JP7397528B2 - ｐＨ依存的抗原結合活性の操作による薬物動態の改善された抗ＨＩＶ抗体 - Google Patents

ｐＨ依存的抗原結合活性の操作による薬物動態の改善された抗ＨＩＶ抗体 Download PDF

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Description

配列表
本願は、電子的にＡＳＣＩＩフォーマットで提出されており参照することにより全体が本書に組み込まれる配列表を含む。２０２０年８月１９日作成の該ＡＳＣＩＩ版は、名称が50538-033WO2_Sequence_Listing_08.19.20_ST25であり、サイズが１２３９８バイトである。
関連出願の相互参照
本願は、２０１９年８月１９日出願の米国仮出願第６２／８８８８４０号の優先権を主張し、その内容は参照することにより全体が本書に組み込まれる。
発明の分野
本開示は全般に、ＨＩＶの予防および治療のための改善された抗ＨＩＶ抗体に関する。本開示は全般に、抗ＨＩＶ抗体のヒスチジン変異にも関する。特に、本開示は、ＨＩＶの予防および治療のためのヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体に関する。
発明の背景
ＨＩＶ－１の侵入は、ウイルスエンベロープ（Ｅｎｖ）糖タンパク質ｇｐ１２０とＴ細胞受容体ＣＤ４のドメイン１（Ｄ１）との相互作用によって引き起こされる。イバリズマブ（ｉＭａｂ）は、広範にＨＩＶ－１を中和する強力なＡｂであり（Jacobson et al., Antimicrob. Agents Chemother. 53:450-457, 2009; Kuritzkes et al., J. Infect. Dis. 189:286-291, 2004）、宿主Ｔ細胞上のＣＤ４受容体の、主としてドメイン２（Ｄ２）に結合し、それによってＨＩＶがＴ細胞内への侵入を達成し感染を成立させるためにＣＤ４受容体を使用する能力を阻害することによって、ＨＩＶを中和する（Burkly et al., J. Immunol. 149:1779-178, 1992）。最近試験された初代分離株の大きなパネル（１１８のＥｎｖシュードタイプ化ウイルス）において、イバリズマブは、５０％感染抑制で全ウイルスの９２％を中和し、９０％感染抑制でウイルスの４７．４％を中和した。イバリズマブは広範なＨＩＶ分離株を強力に抑制することができるが、依然多くのＨＩＶバリアントがイバリズマブの抑制活性から逃れることができる。ＨＩＶタイプ１エンベロープの可変領域５におけるアスパラギン結合グリコシル化部位の欠如がイバリズマブ耐性に関連することが最近報告された（Toma et al., J. Virology 85(8): 3872-2880, 2011; Pace et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Epub ahead of print: September 2012）。
抗体は、その定常領域中の保存された位置においてグリコシル化され、定常領域に結合した炭水化物の存在および構造が抗体活性に影響しうる（Wright and Morrison, TIBTECH 15: 26-32, 1997におけるレビューを参照されたい）。
軽鎖ではなく重鎖におけるＮ－結合炭水化物の導入が、溶解性の改善をもたらすことが報告されている（Pepinsky et al., Protein Sci 19, 954-966, 2010; Wu, et al., Protein Eng Des Sel 23, 643-651, 2010）。Pepinskyの文献において、改変は、可変領域ではなく定常領域におけるものである。一方、抗体の可変領域に戦略的に配置されたグリカンの効果に係る研究は過去に存在しない。
ＨＩＶタイプ１エンベロープの可変領域５におけるアスパラギン結合グリコシル化部位の欠如が、イバリズマブ耐性に関連することが報告されている（Toma et al., J. Virology 85(8): 3872-2880, 2011; Pace et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. Epub ahead of print: September 2012）。さらに、米国特許第９７９０２７６号および第９５８７０２２号に、グリカン修飾抗ＣＤ４モノクローナル抗体が、抗ＣＤ４抗体の可変領域におけるグリカン修飾によって活性の向上もたらしたことが開示されている。これら特許において、グリカン修飾抗ＣＤ４抗体は、可変領域に操作されたＮ－結合グリコシル化部位を有する改変形態の抗ＣＤ４抗体である。いくつかの具体的な態様において、操作されたＮ－結合グリコシル化部位は、イバリズマブ軽鎖の残基３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒ、および７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置に存在する。ある特定の例において、グリコシル化部位は３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよびその組み合わせのいずれかであり、これが改善されたＨＩＶ予防または治療活性を提供する。
ＨＩＶの予防および治療のために、さらに改善された抗ＨＩＶ抗体を開発することが依然望ましい。
発明の概要
本発明は、抗ＨＩＶ抗体の活性を、該抗体の軽鎖および重鎖の可変領域におけるヒスチジン変異によって高めるための新規アプローチを提供する。
一側面において、本発明は、重鎖中の残基に１つ以上の変異を有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、前記残基がＹ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８、Ｔ１００ａおよびその組み合わせからなる群から選択され、前記抗ＨＩＶ抗体が、米国特許第９７９０２７６号および第９５８７０２２号（これらは参照することにより全体が本書に組み込まれる）に開示されるグリカン修飾抗ＣＤ４モノクローナル抗体である、抗体を提供する。
他の一側面において、本発明は、軽鎖中の残基に１つ以上の変異を有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、前記残基がＳ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択される、抗体を提供する。
他の一側面において、本発明は、重鎖中の前記残基の１つにおける変異、および軽鎖中の前記残基の１つにおける変異の組み合わせを有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
他の一側面において、本発明は、重鎖中の残基Ｙ５３ａにおける変異、および軽鎖中の前記残基の１つにおける変異の組み合わせを有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
他の一側面において、本発明は、重鎖中の残基Ｄ５８における変異、および軽鎖中の前記残基の１つにおける変異の組み合わせを有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
本発明の一態様において、抗ＨＩＶ抗体は、抗ＣＤ４抗体、特に米国特許第９７９０２７６号および第９５８７０２２号に開示されるグリカン修飾を有する抗ＣＤ４抗体、とりわけイバリズマブである。
一例として、本発明は、イバリズマブの重鎖中の残基Ｙ５３ａおよび軽鎖中の残基Ｙ９４のそれぞれの２つのヒスチジン変異を有するバリアントである改変バリアントを提供する（「ＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４」または「Ｙ５３ａ／Ｙ９４」または「Ｙ９４／Ｙ５３ａ」と称する）。バリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４は、異なるｐＨ値で所望の抗体－抗原結合性を示すと同時に、野生型イバリズマブ（「ｗｔ」）と同等のインビトロＨＩＶ－１中和活性を持ち、したがって、該変異は正常なイバリズマブの機能を損なわないことが示された。バリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４は、半減期の長さがアカゲザルにおいて野生型イバリズマブの２．１倍であり（Ｐ＝０．００８）、それによってＣＤ４受容体を占拠する時間が５０％延長された。半減期および受容体占拠の同様の改善がヒトにおいて観察されるなら、バリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４は野生型イバリズマブよりも投与頻度が少なくて済む。
別の一例として、本発明は、イバリズマブの重鎖中の残基Ｄ５８および軽鎖中の残基Ｌ３０のそれぞれの２つのヒスチジン変異を有するバリアントである改変バリアントを提供する（「ＨＣ Ｄ５８／ＬＣ Ｌ３０」または「Ｆ５８／Ｌ３０」または「Ｌ３０／Ｄ５８」と称する）。
本発明の態様をさらに記載する：
［項１］
イバリズマブの重鎖中の残基に１つ以上の変異を有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、前記残基がＹ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８、Ｔ１００ａおよびその組み合わせからなる群から選択され、または前記残基がＳ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択され；前記イバリズマブが位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されている、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項２］
イバリズマブの重鎖および軽鎖のそれぞれの残基の変異の組み合わせを有し、ここで、前記残基がＹ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８、Ｔ１００ａおよびその組み合わせからなる群から選択され、Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択される前記抗体の軽鎖中の残基の１つに変異を有する、上記項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項３］
イバリズマブの重鎖中の残基Ｙ５３ａにおける変異と、Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択されるイバリズマブの軽鎖中の残基の１つにおける変異の組み合わせを有する、上記項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項４］
イバリズマブの重鎖中の残基Ｄ５８における変異と、Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択されるイバリズマブの軽鎖中の残基の１つにおける変異の組み合わせを有する、上記項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項５］
ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、イバリズマブの重鎖中の残基Ｙ５３ａと軽鎖中の残基のＹ９４とで２つのヒスチジン変異を有するバリアントであり、前記イバリズマブが位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されている、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項６］
ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、イバリズマブの重鎖中の残基Ｄ５８と軽鎖中の残基のＬ３０とで２つのヒスチジン変異を有するバリアントであり、前記イバリズマブが位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されている、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
［項７］
上記項１に記載の抗体、および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
［項８］
上記項１に記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、ＨＩＶに感染した対象を処置する方法。
［項９］
上記項１のいずれかに記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、必要とする対象においてＨＩＶ感染を予防する方法。
［項１０］
上記項５に記載の抗体、および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
［項１１］
上記項５に記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、ＨＩＶに感染した対象を処置する方法。
［項１２］
上記項５のいずれかに記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、必要とする対象においてＨＩＶ感染を予防する方法。
［項１３］
上記項６に記載の抗体、および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
［項１４］
上記項６に記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、ＨＩＶに感染した対象を処置する方法。
［項１５］
上記項６のいずれかに記載の抗体を処置有効量で対象に投与することを含む、必要とする対象においてＨＩＶ感染を予防する方法。
図１Ａは、重鎖中の異なるＣＤＲ残基のそれぞれにヒスチジン変異を有する各イバリズマブバリアントのｐＨ７．４、６．０および５．０（残基毎に左から右へ）におけるＣＤ４結合活性を、競合ＥＬＩＳＡによって野生型との比較で示すものである。残基毎に右端の棒は「ｐＨ５．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」である。 図１Ｂは、イバリズマブ重鎖中の残基Ｙ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８またはＴ１００ａにヒスチジン変異を有する６つのバリアントが、野生型イバリズマブとの比較でｐＨ７．４において３．０倍以下でＣＤ４結合活性を維持したことを示す（ｐＨ７．４、６．０および５．０（残基毎に左から右へ））。残基毎に右端の棒は「ｐＨ５．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」である。 図２Ａは、軽鎖中の異なるＣＤＲ残基のそれぞれにヒスチジン変異を有する各イバリズマブバリアントのｐＨ７．４、６．０および５．０（残基毎に左から右へ）におけるＣＤ４結合活性を、競合ＥＬＩＳＡによって野生型との比較で示すものである。残基毎に右端の棒は「ｐＨ７での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ５での対ｗｔ結合低下比」である。 図２Ｂは、イバリズマブ軽鎖中の残基Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３またはＹ９４にヒスチジン変異を有する７つのバリアントが、野生型イバリズマブとの比較でｐＨ７．４において３．０倍以下でＣＤ４結合活性を維持したことを示す（ｐＨ７．４、６．０および５．０（残基毎に左から右へ））。残基毎に右端の棒は「ｐＨ５．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」である。そのＹ軸は「ｐＨ５での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７での対ｗｔ結合低下比」である。 図３Ａは、イバリズマブ重鎖中の残基Ｄ５８、Ｅ６１、Ｋ６４、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８またはＴ１００ａのヒスチジン変異と、イバリズマブ軽鎖中の残基Ｌ３０、Ｙ９２、Ｓ９３またはＹ９４のいずれかの変異の組み合わせのＣＤ４結合活性を示す。イバリズマブの残基Ｙ５３ａとＹ９４のヒスチジン変異の組み合わせ（「Ｙ５３ａ／Ｙ９４」）、または残基Ｄ５８とＬ３０のヒスチジン変異の組み合わせ（「Ｄ５８／Ｌ３０」）が、野生型イバリズマブとの比較でｐＨ７．４において３．０倍以下でＣＤ４結合活性を維持したことが示される（ｐＨ７．４、６．０、５．０、「ｐＨ５．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」、および「ｐＨ６．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」（残基毎に左から右へ）。 図３Ｂは、イバリズマブのＹ５３ａまたは軽鎖Ｙ９４に単一の変異を有するバリアントと比較して、組み合わせバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４のＣＤ４結合活性を示す（ｐＨ７．４、６．０、５．０、「ｐＨ５．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」、および「ｐＨ６．０での対ｗｔ結合低下比／ｐＨ７．４での対ｗｔ結合低下比」（残基毎に左から右へ）。 図４は、表面プラズモン共鳴分析によって測定された野生型イバリズマブ（ｗｔ）およびバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４のｐＨ７．４、ｐＨ６．０およびｐＨ５．０における抗原結合カイネティクスの比較を提供する。ＨＣ Ｙ５３ａ；ＬＣ ９４およびＨｉｓ－ＦｃＲｎでは、ｐＨ７．４が上の線、ｐＨ６．０が中間の線、ｐＨ５．０が下の線である。 図５は、Ｙ９４／Ｙ５３ａ－ＬＡＬＡおよびＹ９４／Ｙ５３ａ－ＬＡＬＡ ＦｃＲｎを包含するバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４のインビトロＨＩＶ－１中和活性が、野生型イバリズマブ（ＭＶ１－ＬＡＬＡ）と同程度であったことを示す。 図６Ａは、各抗体を０．７５ｍｇ／ｋｇで投与されたアカゲザルにおける、野生型イバリズマブ（Ｗｔ、青線）およびバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４（「Ｈｉｓ」と記され、緑線で示されるもの；および「Ｈｉｓ ＦｃＲｎ」と記され、赤線で示されるもの）の薬物動態を示す。各線は、各アカゲザルにおいて観察された抗体濃度を示す。点線はアッセイの定量下限（ＬＬＱ）を示す。 図６Ｂは、各抗体を０．７５ｍｇ／ｋｇで投与されたアカゲザルにおける、野生型イバリズマブ（Ｗｔ、青線）およびバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４（Ｈｉｓ、緑線；およびＨｉｓ ＦｃＲｎ、赤線）によるＣＤ４占拠時間を示す。各線は、各アカゲザルにおいて観察されたＣＤ４占拠を示す。 図７は、ヒスチジンバリアントは野生型イバリズマブよりも、ＣＤ４受容体ダウンモジュレーションを誘導する程度が小さかったことを示す。
発明の詳細な説明
本発明の前記のおよび他の特徴、ならびにそれを得るおよび用いる方法は、以下の説明によってより明らかになり、よく理解されうる。
本書において使用する科学用語および技術用語は、本書において別の定義をしない限り、当業者に通常理解される意味を有する。
本発明は、モノクローナル抗体の機能を、抗ＨＩＶ抗体の可変領域におけるグリカン修飾、および重鎖におけるヒスチジン変異によって改善できることを初めて示したものである。
したがって、本発明は、Ｙ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８、Ｔ１００ａおよびその組み合わせからなる群から選択される重鎖中の残基に１つ以上の変異を有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、前記抗ＨＩＶ抗体が、米国特許第９７９０２７６号および第９５８７０２２号に開示されるグリカン修飾抗ＣＤ４モノクローナル抗体である、抗体を提供する。
本発明はさらに、Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｓ９３、Ｙ９４およびその組み合わせからなる群から選択される軽鎖中の残基に１つ以上の変異を有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
本発明はまた、重鎖中の前記残基の１つにおける変異、および軽鎖中の前記残基の１つにおける変異の組み合わせを有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
一例として、本発明は、重鎖中の残基Ｙ５３ａまたはＤ５８における変異、および軽鎖中の前記残基における変異の組み合わせを有するヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体を提供する。
具体的な一例として、本発明は、異なるｐＨ値において所望の抗体－抗原結合性を示すと同時に、ｗｔと同等のインビトロＨＩＶ－１中和活性を持ち、したがって変異によって正常なイバリズマブの機能が損なわれていない、改変バリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４およびＨＣ Ｄ５８／ＬＣ Ｌ３０を提供する。
定義
「抗原」とは、１つ以上のエピトープを含み、免疫学的反応を引き起こすことのできる分子をいう。「抗原分子」も、一般的な意味で、本書に開示されるグリカン修飾タンパク質の結合標的である分子をさして用いられる。
抗原決定基とも称される「エピトープ」は、免疫系、すなわちＢ細胞、Ｔ細胞または抗体によって認識される抗原分子の部分である。エピトープは、コンフォメーショナルエピトープまたはリニアエピトープでありうる。コンフォメーショナルエピトープは、抗原分子の不連続な部分によって形成される、または複数の分子によって形成される。抗原がタンパク質である場合、コンフォメーショナルエピトープは、同一タンパク質分子の不連続なアミノ酸残基によって形成されうる、または異なるタンパク質分子上のアミノ酸残基によって形成されうる（例えばタンパク質のマルチマーによって形成されるクォータナリエピトープ）。リニアエピトープは、抗原の連続する部分、例えばタンパク質抗原の連続するアミノ酸配列によって形成される。
用語「抗体」は本書において広い意味で用いられ、インタクトなポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多重特異性、キメラ、ヒト化、ヒト、霊長類化、一本鎖、シングルドメイン、合成および組換え抗体を包含するインタクトな抗体分子、ならびに所望の活性または機能を有する抗体フラグメントを包含する。
本書において使用される用語「抗体フラグメント」は、特にインタクトな抗体の抗原結合フラグメントを包含する。抗原結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる）、Ｆａｂ’フラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる）、Ｆａｂ’フラグメント（ＣＨ１ドメインのＣ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む少数の残基をさらに有する点で、Ｆａｂフラグメントと異なる）、（Ｆａｂ’）２フラグメント（２つのＦａｂ’フラグメントがヒンジ領域においてジスルフィド架橋で連結されたもので形成される）、Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなる）、Ｆｖフラグメント（完全な抗原認識および結合部位を含む、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインが強く非共有結合により結合した二量体をいう）、ｄＡｂフラグメント（ＶＨドメインからなる）、シングルドメインフラグメント（ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、ＶＨＨドメイン、またはＶＮＡＲドメイン）、単離されたＣＤＲ領域、ｓｃＦｖ（「一本鎖Ｆｖ」とも言い、リンカーで連結されたＶＬおよびＶＨドメインの融合体をいう）、および抗原結合機能を維持する他の抗体フラグメントを包含するが、それに限定されない。
用語「可変領域」とは、抗体の抗原結合領域をいい、異なる抗体分子間で大きく異なる。そのような相異がなく、一般に免疫系のエフェクター機能に関与する抗体領域は、「定常領域」と呼ばれる。免疫グロブリン鎖（成熟形態）の最初のおよそ１１０のアミノ酸が可変ドメインを構成する。２つの重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および２つの軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が、抗体の可変領域を構成する。６つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）および２つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）が、抗体の定常領域を構成する。
用語「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」とは、抗体可変ドメイン中の超可変領域をいう。重鎖および軽鎖の各可変ドメイン中に３つのＣＤＲがあり、抗原結合に与るアミノ酸残基で構成される。用語「フレームワーク領域」または「ＦＲ」とは、比較的保存された可変ドメイン部分をいい、超可変領域残基以外の残基で構成される。
抗体の「抗原結合部位」なる用語は、抗原が結合する、抗体のアミノ酸によって形成されるコンフォメーションおよび／またはコンフィギュレーションを意味する。例えば、ＶＨおよびＶＬドメインのそれぞれの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上に抗原結合部位を規定する。６つのＣＤＲが一緒になって、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（すなわちＶＨまたはＶＬ）も、６つ全てのＣＤＲによる完全な結合部位と比べて有効性はしばしば劣るものの、抗原を認識し結合することができることに注意すべきである。
用語「キメラ抗体」とは、異なるソース、例えば異なる種または異なる抗体クラスもしくはサブクラスに由来するポリペプチドを含む抗体をいう。キメラ抗体の例は、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部分にヒト免疫グロブリンのＦｃフラグメントが融合されたものを包含する。キメラ抗体を作製する方法は当分野において知られており、例えばBossらの米国特許第４８１６３９７号、およびCabillyらの米国特許第４８１６５６７号に記載される方法がある。
用語「ヒト化抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのバックボーンまたはフレームワーク中に非ヒト配列エレメントを含む抗体をいう。一般的にヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）において、超可変領域（ＣＤＲ）中の残基が、所望の特異性、親和性および能力を有する、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類といった非ヒト種（ドナー抗体）の超可変領域の残基で置き換えられたものである。ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基も非ヒト残基で置き換えられる場合もある。ヒト化抗体は、抗体性能をさらに改善するために導入された、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含みうる場合もある。一般的にヒト化抗体は、超可変領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、フレームワーク領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリン配列のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体は場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのＦｃの、少なくとも一部を含む。ヒト化抗体を作製する方法は当分野において知られており、例えばWinterの米国特許第５２２５５３９号、およびBossらの米国特許第４８１６３９７号を参照されたい。
用語「非ヒト霊長類化抗体」とは、ヒト配列エレメントまたは非霊長類配列エレメントを非ヒト霊長類免疫グロブリンバックボーンまたはフレームワーク中に含む抗体をいう。例えば、非ヒト霊長類化抗体は、非ヒト霊長類免疫グロブリン（レシピエント抗体）から、該レシピエント抗体の超可変領域（ＣＤＲ）中の残基を、所望の特異性、親和性および能力を有する、ヒトまたはマウス、ラットもしくはウサギといった非霊長類種に由来するドナー抗体の超可変領域由来残基で置き換えることによって作製することができる。また、非ヒト霊長類化抗体は、所望の霊長類種への投与に適するように、ヒトもしくは非霊長類配列または異なる霊長類種に由来する配列を有するレシピエント免疫グロブリンを用い、該レシピエント免疫グロブリンに、所望の霊長類に由来するＦｃフラグメントおよび／または残基（特にフレームワーク領域残基を包含する）を導入することによって作製することもできる。非ヒト霊長類化抗体の例は、本書の実施例に開示される「サル化」抗体を包含する。
用語「単一特異性抗体」とは、１つのエピトープを認識しそれに結合する抗体をいう。
用語「多重特異性抗体」とは、少なくとも２つの別個の抗体から形成され、複数（すなわち、２つ以上）の別個のエピトープに結合する抗体をいう。
用語「中和抗体」とは、ＨＩＶ－１感染を抑制、軽減または完全に予防する抗体をいう。抗体が中和抗体であるかは、後述の実施例において記載されるインビトロアッセイによって決定することができる。
用語「強力な中和抗体」とは、低濃度で使用されたときにＨＩＶ－１感染を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％またはそれ以上低減する抗体をいう。５０μｇ／ｍｌ未満、１～５０μｇ／ｍｌ、または１μｇ／ｍｌ未満の濃度が、「低濃度」とみなされる。いくつかの態様において、低濃度は、１０～９００ｎｇ／ｍｌといったピコモル範囲の濃度であり、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、７５、５０、２５、１０ｎｇ／ｍｌ、または１０ｎｇ／ｍｌ未満といった、該範囲の任意の濃度を包含する。
用語「広範な中和抗体」とは、ＨＩＶ－１感染を抑制する抗体で、ＨＩＶ－１エンベロープシュードタイプ化ウイルスおよびウイルス分離株の大きなパネル（１００を超える）、例えば地理、クレード、トロピズムおよび感染ステージによるエンベロープ多様性を示す大きな分離株パネルの、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超または９９％超において、インビトロで５０％の感染抑制で規定されるものをいう。
本書において用語「フラグメント」とは、生体分子の一次構造の物理的に連続する部分をいう。タンパク質の場合、フラグメントは、タンパク質のアミノ酸配列の連続する部分によって規定され得、少なくとも３～５アミノ酸、少なくとも６～１０アミノ酸、少なくとも１１～１５アミノ酸、少なくとも１６～２４アミノ酸、少なくとも２５～３０アミノ酸、少なくとも３０～４５アミノ酸、ないしタンパク質完全長から少数のアミノ酸が除かれたものでありうる。ポリヌクレオチドの場合は、フラグメントはポリヌクレオチドの核酸配列の連続する部分によって規定され得、少なくとも９～１５ヌクレオチド、少なくとも１５～３０ヌクレオチド、少なくとも３１～４５ヌクレオチド、少なくとも４６～７４ヌクレオチド、少なくとも７５～９０ヌクレオチド、および少なくとも９０～１３０ヌクレオチドでありうる。いくつかの態様において、生体分子のフラグメントは、免疫原性フラグメントである。
「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２つ以上のアミノ酸の連結により形成される任意の化合物であり、通常、各アミノ酸残基のαアミノ基（ＮＨ２末端を除く）が次の残基のαカルボキシル基に結合して直鎖をなしている、αアミノ酸のポリマーである。本書において別の意味を示さない限り、このクラスの化合物をサイズ制限なしに指して、ペプチド、ポリペプチド、およびポリ（アミノ酸）という用語が同義に使用される。このクラスのサイズの大きい構成員は、タンパク質とも称され、抗体を包含する。
本発明の特定の一例において、バリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４が、異なるｐＨ値において所望の抗体－抗原結合性を示すこと（図４）、野生型イバリズマブと同等のインビトロＨＩＶ－１中和活性を示し、したがって、該変異は正常なイバリズマブの機能を損なわなかったこと（図５）が確認された。バリアントＹ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４は、半減期の長さがアカゲザルにおいて野生型イバリズマブの２．１倍であり（Ｐ＝０．００８；図６Ａ）、それによってＣＤ４受容体を占拠する時間が５０％延長された（図６Ｂ）。半減期および受容体占拠の同様の改善がヒトにおいて観察されるなら、ＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４は野生型イバリズマブよりも投与頻度が少なくて済む。
抗ＨＩＶ抗体は従来技術に記載されており、ＣＤ４受容体のタンパク質配列が当業者に利用可能であるので作製も容易である。ＣＤ４は、細胞の細胞外表面上に位置する４つの免疫グロブリンドメイン（Ｄ１～Ｄ４）を有し、ＭＨＣクラスII分子のβ２ドメインとの相互作用のためにＤ１ドメインを用いる。いくつかの態様において、抗ＨＩＶ抗体は、Ｄ１、Ｄ１－Ｄ２接合部、Ｄ２、Ｄ２のＢＣもしくはＦＧループ、またはその任意の組み合わせの１つ以上に結合する抗ＣＤ４抗体でありうる。特定の態様において、本開示において用いられる抗ＣＤ４抗体は主に、ＣＤ４受容体の第２の免疫グロブリン様ドメイン（Ｄ２）（アミノ酸位置９８～１８０）に向けられる。ＣＤ４のＤ２ドメインに向けられる抗体は、ＣＤ４と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子との相互作用により仲介される免疫機能を妨害することなくＨＩＶ感染を阻害するという望ましい性質を有する。他のいくつかの態様において、本発明において用いられる抗ＣＤ４抗体は、ＣＤ４受容体のＤ１－Ｄ２接合部の近くのＤ２のＢＣループに存在するエピトープ（アミノ酸１２１～１２７）に結合する。他のいくつかの態様において、抗ＣＤ４抗体は、Ｄ２のＦＧループ（アミノ酸１６３～１６５）およびＤ１の一部（アミノ酸７７～９６）に結合する。アミノ酸のナンバリングは、シグナルペプチドを含まない成熟形態のＣＤ４受容体の位置に対応する。ヒトＣＤ４受容体のアミノ酸配列を配列番号１に示すが、ここで、アミノ酸１～２５はシグナルペプチドを表し、アミノ酸２６～１２２はＤ１を構成し、アミノ酸１２３～２０５はＤ２を構成する。
特定の一態様において、抗ＨＩＶ抗体はＣＤ４モノクローナル抗体であり、これはヒト化抗体イバリズマブまたは「ｉＭａｂ」（かつてはＴＮＸ－３５５またはｈｕ５Ａ８と称された）でありうる。イバリズマブは広いスペクトルのＨＩＶ－１分離株による感染を強力に阻害し、ＣＤ４と主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスII分子との相互作用により仲介される免疫機能を妨害することなくＣＤ４受容体のＤ１－Ｄ２接合部の近くのＤ２のＢＣループに存在するエピトープを標的とする。抗ＣＤ４抗体の例は、参照することにより全体が本書に組み込まれる米国特許第５８７１７３２号に記載されるものである。
他の一態様において、抗ＣＤ４抗体またはそのフラグメントは、安定性の改善されたイバリズマブの変異体である。例としては、鎖内ジスルフィド結合形成を阻害する１つ以上の置換をヒンジ領域に有し、それによって抗体分子の二価安定性が著しく改善された抗ＣＤ４抗体、例えば、参照することにより本書に組み込まれる２００７年４月２７日公開の国際出願公開ＷＯ２００８１３４０４６（Ａ１）に記載されるものが挙げられる。
本発明のいくつかの態様において、抗ＣＤ４抗体はＩｇＧ４またはＩｇＧ１によって作製しうる。本発明の一例において、ＭＶ１と称する、ＣＤ４に対する結合親和性を有する抗ＣＤ４ ＩｇＧ１抗体を作製した。ＭＶ１は、ＩｇＧ１定常領域の位置２３４におけるロイシンからフェニルアラニンへの変異、および位置２３５におけるロイシンからグルタミン酸への変異、および位置３３１におけるプロリンからセリンへの変異を有する。ＭＶ１は、配列番号２～３にそれぞれ示される重鎖および軽鎖のアミノ酸配列を有する。
本発明のいくつかの例において、抗ＣＤ４抗体は、重鎖のＦｃ領域またはＦｃＲｎ領域に、抗ＣＤ４抗体のリサイクリングを改善するための１つ以上の改変を含みうる。具体的な一例は、配列番号５に示される重鎖のアミノ酸配列を含む抗ＣＤ４抗体である。
具体的な一例において、抗ＣＤ４抗体は、米国特許第９７９０２７６号および第９５８７０２２号に開示される、位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されたイバリズマブである。好ましい一例において、３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６５Ｓｅｒまたは６７Ｓｅｒのグリコシル化部位は、活性の改善をもたらす。本発明のより好ましい一例において、グリコシル化部位は５２Ｓｅｒの位置である。
本発明の知見に基づき、ヒスチジン変異のアプローチは、抗ＨＩＶ抗体の機能的活性を向上するために適応しうることが示される。構造活性相関（ＳＡＲ）を利用して抗体のキーとなる位置で嵩を増大することによって、より優れた抗体産物を生じるように活性の改善がもたらされると考えられる。
医薬組成物
本書に開示される組換え抗体を含む医薬組成物を、該抗体を１つ以上の任意の薬学的に許容しうる担体と混合することによって調製することができる。薬学的に許容しうる担体は、溶媒、分散媒体、等張剤等を包含する。担体は、液体、半固体、例えばペースト、または固体の担体でありうる。担体の例は、水、塩類液もしくは他の緩衝剤（例えばリン酸、クエン酸緩衝液）、油、アルコール、タンパク質（例えば血清アルブミン、ゼラチン）、炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、トレハロース、マンノース、マンニトール、ソルビトールまたはデキストリンを包含する、単糖、二糖および他の炭水化物）、ゲル、脂質、リポソーム、樹脂、多孔性マトリックス、結合剤、賦形剤、コーティング剤、安定剤、保存剤、アスコルビン酸およびメチオニンを包含する抗酸化剤、ＥＤＴＡといったキレート剤；ナトリウムといった塩形成対イオン；TWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）といった非イオン性界面活性剤、またはその組み合わせを包含する。
医薬組成物は、１つ以上の活性化合物、例えば１つ以上の抗体を、ＨＩＶ感染の抑制、予防および治療に有益な１つ以上のさらなる化合物との組み合わせで含むことができる。
有効成分を担体と、任意の便利で実際的な方法で、例えば混合、溶解、懸濁、乳化、封入、吸収等によって組み合わせることができ、注射、経口摂取、注入等に適当な、錠剤、カプセル剤、粉末（凍結乾燥粉末を包含する）、シロップ、懸濁液といった剤形に調製することができる。持続放出製剤を調製することもできる。
治療および予防方法
さらなる側面において、本書に開示されるヒスチジン変異抗体は、場合により薬学的に許容しうる担体中に提供されて、対象におけるＨＩＶ感染の治療および予防ならびにＨＩＶ伝染の予防のために使用される。
ＨＩＶ感染の「治療」とは、ＨＩＶ感染を、発症を遅延する、進行を遅らせる、ウイルス負荷を低減させる、および／またはＨＩＶ感染によって引き起こされる症状を軽減させるように、有効に抑制することをいう。
「ＨＩＶ感染の予防」とは、ＨＩＶ感染の発症を遅延する、および／またはＨＩＶ感染の罹患もしくは罹患可能性を低下または排除することを意味する。
「ＨＩＶ伝染の予防」とは、１個体から別の個体へのＨＩＶ伝染（例えばＨＩＶ陽性女性から、妊娠、出産もしくは分娩または授乳中の子供へ伝染；またはＨＩＶ陽性対象からＨＩＶ陰性パートナーへの伝染）の発生または可能性を低下または排除することを意味する。
用語「対象」とは、ヒトおよびヒト以外の対象（例えばアカゲザル対象）を包含する任意の霊長類対象をさす。
ＨＩＶ感染を抑制、治療および／または予防するために、本書に開示されるヒスチジン変異抗体が処置有効量で、必要とする対象に投与される。
用語「処置有効量」とは、ＨＩＶ感染を治療および／または予防するようにＨＩＶ感染の抑制をもたらすのに必要な量を意味する。抗体の用量は、疾患状態、ならびに他の臨床的因子、例えば対象の体重および状態、処置に対する対象の応答、製剤の種類および投与経路に依存する。処置に有効であり有害でない正確な用量は、当業者が決定することができる。一般に、ヒト成人に非経口投与するための抗体の適当な用量は、１日、週１回または月１回当たり、約０．１～２０ｍｇ／ｋｇ患者体重の範囲であり、典型的な初回用量は約２～１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。抗体は最終的に血流から排出されるので、再投与が必要でありうる。抗体を放出制御マトリックス中に組み合わせて埋込みまたは注射することもできる。
抗体の対象への投与は、経口、経皮および非経口（例えば静脈内、腹腔内、皮内、皮下または筋肉内）を包含する標準的な経路で行うことができる。さらに、注射によって、または顕著な量の望ましい抗体が制御放出様式で血流に入ることを可能にする外科的埋込みもしくは付着によって抗体を体内に導入することもできる。
本発明を以下の実施例によってさらに説明するが、実施例はさらに限定するものと解釈すべきではない。
実施例１
ｐＨ依存的ＣＤ４結合活性を仲介することのできるイバリズマブＣＤＲ残基の特定
ｐＨ依存的抗原結合イバリズマブバリアントを特定するために、システマティックにイバリズマブＶＨおよびＶＬ遺伝子において各ＣＤＲ残基をヒスチジンに変異させ、各バリアントを発現させ、精製し、ＨＲＰ標識野生型イバリズマブを用いる競合ＥＬＩＳＡによって、各バリアントのｐＨ７．４、６．０および５．０におけるＣＤ４結合活性を野生型と比較して評価した。目的は、ｐＨ７．４におけるＣＤ４結合活性の低下が最小限でありながら、ｐＨ７．４におけるＣＤ４結合と比較してｐＨ６．０におけるＣＤ４結合（ｐH６．０／ｐH７．４）を最も大きく低下するイバリズマブのヒスチジンバリアントを特定することであった。ｐＨ５．０におけるｐＨ依存的ＣＤ４結合活性のインビボ妥当性は明らかではないが、ｐＨ依存的ＣＤ４結合を仲介するヒスチジンバリアントの特定を、特に結合親和性に対する効果が小さいと期待された単一残基の寄与の評価に際して、より良く行うために、ｐＨ５．０の評価も含めた。
イバリズマブにおけるヒスチジンへの変異後に、ｐＨ依存的と考えるべき残基について、野生型（ｗｔ）イバリズマブと比較した親和性の低下がｐＨ５．０＞６．０＞７．４であるように試験ｐＨにわたり一貫したｗｔとの競合能力のｐＨ依存的低下を示すことを評価した。重鎖について、さまざまな残基の変異（「ＨＣＤＲ Ｈｉｓバリアント」）によるｐＨ５．０、６．０および７．４におけるＣＤ４結合活性の変化を、図１Ａに示す。ヒスチジンに変異されたとき、１０のＨＣＤＲ Ｈｉｓバリアントが、ｐＨ７．４に対してｐＨ５．０において５０％以上のＣＤ４結合活性低下を示すことがわかった（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４≧１．５）。図１Ｂに示すように、この１０のＨＣＤＲ Ｈｉｓバリアントのうち、残基Ｙ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８またはＴ１００ａにヒスチジン変異を有する６バリアントだけが、野生型と比較して３．０倍以下でｐＨ７．４におけるＣＤ４結合活性を維持した。
軽鎖について、さまざまな残基の変異（「ＬＣＤＲ Ｈｉｓバリアント」）によるｐＨ５．０、６．０および７．４におけるＣＤ４結合活性の変化を図２Ａに示す。ヒスチジンに変異されたとき、１０のＬＣＤＲ残基が、ｐＨ７．４に対してｐＨ５．０において５０％以上のＣＤ４結合活性低下を示すことがわかった（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４≧１．５）。図２Ｂに示すように、これらＬＣＤＲ Ｈｉｓバリアントのうち、残基Ｓ２６、Ｌ３０、Ｌ３３、Ｑ８９、Ｙ９２、Ｙ９３またはＹ９４にヒスチジン変異を有する７バリアントだけが、野生型と比較して３．０倍以下でｐＨ７．４におけるＣＤ４結合活性を維持した。
ヒスチジンへの変異によってｐＨ依存的結合を仲介するＣＤＲ残基は、高親和性抗原結合のために重要な残基に近接して見られることが多かった（Ｐ＝ｘ）。ＶＨについては、Ｙ５３ａ、Ｄ５８およびＴ１００ａは、ヒスチジンに変異されると最高試験濃度（３μｇ／ｍｌ）で検出可能な競合を示さず３２倍を超える親和性低下を示した残基に直接に隣接する。さらに、ｐＨ依存的Ｋ９６／Ｄ９７／Ｎ９８モチーフは、ヒスチジンに変異されると７．５倍の親和性低下および３２倍を超える親和性低下をそれぞれ示したＥ９５とＹ９９に挟まれていた。同様に、ＶＬについては、Ｓ２６、Ｌ３０（両側で隣接）およびＬ３３に直接隣接する残基は、Ｈｉｓに変異されると３２倍を超える親和性低下をもたらした。Ｑ８９に隣接するＱ９０は２１倍のＣＤ４結合低下をもたらし、Ｙ９２／Ｓ９３／Ｙ９４モチーフを挟むＹ９１およびＲ９５は、２２倍および９倍のＣＤ４結合低下をもたらした（ｐＨ７．４において）。
実施例２
ｐＨ依存的ＣＤ４結合活性を仲介する最適なヒスチジン組み合わせの特定
重鎖の残基Ｙ５３ａ、Ｄ５８、Ｋ９６、Ｄ９７、Ｎ９８またはＴ１００ａならびにＥ６１およびＫ６４におけるヒスチジン変異の組み合わせがｐＨ依存的ＣＤ４結合を改善しうるかを決定するために、ｐＨ依存的ＣＤ４結合活性が最も大きかった４つの軽鎖変異（Ｌ３０、Ｙ９２、Ｓ９３およびＹ９４）を用いて、単一コンストラクトにおける軽鎖変異４つまでの組み合わせの効果を評価した。図３に示すように、個別に１．５のｐＨ５．０／ｐＨ７．４差をもたらしたＳ９３とＹ９４の組み合わせは、３．０のｐＨ５．０／ｐＨ７．４差をもたらした。Ｓ９３／Ｙ９４二重変異体に、単独で１．７のｐＨ５．０／ｐＨ７．４差をもたらしたＹ９２を追加すると、ｐＨ５．０／ｐＨ７．４差は３．４に改善された。同様に、Ｙ９２Ｈ／Ｓ９３Ｈ／Ｙ９４Ｈ三重バリアントに、単独で１．４のｐＨ５．０／ｐＨ７．４差をもたらしたＬ３０変異を追加すると、ｐＨ５．０／ｐＨ７．４差は５．７にさらに改善された。したがって、個別にｐＨ依存的ＣＤ４結合活性を仲介するヒスチジン変異を単一分子中に組み合わせると、より大きいｐＨ依存が仲介された。しかしながら、複数のヒスチジン変異の組み合わせは残念ながら、ｐＨ７．４におけるＣＤ４結合活性に対しては悪影響を及ぼした。実際、組み合わせバリアントによるこの結合親和性の低下は、個々のバリアントの合計よりも実質的に大きかった。観察された組み合わせバリアントの結合親和性低下の線形回帰は、個々の変異の相乗（Ｐ＝０．０００８）対相加（Ｐ＝０．０６）効果に基づき期待された結合性低下に、より良くフィットした（図３参照）。したがって、ｐＨ７．４での十分なＣＤ４結合親和性を維持するために、本発明者は、単一のＶＨヒスチジン変異と単一のＶＬヒスチジン変異の最適な組み合わせを特定することに焦点を絞った。
単一のＶＨヒスチジン変異と単一のＶＬヒスチジン変異の最適な組み合わせを特定するために、ＶＨおよびＶＬのｐＨ依存的抗原結合変異のそれぞれを対をなす組み合わせで共発現させ、ｐＨ依存性を競合ＥＬＩＳＡによって測定した。組み合わせＨｉｓバリアントのｐＨ７．４におけるＣＤ４に対する親和性低下がより大きいために、そして本発明者の目的はｐＨ７．４におけるＣＤ４結合親和性を可能な限り高く維持することであることから、Ｓ２６、Ｓ２８、Ｑ８９およびＹ９２のＶＬ変異は、ｐＨ依存性の程度がｐＨ５．０においてさえ（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４≦２．６）、ｐＨ７．４における親和性低下（ｗｔに対して≧２．６倍）よりも小さかったので、これを除外した。また、Ｅ６１およびＫ６４のＶＨ Ｈｉｓ変異体は、ｐＨ７．４におけるＣＤ４親和性を高度に維持し（それぞれ、ｗｔに対して１．４倍および０．９倍）、ｐＨ依存性は小さかったことから（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４＝１．６）、これを対照として含めた。図３Ａに示すように、Ｙ９４ＨのＨＣ／ＨＬ組み合わせバリアント（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝２．４±０．７）は、Ｓ９３のＨＣ／ＨＬ組み合わせバリアント（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝１．７±０．３、Ｐ＝０．０４）よりも顕著に大きいｐＨ依存性を示し、Ｌ３０のＨＣ／ＨＬ組み合わせバリアントは中程度のｐＨ依存性を仲介し（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝２．０±０．４）、これは先の結果のランク順と一致した。さらに、Ｅ６１およびＫ６４の６つの対照ＨＣ／ＬＣ組み合わせバリアントは、ｐＨ依存性（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４）が最下位７にランクされ、これも先の結果と一致した。
ＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４組み合わせバリアントが、ｗｔと比較してｐＨ５．０およびｐＨ６．０での親和性がそれぞれ４０倍および９倍低く、最も大きいｐＨ依存性を示したが、ｐＨ７．４ではｗｔと比較して２．４倍低い親和性を示しただけで、ｐＨ５．０／ｐＨ７．４およびｐＨ６．０／ｐＨ７．４差はそれぞれ１４．１および３．２となった。重要なことに、ＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４組み合わせバリアントは、より生理学的に妥当なｐＨ６．０で適用可能なｐＨ依存性を示している（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝３．２）。図３Ｂに示すように、このことは単一のＹ５３ａバリアント（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝１．３）、Ｙ９４バリアント（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝１．１）のいずれにおいても顕著ではなく、それらのｐＨ依存性はｐＨ５．０でのみ観察されていたので（それぞれ、ｐＨ５．０／ｐＨ７．４＝２．３および３．０）、ｐＨ依存的結合についての単一ヒスチジン変異体のスクリーニングにおける感度を改善するためにｐＨ５．０を用いるアプローチの有効性が確認される。実際、該二重変異体は、ｐＨ６．０において、ｐＨ５．０における個々の変異体（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４＝２．３および３．０）と比べて少し大きいｐＨ依存的結合（ｐＨ６．０／ｐＨ７．４＝３．２）を示す。
実施例３
表面プラズモン共鳴によるｐＨ依存的ＣＤ４結合活性の確認
BIACORE T3000光バイオセンサー（GE Healthcare, Piscataway, N.J.）を用いて結合親和性分析を行った。イバリズマブおよび全てのバリアントの固定を標準的な方法に従って行った。
すなわち、センサーチップ表面のカルボキシル基を、０．２ＭのＮ－（３－ジメチルアミノプロピル）－Ｎ－エチルカルボジイミドおよび０．０５ＭのＮ－ヒドロキシスクシンイミドを含む溶液３５μＬを５μＬ／分の流速で注入することによって活性化した。次いで、１０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ４．５）中の２μｇ／ｍＬの濃度のイバリズマブまたはその変異体バリアントを、チップ表面に流速１０μＬ／分で、所望のレベルの反応タンパク質レスポンスユニット（１５０－２００ＲＵ）が達成されるまで流した。未反応タンパク質を洗い流した後、センサー表面上の過剰の活性エステル基を、１Ｍエタノールアミン（ｐＨ８．０）３５μｌを流速５μＬ／分で注入することによってキャップした。装置およびバッファーの較正のためのバックグラウンドとして、タンパク質リガンドを省いて同じ条件でのリファレンスを設けた。ＨＢＳ－ＥＰバッファー（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％ ｖｏｌ／ｖｏｌ 界面活性剤Ｐ２０（GE Healthcare））中で２５℃で結合試験を行った。さまざまな濃度のアナライト（ヒトＣＤ４タンパク質）をチップ表面に流速３０μＬ／分で３分間流すことによって、結合カイネティクスを測定した。表面を１０分間洗う間、結合アナライトの解離をモニターした。残留アナライトを、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ（ｐＨ２．０）の３０秒間の注入を、流速５０μＬ／分で２回行うことによって除去した。カイネティクスデータの解析のために、重ね合わせたセンサーグラムをまとめて、BlAevaluation 4.1ソフトウェアを用いてローカルに１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングすることにより、カイネティックパラメータを決定した。
競合ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイによって特定された重要なヒスチジンバリアントＹ５３ａＨ／Ｙ９４Ｈの結合カイネティクスを、表面プラズモン共鳴（Biacore）によって試験した。対照として、野生型、ＬＣ Ｓ５６Ｈバリアント［これはｐＨ依存性を示さず（ｐＨ５．０／ｐＨ７．４＝０．８）、ｐＨ７．４において親和性を維持した（ｗｔと比較して１．３倍）］、およびＨＣ Ｄ９７／ＬＣ Ｓ９３,Ｙ９４バリアント［これは、ｐＨ依存的ＣＤ４結合活性を示したが、ｐＨ７．４における実質的な結合性を喪失した］を含めた。
図５に示すように、野生型イバリズマブ（ＭＶ１－ＬＡＬＡ）のインビトロＨＩＶ－１中和活性は、Ｙ９４／Ｙ５３ａ－ＬＡＬＡおよびＹ９４／Ｙ５３ａ－ＬＡＬＡ ＦｃＲｎを包含するバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４と同程度であった。ここで、アイソタイプ対照（ｈ４Ｇ７）が含まれた。
実施例４
薬物動態分析
アカゲザルにおける野生型イバリズマブ（Ｗｔ、青線）およびバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４（Ｈｉｓ、緑線；およびＨｉｓ ＦｃＲｎ、赤線）の薬物動態を図６Ａに示す。図６Ｂには、各抗体を０．７５ｍｇ／ｋｇで投与されたアカゲザルにおける、野生型イバリズマブ（Ｗｔ、青線）およびバリアントＨＣ Ｙ５３ａ／ＬＣ Ｙ９４（Ｈｉｓ、緑線；およびＨｉｓ ＦｃＲｎ、赤線）によるＣＤ４占拠時間を示す。各線は、各アカゲザルにおいて観察されたＣＤ４占拠を示す。
実施例６
ダウンモジュレーションの分析
図７に示すように、イバリズマブのヒスチジン変異バリアントは野生型イバリズマブよりも、ＣＤ４受容体ダウンモジュレーションを誘導する程度が小さかった。
本発明を好ましい態様を示すことによって開示したが、それは本発明を限定することを意図したものではない。当業者は、本発明の精神および範囲から外れることなく改変および修飾を行うことができる。したがって、本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲によって規定されるものによって規定される。
配列表
配列番号１：ヒトＣＤ４受容体のアミノ酸配列（アミノ酸１～２５はシグナルペプチドを表し、アミノ酸２６～１２２はＤ１を構成し、アミノ酸１２３～２０５はＤ２を構成する）：
Figure 0007397528000001
配列番号２：ＭＶ１の重鎖のアミノ酸配列（リーダー配列を構成する最初の１９アミノ酸残基を含む４７１アミノ酸）：
Figure 0007397528000002
配列番号３：ＭＶ１の軽鎖のアミノ酸配列（リーダー配列を構成する最初の１９アミノ酸を含む２３８アミノ酸）：
Figure 0007397528000003

Figure 0007397528000004
配列番号４：ＬＭ５２の軽鎖のアミノ酸配列：
Figure 0007397528000005

Claims (10)

  1. イバリズマブの重鎖中にＹ５３ａＨ、Ｄ５８Ｈ、Ｋ９６Ｈ、Ｄ９７Ｈ、Ｎ９８Ｈ、およびＴ１００ａＨのいずれか１つの変異を有し、またはイバリズマブの軽鎖中にＳ２６Ｈ、Ｌ３０Ｈ、Ｌ３３Ｈ、Ｑ８９Ｈ、Ｙ９２Ｈ、Ｓ９３Ｈ、およびＹ９４Ｈのいずれか１つの変異を有し、前記イバリズマブが軽鎖中の位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されており、ｐＨ依存的ＣＤ４結合活性を有する、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  2. イバリズマブの重鎖および軽鎖のそれぞれの残基の変異の組み合わせを有し、ここで、前記重鎖中の変異がＹ５３ａＨ、Ｄ５８Ｈ、Ｋ９６Ｈ、Ｄ９７Ｈ、Ｎ９８Ｈ、およびＴ１００ａＨからなる群から選択され、前記軽鎖中の変異がＳ２６Ｈ、Ｌ３０Ｈ、Ｌ３３Ｈ、Ｑ８９Ｈ、Ｙ９２Ｈ、Ｓ９３Ｈ、およびＹ９４Ｈからなる群から選択される、請求項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  3. イバリズマブの重鎖中のＹ５３ａＨ変異と、Ｓ２６Ｈ、Ｌ３０Ｈ、Ｌ３３Ｈ、Ｑ８９Ｈ、Ｙ９２Ｈ、Ｓ９３Ｈ、およびＹ９４Ｈからなる群から選択されるイバリズマブの軽鎖中の変異との組み合わせを有する、請求項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  4. イバリズマブの重鎖中のＤ５８Ｈ変異と、Ｓ２６Ｈ、Ｌ３０Ｈ、Ｌ３３Ｈ、Ｑ８９Ｈ、Ｙ９２Ｈ、Ｓ９３Ｈ、およびＹ９４Ｈからなる群から選択されるイバリズマブの軽鎖中の変異との組み合わせを有する、請求項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  5. ｐＨ ７．４でのＣＤ４結合親和性よりもｐＨ ５．０またはｐＨ ６．０でのＣＤ４結合親和性が低い、請求項１に記載のヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  6. ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、イバリズマブの重鎖中のＹ５３ａＨと軽鎖中のＹ９４Ｈの２つのヒスチジン変異を有するバリアントであり、前記イバリズマブが軽鎖中の位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されている、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  7. ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体であって、イバリズマブの重鎖中のＤ５８Ｈと軽鎖中のＬ３０Ｈの２つのヒスチジン変異を有するバリアントであり、前記イバリズマブが軽鎖中の位置３０Ｅ Ｇｌｎ、５２Ｓｅｒ、５３Ｔｈｒ、５４Ａｒｇ、６０Ａｓｐ、６５Ｓｅｒ、６７Ｓｅｒおよび７６Ｓｅｒからなる群から選択されるアミノ酸位置でのグリコシル化によって改変されている、ヒスチジン変異抗ＨＩＶ抗体。
  8. 請求項１から７のいずれかに記載の抗体、および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
  9. 請求項１から７のいずれかに記載の抗体を処置有効量で含む組成物の使用であって、ＨＩＶに感染した対象を処置するための医薬の製造のための使用。
  10. 請求項１から７のいずれかに記載の抗体を処置有効量で含む組成物の使用であって、必要とする対象においてＨＩＶ感染を予防するための医薬の製造のための使用。
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