JP7406789B2 - 細菌メンブランベシクルの単離方法、単離キット、およびその除去方法 - Google Patents
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Description
〔1〕細菌由来のメンブランベシクルを含む試料から前記メンブランベシクルを単離する、メンブランベシクルの単離方法であって、前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、前記複合体から前記メンブランベシクルを解離させる解離バッファーとを接触させる解離工程と、を含むことを特徴とする、メンブランベシクルの単離方法。
〔2〕前記解離バッファーは、金属陽イオンを含むことを特徴とする、〔1〕に記載のメンブランベシクルの単離方法。
〔3〕〔1〕または〔2〕に記載のメンブランベシクルの精製方法を行なうためのメンブランベシクルの単離キットであって、前記ペプチドまたは前記ポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された前記担体と、前記解離バッファーと、を含むことを特徴とする、メンブランベシクルの単離キット。
〔4〕細菌由来のメンブランベシクルを含む試料から前記メンブランベシクルを除去する、メンブランベシクルの除去方法であって、前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体形成工程によって形成された前記複合体を、前記試料から分離して、前記試料から前記メンブランベシクルの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程を含むことを特徴とする、メンブランベシクルの除去方法。
本発明の一実施形態に係るメンブランベシクルの単離方法(以下、適宜「本発明の単離方法」という。)は、メンブランベシクルを含む試料からメンブランベシクルを単離する、メンブランベシクルの単離方法であって、
前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBのいずれか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、前記複合体から前記メンブランベシクルを解離させる解離バッファーとを接触させる解離工程と、を含んでいる。
(試料)
本発明の単離方法において、「メンブランベシクルを含む試料」(本明細書中では、単に「試料」とも称する。)とは、細菌由来のメンブランベシクルを含む混合物であれば、その他の構成は特に限定されない。例えば、メンブランベシクルを産生する細菌として、グラム陰性細菌では、Acinetobacter baumannii、Bacteroides succinogences、Escherichia coli、Helicobacter pylori、Pseudomonas aeruginosa等が知られており、グラム陽性細菌では、Bacillus subtilis、Clostridium perfringens、Staphylococcus aureus、Streptomyces coelicolor等が知られている。したがって、メンブランベシクルを含む試料は、例えばこれらの細菌の培養上清等であってよい。
本発明の単離方法において利用するペプチド(以下、適宜「本発明のペプチド」という。)は、連続する20個以上40個以下のリジン(「リシン」ともいう。)を含むペプチド(以下、適宜「ポリリジン」という。)であって、試料中のメンブランベシクルと結合することができるペプチドである。
本発明の単離方法においてポリミキシンBもまた、本発明のペプチドと同様に試料中のメンブランベシクルと結合することができる。
本発明の単離方法において利用する担体(以下適宜「本発明の担体」という。)は、本発明のペプチドおよびポリミキシンBが担持可能な担体を意味する。本発明の担体は、メンブランベシクルに結合した本発明のペプチドまたはポリミキシンBと結合しメンブランベシクル-本発明のペプチドまたはポリミキシンB-本発明の担体の順で結合した複合体を形成し得る。
本発明の単離方法において利用する解離バッファー(以下、適宜「本発明の解離バッファー」という。)は、複合体からメンブランベシクルを解離させ、メンブランベシクルを単離することが可能な解離バッファーを意味する。
(複合体形成工程)
本発明の単離方法に含まれる複合体形成工程(以下、適宜「本発明の複合体形成工程」という。)は、メンブランベシクルを含む試料と、本発明の担体に担持された本発明のペプチドまたはポリミキシンBとを接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体に担持された前記ペプチドまたはポリミキシンBとが結合してなる複合体(メンブランベシクル-本発明のペプチドまたはポリミキシンB-本発明の担体の順で結合した複合体。以下、適宜「本発明の複合体」という。)を形成させる複合体形成工程である。
本発明の単離方法には、洗浄工程が含まれていることが好ましい。
本発明の単離方法に含まれる解離工程(以下、適宜「本発明の解離工程」という。)は、前記複合体形成工程によって得られた本発明の複合体と、本発明の解離バッファーとを接触させて、本発明の複合体からメンブランベシクルを解離させる工程である。
本発明の一実施形態に係るメンブランベシクルの除去方法(以下、適宜「本発明の除去方法」という。)は、メンブランベシクルを含む試料からメンブランベシクルを除去する、メンブランベシクルの除去方法であって、
前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、前記複合体形成工程によって形成された前記複合体を、前記試料から分離して、前記試料から前記メンブランベシクルの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程を含んでいる。
本発明の一実施形態に係る除去方法は、上述した本発明のペプチドおよびポリミキシンBが担持された本発明の担体を用いて行なうことができる。また、本発明の除去方法における「メンブランベシクルを含む試料」は、本発明の単離方法にて用いる試料と同様である。よって、材料については〔1-1.材料〕の説明を援用可能である。
(複合体形成工程)
本発明の除去方法は、複合体形成工程および分離工程を含む。複合体形成工程については、上述した本発明の単離方法に含まれる複合体形成工程と同様のため、〔1-2.工程〕の(複合体形成工程)の説明を援用可能である。
本発明の除去方法に含まれる分離工程(以下、適宜「本発明の分離工程」という。)は、
前記複合体形成工程によって形成された本発明の複合体を担持する本発明の担体と、本発明のペプチドまたはポリミキシンBが担持された本発明の担体と接触後の試料とを分離して、前記試料からメンブランベシクルの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程である。
解離工程の方法については、上述の本発明の単離方法に含まれる解離工程と同様のため、〔1-2.工程〕の(解離工程)の説明を援用可能である。解離工程により、本発明の担体が、メンブランベシクルを含む試料との接触前の状態に再生できる。また、解離工程後に、本発明のペプチドおよびポリミキシンBが本発明の担体に結合されたままとなる場合には、本発明のペプチドおよびポリミキシンBについても、本発明の担体に結合した状態で再利用できる。
本発明の一実施形態に係るメンブランベシクルの単離キット(以下、適宜「本発明のキット」という)は、上述した本発明の単離方法または本発明の除去方法を行なうためのキットであって、上述した本発明のペプチドおよびポリミキシンBが担持された本発明の担体および本発明の解離バッファーを含む。よって、キットの構成の説明については、〔1.メンブランベシクルの単離方法〕の説明が援用可能である。
〔材料および方法〕
(試料の調製)
メンブランベシクルを産生する細菌としてPseudomonas aeruginosa PAO1株(独立行政法人製品評価技術基盤機構 バイオテクノロジーセンター(NBRC))を用いて、以下の方法により試料の調製を行なった。培地はLB培地(シグマアルドリッチ社)を用いた。
(1)Pseudomonas aeruginosa PAO1株を5mLのLB培地に植菌し、37℃で一晩振とう培養を行なった。
(2)200mLのLB培地に、培養液の1%を植菌し、37℃で一晩培養を行なった。
(3)200mLの培養液を50mLずつ遠沈管にうつし、10000×g、10minの遠心分離を行ない、メンブランベシクルが含まれる培養上清を回収した。
(4)培養上清を0.45μmのフィルターと、0.22μmのフィルターと、で濾過して残存している菌体および夾雑物の除去を行ない、試料(以下、「上清サンプル」という。)とした。
図2で示すような、ポリリジン(連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチド)が結合した担体(以下、「ポリリジン固定担体」という。)を用いて、上清サンプルからのメンブランベシクルの単離および除去を行なった。ポリリジン固定担体は、参考文献(高分子論文集、64、12、821-829(2007))に記載の方法により調製した、20~40残基のリジンからなるポリリジンが固定化された多孔性球状セルロース粒子を用いた。
(1)100μLのポリリジン固定担体を、300μLのPBS(ナカライテスク社)に懸濁し、700×g、2minで遠心分離を行ない、上清を取り除くことで洗浄した。
(2)(1)の洗浄工程を3回行ない、ポリリジン固定担体を100μLのPBSで懸濁した。
(3)5mLの上清サンプルに添加し、2時間ロータリーミキシングを行なうことで、ポリリジン固定担体と上清サンプルを結合させた。
(4)700×g、2minの遠心分離を行ない、ポリリジン固定担体を沈殿させた。
(5)上清を取り除いて、ポリリジン固定担体を回収し、300μLのPBSで懸濁した。
(6)700×g、2minの遠心分離を行ない、上清を取り除くことで洗浄した。
(7)(6)の操作を3回行ない、解離バッファーを50μL添加し、ポリリジン固定担体に結合したメンブランベシクルを37℃で30分間溶出した。この間、10分おきにボルテックスを行なった。
(8)700×g、2minの遠心分離を行ない40μLの上清を回収して、溶出サンプルとした。
図2で示すような、ポリミキシンBが結合した担体(以下、「ポリミキシンB固定担体」という。)を用いて、上清サンプルからのメンブランベシクルの単離および除去を行なった。ポリミキシンB固定担体は、ポリミキシンBを固定化したアガロース担体を用いた。例えば、ポリミキシンBを固定化したアガロース担体は、参考文献(Biochemistry、16、1642-1648(1977))に記載の方法により調製することが可能である。
(1)50μLのポリミキシンB固定担体を、300μLのPBSに懸濁し、700×g、2minで遠心分離を行ない、上清を取り除くことで洗浄した。
(2)(1)の洗浄工程を3回行ない、ポリミキシンB固定担体を100μLのPBSで懸濁した。
(3)5mLの上清サンプルに添加し、2時間ロータリーミキシングを行なうことで、ポリミキシンB固定担体と上清サンプルを結合させた。
(4)700×g、2minの遠心分離を行ない、ポリミキシンB固定担体を沈殿させた。
(5)上清を取り除いて、ポリミキシンB固定担体を回収し、300μLのPBSで懸濁した。
(6)700×g、2minの遠心分離を行ない、上清を取り除くことで洗浄した。
(7)(6)の操作を3回行ない、解離バッファーを50μL添加し、ポリミキシンB固定担体に結合したメンブランベシクルを37℃で30分間溶出した。この間、10分おきにボルテックスを行なった。
(8)700×g、2minの遠心分離を行ない40μLの上清を回収して、溶出サンプルとした。
比較例1として、超遠心分離法によりメンブランベシクルを単離した。超遠心分離法の具体的な方法について、図4を参照して以下に説明する。
(1)40mLの上清サンプルをVivaspin20(100kDa MWCO、GE Healthcare社)に添加し2580×g、60min、4℃で遠心し約4mLになるまで限外濾過することで濃縮サンプルを得た。
(2)2mLの濃縮サンプルに1mLのPBSを添加し、110000×g、120min、4℃の条件で超遠心分離を行なった。
(3)上清を取り除いて、3mLのPBSで懸濁し、再度同じ条件で超遠心分離を行なった。
(4)上清を取り除いて、200μLのPBSで懸濁し、超遠心分離サンプルとした。
比較例2として、8個の連続したリジンを含むペプチドを磁性ビーズに結合させ(担持させ)、リジンペプチドが担持された磁性ビーズを用いて、メンブランベシクルの単離を行なった。担体としては、ストレプトアビジンが固定化された磁性ビーズ(VERITAS社製、Dynabeads M-280 streptavidin)(本明細書中では、「ストレプトアビジン磁性ビーズ」ともいう。)を用いた。
(1)100μL(1.0mg)のストレプトアビジン磁性ビーズを、1.5mLのマイクロチューブ(単に「チューブ」ともいう。)に加え、当該チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、上清を取り除いた。
(2)チューブをマグネットスタンドから外し、0.6mLのPBSを添加し、混合した。チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、上清を取り除いた。当該(2)の操作(洗浄)を合計3回行なった。
(3)チューブに400μLのPBSを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをPBS中に再懸濁し、洗浄したストレプトアビジン磁性ビーズ(400μL)を得た。
(4)チューブに、30μLのBiotin-K8(100μM)を加えた。
(5)チューブを室温で30分混合し、Biotin-K8とストレプトアビジン磁性ビーズとを接触させることによって、Biotin-K8をストレプトアビジン磁性ビーズに結合させた(すなわち担持させた。)。
(6)チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、上清を取り除いた。
(7)前記(2)と同様の操作(洗浄)を合計3回行なった。
(8)チューブに100μLのPBSを添加し、ストレプトアビジン磁性ビーズをPBS中に再懸濁し、Biotin-K8が担持されたストレプトアビジン磁性ビーズ(1.0mg/100μL)を得た。Biotin-K8が担持されたストレプトアビジン磁性ビーズを、「K8固定化磁性ビーズ」とした。
(9)40mLの上清サンプルに100μLのK8固定化磁性ビーズを添加し、2時間ロータリーミキシングを行なうことで、K8固定化磁性ビーズを上清サンプルと結合させた。
(10)チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、上清を取り除いた。
(11)次の操作を行ない、洗浄した:(11-1)チューブをマグネットスタンドから外し、1mLのPBSをチューブに添加して、混合した;(11-2)チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、上清を取り除いた。
(12)(11)の操作をさらに2回(合計3回)行ない、1%SDSを50μL添加し、K8固定化磁性ビーズに結合したメンブランベシクルを37℃で30分間溶出した。この間、10分おきにボルテックスを行なった。
(13)チューブをマグネットスタンドにセットして1分静置し、45μLの上清を回収して、K8サンプルとした。
上述の各単離方法で得た溶出サンプル、超遠心分離サンプル、およびK8サンプルを、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)により解析することで、メンブランベシクルの各単離方法による単離結果の比較を行なった。12.5%ポリアクリルアミドゲルを用いて、前記サンプルをSDS-PAGEに供した。その後、EzStain Silver(ATTO社)を用いて銀染色を行ない、溶出サンプル内に存在するタンパク質の検出を行なった。超遠心分離サンプルでは、20μLの超遠心分離サンプルに、20μLの2×SDSサンプルバッファー(4%SDS、10%スクロース、10%2-メルカプトエタノール)を混合し、そのうち20μL(培養上清1mL相当)を用いた。K8サンプルでは解離バッファーにSDSが含まれているため、そのまま20μL(培養上清16mL相当)のK8サンプルを用いた。
(比較例1)
比較例1として、超遠心分離法を用いたメンブランベシクルの単離によって得られた超遠心分離サンプルのSDS-PAGEを行なったところ、38kDa付近にOprFに相当するバンドが観察された。このバンドを切り出し、LC-MS/MS(Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry)解析を行なったところ、OprFであると同定できた。
(比較例2)
比較例2として、K8固定化磁性ビーズを用いたメンブランベシクルの単離方法によって得られたK8サンプルのSDS-PAGEを行なった。図6に比較例2のSDS-PAGEの結果を示す。図6に示すように、比較例2ではバンドは観察されなかったため、K8固定化磁性ビーズにはメンブランベシクルが結合しないことが示された。
本発明のポリリジン固定担体を用いたメンブランベシクルの単離方法において、ポリリジン固定担体に結合したメンブランベシクルを、解離バッファーの代わりに1×SDSサンプルバッファー(2%SDS、5%スクロース、5%2-メルカプトエタノール)によって溶解させ解離することで、メンブランベシクルの結合を比較した(実施例1)。実施例1ではSDSを用いてポリリジン固定担体からメンブランベシクルを溶解・解離したため、そのまま10μL(培養上清1mL相当)の溶出サンプルを用いてSDS-PAGEを行なった。
ポリミキシンB固定担体を用いたメンブランベシクルの単離方法において、解離バッファーとして1%デオキシコール酸ナトリウム溶液を用いた例を実施例2とした。実施例2では40μLの溶出サンプルに40μLの2×SDSサンプルバッファーを混合し、そのうち20μL(培養上清1mL相当)をSDS-PAGEに用いた。
ポリリジン固定担体を用いたメンブランベシクルの単離方法において、解離バッファーとして1M NaClを用いた例を実施例3、解離バッファーとして1M MgCl2を用いた例を実施例4とした。実施例3および実施例4では、金属陽イオンを含む解離バッファーを用いて、膜構造が破壊される可能性のあるタンパク質変性剤等を含まないマイルドな(温和な)条件でのメンブランベシクルの単離を試行した。実施例3および実施例4では、40μLの溶出サンプルに40μLの2×SDSサンプルバッファーを混合し、そのうち20μL(培養上清1mL相当)をSDS-PAGEに用いた。
ポリミキシンB固定担体を用いたメンブランベシクルの単離方法において、解離バッファーとして0.5M NaClを用いた例を実施例5、解離バッファーとして0.5M MgCl2を用いた例を実施例6とした。実施例5および実施例6では、金属陽イオンを含む解離バッファーを用いて、膜構造が破壊される可能性のあるタンパク質変性剤等を含まないマイルドな(温和な)条件でのメンブランベシクルの単離を試行した。実施例5および実施例6では、40μLの溶出サンプルに40μLの2×SDSサンプルバッファーを混合し、そのうち20μL(培養上清1mL相当)をSDS-PAGEに用いた。
ポリミキシンB固定担体を利用し、解離バッファーとして0.5M NaClを用いて単離した実施例5のメンブランベシクルについて、電子顕微鏡による観察を行なった。これにより、本発明の単離方法によって、インタクトな状態(またはインタクトに近い状態)のメンブランベシクルを単離できているかを確認した。
図7から図10中で示すように、実施例1から実施例6の溶出サンプルには、メンブランベシクルがポリリジン固定担体およびポリミキシンB固定担体に結合し、溶出していることが示された。よって、ポリリジン固定担体およびポリミキシンB固定担体にメンブランベシクルを結合させ遠心分離した後の上清は、メンブランベシクルを含む試料中からメンブランベシクルの少なくとも一部が除去された分離液であるといえる。このことから、本発明の除去方法によれば、試料からメンブランベシクルを高効率に除去できることが示された。
Claims (3)
- 細菌由来のメンブランベシクルを含む試料から前記メンブランベシクルを単離する、メンブランベシクルの単離方法であって、
前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、
前記複合体形成工程によって得られた前記複合体と、前記複合体から前記メンブランベシクルを解離させる解離バッファーとを接触させる解離工程と、を含み、
前記解離バッファーは、金属陽イオンを含むことを特徴とする、メンブランベシクルの単離方法。 - 請求項1に記載のメンブランベシクルの単離方法を行なうためのメンブランベシクルの単離キットであって、
前記ペプチドまたは前記ポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された前記担体と、前記解離バッファーと、を含むことを特徴とする、メンブランベシクルの単離キット。 - 細菌由来のメンブランベシクルを含む試料から前記メンブランベシクルを除去する、メンブランベシクルの除去方法であって、
前記試料と、連続する20個以上40個以下のリジンを含むペプチドまたはポリミキシンBの何れか1つ以上が担持された担体と、を接触させることによって、前記メンブランベシクルと前記担体とが結合してなる複合体を形成させる複合体形成工程と、
前記複合体形成工程によって形成された前記複合体を、前記試料から分離して、前記試料から前記メンブランベシクルの少なくとも一部が除去された分離液を得る分離工程を含むことを特徴とする、メンブランベシクルの除去方法。
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