JP7402460B1 - プロテオグリカンの製造方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
前記組成物は、プロテオグリカン及びエンドトキシンを含み、
前記組成物に対するエンドトキシン含有割合が4EU/mg以下である。
本明細書において、「プロテオグリカン」は、タンパク質(コアタンパク質)とグリコサミノグリカン(GAG、「多糖」または「糖鎖」ともいう。)とが共有結合した分子(糖タンパク質)を意味する。前記プロテオグリカンは、例えば、皮膚、臓器、および軟骨等の細胞外マトリックスとして存在する。前記グリコサミノグリカンは、通常、分岐構造を有さない長鎖構造を有する糖鎖として知られている。前記プロテオグリカンは、例えば、アグリカン(Aggrecan)、バーシカン(Versican)、デコリン(Decorin)、テスティカン(Testican)、ブレビカン(Brevican)、ビグリカン(Biglycan)、セルグリシン(Serglycin)、シンデカン(Syndecan)、パールカン(Perlecan)、ディストログリカン(Dystroglycan)、アグリン(Agrin)、クローストリン(Claustrin)、グリピカン(Glypican)、ルミカン、ケラトカンおよびニューロカン(Neurocan)等があげられる。前記プロテオグリカンは、例えば、前記タンパク質に結合しているGAGの種類によって、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、またはケラタン硫酸プロテオグリカンに分類できる。
・「新・界面活性剤入門」藤本武彦(三洋化成工業)、95頁記載の方法等であり、当該方法は、1質量%水溶液に希釈した非イオン性化合物を試験管に入れ、その中に温度計と撹拌棒を入れ、撹拌棒で静かに撹拌しながらゆっくり昇温させると、一定温度以上になった時に透明だった水溶液が白濁するので、この白濁した時の温度を測定し、この温度を曇点とするものである。
なお、界面活性剤における前記曇点の定義は、例えば、JIS K3211にもあげられている。
ある態様において、本開示は、プロテオグリカンの製造方法を提供する。本開示の製造方法は、非イオン界面活性剤を用いて、動物組織由来のプロテオグリカンからエンドトキシンを低減する低減工程を含む。本開示の製造方法によれば、所定のプロテオグリカンの分子量を維持したまま、エンドトキシンを低減することができる。
HPLCシステム:LC-20AD(株式会社島津製作所社製)
カラム:TSKgel G5000-PWXL φ7.8mm×300mm(東ソー社製)
溶出液:pH6.8 リン酸緩衝液
流速:0.5mL/min
カラム温度:40℃
検出器:示差屈折率検出器(RID-20A 株式会社島津製作所社製)
注入量:50μL
分子量マーカー:Shodex STANDARD P-82(プルラン)
別の態様において、本開示は、動物組織由来のプロテオグリカンを含む組成物を提供する。本開示の組成物は、プロテオグリカン及びエンドトキシンを含み、前記組成物に対するエンドトキシン含有割合が4EU/mg以下である。
本開示の製造方法により、動物組織由来のプロテオグリカンからエンドトキシンを低減することができ、かつ前記プロテオグリカンの所定の分子量(分子量が約45万)を維持できた。
HPLCシステム:LC-20AD(株式会社島津製作所社製)
カラム:TSKgel G5000-PWXL Φ7.8mm×300mm(東ソー社製)
溶出液:pH6.8 リン酸緩衝液
流速:0.5mL/min
カラム温度:40℃
検出器:示差屈折率検出器(RID-10A 株式会社島津製作所社製)
注入量:50μL
分子量マーカー:Shodex STANDARD P-82(プルラン)
前記分子量マーカーのピークトップ分子量(Mp)および重量平均分子量(Mw)/数平均分子量(Mn)は、下記の通りである。
STD P-800:Mp:739,000、Mw/Mn:1.24
STD P-400:Mp:348,000、Mw/Mn:1.33
STD P-200:Mp:216,000、Mw/Mn:1.22
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STD P-20:Mp:22,000、Mw/Mn:1.08
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0.2mol/l NaCl含有リン酸緩衝液(pH6)に代えて、0.001規定の水酸化ナトリウム含有のエタノールを用いた以外は、実施例1と同様の方法で、比較例1Aのサンプルの作製、エンドトキシン濃度の測定、およびHPLC分析を行った。この結果、比較例1Aのサンプルにおいて、プロテオグリカンの所定の分子量(約45万)の維持は確認できたが、エンドトキシンの低減が確認できなかった。
0.2mol/l NaCl含有リン酸緩衝液(pH6)に代えて、0.01規定の水酸化ナトリウム含有のエタノールを用いた以外は、実施例1と同様の方法で、比較例2のサンプルの作製、エンドトキシン濃度の測定、およびHPLC分析を行った。この結果、比較例1Bのサンプルにおいて、エンドトキシンの濃度は、167.8EU/mgであった。以上の結果から、比較例1Bのサンプルでは、実施例1と比べ、エンドトキシンの低減がされていないことがわかった。
0.2mol/l NaCl含有リン酸緩衝液(pH6)に代えて、0.025規定の水酸化ナトリウム含有のエタノールを用いた以外は、実施例1と同様の方法で、比較例1Cのサンプルの作製、エンドトキシン濃度の測定、およびHPLC分析を行った。この結果、比較例3のサンプルにおいて、エンドトキシンの濃度は、33.7EU/mgであり、プロテオグリカンの分子量は、所定の分子量(約45万)であった。以上の結果から、比較例1Cのサンプルでは、エンドトキシン濃度が低減されている一方で、所定のプロテオグリカンの分子量が維持されていないことがわかった。
本開示の製造方法を用いて、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法を用いて、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
0.05mol/l リン酸緩衝液(pH6.0)に、7.8mgのサケ由来のプロテオグリカンを添加し、前記添加後、23℃、24時間静置した。
本開示の製造方法によって、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法において低減工程を繰り返し行うことによって、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法によって、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法の形成工程の共存系に1(v/v)%のエタノール含有水性溶媒を用いることにより、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法において低減工程を繰り返し行うことによって、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
本開示の製造方法において低減工程を繰り返し行い、かつ2回目の形成工程の共存系に1(v/v)%のエタノール含有水性溶媒を用いることにより、動物組織由来のプロテオグリカンにおけるエンドトキシンを低減できることを確認した。
上記の実施形態および実施例の一部または全部は、以下の付記のように記載されうるが、以下には限られない。
<プロテオグリカンの製造方法>
(付記1)
非イオン界面活性剤を用いて、動物組織由来のプロテオグリカンからエンドトキシンを低減する低減工程を含む、プロテオグリカンの製造方法。
(付記2)
前記低減工程は、
前記非イオン界面活性剤と前記動物組織由来のプロテオグリカンとを含む共存系について、前記非イオン界面活性剤の曇点未満の温度から、前記曇点以上の温度に昇温し、前記非イオン界面活性剤を含む界面活性剤相を形成して、前記界面活性剤相に前記エンドトキシンを濃縮する濃縮工程と、
前記界面活性剤相以外の相を回収することにより、前記エンドトキシンが低減されたプロテオグリカンを回収する回収工程と、
を含む、付記1に記載の製造方法。
(付記3)
前記低減工程は、前記界面活性剤相と、前記界面活性剤相以外の相とを、分離する分離工程を含み、
前記回収工程では、前記分離後の前記界面活性剤相以外の相を回収する、付記2に記載の製造方法。
(付記4)
前記界面活性剤相以外の相は、水相である、付記3に記載の製造方法。
(付記5)
前記分離は、遠心分離による分離である、付記3または4に記載の製造方法。
(付記6)
前記共存系は、前記非イオン界面活性剤のミセルを含み、
前記ミセルは、前記エンドトキシンを含む、
付記2から5のいずれかに記載の製造方法。
(付記7)
前記低減工程に先立ち、前記非イオン界面活性剤と前記動物組織由来のプロテオグリカンとを接触させて、前記エンドトキシンを含む前記非イオン界面活性剤のミセルを形成する形成工程を含み、
前記濃縮工程では、前記ミセルから、前記界面活性剤相を形成して、前記界面活性剤相に前記エンドトキシンを濃縮する、付記2から6のいずれかに記載の製造方法。
(付記8)
前記非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(POEAE)系非イオン界面活性剤である、付記1から7のいずれかに記載の製造方法。
(付記9)
前記非イオン界面活性剤は、ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテルである、付記1から8のいずれかに記載の製造方法。
(付記10)
前記低減工程後のプロテオグリカンのピークトップ分子量は、30万~130万である、付記1から9のいずれかに記載の製造方法。
(付記11)
前記プロテオグリカンの糖鎖は、コンドロイチン硫酸である、付記1から10のいずれかに記載の製造方法。
(付記12)
前記動物は、サケ、ブタ、トリ、カレイ、およびエイからなる群から選択される、付記1から11のいずれかに記載の製造方法。
<組成物>
(付記13)
動物組織由来のプロテオグリカンを含む組成物であって、
前記組成物は、プロテオグリカン及びエンドトキシンを含み、
前記組成物に対するエンドトキシン含有割合が4EU/mg以下である、組成物。
(付記14)
前記プロテオグリカンのピークトップ分子量は、30万~130万である、付記13に記載の組成物。
(付記15)
前記プロテオグリカンの糖鎖は、コンドロイチン硫酸である、付記13または14に記載の組成物。
(付記16)
前記動物は、サケ、ブタ、トリ、カレイ、およびエイからなる群から選択される、付記13から15のいずれかに記載の組成物。
Claims (8)
- 非イオン界面活性剤と動物組織由来のプロテオグリカンとを混合して、エンドトキシンを含む前記非イオン界面活性剤のミセルを形成する形成工程と、
前記非イオン界面活性剤を用いて、前記動物組織由来のプロテオグリカンからエンドトキシンを低減する低減工程とを含み、
前記低減工程は、
前記非イオン界面活性剤と前記動物組織由来のプロテオグリカンとを含む共存系について、前記非イオン界面活性剤の曇点未満の温度から、前記曇点以上の温度に昇温し、前記ミセルから、前記非イオン界面活性剤を含む界面活性剤相を形成して、前記界面活性剤相に前記エンドトキシンを濃縮する濃縮工程と、
前記界面活性剤相と、前記界面活性剤相以外の相とを、分離する分離工程と、
前記分離後の界面活性剤相以外の相を回収することにより、前記エンドトキシンが低減されたプロテオグリカンを回収する回収工程と、
を含む、プロテオグリカンの製造方法。 - 前記界面活性剤相以外の相は、水相である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記分離は、遠心分離による分離である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記非イオン界面活性剤は、ポリオキシエチレンアルキルエーテル(POEAE)系非イオン界面活性剤である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記非イオン界面活性剤は、ポリエチレングリコール tert-オクチルフェニルエーテルである、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記低減工程後のプロテオグリカンのピークトップ分子量は、30万~130万である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記プロテオグリカンの糖鎖は、コンドロイチン硫酸である、請求項1または2に記載の製造方法。
- 前記動物は、サケ、ブタ、トリ、カレイ、およびエイからなる群から選択される、請求項1または2に記載の製造方法。
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