０〕
　前記腫瘍関連抗原が、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択される、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
　〔１１〕
　前記腫瘍関連抗原が、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ（配列番号１）、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶ（配列番号２）またはこれらの混合物である、〔１〕～〔９〕のいずれかに記載の方法。
　〔１２〕
　工程（３）において、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞への前記ｃＤＮＡの導入が、ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはゲノム編集技術を用いる、〔１〕～〔１１〕のいずれかに記載の方法。
　〔１３〕
　前記非ウイルスベクターが、トランスポゾンベクターである、〔１２〕に記載の方法。
　〔１４〕
　前記トランスポゾンベクターが、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ベクターである、〔１３〕に記載の方法。
　〔１５〕
　工程（４）において、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の、成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程が、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行われる、〔１〕～〔１４〕のいずれかに記載の方法。
　〔１６〕
　前記フィーダー細胞が、自家または他家の末梢血単核球である、〔１５〕に記載の方法。
　〔１７〕
　工程（２）における前記被験者が、肝細胞がん患者または肝芽腫患者である、〔１〕～〔１６〕のいずれかに記載の方法。
　〔１８〕
　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブである、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
　〔１９〕
　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、前記腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣテトラマーまたはＭＨＣデキストラマー（登録商標）と結合する、〔１〕～〔１７〕のいずれかに記載の方法。
　〔２０〕
　前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、〔１〕～〔１９〕のいずれかに記載の方法。
　〔２１〕
　前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、〔１〕～〔２０〕のいずれかに記載の方法。
　〔２２〕
　工程（２）において選別されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞を保存し、マスターセルバンクを構成する、〔１〕～〔２１〕のいずれか１項に記載の方法。
　〔２３〕
　前記保存が凍結保存である、〔２２〕に記載の方法。
　〔２４〕
　前記マスターセルバンクに保存された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞に対して、それぞれ工程（３）および（４）を行う、〔２２〕または〔２３〕に記載の方法。
　〔２５〕
　前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を含む、〔２２〕に記載のマスターセルバンク。
　〔２６〕
　〔１〕～〔２４〕のいずれかに記載の方法により製造された再生Ｔ細胞。
　〔２７〕
　〔２６〕に記載の再生Ｔ細胞を有効成分とする、がんの予防または治療剤。
　〔２８〕
　〔２６〕に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
　〔２９〕
　〔２８〕に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）の製造方法では、がん治療の対象となる被験者から採取した、Ｔ細胞およびＢ細胞が除去された末梢血単核球（非Ｔ非Ｂ細胞または単球）またはＴ細胞を初期化し、ｉＰＳ細胞を得た後、Ｔ細胞への分化効率が良いｉＰＳ細胞クローンを予め選別する。このため、治療に必要とされるタイミングに合わせて、治療に必要なｉＰＳ－Ｔ細胞を十分量確保することができる。また本発明の方法では、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞から誘導されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に対してＴＣＲを導入するため、これらの細胞をｉＰＳ－Ｔ細胞へ分化させた後、拡大培養した場合に、ＴＣＲ遺伝子の再構成が起きにくく、導入されたＴＣＲの抗原特異性が維持される。さらに、拡大培養に起因する疲弊化が少ないｉＰＳ－Ｔ細胞を製造することができる。さらに、ｉＰＳ－Ｔ細胞を製造する際には、Ｔ細胞への分化効率が良いｉＰＳ細胞クローンを選別して用いるため、ｉＰＳ－Ｔ細胞の製造バッチ間における収量および分化程度の変動、ならびに細胞を採取する被験者の個体差が、得られるｉＰＳ－Ｔ細胞の品質等におよぼす影響を最小にすることが可能となる。また抗原を認識し、標的を効率よく殺傷するＴＣＲを持つＴ細胞を、効率よく製造することが可能となる。
　本発明の方法によれば、ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製は、遺伝的多様性を有するＴ細胞集団から単一細胞ごとに行うため、多様な抗原特異性を持つｃＤＮＡ群を準備することができる。また、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞由来のｉＰＳ細胞クローンの作製および保存を、抗原特異的ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製に先行して、または前記ｃＤＮＡの調製と並行して行うため、これらを順次行う方法に比べて、ｉＰＳ－Ｔ細胞を短期間に製造することができる。このため、ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法を適用するがん治療において、治療対象のがん患者における腫瘍の抗原変化もしくは治療耐性の発現またはがんの再発に対して、発現している抗原に特異的なｉＰＳ－Ｔ細胞の準備を迅速に行うことが可能となる。
　本発明の方法によれば、ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製するために使用するＴ細胞を採取する被験者は、ｉＰＳ－Ｔ細胞補充療法による治療対象のがん患者である被験者と同一個体であってもよく、また互いに別個体であってもよい。このため、多様な抗原に対応するＴＣＲプールを作製することが可能となり、個々のがん患者に最適な抗原特異性を有するＴＣＲを選択することができる。
末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程の概略を示す図である。 末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程の詳細を示す図である。図２において、上段部分図は、腫瘍関連抗原Ｘ特異的ＴＣＲ遺伝子を単離する工程および抗原特異的反応性の検証を行う工程を示し、下段部分図は、ＴＣＲ遺伝子導入ｉＰＳ細胞を製造する工程および前記ｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程を示す。 トランスポゾンを使用して、ＴＣＲ遺伝子を導入する工程を示す図である。 ｉＰＳ細胞から誘導された再生Ｔ細胞（腫瘍関連抗原特異的ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞）の表現型を示す図である。 再生Ｔ細胞における細胞老化マーカーとして、テロメアを解析した結果を示す図である。 再生Ｔ細胞における細胞疲弊マーカーとして、ＰＤ－１およびＴＩＧＨＴ分子の発現を解析した結果を示す図である。 健常者の末梢血単核球中の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞）および再生Ｔ細胞において、ＰＭＡおよびイオノマイシンによる刺激により産生されるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ量を比較した図である。 ＨＬＡ－Ａ２４発現細胞株（標的細胞）に対する再生Ｔ細胞の抗原特異的な細胞傷害活性を示す図である。各ポイントは、平均値±標準偏差を示す。 ＧＰＣ３抗原特異的ＴＣＲ遺伝子を導入した、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を示す図である。 末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を説明する図である。 末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。 ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を説明する図である。 末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のｉＰＳ細胞から、再生Ｔ細胞を製造する工程の概略を示す図である。
〔Ｔ細胞〕
　本発明において、被験者から得られる「Ｔ細胞」とは、細胞表面にＴ細胞受容体（T cell receptor：ＴＣＲ）と呼ばれる抗原受容体を発現している細胞である。ＴＣＲには、α鎖およびβ鎖からなるヘテロ二量体と、γ鎖およびδ鎖からなるヘテロ二量体がある。α鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、αβ型Ｔ細胞と呼ばれ、またγ鎖およびδ鎖からなるＴＣＲを有するＴ細胞は、γδ型Ｔ細胞と呼ばれる。本発明の一態様において、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／αβ型Ｔ細胞が好ましいが、ＣＤ３／γδ型Ｔ細胞であってもよい。本発明におけるＴ細胞のＴＣＲは、遺伝子導入したものである。
　本発明において、「Ｔ細胞集団」とは、上記のＴ細胞であって、抗原を認識するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の遺伝子配列が全体として多様な細胞集団を指す。従って、生体から採取されたＴ細胞は、多様な抗原に対する特異性を有するＴ細胞集団である。生体内に存在するＴ細胞は、Ｔ前駆細胞が胸腺内で発生分化する際に、ＴＣＲ遺伝子のランダムな組み換えが生じることにより、個々のＴ細胞が異なるＴＣＲ遺伝子配列を有し、あらゆる抗原に対して免疫反応を引き起こすことが可能となっている。個々のＴ細胞が有するＴＣＲは、それぞれが特異的に認識する抗原またはペプチド配列により決定されているが、Ｔ細胞を集団として捉えることにより、そのＴ細胞集団が、多様な抗原を免疫対象とすることが理解できる。従って、生体から採取されたＴ細胞集団は、その意味で遺伝的多様性を有するＴ細胞集団である。
　本発明において、「腫瘍関連抗原」とは、腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原であって、腫瘍細胞で過剰発現しているタンパク質由来の抗原およびその変異体、腫瘍ウイルス由来抗原、ある種の分化抗原および遺伝子変異およびスプライス異常による新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）などである。本明細書においては、腫瘍関連抗原を腫瘍抗原と記載する場合もある。タンパク質抗原である場合には、これを断片化したペプチド（ペプチド断片）であってもよい。腫瘍に特異的または非特異的に発現する抗原としては、ＷＴ１、ＧＰＣ３、ＸＡＧＥ１、ＭＵＣ１、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ６、ＥＧＦＲｖIII、ＨＥＲ－２／ｎｅｕ、ＭＡＧＥ Ａ３、ＭＡＧＥ Ａ１、テロメラーゼ、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ２／４、ＰＳＣＡ、ＣＴＬＡ－４、ｇｐ１００、ＧＤ２、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、ＧＭ３、ｓＬｅ（ａ）、糖脂質Ｆ７７、メソテリン、ＰＤ－Ｌ１、ｔｒｐ１、ｔｒｐ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、ＣＤ３３、ｃ－Ｍｅｔ、ｐ５３、ｐ５３変異体、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＭＡ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、ＣＥＡ、ＰＳＡ、ＡＦＰ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐＣＡＭ、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、ＥｐｈＡ２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＯＹ－ＴＥＳ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、サバイビン、Ｒａｓ、Ｒａｓ変異体、ＥＲＧ、ｂｃｒ－ａｂｌ、ＸＢＰ１などが挙げられるが、これらに限定されない。ウイルス抗原としては、不活化ＨＢＶおよびＨＰＶ等の不活化ウイルス、ならびに各種ウイルス由来のタンパク質であるＥＢＶ ＬＭＰ１、ＥＢＶ ＬＭＰ２、ＥＢＮＡ（ＥＢＶ nuclear antigen）、ＨＰＶ Ｅ１、ＨＰＶ Ｅ２、ＨＰＶ Ｅ６、ＨＰＶ Ｅ７、ＨＢＶ　ＨＢｓ、ＨＴＬＶ－１ ＴａｘおよびＨＢＺ（ＨＴＬＶ－１ ｂＺＩＰ Ｆａｃｔｏｒ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の一態様において、腫瘍関連抗原は、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択することができる。
　本発明の一態様において、腫瘍関連抗原は、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶまたはこれらの混合物である。なお本発明において、アミノ酸は慣用的な１文字表記による略号で表示される。
　本発明において、「腫瘍関連抗原に対して反応性を有する」とは、Ｔ細胞が、抗原提示細胞上の主要組織適合抗原（major histocompatibility complex：ＭＨＣ）クラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドに、ＴＣＲを介して選択的に結合／接合して生じる反応をＴ細胞が有することを意味し、前記エピトープペプチド以外のものへのＴ細胞の結合／接合ではＴ細胞の反応が生じないことを指す。ＴＣＲを介して、ＭＨＣクラスIまたはクラスIIに提示された腫瘍関連抗原に由来するエピトープペプチドへの結合／接合により生じるＴ細胞の反応には、細胞傷害性、ＩＦＮ－γおよびグランザイムの産生、Ｔ細胞活性化マーカーの発現、ならびにＮＦ－ＡＴ等の転写因子の活性化が挙げられる。
　本発明において、Ｔ細胞は、がん患者また非がん患者である被験者から採取される。Ｔ細胞が採取される被験者は、がんワクチンを投与されたことがあるか、現在投与されているか、または今後投与される予定のがん患者であってもよく、またがんワクチンが投与されない非がん患者であってもよい。投与されるがんワクチンは、１種類またはそれ以上が投与されてもよい。がんワクチンとは、がんもしくは腫瘍特異的タンパク質またはペプチドであって、がんまたは前記腫瘍関連抗原に由来し、がんまたは腫瘍特異的免疫応答を誘導するためのワクチン抗原を含む組成物である。通常、がんワクチンは、ワクチン抗原が誘導する特異的免疫応答を増強するためのアジュバントを含んでいる。Ｔ細胞は、αβＴ細胞が好ましい。Ｔ細胞の採取源としては、侵襲性が低いことから末梢血が好ましいが、それに限定されない。その他の好ましい採取源として、がん組織もしくは腫瘍組織、リンパ節もしくはその他の組織もしくは臓器、または血液、臍帯血、リンパ液、組織液（組織間液、細胞間液および間質液）、体腔液（腹水、胸水、心嚢液、脳脊髄液、関節液および眼房水）等の体内のすべての採取源が挙げられる。本発明の一態様において、好ましいＴ細胞は、腫瘍組織由来Ｔ細胞である。腫瘍組織由来Ｔ細胞は、通常、腫瘍浸潤Ｔ細胞である。
　被験者ががん患者である場合、前記がん患者のがんは、卵巣がん、肝芽腫、肝細胞がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がんまたはＢ細胞非ホジキンリンパ腫から選ばれる。前記がんは、好ましくは肝細胞がんまたは肝芽腫である。
〔ｉＰＳ細胞クローン〕
　本発明において、ｉＰＳ細胞は、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞を初期化して作製することが好ましいが、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に限定されるわけではない。「非Ｔ非Ｂ細胞」とは、Ｔ細胞として分類されず、かつＢ細胞とも分類されない単核球を意味する。本発明において、非Ｔ非Ｂ細胞または単球は、被験者の末梢血単核球として採取した後、単核球に含まれるＴ細胞およびＢ細胞を除去することにより調製することができる。末梢血単核球は、ヒト全血から単核球分離溶液により単離することができる。単核球分離溶液としては、例えばLymphoprep（登録商標）が挙げられる。単核球よりＢ細胞およびＴ細胞を除去するためには、Ｂ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２またはＢ細胞受容体、およびＴ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４またはＣＤ８に対する抗体を利用して、例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。Ｔ細胞は、ヒト全血から単核球分離溶液により単離することができる。単核球分離溶液としては、例えばLymphoprep（登録商標）が挙げられる。Ｔ細胞の精製は、Ｔ細胞の持つ表面抗原であるＣＤ３、ＣＤ４もしくはＣＤ８またはＴ細胞受容体を利用して行うことができる。例えばフローサイトメトリーまたはＭＡＣＳ（登録商標）ビーズなどの磁気ビーズを使用してもよい。
　ｉＰＳ細胞の製造方法は当該分野で公知である。本発明において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に細胞初期化因子を導入することにより誘導することができる。細胞初期化因子としては、例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７、ｋｌｆ４、ｋｌｆ２、ｃ－Ｍｙｃ、Ｎ－Ｍｙｃ、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、Ｆｂｘ１５、ＥＲａｓ、ＥＣＡＴ１５－２、Ｔｃｌ１、β－ｃａｔｅｎｉｎ、Ｌｉｎ２８ｂ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｅｓｒｒｂ、Ｎｒ５ａ２、Ｔｂｘ３およびＧｌｉｓ１等の遺伝子または遺伝子産物が挙げられる。これらの細胞初期化因子は、単独で用いてもよく、また組み合わせて用いてもよい。これらの細胞初期化因子の中で、効率良くｉＰＳ細胞を樹立できるという観点からは、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ（いわゆる山中４因子）を、前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することが好ましい。
　前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞への細胞初期化因子を導入する方法としては特に制限はなく、当該分野で公知の方法を採用することができる。例えば、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記非Ｔ非Ｂ細胞または単球に導入する場合においては、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子（例えばｃＤＮＡ）を、非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞内で機能するプロモーターを含む発現ベクターに挿入し、前記発現ベクターを、感染、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法またはエレクトロポレーション法により非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することができる。前記細胞初期化因子がタンパク質の形態にあって、前記タンパク質を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合においては、タンパク質導入試薬を用いる方法、タンパク質導入ドメイン融合タンパク質を用いる方法、エレクトロポレーション法およびマイクロインジェクション法が挙げられる。前記細胞初期化因子がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態にあって、前記ｍＲＮＡを前記非Ｔ非Ｂ細胞または単球に導入する場合においては、ｍＲＮＡ導入試薬を用いる方法および培養液に添加する方法が挙げられる。
　感染による遺伝子導入に用いる発現ベクターとしては、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、センダイウイルス等のウイルスベクター、動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、挿入変異が生じにくく、また遺伝子導入効率が高く、導入される遺伝子のコピー数も多いという観点から、センダイウイルスを用いて、前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を前記非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入することが好ましい。
　前記細胞初期化因子をコードする遺伝子を非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーター、ユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、前記プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。
　非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞を初期化して得られたｉＰＳ細胞の培養に用いられる培養液としては、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにｉＰＳ細胞の未分化能を維持するためのサイトカイン類を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer'培養液、Neurobasal Medium (ライフテクノロジーズ社)、StemFit（登録商標）AK03N（味の素ヘルシーサプライ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。サイトカイン類としては、好ましくは、bFGFが挙げられ、培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100μg/mL（好ましくは50μg/mL）である。
　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、接着培養が好ましい。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等により物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性を有する解離溶液、コラゲナーゼ活性を有する解離溶液、またはプロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等）を用いた単離方法が挙げられる。
　本発明の一態様において、ｉＰＳ細胞は、好ましくは、１×１０３～１×１０４ cells/cm2、１×１０４～１×１０５ cells/cm2または１×１０５～１×１０６ cells/cm2の細胞密度に到達した場合に、別の培養器に継代される。継代の回数は、必要な量のｉＰＳ細胞が得られれば何回でもよく、好ましくは、１～５回または５～１０回である。
　製造したｉＰＳ細胞は多数のｉＰＳ細胞クローンからなる。後述するが、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別するために、コロニーピックアップ法によりｉＰＳ細胞のクローン化を行うことが好ましい。コロニーピックアップ法としては、特に制限はされないが、顕微鏡下にピペットマンを用いる方法、限界希釈法および全自動コロニーピッカーを用いた方法等が用いられる。得られたｉＰＳ細胞クローンは、拡大培養後、マスターセルバンクを構成してもよい。前記ｉＰＳ細胞クローンにより構成される「マスターセルバンク」とは、単一のｉＰＳ細胞クローンの単一プールごとに、独立した細胞保存容器に分注して集積したものである。前記マスターセルバンクでは、ｉＰＳ細胞クローンを凍結保存することが好ましい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。例えば、培養したｉＰＳ細胞クローンを回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10％ DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存することができる。本発明のマスターセルバンクは、凍結保存ができる任意の施設または貯蔵庫に保管することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。
　「分化効率」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞、造血幹細胞から未熟Ｔ細胞および未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への各分化段階において、全生存細胞におけるそれぞれ造血幹細胞、未熟Ｔ細胞および成熟Ｔ細胞の存在割合を指す。各分化段階における分化細胞の同定は、表面マーカーのＦＡＣＳ解析により行うことができる。造血幹細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合として、未熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合として、また成熟Ｔ細胞への分化効率は、全生存細胞におけるＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合として示される。
　「分化効率が高い」または「分化効率が良い／良好」とは、ｉＰＳ細胞から造血幹細胞への分化において、造血幹細胞であるＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ細胞の割合が５～１５％またはそれ以上であることを指し；造血幹細胞から未熟Ｔ細胞への分化において、未熟Ｔ細胞であるＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞の割合またはＣＤ５ポジティブ細胞の割合が、それぞれ１０％以上または５０％以上であることを指し；未熟Ｔ細胞から成熟Ｔ細胞への分化において、ＣＤ８α鎖、ＣＤ８β鎖、ＴＣＲα鎖およびＴＣＲβ鎖のすべてがポジティブである細胞の割合が５０％以上であることを指す。
　本発明の再生Ｔ細胞は、好ましくは、前記ｉＰＳ細胞クローンを、先ず造血幹細胞に分化させ、次に前記造血幹細胞を未熟Ｔ細胞に分化させ、最終的に、未熟Ｔ細胞をＣＤ８シングルポジティブＴ細胞である成熟Ｔ細胞に分化させることにより製造する。
　本発明において、「造血幹細胞」とは、リンパ球、好酸球、好中球、好塩基球、赤血球および巨核球等の血球系細胞に分化可能な細胞である。なお造血幹細胞と造血前駆細胞（hematopoietic progenitor cells、HPC）とは区別されるものではなく、特に断らない限り同一の細胞を指す。造血幹細胞／前駆細胞は、例えば、表面抗原であるＣＤ３４およびＣＤ４３がダブルポジティブであることによって認識される。
本発明において、「未熟Ｔ細胞」とは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の両方ともが発現していないＴ細胞の段階から、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現し、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を経てＣＤ８シングルポジティブ細胞までの各段階のＴ細胞を指す。未熟Ｔ細胞としては、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブであることが好ましい。
　本発明において、「成熟Ｔ細胞」とは、ＴＣＲα鎖およびβ鎖を発現し、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブ細胞を経てＣＤ８シングルポジティブ細胞に至ったＴ細胞を指す。成熟Ｔ細胞としては、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブであることが好ましい。
〔造血幹細胞および未熟Ｔ細胞の培養〕
　造血幹細胞は、好ましくは、ビタミンC類を添加した培養液中でｉＰＳ細胞を培養することによって製造される。ここで、「ビタミンC類」とは、L-アスコルビン酸およびその誘導体を指し、「L-アスコルビン酸誘導体」とは、生体内で酵素反応によりビタミンCに変換されるものを意味する。L-アスコルビン酸の誘導体としては、例えば、リン酸ビタミンC、アスコルビン酸グルコシド、アスコルビルエチル、ビタミンCエステル、テトラヘキシルデカン酸アスコルビル、ステアリン酸アスコルビルおよびアスコルビン酸-2リン酸-6パルミチン酸が挙げられる。L-アスコルビン酸の誘導体は、好ましくは、リン酸ビタミンCであり、例えば、リン酸-Lアスコルビン酸ナトリウムまたはリン酸-L-アスコルビン酸マグネシウム等のリン酸-Lアスコルビン酸塩が挙げられる。ビタミンC類は、例えば、培養液において、5～500μg/mLの濃度で含有される。
　造血幹細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにビタミンC類等を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's培養液、Neurobasal Medium（ライフテクノロジーズ社）、StemPro34（ライフテクノロジーズ社）およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清が含有されていてもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。
　造血幹細胞の製造に用いる培養液には、BMP4（Bone morphogenetic protein 4）、VEGF（vascular endothelial growth factor）、bFGF（basic fibroblast growth factor）、SCF（stem cell factor）、TPO（トロンボポエチン）、およびFLT3L（Flt3 ligand）からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、BMP4は1～100 ng/mLであり、VEGFは1～100 ng/mLであり、bFGFは1～100 ng/mLであり、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1～100 ng/mLであり、またFLT3Lは1～100 ng/mLである。
　造血幹細胞の培養液には、TGFβ阻害剤を培養液に添加してもよい。「TGFβ阻害剤」とは、TGFβファミリーのシグナル伝達に干渉する低分子阻害剤であり、例えば、SB431542およびSB202190（R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2: 20 (2003))、SB505124 (GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908およびSD208 (Scios)、ならびにLY2109761、LY364947およびLY580276（Lilly Research Laboratories）が挙げられ、培養液への添加濃度は、好ましくは0.5～100μMである。
　ｉＰＳ細胞は、C3H10T1/2（Takayama N., et al. J Exp Med. 2817-2830, 2010）、または異種由来のストローマ細胞（Niwa A et al. J Ce11 Physiol. 2009 Nov; 221 (2) :367-77）等のフィーダー細胞と共培養してもよい。
　造血幹細胞の製造時のｉＰＳ細胞の培養方法は、接着培養または浮遊培養であってもよいが、浮遊培養が好ましい。例えば、ｉＰＳ細胞は、使用したディッシュに対して80％コンフルエントになるまで培養されたコロニーを遊離し、単細胞に解離させたのちに、浮遊培養に供することができる。ｉＰＳ細胞の単離方法としては、例えば、セルスクレーパー等で物理的に単離する方法、プロテアーゼ活性およびコラゲナーゼ活性を有する解離溶液（例えば、Accutase（登録商標）およびAccumax（登録商標）等)、またはコラゲナーゼ活性を有する解離溶液を用いた単離方法が挙げられる。
　浮遊培養とは、細胞を培養容器に対して非接着の状態で培養することである。浮遊培養は、特に限定はされないが、細胞との接着性を向上させる目的で人工的な処理（例えば、細胞外マトリックス等によるコーティング処理）が施されていない培養容器、または人工的に接着を抑制する処理（例えば、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（po1y-HEMA）もしくは非イオン性の界面活性ポリオール（Pluronic F-127等）によるコーティング処理）した培養容器を使用して行うことができる。浮遊培養の際には、胚様体（EB）を形成させて培養することが好ましい。胚様体を浮遊培養して造血幹細胞を得た場合は、これを単細胞に解離させたのちに、接着培養を行うことが好ましい。
　造血幹細胞は、ｉＰＳ細胞を培養することにより得られる嚢胞様構造物（iPS-sacとも称する）から調製することもできる。ここで、「嚢胞様構造物」とは、ｉＰＳ細胞由来の立体的な嚢状（内部に空間を伴うもの）構造体で、内皮細胞集団等で形成され、内部に造血幹細胞を含む構造体である。
　ｉＰＳ細胞から造血幹細胞を製造するために培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度、好ましくは約37℃～約39℃程度である。また、培養期間については、当業者であれば造血幹細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。造血幹細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも6日以上、7日以上、8日以上、9日以上、10日以上、11日以上、12日以上、13日以上、または14日以上であり、好ましくは14日である。培養期間が長いことについては、造血幹細胞の製造において問題とされない。また、低酸素条件で培養してもよく、本発明の一態様において、低酸素条件としては、例えば、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％またはそれら未満の酸素濃度が挙げられる。
　「ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞」は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ４およびＣＤ８が共に陽性である細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ４＋）であり、Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であることによって認識できることから、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５が陽性である細胞として同定することができる。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、誘導によってＣＤ４シングルポジティブ細胞またはＣＤ８シングルポジティブ細胞へと分化させることができる。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、p38阻害剤および／またはSDF-1を添加した培養液中で、造血幹細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
　「p38阻害剤」とは、p38タンパク質（p38MAPキナーゼ）の機能を阻害する物質として定義される。p38阻害剤は、例えば、p38の化学的阻害剤、p38のドミナントネガティブ変異体、またはそれをコードする核酸が挙げられるが、これらに限定されない。
　p38の化学的阻害剤としては、SB203580(4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-メチルスルホニルフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB202190 (4-(4-フルオロフェニル)-2-(4-ヒドロキシフェニル)-5-(4-ピリジル)-1H-イミダゾール)およびその誘導体、SB239063 (trans-4-[4-(4-フルオロフェニル)-5-(2-メトキシ-4-ピリミジニル)-1H-イミダゾール-1-イル]シクロヘキサノール)およびその誘導体、SB220025およびその誘導体、PD169316、RPR200765A、AMG-548、BIRB-796、SCl0-469、SCIO-323、VX-702、またはFR167653が挙げられるが、これらに限定されない。これらの化合物は市販されており、例えば、SB203580、SB202190、SC239063、SB220025およびPD169316についてはCalbiochem社、SCl0-469およびSCIO-323についてはScios社等から入手可能である。p38阻害剤は、例えば、約1μM～約50μMの範囲で培養液に添加される。
　p38のドミナントネガティブ変異体としては、p38のDNA結合領域に位置する180位のスレオニンをアラニンに点変異させたp38T180A、ならびにヒトおよびマウスにおけるp38の182位のチロシンをフェニルアラニンに点変異させたp38Y182F等が挙げられる。
　SDF-1（Stromal cell-derived factor 1）は、SDF-1αまたはその成熟型だけでなく、SDF-1β、SDF-1γ、SDF-1δ、SDF-1εもしくはSDF-1φ等のアイソフォーム、またはそれらの成熟型であってもよく、もしくはこれらの任意の割合の混合物等であってもよい。好ましくは、SDF-1αが使用される。なお、SDF-1は、CXCL-12またはPBSFと称される場合もある。
　SDF-1は、そのケモカインとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の1または数個のアミノ酸が置換、欠失および／または付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失および／または付加されていてもよい。SDF-1において少なくとも４つのシステイン残基（ヒトSDF-1αの場合、Cys30、Cys32、Cys55およびCys71）が保持されており、かつ天然体のアミノ酸配列に対して90％以上の同一性を有する範囲であれば、アミノ酸変異が許容される。SDF-1は、哺乳動物、例えば、ヒト、例えば、サル、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウス等の非ヒト哺乳動物のものであってもよい。例えば、ヒトのSDF-1αとして、GenBank登録番号:NP_954637で登録されているタンパク質が使用でき、SDF-1βとして、GenBank登録番号:NP_000600で登録されているタンパク質が使用できる。
　SDF-1は、市販のものを使用してもよいし、天然から精製されたものを使用してもよいし、またはペプチド合成や遺伝子工学的手法によって製造されたものを使用してもよい。SDF-1は、例えば、約10 ng/mL～約100 ng/mLの範囲で培養液に添加される。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これにp38阻害剤および／またはSDF-1、さらに好ましくはビタミンC類を添加して調製することができる。なお、CD4／CD8ダブルポジティブＴ細胞の製造において使用されるビタミンC類の種類は、例えば上述のとおりであるが、ビタミンC類の濃度は、例えば、5～200μg/mLである。基礎培養液としては、例えばIscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液には、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、脂質、アミノ酸、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる1つ以上の物質も含有し得る。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液には、SCF、TPO（トロンボポエチン）、FLT3LおよびIL-7からなる群より選ばれるサイトカインをさらに添加してもよい。これらの濃度は、例えば、SCFは10～100 ng/mLであり、TPOは1O～200 ng/mLであり、FLT3Lは1～100 ng/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。
　造血幹細胞は、接着培養しても、または浮遊培養してもよいが、接着培養することが好ましい。接着培養の場合、培養容器をコーティングして用いてもよい。例えば、コーティング剤としては、マトリゲル（Niwa A, et al. PLoS One. 6(7):e22261, 2011）、コラーゲン、ゼラチン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、レトロネクチン、Fc-DLL4またはエンタクチン、およびこれらの組み合わせが挙げられる。
　ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を製造するために造血幹細胞を培養する際の培養温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約39℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であれば、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも10日以上、12日以上、14日以上、16日以上、18日以上、20日以上、22日以上、または23日以上であり、好ましくは23日である。
　得られたＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞は、単離して用いても良く、他の細胞種が含有される細胞集団として用いても良い。単離する場合、当業者に周知の方法を用いることができる。例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３および／またはＣＤ４５に対する抗体により標識し、フローサイトメーターを用いて単離する方法、または所望の抗原を固定化したアフィニティカラム等を用いて精製する方法が挙げられる。
　「ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞」、すなわち成熟Ｔ細胞は、Ｔ細胞のうち、表面抗原のＣＤ８が陽性である細胞（ＣＤ８＋ ＣＤ４－）であり、細胞傷害性Ｔ細胞とも呼ばれる。Ｔ細胞は、表面抗原であるＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であることによって認識できることから、ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、ＣＤ８、ＣＤ３およびＣＤ４５が陽性であり、ＣＤ４が陰性である細胞として同定することができる。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞は、副腎皮質ホルモン剤を添加した培養液中で、ＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する工程を含む方法によって製造することができる。
　副腎皮質ホルモン剤は、好ましくは、糖質コルチコイドまたはその誘導体であり、例えば、酢酸コルチゾン、ヒドロコルチゾン、酢酸フルドロコルチゾン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、またはプロピオン酸ベクロメタゾンが挙げられる。好ましくは、副腎皮質ホルモン剤は、デキサメタゾンである。培養液中におけるその濃度は、例えば、1～100 nMである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、特に限定されないが、動物細胞の培養に用いられる培養液を基礎培養液とし、これに副腎皮質ホルモン剤を添加して調製することができる。基礎培養液としては、例えば、Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）培養液、Medium 199培養液、Eagle's Minimum Essential Medium（EMEM）培養液、αMEM培養液、Dulbecco's modified Eagle's Medium（DMEM）培養液、Ham's F12培養液、RPMI 1640培養液、Fischer's　Neurobasal Medium培養液（ライフテクノロジーズ社）、およびこれらの混合培養液が挙げられる。培養液には、血清を添加してもよく、または無血清であってもよい。必要に応じて、基礎培養液は、例えば、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、セレン、脂肪酸、微量元素、2-メルカプトエタノール、チオールグリセロール、モノチオールグリセロール、脂質、アミノ殿、L-グルタミン、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類、およびサイトカイン等から選ばれる１つ以上の物質も含有し得る。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いる培養液は、抗ＣＤ３抗体、ビタミンC類、またはサイトカインをさらに含有することが好ましい。当該サイトカインとしては、例えば、IL-2、IL-7、IL-15およびIL-21等が挙げられる。
　抗ＣＤ３抗体としては、ＣＤ３を特異的に認識する抗体であれば特に限定されないが、例えば、OKT3クローンから産生される抗体が挙げられる。抗ＣＤ３抗体の培養液中における濃度は、例えば、10～1000 ng/mLである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるビタミンC類は、例えば上述したものであり、上述と同じ条件で用いることができる。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の製造に用いるサイトカインの培養液中における濃度は、例えば、IL-2は10～1000 U/mLであり、IL-7は1～100 ng/mLである。
　ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞を製造するためのＣＤ４／ＣＤ８ダブルポジティブＴ細胞を培養する際の温度条件は、特に限定されないが、例えば、約37℃～約42℃程度が好ましく、約37℃～約38℃程度がより好ましい。また、培養期間については、当業者であればＣＤ８シングルポジティブＴ細胞の細胞数等をモニターしながら、適宜決定することが可能である。ＣＤ８シングルポジティブＴ細胞が得られる限り、培養日数は特に限定されないが、例えば、少なくとも1日以上、2日以上、3日以上、4日以上、または5日以上であり、好ましくは3日である。
〔ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製〕
　本発明において、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡの調製は、単一細胞ごとに行うことが好ましい。被験者から採取されるＴ細胞は、全体として遺伝的多様性を有するＴ細胞集団であるが、個々のＴ細胞が有するＴＣＲが認識する抗原またはペプチド配列が決定されており、個々のＴ細胞の抗原特異性は異なる。個々の腫瘍関連抗原に対して最適な、すなわち個々の腫瘍関連抗原に対する反応性が高いＴＣＲを選択するために、単一細胞ごとにｃＤＮＡを調製することが好ましい。
被験者から得られたＴ細胞は、目的とする腫瘍関連抗原とともに培養し、増殖させることが好ましい。用いた腫瘍関連抗原に応答するＴ細胞集団から活性化マーカーを用いて、セルソーターなどにより単一の細胞を単離してもよい。活性化マーカーとしては、細胞表面ＣＤ１３７が好ましい。ヒトＴ細胞を単離するための公知の手法としては、例えば、ＣＤ３およびＣＤ１３７等のＴ細胞表面マーカーに対する抗体とセルソーターとを用いたフローサイトメトリーが挙げられる。得られた単一Ｔ細胞よりＰＣＲ法を用いて遺伝子クローニングを行い、ＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを増幅することができる。
〔シングルセルＰＣＲによるＴＣＲ遺伝子の単離〕
　単一細胞を得るために、末梢血などから得られる腫瘍抗原に対して特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を、抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣデキストラマー（Dextramer）（登録商標）との結合により、セルソーターによる単一細胞ソーティングを行うことができる。ＭＨＣデキストラマーとは、ＭＨＣと蛍光色素分子を結合させたデキストランポリマー骨格から構成される化合物である。ＭＨＣデキストラマーに代えて、ＭＨＣテトラマーを用いてもよい。ＭＨＣテトラマーとは、抗原ペプチドとＭＨＣ分子との複合体を、ビオチンおよびアビジンにより四量体としたものである。他の態様において、末梢血などから得られる腫瘍抗原に対して特異的なＣＤ８陽性Ｔ細胞を、前記抗原の存在下で培養を行い、増殖させた後、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブ細胞をセルソーターにより単一細胞ソーティングすることができる。他の態様において、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブ細胞から、抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣデキストラマーに結合する細胞集団を、セルソーターにより単一細胞ソーティングすることができる。得られた単一細胞からＲＮＡを抽出し、逆転写反応により得られたｃＤＮＡを用いてＰＣＲ法によりＴＣＲ遺伝子対（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子）を単離することができる。単離したＴＣＲ遺伝子対についてシークエンス解析を行い、腫瘍抗原反応性Ｔ細胞の種類（ＴＣＲレパトア）およびその出現頻度の解析を行うことができる。
〔ベクターの構築〕   
　単離したＴＣＲのｃＤＮＡを鋳型として増幅したＰＣＲ断片を、例えばギブソン・アッセンブリー・システムを用いて、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（トランスポゾンベクター）に組み込むことができる。具体的には、ユビキチンプロモーターの下流に、単離したＴＣＲα鎖遺伝子とＴＣＲβ鎖遺伝子とをＴ２Ａ配列を介して連結した遺伝子を結合し、さらにその下流に、ＩＲＥＳ（internal ribosome entry site）配列に対してリガンド結合部位および細胞内ドメインを除いたＥＧＦＲ（ＥＧＦＲｔ、truncated EGFR）または細胞内ドメインを欠損するＣＤ１９等のマーカー遺伝子を連結し、この構築物をウイルスベクターまたは非ウイルスベクターに組み込む。ベクターとしては、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを用いることができるが、非ウイルスベクターが好ましい。非ウイルスベクターとしては、トランスポゾンベクターの中でもpｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ベクターが好ましい。トランスポゾン法は、従来のウイルスベクター法と比較して、安価で安全な次世代の遺伝子導入法である。
〔ＴＣＲ ｃＤＮＡの細胞導入〕
　Ｔ細胞への分化状態が良好な非Ｔ非Ｂ細胞もしくは単球またはＴ細胞由来のｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した前記成熟Ｔ細胞へのＴＣＲα鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡ対を導入する方法としては、ウイルスベクターを用いる方法もしくは非ウイルスベクターを用いる方法またはゲノム編集技術を用いるＴＣＲの置き換えのいずれも採用することができる。ウイルスベクターとしては、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびセンダイウイルス等のウイルスベクター、ならびに動物細胞発現プラスミドが挙げられるが、レトロウイルスまたはレンチウイルスが好ましい。レトルウイルスまたはレンチウイルス感染を行う場合は、スピンインフェクション法等を用いることが好ましい。非ウイルスベクターを用いる場合は、トランスポゾン法が好ましい。ゲノム編集技術を用いるＴＣＲの置き換えには、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９法、ＣＲＩＳＰＲ／ＭＡＤ法およびＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ３法を用いてもよい。非ウイルスベクターの遺伝子導入方法またはゲノム編集のためのガイドＲＮＡおよびドナーＤＮＡの導入方法としては、リポフェクション法、リポソーム法、リン酸カルシウム共沈殿法、ＤＥＡＥデキストラン法、マイクロインジェクション法およびエレクトロポレーション法が挙げられる。ベクターを用いずに、ＰＣＲ産物を直接細胞に導入することもできる。トランスポゾンベクターまたはＰＣＲ産物の細胞導入には、エレクトロポレーション法を用いることが好ましい。エレクトロポレーション機器としては、遺伝子導入装置ExPERT（登録商標）システム（MaxCyte社）が好ましい。
　前記ｃＤＮＡ対を前記細胞に導入する場合に用いる発現ベクターにおいて使用されるプロモーターとしては、例えばＥＦ１αプロモーター、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＨＳＶ－ＴＫプロモーターおよびユビキチンプロモーター等が挙げられる。これらのプロモーターは、テトラサイクリン等の薬剤の有無等によって、前記プロモーターの下流に挿入された遺伝子の発現を制御できるものであってもよい。発現ベクターは、プロモーターに加えて、エンハンサー、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー遺伝子（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子）、ＳＶ４０複製起点等を含むことができる。
　前記ｃＤＮＡ対が導入されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞より分化した前記成熟Ｔ細胞は、上述した培養液、培養液組成、培養温度等の培養条件で培養することにより、前記ｃＤＮＡ対がそれぞれコードするα鎖およびβ鎖からなるＴＣＲを発現する再生Ｔ細胞が得られる。この培養において、これらの細胞の増殖を行う場合には、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行うことが好ましい。前記フィーダー細胞は、自家または他家の末梢血単核球が好ましい。「自家の」とは、末梢血単核球および前記ｉＰＳ細胞クローンが由来する被験者が同一であることを意味し、「他家の」とは、末梢血単核球および前記ｉＰＳ細胞クローンが由来する被験者が異なることを意味する。
　目的のＴＣＲが発現しているか否かは、例えば、ＴＣＲＶβ解析キット（BECKMAN COULTER社：カタログ番号IM-3497）を用いるＴＣＲβ遺伝子のレパトア解析に基づき、確認することができる。ベクターには、ＥＧＦＲｔ（truncated EGFR）およびＣＤ１９ｔ（truncated CD19）等のマーカー遺伝子が組み込まれているため、マーカー遺伝子の発現を解析することにより、ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現を推測することができる。
　前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞は、拡大培養後、マスターセルバンクを構成してもよい。ここで言及する「マスターセルバンク」とは、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を、単一クローンの単一プールごとに、独立した細胞保存容器に分注して集積したものである。通常、細胞の性質に変化が生じない範囲で前記細胞を増殖させ、複数の細胞保存容器に分注することが好ましい。マスターセルバンクに保存された前記細胞は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を導入し、再生Ｔ細胞を製造するための出発原料となる細胞であり、前記再生Ｔ細胞の製造ごとに、マスターセルバンクから必要数の前記細胞を含む細胞保存容器を取り出すことができる。したがって、本発明の再生Ｔ細胞を、同一品質で、繰り返し供給することができる。
　前記マスターセルバンクでは、細胞保存容器に分注された前記細胞を凍結保存することが好ましい。細胞の凍結保存方法は、当業者に周知である。例えば、拡大培養した細胞の単一クローンを回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数し、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、10％ DMSOを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存することができる。例えば、１本あたり１×１０６～１０７個の細胞を含む細胞保存容器を、細胞保存容器ストッカー等に２００～１０００本集積して、マスターセルバンクを構築することができる。本発明のマスターセルバンクは、凍結保存ができる任意の施設または貯蔵庫に保管することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。
〔ｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　腫瘍関連抗原に対応するＴＣＲ対は、１エピトープあたりに５～１０個と言われており、それぞれのＴＣＲ対は、腫瘍関連抗原の点変異変異体に対して異なる感受性を持つことが予測されている。したがって、例えば腫瘍関連抗原に点変異が起こった場合でも、前記エピトープを認識することのできるＴＣＲが存在する可能性が高く、点変異変異体に対しても抗原に特異的な再生Ｔ細胞の準備を迅速に行うことができる。また、変異の結果、腫瘍関連抗原がまったく変化した場合であって、再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療に耐性が生じた場合であっても、複数の腫瘍抗原に対する患者の反応性を解析し、それらの腫瘍関連抗原に応答するＴＣＲを、すでに取得されているＴ細胞への分化能の高いｉＰＳ細胞または前記ｉＰＳ細胞由来の分化細胞から製造を開始できるため、迅速に再生Ｔ細胞を製造することが可能である。
〔ＴＣＲ取得源のＴ細胞〕
　腫瘍関連抗原に対応するＴＣＲ対の取得源となるＴ細胞は、末梢血から採取することが好ましい。末梢血に腫瘍関連抗原特異的なＴ細胞を出現させるために、予め被験者に腫瘍関連抗原を投与する必要がある場合は、被験者に前記腫瘍関連抗原を投与後に末梢血からＴ細胞を採取することが好ましい。このような腫瘍関連抗原としては、例えばＧＰＣ３が挙げられる。一方、腫瘍関連抗原の投与がなくとも、腫瘍特異的なＴ細胞が末梢血に存在する場合には、腫瘍関連抗原の投与を行うことなく、例えばＭＨＣデキストラマーを使用して、末梢血から腫瘍関連抗原特異なＴ細胞を単離してもよい。このような腫瘍関連抗原としては、例えばＷＴ１、ＮＹＥＳＯ－１およびＥＢＶ抗原などが挙げられる。
　上記のように、被験者に対して腫瘍関連抗原を投与した後、または腫瘍関連抗原を投与することなく被験者の末梢血から採取されたＴ細胞は、いずれの場合であっても、好ましくは試験管内で腫瘍関連抗原により刺激し、腫瘍応答性の細胞集団を増幅した後、活性化マーカーを用いた細胞単離を行うことができる。末梢血中において、腫瘍関連抗原特異的なＴ細胞の出現頻度が極めて高い場合には、試験管内での腫瘍関連抗原による刺激を行わない場合があってもよい。
　ＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取する被験者と、再生Ｔ細胞補充療法によるがん治療の対象となる被験者が別個体である場合には、治療対象被験者から抗原特異的Ｔ細胞を採取する必要はない。したがって、再生Ｔ細胞補充療法の治療時期とは独立して、任意の時期に予めＴＣＲ対を得るためのＴ細胞を採取することができるので、再生Ｔ細胞補充療法を迅速に開始することができる。
〔医薬組成物〕
　本発明の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物は、がん治療対象を処置するために使用することができる。本発明の医薬組成物は、製剤技術分野において慣用の方法、例えば、日本薬局方に記載の方法等により製造することができる。本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤を含んでいてもよい。前記添加剤としては、例えば、細胞培養液、生理食塩水や適当な緩衝液（例えば、リン酸系緩衝液）等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物は、再生Ｔ細胞を生理食塩水や適当な緩衝液（例えばリン酸系緩衝液）等に懸濁することによって製造することができる。所望の治療効果が発揮されるように、一回投与分の量として、例えば１×１０７個以上の細胞を含有することが好ましい。より好まし細胞含有量は１×１０８個以上、さらに好ましくは１×１０９個以上である。細胞の含有量は、投与対象の性別、年齢、体重、患部の状態、細胞の状態等を考慮して適宜調整することができる。本発明の医薬組成物は、再生Ｔ細胞の他、細胞を保護する目的でジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）および血清アルブミン等を含有してもよい。また、細菌の混入を防止するために、抗生物質等ならびに細胞の活性化および分化を促す目的でビタミン類やサイトカイン等を含有してもよい。さらに本発明の医薬組成物は、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等）を含有してもよい。
本発明の再生Ｔ細胞を有効成分として含む医薬組成物は、凍結保存することができる。凍結保存する場合、保存温度は、細胞の保存に適した温度であれば特に限定されない。例えば、－２０℃、－８０℃および－１２０～－１９６℃が挙げられるが、－１５０℃以下が好ましい。凍結保存する場合、細胞は、凍結バイアルおよび凍結バッグ等の適切な容器中で保存することが好ましい。再生Ｔ細胞の凍結時および解凍時の細胞損傷リスクを最小限にするための操作は、当業者に周知である。
　本発明の再生Ｔ細胞の冷凍保存においては、前記Ｔ細胞を培養液から回収し、緩衝液または培養液により洗浄し、細胞数を計数した後、遠心分離等により濃縮して、凍結媒質（例えば、１０％ＤＭＳＯを含む培養液）中に懸濁した後、低温凍結保存する。再生Ｔ細胞はクローンごとまたは各クローンを混合して保存してもよい。本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物は、凍結バイアルおよび凍結バッグ等の容器当たり、例えば、５×１０４個～９×１０１０個の再生Ｔ細胞を含むが、対象とするがんの種類、投与対象、投与経路等に応じて変更することができる。
　本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物の投与経路としては、例えば、輸注、腫瘍内注射、動注、門脈注、腹腔内投与等が挙げられる。ただし、本発明の医薬組成物中の有効成分である再生Ｔ細胞が患部に送達される限り、投与経路はこれらに限られるものではない。投与スケジュールとしては、単回投与または複数回投与とすることができる。複数回投与の期間は、例えば、２～４週に１回投与を繰り返す方法または半年から１年に１回投与を繰り返す方法等を採用することができる。投与スケジュールの作成においては、対象患者の性別、年齢、体重、病態等を考慮することができる。
　本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物を、がん患者におけるがんの予防または治療に使用する場合において、再生Ｔ細胞上のＴＣＲが他家である場合、がん患者の体内でのアロ反応を避けるため、がん患者の正常細胞に対してアロ反応を示さないＴＣＲを導入した再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物が使用される。
　本発明の医薬組成物は、がんの予防または治療のために用いられる。がんとしては、卵巣がん、肝芽腫、肝細胞がん、胃がん、食道がん、膵臓がん、腎細胞がん、乳がん、悪性黒色腫、非小細胞肺がん、子宮頸がん、膠芽腫、前立腺がん、神経芽腫瘍、慢性リンパ性白血病、甲状腺乳頭がん、大腸がん、およびＢ細胞非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定されない。
　がんの予防または治療のために、本発明の再生Ｔ細胞を含む医薬組成物とがんワクチンとを組み合わせて使用する場合、本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与時期は限定されず、本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与を、投与対象に対し、同時に投与してもよく、また時間差をおいて投与してもよい。本発明の医薬組成物とがんワクチンとは別々に製剤化されていてもよく、また両者が混合された配合剤であってもよい。本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与量は、臨床上用いられている投与量に準ずればよく、疾患、投与対象、投与経路および薬物との組み合わせ等により適宜選択することができる。
　本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与形態は特に限定されず、最終的に、本発明の医薬組成物およびがんワクチンの両方が投与されればよい。このような投与形態としては、例えば、（１）本発明の医薬組成物およびがんワクチンの同一投与経路による時間差をおいた個別投与、（２）本発明の医薬組成物およびがんワクチンの異なる投与経路による同時投与、および（３）本発明の医薬組成物およびがんワクチンの異なる投与経路による時間差をおいた個別投与等が挙げられる。
　本発明の医薬組成物とがんワクチンとを組み合わせることにより、以下に示す優れた効果を得ることができる。
（１）本発明の医薬組成物またはがんワクチンを単独で投与する場合に比べて、その投与量を軽減することができる、
（２）本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与により、長い治療期間を設定することができる、
（３）本発明の医薬組成物およびがんワクチンの投与により、治療効果の持続を図ることができる、および
（４）本発明の医薬組成物およびがんワクチンとの併用により、抗がん効果または抗腫瘍効果における相乗効果が得られる。
　本発明の一態様において、がんペプチドワクチン(例えば、ＧＰＣ３を含有するがんワクチン)を投与した肝芽腫患者の末梢血から、ＧＰＣ３に対する細胞傷害性Ｔ細胞を単離し、Ｔ細胞補充療法に先立って、ＴＣＲを調製することができる。また、Ｔ細胞補充療法の対象である患者とは別個体である他者より予め調製したＴＣＲは、複数の前記患者の非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来の自家再生Ｔ細胞製造時に導入されるＴＣＲとすることができる。得られた再生Ｔ細胞は、ＧＰＣ３に対する抗原特異性を維持し、複数の前記患者において、ＧＰＣ３を発現するがん細胞（腫瘍）に対する抗原特異的な細胞傷害性を有する。このように、本発明の方法および本発明の方法により製造された再生Ｔ細胞により、がんに対して有効な、再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物を得ることができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
〔末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球を初期化したｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　図１は、本発明の再生Ｔ細胞の製造工程を示す。腫瘍抗原Ｘペプチド投与（図１-(1')）により治療を受けているがん患者（被験者）の末梢血単核球を採取し、腫瘍抗原Ｘに特異的に反応するＴ細胞よりＴＣＲ遺伝子を単離した（図１-(2')）。前記ＴＣＲ遺伝子の出現頻度および腫瘍抗原特異的な結合能より、より高い治療効果が期待されるＴＣＲ遺伝子を選択した（図１-(3')）。治療を受けている患者において腫瘍の再発および腫瘍細胞の変異が生じた場合には、治療に有効なＴＣＲ遺伝子を再度選択することが可能である。十分な治療効果を得るためには、ＴＣＲの種類（ＴＣＲレパトア）を多く取得することが重要である。
　別途、前記患者の末梢血の非Ｔ非Ｂ細胞または単球より、ｉＰＳ細胞を製造した（図１-(1)および(2)）。次に、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が良好なｉＰＳ細胞クローンの選別を行った（図１-(3)）。この選別により、ｉＰＳ細胞クローンの違いによるＴ細胞への誘導効率のばらつきが顕著に低減され、再生Ｔ細胞製造の堅牢性・効率性が向上することが確認された。上記の、腫瘍抗原特異的に反応する選択されたＴＣＲ遺伝子群を、前記のＴ細胞への分化効率がｉＰＳ細胞クローンに発現させ（図１-(4)）、選択されたＴＣＲ遺伝子ごとに成熟Ｔ細胞への分化および増殖を行った（図１-(5)）。なお、前記成熟Ｔ細胞は、腫瘍抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞であって、再生Ｔ細胞である。この再生Ｔ細胞は、がん患者に投与される（図１-(6)）。
　本発明の方法においては、ｉＰＳ細胞の製造工程（図１-(1)～(3)）と腫瘍抗原Ｘに反応するＴＣＲ遺伝子を取得する工程（図１-(1')～(3')）とを並行して行うことができるため、これらの工程を順次行う場合と比較してより短期間（約５５日）でこれらの工程を完了することができる。
　上記をより詳細に説明する。下記の通りに、腫瘍抗原Ｘ特異的ＴＣＲ遺伝子の単離および抗原特異的反応性の検証を行った（図２上段部分図を参照）。腫瘍抗原に対するペプチド投与治療が実施され（図２-(1)）、末梢血中の腫瘍抗原Ｘ反応性Ｔ細胞が増幅されたがん患者（被験者）の末梢血から末梢血単核球を採取した。得られた末梢血単核球に腫瘍抗原Ｘペプチドを添加して、腫瘍抗原Ｘに反応するＣＤ８陽性の細胞傷害性Ｔ細胞の増幅培養を行った後、セルソーターにより、腫瘍抗原Ｘに反応する活性化された細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８陽性およびＣＤ１３７陽性の細胞）の単一細胞ソーティングを行った（図２-(2)）。単離された単一細胞から、シングルセルＰＣＲ によりＴＣＲ遺伝子対（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子）を単離し、単離したＴＣＲ遺伝子対についてシークエンス解析を行い、腫瘍抗原Ｘ反応性Ｔ細胞の種類（ＴＣＲレパトア）とその出現頻度の解析を行った（図２-(3)）。単離されたＴＣＲ遺伝子対は、レポーター遺伝子を組み込んだＴＣＲ遺伝子欠損Ｔ細胞株に発現させて、ＴＣＲ遺伝子複合体を再構築した（図２-(4)）。続いて、再構築したＴＣＲ遺伝子複合体と、腫瘍抗原Ｘペプチドを提示したＨＬＡを発現する細胞との反応性（抗原特異的反応性）について検証を行った（図２-(5)）。すなわち、前記ＴＣＲ遺伝子対を発現させたＴ細胞株および目的とする腫瘍抗原Ｘペプチドを提示したＨＬＡを発現する細胞を共培養するが、発現した前記ＴＣＲと腫瘍抗原Ｘペプチドを提示したＨＬＡとが抗原特異的結合した場合、ＴＣＲ遺伝子シグナルが活性化され、標的遺伝子プロモーターの下流に組み込まれたレポーター遺伝子が発現される。その後、レポーター遺伝子活性の測定を行い、腫瘍抗原特異的なＴＣＲの結合評価を行うことにより、抗原特異的反応性を検証した。以上の工程を経て、腫瘍抗原Ｘに特異的な反応性を示したＴＣＲ遺伝子対の中から、出現頻度が高いものを複数選択し、後述の非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来ｉＰＳ細胞(Ｍ－ｉＰＳ細胞)への導入遺伝子として用いた。
　ＴＣＲ遺伝子導入ｉＰＳ細胞および再生Ｔ細胞の製造を下記の通りに行った（図２下段部分図を参照）。がん患者（被験者）に対する腫瘍抗原Ｘペプチドの投与（図２-(1)）と並行して、前記がん患者の末梢血単核球よりｉＰＳ細胞を作製した（図２-(2'))。図内に記載されるＭ－ｉＰＳ細胞は、Ｔ細胞に由来しないｉＰＳ細胞であり、ＴＣＲ遺伝子の遺伝子再構成が行われていない細胞である。次に、作製したＭ－ｉＰＳ細胞株群から、Ｔ細胞への分化効率が良好なＭ－ｉＰＳ細胞株を選別した（図２-(3')）。選別したＭ－ｉＰＳ細胞株に対して、腫瘍抗原Ｘ特異的ＴＣＲ遺伝子（ＴＣＲα鎖遺伝子およびＴＣＲβ鎖遺伝子の両遺伝子、図２-(3)を参照）を、トランスポゾンを用いて遺伝子導入し（図２-(6)および図３を参照）、マーカー分子であるＣＤ１９の発現を指標に、セルソーター（MACSQuant Tyto（登録商標）セルソーター、Miltenyi Biotec社）を用いて、ＴＣＲ遺伝子を発現するＭ－ｉＰＳ細胞株（ＴＣＲ－ｉＰＳ細胞株）の選別を行った。次に、胚様体法を用いて造血幹前駆細胞を誘導し、生体内でのＴ細胞発生を模倣した段階的分化誘導法により、未熟Ｔ細胞を経て成熟Ｔ細胞への分化誘導を行った。
　上記のようにしてｉＰＳ細胞より誘導された再生Ｔ細胞（腫瘍抗原特異的ＣＤ８陽性細胞傷害性Ｔ細胞）の表現型を解析した。細胞表面抗原マーカーによる再生Ｔ細胞のフローサイトメーターによる解析結果を図４に示す。ｉＰＳ細胞より誘導された再生Ｔ細胞は、生体内の成熟した細胞傷害性Ｔ細胞において発現が認められるＣＤ４５＋ＴＣＲαβ＋ＣＤ３＋ＣＤ４－ＣＤ８αβ＋の発現が確認された。また、前記ＣＤ８陽性細胞は、腫瘍抗原Ｘペプチドを提示したＨＬＡフラグメント（Antigen-X binding）と特異的に結合することも分かった。
　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞について、細胞老化マーカーであるテロメア（若返りの指標）を解析した結果を図５に示す。患者末梢血単核球（Ａ）および再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞（Ｂ）のテロメア長に比較して、前記腫瘍抗原特異的Ｔ細胞から作製されたｉＰＳ細胞（Ｃ）では約３倍、また本発明の腫瘍抗原特異的再生Ｔ細胞（Ｄ）では約２倍のテロメア長であり、ＣおよびＤにおいてテロメア長の回復が確認された。すなわち、本発明の再生Ｔ細胞においては、細胞老化の改善が示唆される。
　本発明のｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞について、免疫チェックポイントに関連する細胞疲弊マーカーのひとつあるＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現を、抗ＴＩＧＩＴ抗体および抗ＰＤ－１抗体で染色し、フローサイトメーターにより解析した。比較として、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞についても解析した。結果を図６に示す。本発明の再生Ｔ細胞は、再生前の腫瘍抗原特異的Ｔ細胞に比べて、ＰＤ－１およびＴＩＧＩＴ分子の発現が大きく低下していることが確認された。したがって、本発明の再生Ｔ細胞は、高い細胞傷害活性を有することが示唆される。
　細胞傷害性能の重要な指標となるサイトカイン産生能解析を行った。健常人から採取した末梢血単核球中の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞）および本発明の再生Ｔ細胞を、ＰＭＡ（Phorbol 12-Myristate 13-Acetate）およびイオノマイシン（Ionomycin）により刺激し、産生されるＩＬ－２およびＩＦＮ－γ量を比較した。結果を図７に示す。健常人から得られた細胞傷害性Ｔ細胞に比べ、本発明の再生Ｔ細胞では、ＩＬ－２およびＩＦＮγを産生する細胞が顕著に増加していることが確認された。
　本発明の再生Ｔ細胞の、抗原特異的な細胞傷害活性能を評価した。ＨＬＡ－Ａ２４発現細胞株（標的細胞）を、抗原Ｘペプチド存在下または非存在下で培養し、それぞれ抗原Ｘペプチド発現細胞または抗原Ｘペプチド非発現細胞を作製した。本発明の再生Ｔ細胞とこれらの標的細胞とを共培養し、標的細胞に対する再生Ｔ細胞の細胞傷害活性を測定した。共培養時の再生Ｔ細胞と標的細胞との細胞数比は、２０：１、１０：１および５：１とした。その結果を図８に示す。本発明の再生Ｔ細胞は、抗原Ｘペプチド非発現細胞（open circles）に対しては細胞傷害活性を示さなかったが、抗原Ｘペプチド発現細胞（closed circles）に対して細胞傷害活性を示し、その活性は標的細胞に対する再生Ｔ細胞の細胞数の増加に応じて増強された。
〔ＴＣＲをコードするｃＤＮＡの調製〕
　ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチド（ＥＹＩＬＳＬＥＥＬ、配列番号１）およびＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチド（ＦＶＧＥＦＦＴＤＶ、配列番号２）を溶解し、免疫アジュバントである不完全フロイントアジュバント（Montanide ISA-51, Seppic, France）と１：１（v／v）で混合した。この混合物を、それぞれＨＬＡ型が一致する肝細胞がんまたは肝芽腫患者の皮下に注射した。ＧＰＣ３ペプチドは、１週間に一度または１週間に一度未満の頻度で５回以上投与した。ＧＰＣ３ペプチドによる免疫が完了した患者から採取した末梢血より、単核球分離溶液Lymphoprep（登録商標）を用いて末梢血単核球を単離した。得られた末梢血単核球を、ＨＬＡ型が一致するＨＬＡ拘束性のＧＰＣ３ペプチドを含む培養液で約１２日間培養した。ＧＰＣ３ペプチドにより活性化された細胞を、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブ細胞集団としてセルソーター（MACSQuant Tyto（登録商標）セルソーター、Miltenyi Biotec社）を用いて分画した。
　上記の通り、ＧＰＣ３ペプチドで活性化され、増殖したＧＰＣ３応答性Ｔ細胞を、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３およびＴ細胞活性化マーカーであるＣＤ１３７に対する抗体で染色し、セルソーターを用いて分画し、シングルセルとした。得られたシングルセルよりＲＮＡを抽出し、ＲＴ－ＰＣＲ法を用いてＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖のｃＤＮＡを単離、増幅した。複数のＧＰＣ３応答性Ｔ細胞のシングルセルより、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖のｃＤＮＡ対を得た。得られたＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖の遺伝子配列を決定し、ＴＣＲレパトアを解析した。
〔ｉＰＳ細胞クローンの作製〕
　ＧＰＣ３ペプチド投与前または投与後の肝細胞がんまたは肝芽腫患者から採取された末梢血から、単核球分離溶液Lymphoprep（登録商標）を用いて単核球を単離した。得られた単核球から、ＣＤ１９／ＣＤ２０陽性のＢ細胞およびＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８陽性のＴ細胞を、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳビーズを用いて除去し、非Ｔ非Ｂ細胞または単球を得た。得られた非Ｔ非Ｂ細胞または単球細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）を搭載したセンダイウイルス（CytoTune（登録商標）2.0）およびＳＶ４０Ｔａｇをコードしたセンダイウイルスを、５～２０のＭＯＩ（multiplicity of infection）で感染させた。なおＳＶ４０は除いてもよい。
　得られたｉＰＳ細胞は、数多くのｉＰＳ細胞クローンからなる。このため、コロニーピックアップを行い、クローン化した。すべてのクローン化されたｉＰＳ細胞は凍結保存した。クローン化されたｉＰＳ細胞を、分化培地により約１０日培養して造血幹細胞を誘導し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブ造血幹細胞を単離した。単離した造血幹細胞は、ＤＬＬ４タンパク質と免疫イムノグロブリンのＦｃ領域との融合タンパク質であるＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。
　上記２１日間培養後に得られる未熟細胞傷害性Ｔ細胞の頻度を、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ率で検証し、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブ細胞の出現頻度が最も高いクローンを選別した。なお、ｉＰＳ細胞クローンの作製は、Ｔ細胞補充療法を迅速に行うため、ＧＰＣ３ペプチドによるがん患者（被験者）の免疫が完了するまでに終了させておくことが好ましい。
　Ｔ細胞への分化効率が良好ないくつかのｉＰＳ細胞クローンは、ｉＰＳ細胞維持培地により２週間の拡大培養を行った後、細胞保存容器に分注し、凍結保存することにより、マスターセルバンクを構築した。
〔ｉＰＳ細胞クローンに対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例３において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンに対し、ＧＰＣ３抗原特異性が確認されたＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖をコードした遺伝子を有するpｉｇｇｙＢａｃベクターを、エレクトロポレーション法を用いて導入した。次に、目的のＴ細胞受容体α鎖およびβ鎖を発現するｉＰＳ細胞を、マーカー分子であるＣＤ１９の発現を指標に、セルソーターにより単離した。単離されたｉＰＳ細胞は、分化培地により約１０日培養し、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブの造血幹細胞を誘導し、セルソーターにより単離した。単離した血幹細胞は、ＦｃＤＬＬ４でコートされたプレート上で約２１日間培養し、Ｔ細胞への分化誘導を行った。
　上記２１日間培養後に得られるＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブの未熟Ｔ細胞を、セルソーターを用いて単離精製した。次に、未熟Ｔ細胞を、ＰＨＡ（phytohemagglutinin）およびフィーダー細胞として末梢血単核球の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で共培養し、成熟細胞傷害性Ｔ細胞へと誘導した。これらの刺激は１回以上行った。得られたＴ細胞の性能は、ＧＰＣ３特異的な標的細胞の細胞傷害活性、ＩＦＮ－γ産生および抗原結合能で確認した。
〔ｉＰＳ細胞クローンから分化した成熟Ｔ細胞に対するＴＣＲ遺伝子の導入〕
　実施例３において得られた、Ｔ細胞への分化効率が良好な非Ｔ非Ｂ細胞または単球由来のｉＰＳ細胞クローンから、造血幹細胞および未熟Ｔ細胞を経由して分化した成熟Ｔ細胞に対し、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖をコードする遺伝子（ｃＤＮＡ）を、pｉｇｇｙＢａｃシステムを用いて、実施例４と同様にして導入した。
　遺伝子導入したｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞の表現型を、フローサイトメーターにより解析した結果を図９に示す。図９において、「Ｎｏ ＥＰ」は、遺伝子導入に用いた前記成熟Ｔ細胞であって、ＷＴ１抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖を発現させた前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＥＧＦＰ」は、遺伝子導入操作の指標とするトレーサー遺伝子（ＥＧＦＰ（enhanced green fluorescent protein）遺伝子）を組み込んだ発現ベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」は、トレーサー遺伝子として細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子のみを組込んだpｉｇｇｙＢａｃベクターおよびトランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果；「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」は、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子、細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子を組込んだpｉｇｇｙＢａｃベクターおよびトランスポゾンベクターを導入した前記成熟Ｔ細胞の解析結果を示す。
　「Ｎｏ ＥＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３のみが検出された。すなわち、遺伝子導入に用いた細胞は、Ｔ細胞であることが確認された。
　「ＥＧＦＰ」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびＥＧＦＰ遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。
　「Ｅｍｐｔｙ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現が検出された。すなわち、遺伝子導入操作は適切に行われたことが分かる。
　「ＴＣＲ‐ＣＤ１９」で示されるｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞では、ＣＤ３遺伝子およびpｉｇｇｙＢａｃベクターに組み込まれたトレーサー遺伝子である細胞内欠損型ヒトＣＤ１９遺伝子の発現に加え、ＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が認識するＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）との結合が検出された。すなわち、pｉｇｇｙＢａｃシステムを用いて、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞にＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を導入することにより、前記細胞上に発現したＧＰＣ３抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖が、ＧＰＣ３ペプチド／ＨＬＡ複合体（ＧＰＣ３‐Ｄｅｘ）を認識する分子として機能することが示された。したがって、ｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞に導入するＴ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子として、新規腫瘍関連抗原（ネオアンチゲン）およびその他の腫瘍関連抗原特異的Ｔ細胞受容体α鎖β鎖遺伝子を用いることにより、これらの抗原を認識するｉＰＳ細胞由来の成熟Ｔ細胞を作製することができることが示された。
〔末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞からの再生Ｔ細胞の製造〕
　図１０は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する方法を示す。ＥＢＶ（Epstein-Barrウイルス）に感染者した被験者の末梢血より単核球を分離し、分離した単核球を、試験管内でＥＢＶ抗原により刺激し、ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞集団を単離した。単離したＣＤ８陽性Ｔ細胞集団に、山中４因子（Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４およびｃ－Ｍｙｃ）およびＳＶ４０Ｔ抗原を、センダイウイルスベクターを用いて導入し、ｉＰＳ細胞集団を得た。得られたｉＰＳ細胞集団からｉＰＳ細胞クローンを分取し、それぞれのクローンについて、Ｔ細胞への分化能を調べ、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別した。ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞は、同種移植を行った場合であっても、アロ反応を生じにくい細胞である。
　図１１は、末梢血Ｔ細胞を初期化したｉＰＳ細胞から再生Ｔ細胞を製造する工程において、Ｔ細胞への分化効率が高い細胞として選別されたｉＰＳ細胞クローンに対してゲノム編集を行い、再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するＣＤ８陽性Ｔ細胞に由来し、Ｔ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの発現に関与するβ２Ｍ遺伝子およびＣＩＩＴＡ遺伝子、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化に関与するＰＶＲ遺伝子ならびにＴ細胞受容体の再々構成に関与するＲａｇ２遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いて削除し、一方で、ＮＫ細胞の抑制性のリガンドであるβ２Μ／結合ペプチド／ＨＬＡ－Ｅの融合遺伝子（ＨＬＡ－Ｅ＊）を発現させて、宿主のＴ細胞およびＮＫ細胞からの攻撃を受けないｉＰＳ細胞とした。このゲノム編集において、薬剤誘導型カスパーゼ９などの自殺遺伝子および／または特異的なマーカー遺伝子（ＥＧＦＲ（epidermal growth factor receptor）、ＣＤ１９およびＣＤ２０など）を発現させることにより、生体内への投与後に細胞を除去することも可能となる。ゲノム編集後に再クローン化を行い、Ｔ細胞への分化効率が高いことを確認後、ｉＰＳ細胞由来の再生Ｔ細胞のクローンとして保存し、マスターセルバンクを構築してもよい。ｉＰＳ細胞から分化および増殖させた再生Ｔ細胞は、がん治療用再生Ｔ細胞を製造するためのホストＴ細胞であり、前記ホストＴ細胞によりマスターセルバンクを構築してもよい。前記ホストＴ細胞は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ（chimeric antigen receptor）遺伝子を導入した再生Ｔ細胞を作製する材料として使用することができる。このホストＴ細胞は、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞であるため、生体内に移入されてもアロ反応を起こしにくい。「ホストＴ細胞」とは、この細胞そのものは患者の治療に供されることはないが、再生Ｔ細胞を有効成分とするがんの予防または治療剤を製造するための出発原料として使用されるＴ細胞を意味する。
　図１２は、前記ホストＴ細胞から、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞を製造する方法を示す。ＥＢＶ抗原を認識するホストＴ細胞において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集による遺伝子置換により、再構成を生じたＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖を、それぞれがん抗原を認識するＴ細胞受容体β鎖とＴ細胞受容体α鎖とのＴ２ａを介する連結体に置換した。一方、ＥＢＶ抗原を認識するＴ細胞受容体α鎖は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を用いたゲノム編集により除去した。図１２に記載された方法により、がん抗原を認識する再生Ｔ細胞の製造を行うことが可能であった。
　図１３は、図１０～１２に示された方法をまとめて説明するものである。末梢血Ｔ細胞を初期化した同種のユニバーサルｉＰＳ細胞から製造された再生Ｔ細胞（ｉＰＳ－Ｔ細胞）は、ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子を導入したＴ細胞を作製するための出発原料とすることができる。「ユニバーサルｉＰＳ細胞」とは、免疫原性が非常に低いため、どのような種類のＭＨＣ（Major Histocompatibility Complex；主要組織適合性複合体）を持つ患者に対しても、拒絶反応を招来することなく使用することができるｉＰＳ細胞を意味する。即ち、ＭＨＣのマッチングを考慮することなく、患者に投与することができるｉＰＳ細胞である。ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子をノックアウトし、ＮＫ細胞を抑制するリガンドを発現させることにより、ユニバーサルｉＰＳ細胞を作製することができる。
　ＴＣＲ遺伝子またはＣＡＲ遺伝子の導入には、従来のＴ細胞の補充療法または再生療法に用いられるＴ細胞の製造に使用されるウイルスベクターを用いてもよい。ｉＰＳ－Ｔ細胞を出発原料とすることにより、がんの予防または治療剤の有効成分となる所望のＴ細胞を短期間に製造することが可能となる。またネオアンチゲンを認識するＴＣＲの導入も容易であり、異なるネオアンチゲンを認識する複数のＴＣＲ遺伝子を導入することにより、多クローン性を維持したままのｉＰＳ－Ｔ細胞の製造も可能である。

Claims (29)

  1. 　（１）被験者から得られるＴ細胞であって、腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
    　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
    　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
    　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
    を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
  2. 　（１）被験者から得られるＴ細胞を腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
    　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
    　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
    　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
    を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
  3. 　（１）腫瘍関連抗原が投与された被験者より得られるＴ細胞を前記腫瘍関連抗原と接触させ、前記腫瘍関連抗原に対して反応性を有するＴ細胞集団から、単一細胞ごとに、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖をそれぞれコードするｃＤＮＡを調製する工程、
    　（２）被験者の末梢血単核球であって、Ｂ細胞およびＴ細胞が除去された末梢血単核球またはＴ細胞をｉＰＳ細胞に初期化し、得られたｉＰＳ細胞からＴ細胞への分化効率が高いｉＰＳ細胞クローンを選別する工程、
    　（３）前記ｃＤＮＡを、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞に導入する工程、および
    　（４）工程（３）において得られた、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程、
    を含む、ｉＰＳ細胞を介する再生Ｔ細胞の製造方法。
  4. 　工程（２）の実施が、工程（１）の実施に先行する、または工程（１）の実施と並行する、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 　工程（１）および（２）における被験者が、同一個体である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　工程（１）および（２）における被験者が、互いに別個体であって、工程（２）における被験者が、がんの予防または治療対象である、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  7. 　さらに、工程（４）において得られる前記ｃＤＮＡが導入されたＴ細胞から、工程（２）における被験者に由来する細胞に対してアロ反応を示さないＴ細胞を選別する工程を含む、請求項６に記載の方法。
  8. 　さらに、工程（１）で調製されたｃＤＮＡから、工程（２）における被験者に由来する細胞に対してアロ反応を誘導しないＴ細胞受容体をコードするｃＤＮＡを選別する工程を含む、請求項６に記載の方法。
  9. 　被験者に由来する前記細胞が、末梢血単核球である、請求項７または８に記載の方法。
  10. 　前記腫瘍関連抗原が、ＧＰＣ３、ＷＴ１、ＸＡＧＥ１、ＬＭＰ２、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＥＢウイルス抗原およびネオアンチゲンならびにこれらのペプチド断片からなる群より選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　前記腫瘍関連抗原が、ＨＬＡ－Ａ２４拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＥＹＩＬＳＬＥＥＬ（配列番号１）、ＨＬＡ－Ａ２拘束性ＧＰＣ３ペプチドであるＦＶＧＥＦＦＴＤＶ（配列番号２）またはこれらの混合物である、請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。
  12. 　工程（３）において、前記ｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した前記造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した前記未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞への前記ｃＤＮＡの導入が、ウイルスベクター、非ウイルスベクターまたはゲノム編集技術を用いる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 　前記非ウイルスベクターが、トランスポゾンベクターである、請求項１２に記載の方法。
  14. 　前記トランスポゾンベクターが、pｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ベクターである、請求項１３に記載の方法。
  15. 　工程（４）において、前記ｃＤＮＡが導入された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞または前記未熟Ｔ細胞の、成熟Ｔ細胞への分化および前記成熟Ｔ細胞の増殖を行う工程が、フィーダー細胞およびＰＨＡ（phytohemagglutinin）の存在下、レトロネクチン（登録商標）および抗ＣＤ３抗体の存在下、または抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体の存在下で行われる、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　前記フィーダー細胞が、自家または他家の末梢血単核球である、請求項１５に記載の方法。
  17. 　工程（２）における前記被験者が、肝細胞がん患者または肝芽腫患者である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、ＣＤ３／ＣＤ１３７ダブルポジティブである、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. 　工程（１）における前記Ｔ細胞集団が、前記腫瘍関連抗原ペプチドと複合体を形成するＭＨＣテトラマーまたはＭＨＣデキストラマー（登録商標）と結合する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  20. 　前記造血幹細胞が、ＣＤ３４／ＣＤ４３ダブルポジティブである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 　前記未熟Ｔ細胞が、ＣＤ８α鎖／β鎖ダブルポジティブである、請求項１～２０のいずれか１項に記載の方法。
  22. 　工程（２）において選別されたｉＰＳ細胞クローン、前記ｉＰＳ細胞クローンから分化した造血幹細胞、前記造血幹細胞から分化した未熟Ｔ細胞または前記未熟Ｔ細胞から分化した成熟Ｔ細胞を保存し、マスターセルバンクを構成する、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. 　前記保存が凍結保存である、請求項２２記載の方法。
  24. 　前記マスターセルバンクに保存された前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞に対して、工程（３）および（４）を行う、請求項２２または２３に記載の方法。
  25. 　前記ｉＰＳ細胞クローン、前記造血幹細胞、前記未熟Ｔ細胞または前記成熟Ｔ細胞を含む、請求項２２に記載のマスターセルバンク。
  26. 　請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法により製造された再生Ｔ細胞。
  27. 　請求項２６に記載の再生Ｔ細胞を有効成分とする、がんの予防または治療剤。
  28. 　請求項２６に記載の再生Ｔ細胞を含有する医薬組成物。
  29. 　請求項２８に記載の医薬組成物を用いる、がんの予防または治療方法。
     

     
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