JP7392145B2 - 免疫療法のためのt細胞二重特異性抗体の作製における最適化された抗cd3アーム - Google Patents
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別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるものと同じ意味を有する。本明細書を解釈するために以下の定義が適用され、適宜、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆の場合も同様である。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その」は、文脈において明確に別段の指示がない限り、複数形も指し、例えば、「宿主細胞」への参照は、複数のそのような宿主細胞を含む。
VHドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
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VHドメインは、配列番号10のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号11のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号11のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号12のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号13のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号14のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号15のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号15のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号16のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号17のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号18のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号19のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号20のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号21のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号23のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号24のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号25のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号25のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号26のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号27のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号27のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号28のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号29のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号29のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号30のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号2のアミノ酸配列を含むか、又は
VHドメインは、配列番号30のアミノ酸配列を含み、及びVLドメインは、配列番号4のアミノ酸配列を含み;
好ましくは、第1の抗原結合ドメインは、2つの同一の重鎖と、2つの同一の軽鎖とを含み、及び第2の抗原結合ドメインは、2つの同一のCD3抗原結合断片を含み、第1の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖は、第2の抗原結合ドメインのそれぞれの前記CD3抗原結合断片に融合され;より好ましくは、第1の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖の定常領域のC末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して第2の抗原結合ドメインのそれぞれの前記CD3抗原結合断片の重鎖可変領域のN末端に融合される。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。
作製される異なる形式の二機能抗体の定義:
Luye CEA/CD3 BsAbとも称されるCEA/CD3 BsAb(ヒトCEA及びCD3に対する二重特異性抗体)。
CEA/CD3OPT1a(最適化されたCD3OPT1aバリアントが組み込まれたCEA/CD3二重特異性抗体)。
CEA/CD3OPT1a3b(最適化されたCD3OPT1a3bバリアントが組み込まれたCEA/CD3二重特異性抗体)。
CEA/CD3OPT1a3b2a(最適化されたCD3OPT1a3b2aバリアントが組み込まれたCEA/CD3二重特異性抗体)。
Lead CEA/CD3とも称されるCEA/CD3OPT1a3b2b1(最適化されたCD31a3b2b1バリアントが組み込まれたCEA/CD3二重特異性抗体)。
表1は、以下の実施例において使用されるLuye CEA/CD3の構成要素を示す。
CEA/CD3 T細胞二重特異性抗体の構築
これまで開発された大部分のT細胞二重特異性抗体は、T細胞の動員に抗CD3部分を利用しており、OKT3、UCHT1、SP34及びTR66(June,et al.,J.Immunol.136:3945-3952(1986);Yang,et al.,J.Immunol.137:1097-1100(1986);及びHayward,et al.,Immunol.64:87-92(1988))が抗CD3アームとして最も一般的に使用されている。CEA-CD3形式における様々なCD3結合体の特徴をさらに比較するために、本発明者らは、図1の形式を使用してCEA T細胞二重特異性抗体を作製した。SP34及びそのバリアントがCD3結合アームとして使用され(CD3結合体バリアント)、hT84.66がCEA結合アームとして使用された(CEA結合体バリアント)。SP34及びhT84.66の最適化された形式(すなわちOPT形式)を設計して、scFvのフレームワークを安定化させて、半減期に影響を及ぼし、且つ凝集を減少させた(表2を参照されたい)。
CEA/CD3二重特異性抗体は、CEA発現標的細胞のT細胞による死滅及びサイトカイン放出を媒介する。
本発明者らは、異なるCEA発現腫瘍細胞に対するCEA/CD3二重特異性抗体の抗腫瘍効果を調べた。新鮮なヒトPBMCがIL-2(20ng/ml)の存在下で抗CD3及び抗CD28と6日間培養された。細胞傷害性アッセイは、E/T(エフェクター:標的)比10:1で実施された。異なる抗体によって媒介される細胞傷害性は、試験抗体の段階希釈物中の18時間のインキュベーション後に死腫瘍細胞から放出されるLDHによって評価された。図2A及び2Bに示されるとおり、hT84.66/SP34二重特異性抗体(CEA/CD3親BsAbと称される、表1の配列表)は、用量依存的な様式でCEA発現LS-174T及びLoVo腫瘍細胞のT細胞にリダイレクトされる細胞傷害性を増強した。
CEA/CD3二重特異性抗体におけるCD3結合標的アームは、結合親和性の低減のために設計された。
CD3に結合する高親和性は、固有の課題を伴う。高親和性のCD3結合体を有するT細胞エンゲージャー二重特異性抗体も、治療抗体の投与によって引き起こされる重篤な有害な副作用につながるサイトカイン放出症候群(CRS)を誘導する可能性がある。最も重要なこととして、T細胞二重特異性抗体の高い結合親和性は、腫瘍細胞の代わりに脾臓及びリンパ節などのT細胞に富む組織に高い偏りを有する。通常、CD3結合親和性が高い(1nM/L未満)場合、T細胞二重特異性抗体は、リンパ器官に蓄積される一方、より低いCD3親和性(50nM/L超)は、抗体組織分布に影響を及ぼすのに十分でないであろう。本発明者らが使用した抗CD3モノクローナル抗体の親和性は、相対的にOKT3より低いが、その親和性は、依然としてナノモル濃度範囲である。したがって、本発明者らは、点変異手法を使用するCD3モノクローナル抗体のVH配列に基づいてより低いCD3結合体バリアントを作製しようとした。知られているとおり、抗体のフレームワーク領域は、抗原結合に直接的に関与しないが、それは、分子のフォールディングを決定し、したがって、相補性決定領域(CDR)は、抗原結合部位と相互作用することができる。ランダムフレームワーク変異試験も、フレームワーク中の特定の残基が抗体構造を安定化し、抗原結合においてアロステリックな寄与の役割を果たすことを実証した。結果として、抗体フレームワーク中のそれらの残基の変化は、結合親和性に影響を及ぼす。本発明者らは、抗CD3及びCD3の相互作用のタンパク質結晶構造を慎重に調査し、コンピューターによる調査に基づいて抗CD3のVH-フレームワーク領域中の残基の選択的な変異を実施し、14のCD3結合体バリアントを作製した。ヒトCD3に対するCD3バリアントの結合は、CD3発現ジャーカット細胞を使用してフローサイトメトリーにより測定された(図5A)。ジャーカット細胞上のCD3に対する結合をほぼ完全に失った2つの変異体CD3バリアント(CEA/CD3OPT2及びCEA/CD3OPT3)に加えて、他の5つのCD3変異体バリアント(CEA/CD3OPT1a、CEA/CD3OPT3a、CEA/CD3OPT3b、CEA/CD3OPT4及びCEA/CD3OPT6)のCD3結合親和性は、それらの親クローンCEA/SP34と比較して異なる程度まで低下したが、最初の変異体CD3バリアントにおいてCD3に対する結合親和性の劇的な低減は観察されなかった(図5A及び表3)。はるかに低い結合親和性を有する変異体CD3バリアントを得るために、さらに6つのCD3結合体バリアントがCEA/CD3OPT1a及びCEA/CD3OPT3bバリアントの配列に基づいて設計された。したがって、本発明者らは、これらのCEA/CD3結合体バリアントを有する健常なドナーから新たに単離されたPBMCを染色することにより、CD3に対するそれらの結合親和性を調べた。実際に、FACS分析は、変異体CEA/CD3OPT1a3b、CEA/CD3OPT1a3b2a、CEA/CD3OPT1a3b2b1及びCEA/CD3OPT1a3b2b2が、単一の変異と比較して著しく低減した結合親和性を呈することを示した(図5B及び表3)。この実施例における二重特異性抗体の配列:CD3のVH配列は、表3に列挙され、CD3のVL配列は、配列番号2に記載され、CEAのVH及びVL配列は、それぞれ配列番号5~6に記載される。
TCRシグナル伝達強度の低減に基づくCD3結合体バリアントの選択
T細胞の表面でのCD28とTCR及び共刺激分子の同時の結合は、完全なT細胞活性化をもたらす。通常の条件下では、T細胞において誘発されるシグナル伝達経路は、NFAT転写因子の活性化及び核移行を含む。CEA/CD3 BsAbにおける変異体CD3結合体によって媒介されるTCRシグナル伝達の強度を評価するために、本発明者らは、NFATプロモーター下でルシフェラーゼ遺伝子を発現するジャーカットT細胞株を使用した。ジャーカット細胞をCEA発現腫瘍細胞と共培養するとき、CEA/CD3 BsAbは、ジャーカット細胞上のTCRに結合し、且つそれを二量体化して、NFAT遺伝子活性を促進することができ、その結果、NFATプロモーターにより制御されるルシフェラーゼは、抗体の用量に反応する様式で発現される。図7Aにおいて予想されるとおり、強力なNFAT活性のシグナル伝達は、抗CD3 mAbではなく、CEA/CD3二重特異性抗体の存在下でCEA発現LS-174T細胞とジャーカット細胞との共培養によって検出された。加えて、NFAT活性のシグナル伝達は、CEA陰性HEK293細胞を使用して同じ実験構成において観察されなかった(図7A)。この試料及び信頼できるアッセイを利用することにより、本発明者らは、全ての変異体CEA/CD3バリアントによって媒介されるTCRシグナル伝達の強度をさらに評価した。興味深いことに、非常に弱いNFAT活性が三重変異体バリアント(CEA/CD3OPT1a3b2a、CEA/CD3OPT1a3b2b1及びCEA/CD3OPT1a3b2b2)による実験構成において検出されたが、二重変異体CEA/CD3OPT1a3bは、依然として相対的に高いNFAT活性が維持され(図7B~7C及び表5~6)、これは、CEA/CD3バリアントの結合親和性と一致する(図5B)。したがって、このアッセイは、抗CD3モノクローナル抗体のVHフレームワークにおける複数の実施された変異が、CD3結合親和性を低減しただけでなく、それらの開始されたTCRシグナル伝達経路も減退させたことを示す。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表1に列挙された。
CEA/CD3バリアントによる細胞傷害性に対するCD3親和性の影響を評価する
理論上、T細胞二重特異性抗体におけるCD3結合アームは、それがT細胞と腫瘍細胞との間で維持している相互作用を架橋でき、T細胞が腫瘍細胞に対する溶解を最終的に活性化し、誘発することを可能にするように相対的に高い結合親和性を必要とする。しかしながら、高いCD3結合親和性は、免疫療法に対する重篤な副作用を誘導する可能性がある。したがって、T細胞二重特異性抗体のCD3結合親和性を評価し、サイトカイン放出レベルと腫瘍溶解活性との間の最適なバランスを実現することは、特に重要である。異なる結合親和性を有する6つの抗CD3バリアント間で細胞傷害活性を比較するために、CEA/CD3バリアント抗体によって誘導される標的細胞のT細胞に媒介される死滅がLS-174T Luc(高いCEA発現)及びKATO III Luc(中程度のCEA発現)ヒト腫瘍細胞に対して評価された。H929 Luc(CEA陰性腫瘍細胞株)は、陰性対照として使用された。健常ドナーから単離されたヒトPBMCがIL-2(20ng/ml)の存在下で抗CD3及び抗CD28と6日間培養された。得られたPBMC集団が計数され、10:1の最終的なE:T比で標的細胞に加えられた。特異的な溶解は、インキュベーションの18時間後にルシフェラーゼ強度単位の定量化によって決定された。図8A及び表7に示されるとおり、6つのCEA/CD3二重特異性抗体(CEA/CD3親BsAb、CEA/CD3OPT1a、CEA/CD3OPT3b、CEA/CD3OPT1a3b、CEA/CD3OPT1a3b2a及びCEA/CD3OPT1a3b2b1)は、用量依存的な様式でCEA発現LS-174T腫瘍細胞のT細胞にリダイレクトされた細胞傷害性を増強し、特異的な溶解によって測定されるIC50値は、これらのアッセイにおいて試験されるこれらの6つの二重特異性抗体間で著しく変動しなかったが、これは、CD3アーム結合親和性が、CEAを高度に発現するLS-174T細胞によって誘導される細胞傷害活性に強い影響を及ぼさないことを示唆している。対照的に、CEA陰性H929Luc細胞に対して、他のパラメーターが同じであるアッセイにおいて、著しい細胞傷害性は見出されなかった(図8B)。次に、本発明者らは、標的細胞上でのCEA発現レベルが、CEA/CD3 BsAb、特に比較的低いCD3結合親和性を有するものによって誘発される細胞傷害活性に対して影響を及ぼすかどうかを調査した。結果として、本発明者らは、標的としてKATO III細胞を選択したが、それは、中程度のレベルのCEAがこの細胞株上で発現されるためである(図9A)。同様の細胞傷害性アッセイが実施され、異なるCEA/CD3二重特異性抗体により媒介される腫瘍溶解活性がKATO III及びPBMCの共培養の18時間後にルシフェラーゼ強度単位によって評価された。明らかに、KATO III細胞に対する溶解の効率は、全ての試験されたCEA/CD3 BsAbにおけるLS-174Tの死滅と比較して著しく低かった(図9B及び表8)。さらに、二重特異性抗体形式において比較的低いCD3親和性の結合体によって媒介される細胞傷害活性は、標的細胞における比較的低い発現レベルのCEAによって著しく影響を及ぼされるように見える(図9B及び表8)。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表1に列挙される。
変異体CD3結合体バリアントによって媒介されるサイトカイン放出の評価
活性化T細胞によって分泌されるサイトカインは、インビトロ及びインビボでの免疫応答に非常に影響を及ぼし得る。それらの中で、IL-2及びINF-γは、T細胞増殖の支持並びに細胞傷害性Tリンパ球、ナチュラルキラー細胞及びマクロファージの活性化を刺激する能力を含む、様々な細胞型に対する複数の免疫調節性の効果を有する。しかしながら、高レベルのサイトカイン放出は、固有であり、且つ潜在的に致死的な有害作用を引き起こす可能性があるため、最近では、T細胞媒介性免疫療法におけるサイトカイン分泌の低減が重要視されている。したがって、サイトカイン放出のレベルを測定することにより、T細胞二重特異性抗体のCD3結合親和性を評価することが重要である。サイトカイン放出に対するCEA/CD3結合体バリアントの直接的な影響について試験するために、ヒトPBMCが単離され、抗CD3/CD28でコーティングされたビーズとともに6日間培養された。その後、CEA/CD3二重特異性抗体の存在下でLS-174T細胞(CEAの高い発現)及びKATO III細胞(CEAの中程度の発現)と共培養された活性化T細胞が段階希釈された。上清は、共培養の24時間後に回収され、IL-2、IFN-γ及びTNF-α分泌は、ELISAによって評価された。実際に、IFN-γ、TNF-α及びIL-2のレベルは、それらのCD3結合親和性と完全に相関する;CEA/CD3親BsAbの投与における最も高いサイトカイン放出及び三重変異体CD3結合体における最も低いサイトカイン放出(図10)。このサイトカイン放出プロファイルは、NFAT活性のものと同様であった。比較的低い有効性の細胞傷害性が、CEAを中程度に発現するKATO III細胞(図9B)において見出されたため、本発明者らは、CEA発現レベルもサイトカイン放出に寄与するかどうかを探索することを必要とした。CEA/CD3親二重特異性抗体の投与は、抗体用量依存的な様式でPBMC及びKATO III腫瘍細胞の共培養からIFN-γ及びTNF-α産生を誘導した一方、サイトカイン分泌のレベルは、CEAを高度に発現するLS-174T細胞との共培養において観察されるものよりはるかに低かった(図10A~図10C、図11A~図11B)。対照的に、IFN-γ及びTNF-αの産生は、CEA/CD3OPT1a3b2a及びCEA/CD3OPT1a3b2b1二重特異性抗体で治療された同様の共培養系においてかろうじて検出可能であった(図11A~図11B)。データは、CEA/CD3二重特異性抗体によって誘発されるサイトカイン放出がCD3結合親和性に大きく依存し、及び標的上での抗原発現レベルもサイトカイン放出に部分的に寄与するという強力な証拠を提供する。この実施例における二重特異性抗体の配列は、表1に列挙される。
CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAbの結合特異性及び組織交差反応性の評価
CEA/CD3-OPT1a3b2b1 BsAbが、治療に関連する毒性を引き起こす可能性がある非標的抗原決定基に結合する潜在力を有するかどうかを確かめるために、正常ヒト及び癌性組織のセットが免疫組織化学(IHC)手法によって染色され、調査された。簡潔には、スライド上のFFPE組織切片は、脱パラフィンされ、水和され、且つ加熱されたクエン酸緩衝液抗原賦活化に低圧下で20分間かけられた。PBSによる洗浄後、切片は、内在性の過酸化物でブロッキングされ(10分)、タンパク質でブロッキングされ(60分)、一次抗体とインキュベート(60分)された後、室温で二次抗体とインキュベートされた(60分)。染色は、ジアミノベンジジン過酸化物で可視化され(1~2分)、組織は、ヘマトキシリンで対比染色された。細胞株のために、前に固定された細胞は、ガラススライド上に塗りつけられ、一晩風乾され、4℃で保管された。分析のために、なすりつけ標本は、新たな冷たい4%PFA中で10分間固定された後、PBSで洗浄された。洗浄後、切片は、抗原賦活化のために処理された後、FFPE切片について記載された同じ工程にかけられた。
インビトロ及びインビボでの機能におけるCEA/CD3OPT1a3b2b1二重特異性抗体に対するRoche CEA-TCBの比較分析
Roche CEA-TCB及びCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbの抗体形式
Rocheは、CEA/CD3二重特異性抗体を開発し、転移性結腸直腸癌の治療における有望な臨床効果が観察された。Roche CEA-TCB(シビサタマブとしても知られる、RG7802、RG-7802、RO6958688又はRO-6958688)CEA/CD3二重特異性抗体の構造及び配列情報は、IMGTデータベースから得られた。http://imgt.org/mAb-DB/search.action?innName=cibisatamabを参照されたい。Roche CEA-TCB形式は、以下の4つのコンストラクトを異なる比でトランスフェクトし、およそ180kDaの分子量の完全長抗体を同定することによって作製された。配列は、以下のとおりである。
(1)10636H|シビサタマブ|ヒト化||VH-CH1-VH-C-KAPPA-CH2-CH3(VH(1-121)[D1]+CH1(122-219)[D2]+VH(236-360)[D3]+C-KAPPA(362-467)[D4]+CH2(478-587)[D5]+CH3(588-692)[D6])694
Roche CEA-TCB及びCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(図中でLead CEA/CD3とも称される)は、異なる分子構造を有するため、本発明者らは、まず標的分子CEA及びCD3に対する両方の抗体の結合親和性を比較した。ヒトPBMC及びジャーカットヒトTリンパ球細胞株とCEA-TCB及びCEA/CD3OPT1a3b2b1との相互作用が調査された。フローサイトメトリーアッセイによって評価されるとおり、Roche CEA-TCBは、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(EC50=81.03nM)よりはるかに高い親和性(EC50=0.34nM)を有してヒトPBMC T細胞に結合する(図14A及び表9)。PBMCに対する結合と同様に、Roche CEA-TCBは、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbと比較してジャーカット細胞に対して著しく高い結合親和性を示し、112nMに対して0.2の結合EC50を有する(図14B及び表9)。抗原CEAに関するCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbに対するRoche CEA-TCBの結合活性は、フローサイトメトリーによってCEAを高度に発現するMKN-45及びLS-174T腫瘍細胞において評価された。CD3に対する結合とは対照的に、MKN-45及びLS-174T細胞に対するRoche CEA-TCBの結合活性は、CEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAbのものよりはるかに低かった(図14C、図14D)。データは、Roche CEA-TCB及びCEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAbが、CEA及びCD3の分子構造又は異なる結合体に起因して標的及びCD3に対する正反対の結合活性を有することを実証した。
Roche CEA-TCBとCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(図面においてLead CEA/CD3とも称される)との間のCEA及びCD3に対する異なる結合親和性を実証したため、次に、本発明者らは、CEA発現標的細胞MKN-45の細胞溶解を媒介する2つの二重特異性抗体のインビトロでの有効性を評価した。インビトロ腫瘍溶解アッセイを準備するために、ヒトPBMCが健常ドナーから新たに単離され、段階希釈されたRoche CEA-TCB及びCEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb中で1×104のMKN-45発現ルシフェラーゼとともに1ウェル当たり2×105細胞(E/T比:20:1)で48時間蒔かれた。特異的な溶解は、ルシフェラーゼ強度によって計算された。図15Aに示されるとおり、CEA/CD3OPT1a3b2b1は、Roche CEA-TCBと比較して用量依存的な様式でMKN-45細胞に対してより強力な著しい標的特異的な細胞傷害性を示し、Roche CEA-TCBのEC50は、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbのものより50倍高かった(図15A)。炎症性サイトカイン(IL-6及びTNF-αなど)及び慢性炎症は、腫瘍発生率の増大及び癌を有する患者に関する予後の悪化と相関した。サイトカイン放出と抗体媒介性細胞傷害性の関連性を決定するために、PBMC及び標的細胞MKN-45の共培養の上清からのサイトカイン放出の並行した分析がELISAアッセイによってなされた。IFN-γ、TNF-α、IL-2及びIL-6のレベルは、PBMC及びMKN-45のCEA/CD3 OPT1a3b2b1 BsAb処理された共培養物中でRoche CEA-TCBより高く見えるが、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbからのサイトカイン放出レベルは、抗体に誘導されるEC50の濃度で判断した場合Roche CEA-TCBと同様であった(図15B~図15E)。(示される矢印は、腫瘍溶解のEC50濃度を指している)。本発明者らは、上清からの抗炎症性サイトカインIL-10レベルにも注目した。IL-10産生の抗体用量依存的な応答は、Roche CEA-TCB及びCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbで処理された共培養上清の両方から検出されたが、2つの抗体処理上清間で著しい相違はなかった(図15F)。データは、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbがRoche CEA-TCBより強力な細胞溶解活性を有するが、Roche CEA-TCBと同様のサイトカイン放出レベルを有することを示した。
CEAは、多数のヒト癌において過剰発現されるが、この細胞表面の糖タンパク質は、腎尿路生殖器路、気道及び胃腸管などの様々な上皮組織でも一般的に発現される。結果として、本発明者らのCEA/CD3二重特異性抗体は、理論的には、エフェクターT細胞と正常CEA発現細胞との間の結合をもたらすことができ、オフターゲット細胞傷害性を引き起こす可能性がある。したがって、本発明者らのCEA/CD3二重特異性抗体によって媒介される細胞傷害性に必要となるCEA発現の最小レベルを評価することが重要である。Roche CEA-TCBの細胞傷害活性は、CEAを発現する様々なものとともに100を超える標的細胞株で死滅アッセイを実施することによって十分に特徴付けられた。これらの細胞傷害性実験から、CEA-TCB二重特異性抗体は、10,000を超えるCEA結合部位を有する腫瘍標的細胞を死滅させることができるが、10,000未満のCEA結合部位を有する標的細胞は、CEA-TCBに対してほとんど応答しなかったことがわかった。本発明者らのCEA/CD3二重特異性抗体に媒介される細胞傷害性に必要となるCEA発現の閾値レベルを決定するために、本発明者らは、様々なCEA発現レベルを有する複数の腫瘍細胞株を選択した。フローサイトメトリー分析は、CEAが胃腫瘍MKN-45細胞上で最も高度に発現され、肺癌A549細胞上で最も低く発現されたことを示し、中間のCEA発現レベルは、LS-174T、KATO III及びHT-29において示された(図17及び表10)。新たに単離されたヒトPBMCは、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAb(図面においてLead CEA/CD3とも称される)又はアイソタイプ/CD3 BsAb(すなわち非CEA抗体/CD3、非CEA抗体部分は、クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)Tox Bに結合する)の存在下又は非存在下においてE/T比 10:1で腫瘍細胞と48時間共培養され、ベンチマーク抗体としてのRoche CEA-TCBと比較された。予想されるとおり、CEAを高度に発現するMKN-45及びLS-174T標的細胞の細胞溶解は、Roche CEA-TCBよりCEA/CD3OPT1a3b2b1によってより強力であるように見えた。並行したウェルにおいて、アイソタイプ/CD3処理された共培養物で細胞傷害活性は観察されなかった(図17及び表10)。興味深いことに、CEAの中程度の発現を有するKATO III細胞の比較的弱い細胞溶解は、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbによって媒介されたが、KATO III細胞は、Roche CEA-TCB二重特異性抗体に対して全く応答を有しなかった。より重要なこととして、Roche CEA-TCBのように、CEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbは、比較的低いCEA発現を有するHT-29に対して細胞溶解活性を誘発しなかった。(図17及び表10)。本発明者らのデータは、Roche CEA-TCB二重特異性抗体が、その比較的低いCEA結合親和性に起因してインビトロ及びインビボでの腫瘍溶解において高いCD3親和性結合体から恩恵を被らないため、腫瘍標的に対する結合親和性が細胞溶解の効力において重要な役割を果たすことを示唆する。
最終的に、本発明者らは、インビボでの異種移植分析によって腫瘍発達に対するCEA/CD3二重特異性抗体の影響を評価した。NSGマウスは、0日目に右側腹部の皮下にLS-174T細胞を、7日目にヒトPBMCを注射された。溶媒(PBS)又は抗体(1又は3mg/Kg)は、14日にわたり1週間に2回腹腔内投与された(図18A)。抗腫瘍有効性試験のために、腫瘍体積がキャリパーで毎週測定され、計算された。CEA/CD3 BsAbの抗腫瘍応答は、終点で比較された。CEA/CD3OPT1a3b2b1、CEA/CD3親及びCEA/CD3OPT1a3b BsAbは、3mg/Kg治療でPBS対照群と比較してLS-174T細胞で誘導される腫瘍増殖を完全に阻害した(図18B)。7匹のマウスのうちの1匹は、1mg/kgでマウスにおいてCEA/CD3OPT1a3b2b1 BsAbの治療に対して十分に応答しなかったが、腫瘍増殖の強力な阻害が観察された(図19A)。マウスの体重変化は、PBSと抗体治療マウスとの間で著しく異ならなかった(データは示さず)。しかしながら、Rocheが公表したデータと比較した場合、Roche CEA-TCBは、完全な腫瘍応答がRoche CEA-TCBの比較的高い用量での治療(2.5mg/kg)において観察されなかったため、十分に強力ではなかった(図19B)。
本開示は、その詳細な説明と関連して記載されているが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の範囲を例示することを意図しており、限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点及び変更形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
Claims (10)
- CD3抗原結合断片であって、
配列番号23のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
配列番号24のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または、
配列番号25のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号2のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
配列番号26のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号4のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
を含む、CD3抗原結合断片。 - 第1の抗原結合ドメイン及び第2の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗原結合分子であって、前記第2の抗原結合ドメインは、請求項1に記載のCD3抗原結合断片を含む、二重特異性抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合ドメインは、2つの同一の重鎖と、2つの同一の軽鎖とを含み、及び前記第2の抗原結合ドメインは、請求項1に記載の2つの同一のCD3抗原結合断片を含み、前記第1の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖は、前記第2の抗原結合ドメインのそれぞれの前記CD3抗原結合断片に融合される、請求項2に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合ドメインのそれぞれの前記軽鎖の定常領域のC末端は、直接的に又はペプチドリンカーを介して前記第2の抗原結合ドメインのそれぞれの前記CD3抗原結合断片の前記重鎖可変領域のN末端に融合される、請求項3に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合ドメインは、アグリコシル化モノクローナル抗体を含み、及び/又は前記CD3抗原結合断片は、scFvを含む、請求項2~4のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 前記第1の抗原結合ドメインは、CEA抗原結合ドメインである、請求項2~5のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 前記CEA抗原結合ドメインは、配列番号5を含む重鎖可変領域及び配列番号6を含む軽鎖可変領域を含むか;又は前記CEA抗原結合ドメインは、配列番号7を含む重鎖可変領域及び配列番号8を含む軽鎖可変領域を含む、請求項6に記載の二重特異性抗原結合分子。
- 必要とする対象において癌を治療するための医薬であって、請求項1に記載のCD3抗原結合断片又は請求項2~7のいずれか一項に記載の二重特異性抗原結合分子を含む、医薬。
- 前記癌は、CEA陽性癌である、請求項8に記載の医薬。
- 前記癌は、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌又は他の胃腸癌である、請求項9に記載の医薬。
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