JP7388702B2 - 抗腫瘍剤及び配合剤 - Google Patents

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Description

本発明は、抗腫瘍剤及び配合剤に関する。
がん治療においては、抗がん剤や放射線などの治療に対して抵抗性を持つ細胞が存在することが、再発や転移の原因となり、がんの治療を妨げている。このような治療抵抗性細胞として、近年がん幹細胞の存在が注目されている。がん幹細胞は、各種ストレスに対して耐性が高く、がん幹細胞を標的とした薬剤の開発ががんの根治のためには急務である。しかし、がん幹細胞を標的にした治療の開発のための、がん幹細胞のストレス耐性の分子機構の解析は端緒についたばかりである。
上皮性がん幹細胞のマーカーの一つであるＣＤ４４は、そのストレス耐性に関与する分子として知られている（Cancer Cell. 2011 Mar 8;19(3):387-400）。ＣＤ４４には、スプライスバリアントフォーム（以下、ＣＤ４４ｖ）が存在し、ＣＤ４４ｖが細胞膜上にシスチントランスポーターｘＣＴを安定して発現させる。ｘＣＴは細胞内にシスチンを取り込む機能を有し、それによって取り込まれたシスチンはグルタチオン（ＧＳＨ）の産生に用いられるために、ＣＤ４４ｖを高発現している細胞では、ＧＳＨの量が増加する。ＧＳＨは強力な抗酸化作用を持ち、細胞に生じたストレスを減少させる役割を持つために、ＣＤ４４ｖを高発現するがん幹細胞は、治療に対して抵抗性を有するとされる。
一方、潰瘍性大腸炎や関節リウマチの治療に使用されている薬剤に、スルファサラジン（Sulfasalazine）(別名：サラゾスルファピリジン、サラゾピリン、サリチルアゾスルファピリジン)がある。スルファサラジンは、スルファピリジンと５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）の酸性アゾ化合物であり、経口投与すると、腸内で腸内細菌によりスルファピリジンと５－アミノサリチル酸（５－ＡＳＡ）に分解される。前記疾患に対しては、特に５－ＡＳＡが主な有効成分とされている。
近年、分解される前の未変化体のスルファサラジンにｘＣＴ阻害作用があり、抗腫瘍剤として有効であることが明らかになった（Leukemia vol.15, pp.1633-1640, 2001）。つまり、スルファサラジンを癌細胞に添加すると、ｘＣＴによる細胞内へのシスチンの取り込みが抑制され、グルタチオン産生量が低下し、その結果、癌細胞の酸化ストレス耐性が下がり、抗腫瘍剤への感受性が上昇する。
ＣＤ４４ｖを高発現するがん幹細胞に対しても、ｘＣＴ阻害作用を有するスルファサラジンは有効に増殖を抑制することが知られている（特開２０１２－１４４４９８）。
本発明は、新規な抗腫瘍剤及び配合剤を提供することを課題とするものである。
本発明者らは、スルファサラジンは、未分化な腫瘍細胞がほとんどである腫瘍に対しては単独で抗腫瘍効果を有するが、分化形質を示す腫瘍細胞を含むような分化型腫瘍に対してはＣＤ４４ｖを高発現するがん幹細胞を減少させるものの、腫瘍全体の体積を減少させる効果がないことを見出した。そこで、そのような分化型腫瘍に対し、スルファサラジンが抗腫瘍効果を有しない腫瘍細胞に対して抗腫瘍効果をもつ薬剤を開発することによって分化型腫瘍に対する抗腫瘍剤を得ようと鋭意努力したところ、アルデヒド脱水素酵素阻害剤をスルファサラジンと併用すれば、スルファサラジン単独では効果の弱い腫瘍細胞に対し顕著な抗腫瘍効果があることを見出し、本発明の完成に至った。
本発明の一実施態様は、有効量のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と同時に投与される、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤であるか、あるいは有効量のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と同時に投与される、アルデヒド脱水素酵素阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。
本発明の他の実施態様は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤とを有効成分として含有する配合剤である。
本発明のさらなる実施態様は、上記配合剤を含有する抗腫瘍剤である。
前記グルタチオン濃度低下剤がｘＣＴ、Thioredoxin-1（チオレドキシン-１：ＴＲＸ-１）、glutamate-cysteine ligase（ＧＣＬ）（ＥＣ６．３．２．２）（γ－グルタミルシステイン合成酵素とも呼ばれる）、グルタチオン合成酵素（ＥＣ６．３．２．３）のいずれかの活性を阻害する薬剤であってもよい。前記薬剤がxCTトランスポーターの阻害剤であってもよい。前記xCTトランスポーターの阻害剤がスルファサラジン、エラスチン、またはソラフェニブであってもよい。前記アルデヒド脱水素酵素阻害剤が下記式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であってもよい。
（式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。）
本発明のさらなる実施態様は、Ｃ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、または６員環のアザシクロアルキル基を形成する。）
前記式（Ｉ）で表される化合物がジクロニン（Dyclonine）、BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、またはAldi-2であってもよい。
本発明のさらなる実施態様は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤をin vitroで腫瘍細胞に同時に投与する工程と、前記腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含む測定方法である。
本発明のさらなる実施態様は、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と併用効果を有するアルデヒド脱水素酵素阻害剤の特定方法であって、特定のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と複数のアルデヒド脱水素酵素阻害剤をin vitroで腫瘍細胞に同時に投与する工程と、前記腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含む特定方法である。
本発明のさらなる実施態様は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤と併用効果を有するグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤の特定方法であって、抗腫瘍剤である特定のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と、複数のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤とをin vitroで腫瘍細胞に同時に投与する工程と、前記腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含む特定方法である。
本発明のさらなる実施態様は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤との併用効果を奏する腫瘍細胞の特定方法であって、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤の特定の組み合わせをin vitroで複数の腫瘍細胞に同時に投与する工程と、前記複数の腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含む特定方法である。
上記いずれかの特定方法または測定方法において、前記腫瘍細胞が、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤に耐性であってもよい。
＝＝関連文献とのクロスリファレンス＝＝
本出願は、２０１７年１１月１５日付で出願した日本国特許出願２０１７－２２０２３１に基づく優先権を主張するものであり、当該基礎出願を引用することにより、本明細書に含めるものとする。
本発明の一実施例において、スルファサラジンとジクロニンとの併用効果を示したグラフである。 本発明の一実施例において、ｘＣＴノックダウンによるジクロニン感受性の変化を示したグラフである。 本発明の一実施例において、各種癌細胞株におけるスルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯとジクロニンとの併用効果を示した図である。 本発明の一実施例において、スルファサラジンとジクロニンのin vivoにおける併用効果を示したグラフである。 本発明の一実施例において、ジクロニンによるＡＬＤＨ活性の阻害効果を示す実験結果の図である。 本発明の一実施例において、スルファサラジンとジクロニン併用によるＨＮＥ（４－ＨＮＥ；４-ヒドロキシ-２-ノネナール）の蓄積効果を示した図である。 本発明の一実施例において、スルファサラジンまたはＢＳＯとジクロニン類縁体（ジクロニン骨格を有するもの）との併用効果を示したグラフである。 本発明の一実施例において、ＢＳＯとジクロニン類縁体（ジクロニン骨格を有さないもの）との併用効果を示したグラフである。 本発明の一実施例において、ＯＳＣ１９細胞またはスルファサラジン耐性ＯＳＣ１９細胞におけるスルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯとジクロニンとの併用効果を示したグラフである。 本発明の一実施例において、ＨＳＣ４細胞、ＯＳＣ１９細胞またはスルファサラジン耐性ＯＳＣ１９細胞におけるＡＬＤＨ遺伝子ファミリーの発現を示したグラフである。 ＨＮＥの代謝経路を表した図である。略語：ＨＮＡ，４-ヒドロキシ-２-ノネノイン酸；ＧＳＨ，グルタチオン；ＡＬＤＨ，アルデヒド脱水素酵素；ＧＳＴ，グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ
以下、本発明の実施の形態を、実施例を挙げながら詳細に説明する。なお、本発明の目的、特徴、利点、および、そのアイデアは、本明細書の記載により、当業者には明らかであり、本明細書の記載から、当業者であれば容易に本発明を再現できる。以下に記載された発明の実施の形態及び具体的な実施例などは、本発明の好ましい実施態様を示すものであり、例示又は説明のために示されているのであって、本発明をこれらに限定するものではない。本明細書で開示されている本発明の意図並びに範囲内で、本明細書の記載に基づき、様々な改変並びに修飾ができることは、当業者にとって明らかである。
なお、実施の形態及び実施例に特に説明がない場合には、標準的なプロトコール集に記載の方法、あるいはそれを修飾したり、改変したりした方法を用いる。また、市販の試薬キットや測定装置を用いる場合には、特に説明が無い場合、それらに添付のプロトコールを用いる。
＝＝抗腫瘍剤＝＝
本発明の一実施形態は、有効量のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と同時に投与される、グルタチオン濃度低下剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。ここで、有効量のアルデヒド脱水素酵素阻害剤とは、抗腫瘍活性として、グルタチオン濃度低下剤と併用効果を有する量のアルデヒド脱水素酵素阻害剤である。
また、本発明の他の実施形態は、有効量のグルタチオン濃度低下剤と同時に投与される、アルデヒド脱水素酵素阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤である。ここで、有効量のグルタチオン濃度低下剤とは、抗腫瘍活性として、アルデヒド脱水素酵素阻害剤と併用効果を有する量のグルタチオン濃度低下剤である。
アルデヒド脱水素酵素阻害剤は、アルデヒド脱水素酵素２（アルデヒド脱水素酵素２；ＡＬＤＨ）（ＥＣ１．２．１．１０）の酵素活性を阻害する薬剤である。阻害対象とするＡＬＤＨのタイプおよびイソタイプは特に限定されず、ＡＬＤＨ１～５、及びそれらのイソタイプのいずれであってもよい。抗腫瘍剤で使用されるアルデヒド脱水素酵素阻害剤は特に限定されないがクロープロパミド（chlorpropamide）、トルブタミド（tolbutamide）、ジエチルアミノベンズアルデヒド、ジスルフィラム(tetraethylthioperoxydicarbonic diamide)、シアナミド(cyanamide)、オキシフェドリン、シトラル（3,7-dimethyl-2,6-octadienal）、コプリン（coprine）、ダイジン（daidzin）、DEAB(4-(Diethylamino)benzaldehyde)、ゴシポール（gossypol）、キヌレニン代謝物（3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic acid, kynurenic acid, および indol-3-ylpyruvic acid）、モリネート（Molinate）、ニトログリセリン、パージリン（N-benzyl-N-methylprop-2-yn-1-amine）及びそれらの類縁体、またはそれらの薬理学的に許容される塩が例示できる。特に、以下に示すジクロニン及びジクロニン類縁体（Ｉ）が好ましく、図７に示した化合物（BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、およびAldi-2）がより好ましい。
（式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。Ｒ１はＣ４～５の直鎖または分岐アルキル基であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３はＣ２のアルキル基か、またはＲ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする６員環のアザシクロアルキル基であることが好ましい。なお、Ｒ１はＣ４の直鎖アルキル基であり、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする６員環のアザシクロアルキル基である化合物はジクロニンである。ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、Ｉが好ましい。）
なお、薬理学的に許容される塩とは、それらの化合物と塩を形成するものであれば限定されないが、具体的には例えば塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、過塩素酸塩、リン酸塩などの無機酸の付加塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩などの有機酸の付加塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンスルホン酸塩、カンファースルホン酸塩などのスルホン酸の付加塩、アミノ酸の付加塩などを挙げることができ、好ましくは塩酸塩、シュウ酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩である。さらに、それらの化合物またはその薬理学的に許容される塩は、無水物のみならず水和物や結晶多形も含まれることは言うまでもない。
グルタチオン濃度低下剤は、細胞内におけるグルタチオン濃度を低下させる薬剤である。これらの抗腫瘍剤で使用されるグルタチオン濃度低下剤は限定されないが、ｘＣＴが細胞内に取り込んだシスチンからグルタチオンが産生される経路を阻害する薬剤が好ましく、ｘＣＴ、Thioredoxin-1（チオレドキシン-１：ＴＲＸ-１）、glutamate-cysteine ligase（ＧＣＬ）（ＥＣ６．３．２．２）（γ－グルタミルシステイン合成酵素とも呼ばれる）、グルタチオン合成酵素（ＥＣ６．３．２．３）のいずれかの活性を阻害する薬剤であることがより好ましく、ｘＣＴ阻害剤がより好ましい。ｘＣＴ阻害剤は特に限定されないが、スルファサラジン、エラスチン、ソラフェニブ、または抗ｘＣＴ抗体であることが好ましい。
グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１８）の酵素活性を阻害する薬剤であって、特に、ＨＮＥ（４－ＨＮＥ；４-ヒドロキシ-２-ノネナール）をＨＮＥ－ＧＳＨに変換する活性を阻害する薬剤である。グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は特に限定されないが、グルタチオンアナログ（例えば、WO95/08563、WO96/40205、WO99/54346など）、ケトプロフェン、インドメタシン、エタクリン酸、ピロプロスト、抗ＧＳＴ抗体、ＧＳＴのドミナントネガティブ変異体等が挙げられる。
ここで、二つの薬剤を「同時に投与する」とは、時間的に同時に投与することのみならず、一方の薬剤の効果が残っている間に、他方の薬剤を投与する限り、時間的に前後してそれぞれ単独で投与することも意味するものとする。二つの薬剤を同時に投与する場合、一方のみを含有する薬剤を２種類同時に投与してもよいが、配合剤として二つの薬剤を一つの剤形にして投与してもよい。
抗腫瘍剤の投与対象は、脊椎動物であれば特に限定されないが、ヒトのがん患者であることが好ましい。治療対象の腫瘍は特に限定されないが、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤に対して耐性を有する腫瘍細胞を含む腫瘍が好ましい。この腫瘍細胞は、アルデヒド脱水素酵素が高発現していてもよい。グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、ｘＣＴ阻害剤であることが好ましく、スルファサラジンであることがより好ましい。耐性を有する腫瘍細胞とは、in vivoでは、患者に通常治療濃度で通常治療日数投与したときに生き残る腫瘍細胞であって、in vitroでは、８０％以上の種類の細胞株において生存率が５０％以下である濃度で生存率が９０％以上の腫瘍細胞をいうものとする。例えば、スルファサラジン耐性腫瘍細胞とは、in vivoでは、患者にＡＵＣ０－２４が５０～３００μｇ・ｈ／ｍＬで約２週間投与したときに生き残る腫瘍細胞であって、in vitroでは、２００μＭで生存率が９０％以上の腫瘍細胞をいうものとする。スルファサラジン耐性腫瘍細胞は、ＣＤ４４ｖ発現も低レベルであるか、陰性であることが好ましい。アルデヒド脱水素酵素が過剰発現している腫瘍細胞とは、ＡＬＤＨ１Ａ１、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ１Ｂ１，ＡＬＤＨ３Ａ１のいずれかの遺伝子発現が、ＯＳＣ１９細胞に比較して３倍以上、好ましくは１０倍以上高いレベルで発現している細胞をいうものとする。この治療対象の腫瘍には、ＣＤ４４ｖが発現している腫瘍細胞が混入していてもよい。ＣＤ４４ｖが発現している腫瘍細胞に対しては、スルファサラジンが効果的に抗腫瘍作用を有するからである。ＣＤ４４ｖが発現している腫瘍細胞とは、ＣＤ４４ｖ発現が検出できる細胞であればよいが、高発現している細胞が好ましく、その場合の高発現とは、卵巣腫瘍細胞の平均レベルと同じ程度か高ければよいが、２倍以上高いことが好ましく、４倍以上高いことがより好ましく、１０倍以上高いことがさらに好ましい。
腫瘍の種類は特に限定されないが、固形がんであることが好ましく、大腸腺癌、胃腺癌、乳腺癌、肺腺癌、膵腺癌、頭頸部の扁平上皮癌、卵巣腫瘍、精巣腫瘍を例示することができる。
抗腫瘍剤は、通常の方法により、錠剤、粉剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などに剤形化されてもよい。その際、当業者に知られた薬学的に許容できる添加剤、例えば賦形剤や担体を用いて製造される。
抗腫瘍剤は、有効量の範囲内で、投与対象に対して適した方法で投与すればよい。有効量は、剤形の種類、投与方法、投与対象の年齢や体重、投与対象の病状等を考慮して、最終的には医師または獣医師の判断により適宜決定することができる。例えば、化合物の投与量は１日当たり、０．１ｍｇ／ｋｇ以上であることが好ましく、１ｍｇ／ｋｇ以上であることがより好ましく、１０ｍｇ／ｋｇ以上であることがさらに好ましく、１０００ｍｇ／ｋｇ以下であることが好ましく、３００ｍｇ／ｋｇ以下であることがより好ましく、１００ｍｇ／ｋｇ以下であることがさらに好ましい。投与方法は、特に限定されず、例えば、経口投与してもよいし、腹腔内や静脈内への注射や点滴により非経口投与してもよいし、注射等によりがん内に直接投与してもよい。
＝＝腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率の測定方法＝＝
本発明の一実施形態は、アルデヒド脱水素酵素阻害剤と、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤とをin vitroで腫瘍細胞に同時に投与する工程と、薬剤を投与した腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含む測定方法である。本節におけるアルデヒド脱水素酵素阻害剤、グルタチオン濃度低下剤、グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、「抗腫瘍剤」の節で詳述したものに準じる。
アルデヒド脱水素酵素阻害剤と、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤とは、抗腫瘍活性について併用効果を有しているので、この測定方法によって、併用効果の高い薬剤の組み合わせを見出したり、ある薬剤の組み合わせに対し、特に有効な腫瘍細胞を見出したりすることができる。
具体的には、特定のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と複数のアルデヒド脱水素酵素阻害剤をin vitroで腫瘍細胞に同時に投与し、薬剤を投与した腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定することによって、特定のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と併用効果を有するアルデヒド脱水素酵素阻害剤を特定することができる。また、特定のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と複数のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤をin vitroで腫瘍細胞に同時に投与し、薬剤を投与した腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定することによって、特定のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と併用効果を有するグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤を特定することができる。あるいは、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤の特定の組み合わせをin vitroで複数の腫瘍細胞に同時に投与し、薬剤を投与した複数の腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定することにより、アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤との併用効果を奏する腫瘍細胞を特定することができる。
（実験例１）スルファサラジンとジクロニンとの併用効果
（目的）本実験例では、スルファサラジン耐性細胞の生存率低下に関し、ｘＣＴ阻害効果のあるスルファサラジンとジクロニンとが併用効果を奏することを示す。
（方法）９６ウエルプレートに、スルファサラジン耐性細胞株である口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ－４を２０００個／ウエルで播種し、培養を開始した。培地は、ＤＭＥＭを用いた。２４時間後、５０μＭジクロニンまたは等量のＤＭＳＯと、０μＭ（無添加）、５０μＭ、１００μＭ、２００μＭ、または４００μＭのスルファサラジンを含有した培地に交換し、４８時間、培養を続けた。その後、Celltiter-Glo（Promega社）を用いて細胞生存率を測定し、コントロール（ＤＭＳＯ添加、スルファサラジン無添加）の細胞生存数を１００％として、各場合の細胞生存率を算出した。図１にスルファサラジンの各濃度に対する生存率を表すグラフを作成した。
（結果）ＨＳＣ４は、スルファサラジン耐性細胞株であって、スルファサラジン単独では細胞生存率にほとんど影響がない。また、ジクロニン単独（ジクロニン添加、スルファサラジン無添加）でも、８０％の生存率を示す。しかしながら、ジクロニンとスルファサラジンを両方添加すると、スルファサラジンが１００μＭ以上で、生存率が１０％以下となる。
このように、スルファサラジン耐性細胞の生存率低下に関し、スルファサラジンとジクロニンとが併用効果を奏する。
（実験例２）ｘＣＴノックダウンによるジクロニン感受性の変化
（目的）本実験例では、ｘＣＴ阻害効果のあるスルファサラジンの代わりにｘＣＴをノックダウンしても、同様なジクロニンとの併用効果が得られることを示すことによって、スルファサラジンとジクロニンとが併用効果を有するのは、スルファサラジンのｘＣＴ阻害効果を介していることを示す。
（方法）９６ウエルプレートにスルファサラジン耐性細胞株である口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ－４細胞を３０００個／ウエルで播種し、非サイレンシングコントロール（スクランブル(Sense: UUCUCCGAACGUGUCACGUtt（配列番号１）, Antisense: ACGUGACACGUUCGGAGAAtt（配列番号２）)）ｓｉＲＮＡまたはｘＣＴ特異的ｓｉＲＮＡ（xCT siRNA#1 Sense: AGAAAUCUGGAGGUCAUUAtt（配列番号３）, Antisense:AGAAAUCUGGAGGUCAUUAtt（配列番号４）, xCT siRNA#2 Sense: CCAGAACAUUACAAAUAAUtt（配列番号５）, Antisense: AUUAUUUGUAAUGUUCUGGtt（配列番号６））をLipofectamine RNAiMAX（ThermoFisher Scientific社）を用いてリポフェクトし、培養を開始した。培地はＤＭＥＭを用いた。２４時間後、５０μＭジクロニン（溶媒はＤＭＳＯ）または等量のＤＭＳＯを含有する培地に交換し、４８時間培養を続けた。その後、Celltiter-Glo（Promega社）を用いて細胞生存率を測定し、コントロール（非サイレンシングコントロール、ＤＭＳＯ添加）の細胞生存率を１００％として、それぞれの細胞生存率を算出した。図２に結果を示す。
（結果）ＨＳＣ－４は、５０μＭのジクロニン単独では約６０％の細胞生存率を有するのに対し、ｘＣＴをノックダウンした場合、５０μＭのジクロニン存在下で、約１０～２０％の細胞生存率しか有しない。
このように、スルファサラジンとジクロニンとが併用効果を有するのは、スルファサラジンのｘＣＴ阻害効果を介している。
（実験例３）各種癌細胞株におけるスルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯとジクロニンとの併用効果
（目的）本実験例では、様々な腫瘍細胞株において、スルファサラジン、ｘＣＴの特異的阻害剤であるエラスチン、またはグルタチオン合成阻害剤であるＢＳＯとジクロニンとが併用効果を奏することを示すのと同時に、ｘＣＴの阻害がグルタチオン合成阻害を介していることを示す。
（方法）９６ウエルプレートに、図３に示す細胞株を３０００個／ウエルで播種し、培養を開始した。培地は、ＤＭＥＭを用いた。２４時間後、５０μＭジクロニンまたは等量のＤＭＳＯと、０μＭ（無添加）または４００μＭのスルファサラジン、０μＭ（無添加）または５μＭのエラスチン、０μＭ（無添加）または１００μＭのＢＳＯを含有した培地に交換し、４８時間、培養を続けた。その後、Celltiter-Glo（Promega社）を用いて細胞生存率を測定し、コントロール（ＤＭＳＯ添加、ジクロニン無添加）の細胞生存数を１００％として、それぞれの細胞生存率を算出した。図３に各場合の細胞生存率を図示した。
（結果）細胞によって大小はあるが、スルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯとジクロニンのいずれの組み合わせにおいても同様な併用効果が観察された。
このように、スルファサラジンやエラスチンによるｘＣＴの阻害は、グルタチオンの合成阻害によって、その抗腫瘍効果を発揮する。従って、スルファサラジンやエラスチンの代わりにグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤を用いることができる。
（実験例４）スルファサラジンとジクロニンのin vivoにおける併用効果
（目的）本実験例では、スルファサラジンとジクロニンの併用効果が、in vivoでも観察されることを示す。
（方法）スルファサラジン耐性細胞株である口腔扁平上皮がん細胞株ＨＳＣ－２細胞の１×１０６個をヌードマウス皮下に移植し、移植後４日目より生理食塩水、スルファサラジン単独、ジクロニン単独、スルファサラジンとジクロニン両方を１日１回、各薬剤をスルファサラジン４００ｍｇ／ｋｇ、ジクロニン５ｍｇ／ｋｇの投与量で腹腔内投与し、２２日目まで続けた。３～４日おきに、腫瘍の短径、長径を測定し、以下の式により腫瘍体積を算出し、結果を図４にグラフ化した。
腫瘍体積＝（長径×（短径）２）／２
なお、腫瘍体積の統計解析は、２２日目にｔ検定により行った。
（結果）図４で示すように、各薬剤単独では、３５％程度の腫瘍体積の減少であったが、両方投与すると、７０％程度体積が減少した。
このように、スルファサラジンとジクロニンとの併用投与によって、スルファサラジン耐性腫瘍の増殖を低下させることができる。
（実験例５）ジクロニンによるＡＬＤＨの阻害
（目的）本実験例では、ジクロニンがＡＬＤＨの阻害活性を有することを示す。
（方法）１０ｃｍ細胞培養デイシュに口腔届平上皮がん細胞株ＨＳＣ－４細胞を８×１０５個／ディッシュで播種し、培養を開始した。培地は、ＤＭＥＭを用いた。２４時間後、５０μＭのジクロニン（溶媒はＤＭＳＯ）を含む培地に交換し、２４時間培養した。その後、細胞を回収し、ALDEFLUOR kit（STEMCELL Technologies社）により、N，N－diethylaminobenzaldehyde（ＤＥＡＢ）存在下でのＡＬＤＨ活性を有する細胞を染色し、ＦＡＣＳで解析した（図ではDyclonine）。コントロールとして、ＤＥＡＢを添加せずALDEFLUOR kitで染色しなかったもの（図ではUnstained）、ジクロニンを含まない等量のＤＭＳＯを含む培地に交換し、ALDEFLUOR kitで染色したもの（図ではNon-treatment）についての実験結果を示す。なお、陽性細胞の計測については、DEAB存在下でALDEFLUOR kitによる染色を行ったDMSO処理サンプル（図ではDEAB）について陽性細胞がほぼ０％となるようなゲートを作製し、各場合の陽性率を計算した。
（結果）図５に示すように、ＤＭＳＯ処理細胞においてはＡＬＤＨ活性の高い細胞群が２５％程度存在しているが、ジクロニン処理細胞および既知のＡＬＤＨ阻害剤であるＤＥＡＢ処理細胞においてはＡＬＤＨ活性が高い細胞群は１％程度まで抑制されている。
このように、ジクロニンはＡＬＤＨの阻害活性を有する。
（実験例６）スルファサラジンとジクロニン併用によるＨＮＥの蓄積
（目的）本実験例では、スルファサラジンとジクロニンの併用によって、腫瘍細胞内でのＨＮＥのレベル、及びＨＮＥを蓄積する細胞の頻度が著しく増加することを示す。
（方法）実験例１と同様に、５０μＭジクロニンまたは等量のＤＭＳＯと、０μＭ（無添加）または４００μＭのスルファサラジンとを含有した培地でＨＳＣ－４細胞を培養し、処理後の細胞を４％ＰＦＡ－ＰＢＳにて固定した。さらに、０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ１００－ＰＢＳにて細胞膜透過処理を行った後、３％ＢＳＡ－ＰＢＳによるブロッキングを行った。その後、１次抗体として抗ＨＮＥ抗体、２次抗体としてAlexafluor488標識抗マウスＩｇＧ抗体を用いて蛍光染色した。ポジティブコントロールとして、５０μＭＨＮＥで３０分インキュベートした細胞を用い、同様に抗体染色を行った。蛍光顕微鏡での観察像を図６に示す。
（結果）ジクロニンまたはスルファサラジンをそれぞれ単独で処理した場合、低頻度で細胞内ＨＮＥ濃度の増加が観察されるが、スルファサラジンとジクロニンの併用によって、高頻度で高濃度の細胞内ＨＮＥの蓄積が観察された。
このように、ｘＣＴ阻害剤とＡＬＤＨ阻害剤を併用することで、高頻度で高濃度の細胞内ＨＮＥの蓄積が観察されるようになる。この理由として、以下の理論に拘泥するものではないが、図１１に示すように、細胞内では、ＨＮＥを分解する経路が複数存在し、その中でＧＳＴを介する経路とＡＬＤＨを介する分解経路の二つを同時に阻害することにより、細胞内でＨＮＥが蓄積するものと考えられる。そして、ＨＮＥには細胞毒性があるので、腫瘍細胞が増殖できなくなると考えられる。
（実験例７）スルファサラジンまたはＢＳＯとジクロニン類縁体（ジクロニン骨格を有するもの）との併用効果
（目的）ジクロニン骨格を有する下記ジクロニン類縁体（Ｉ）は、スルファサラジンまたはＢＳＯとの併用効果を有することを示す。
（式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。Ｒ１はＣ４～５の直鎖または分岐アルキル基であることが好ましく、Ｒ２及びＲ３はＣ２のアルキル基か、またはＲ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする６員環のアザシクロアルキル基であることが好ましい。なお、Ｒ１はＣ４の直鎖アルキル基であり、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする６員環のアザシクロアルキル基である化合物はジクロニンである。ハロゲンは、Ｆ、Ｃｌ、Ｉ、Ｂｒ、Ｉが好ましい。）
（方法）実験例１と同様に、０μＭ（無添加）、２５μＭ、５０μＭ、または１００μＭのジクロニン、又は１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭのジクロニン類縁体BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、またはAldi-2（構造式は図７Ｂ参照）と、０μＭ（無添加）または１００μＭＢＳＯまたは３００μＭスルファサラジンを含有した培地でＨＳＣ－４細胞を培養し、細胞生存率を測定して、図７Ａにグラフ化した。
（結果）これらの化合物はすべてＢＳＯまたはスルファサラジンとの併用効果を奏した。
このように、ジクロニン骨格を有するジクロニン類縁体（Ｉ）は、ｘＣＴ阻害剤と抗腫瘍剤として併用効果を有する。
（実験例８）ＢＳＯとジクロニン類縁体（ジクロニン骨格を有さないもの）との併用効果
（目的）ジクロニン骨格を有さないジクロニン類縁体は、ＢＳＯとの併用効果を有さないことを示す。
（方法）実験例１と同様に、０μＭ（無添加）、１２．５μＭ、２５μＭ、または５０μＭジクロニン、又は３．１２５μＭ、６．２５μＭ、１２．５μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭのジクロニン類縁体（4-hydroxyacetpphenone：構造式は図８Ｂ参照）と、０μＭ（無添加）または１００μＭＢＳＯを含有した培地でＨＳＣ－４細胞を培養し、細胞生存率を測定して、図８Ａにグラフ化した。
（結果）ジクロニン骨格を有さないジクロニン類縁体はＢＳＯとの併用効果を奏しなかった。
このように、ｘＣＴ阻害剤との相互作用には、ジクロニン骨格が重要である。
（実験例９）スルファサラジン耐性ＯＳＣ１９細胞におけるスルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯとジクロニンとの併用効果
（目的）ｘＣＴ阻害剤に対する耐性を獲得したがん細胞株においてジクロニンがグルタチオン合成阻害剤との併用効果を有することを示す。
（方法）スルファサラジン感受性口腔扁平上皮がん細胞株ＯＳＣ１９をスルファサラジンを含むＤＭＥＭ培地中で２ケ月間培養し、スルファサラジン耐性ＯＳＣ１９細胞を樹立した。ＯＳＣ１９細胞の親株またはＯＳＣ１９－ＳＳＺＲ細胞を９６ウエルプレートに３０００個／ウエルで播種し、２４時間培養後、図９に示した濃度のスルファサラジン、エラスチン、またはＢＳＯと、５０μＭのジクロニン（溶媒はＤＭＳＯ）または等量のＤＭＳＯを含む培地に交換し、４８時間培養した。その後、Celltiter-Glo（Promega社）により細胞生存率を測定し、コントロール（スルファサラジン、エラスチンおよびＢＳＯ無添加、ＤＭＳＯ添加）を１００％として細胞生存率を算出した。
（結果）ジクロニンはＯＳＣ１９－ＳＳＺＲ細胞においてもスルファサラジン、エラスチンまたはＢＳＯとの併用効果を示した。
このように、ジクロニンはｘＣＴ阻害剤に対する耐性を獲得したがん細胞においてもグルタチオン合成阻害剤との併用効果を示す。
（実験例１０）スルファサラジン耐性ＯＳＣ１９細胞およびＨＳＣ－４におけるＡＬＤＨ遺伝子ファミリーの発現
（目的）ｘＣＴ阻害剤に対する耐性を有するがん細胞においてＡＬＤＨ遺伝子ファミリーが高発現していることを示す。
（方法）ＨＳＣ－４細胞、ＯＳＣ１９細胞およびＯＳＣ１９－ＳＳＺＲ細胞よりメッセ
ンジャーＲＮＡを抽出し、逆転写反応を行うことにより相補的ＤＮＡを合成した。その後、得られた相補的ＤＮＡを鋳型とし、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法によりＡＬＤＨＩＡｌ、
ＡＬＤＨＩＢｌ、ＡＬＤＨ２、ＡＬＤＨ３ＡｌおよびＲＰＳ１７の発現量を測定した。ＲＰＳ１７の発現量をリファレンスとして、ΔΔＣｔ法により各ＡＬＤＨファミリー遺伝子の発現量を定量し、図１０にグラフ化した。
（結果）ＡＬＤＨＩＡｌはＯＳＣ１９に比較して、ＯＳＣ１９－ＳＳＺＲにおいて発現が上昇していた。ＡＬＤＨＩＢｌおよびＡＬＤＨ２はＨＳＣ～４に高い発現が認められた。ＡＬＤＨ３ＡｌはＨＳＣ４およびＯＳＣ１９－ＳＳＺＲにおいて高発現であった。このように、ｘＣＴ低感受性のがん細胞株においてＡＬＤＨファミリー遺伝子の発現が高い傾向にあった。
このように、ＡＬＤＨファミリー遺伝子の発現が高いがん細胞では、ＡＬＤＨファミリー遺伝子によりＨＮＥを分解しているために、ｘＣＴ阻害剤によってＧＳＴへの分解を抑制しても、ＨＮＥによる毒性は作用せず、ｘＣＴ阻害剤に耐性を得る（図１１参照）。このような細胞にＡＬＤＨ阻害剤を投与すると、ｘＣＴ阻害剤に対する感受性が上がるので、ＡＬＤＨ阻害剤及びグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤を含有する抗腫瘍剤は、ＡＬＤＨファミリー遺伝子の発現が高いがん細胞にも効果的に作用する。
本発明によって、新規な抗腫瘍剤及び配合剤を提供することができるようになった。

Claims (9)

  1. 有効量のアルデヒド脱水素酵素阻害剤と同時に投与される、グルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤であって、
    前記アルデヒド脱水素酵素阻害剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその薬理学的に許容される塩であり、
    Figure 0007388702000004
    （Ｉ）
    （式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。）
    前記グルタチオン濃度低下剤はスルファサラジン、エラスチン、ソラフェニブ、または抗ｘＣＴ抗体であり、
    前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、グルタチオンアナログ、ケトプロフェン、インドメタシン、エタクリン酸、ピロプロスト、抗ＧＳＴ抗体、またはＧＳＴのドミナントネガティブ変異体である、抗腫瘍剤。
  2. 有効量のグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤と同時に投与される、アルデヒド脱水素酵素阻害剤を有効成分として含有する抗腫瘍剤であって、
    前記アルデヒド脱水素酵素阻害剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であり、
    Figure 0007388702000005
    （Ｉ）
    （式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。）
    前記グルタチオン濃度低下剤はスルファサラジン、エラスチン、ソラフェニブ、または抗ｘＣＴ抗体であり、
    前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、グルタチオンアナログ、ケトプロフェン、インドメタシン、エタクリン酸、ピロプロスト、抗ＧＳＴ抗体、またはＧＳＴのドミナントネガティブ変異体である、抗腫瘍剤。
  3. 前記式（Ｉ）で表される化合物がジクロニン、BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、またはAlid-2である、請求項１または２に記載の抗腫瘍剤。
  4. アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤とを有効成分として含有する配合剤を含む抗腫瘍剤であって、
    前記アルデヒド脱水素酵素阻害剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物またはその薬理学的に許容される塩であり、
    Figure 0007388702000006
    （Ｉ）
    （式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。）
    前記グルタチオン濃度低下剤はスルファサラジン、エラスチン、ソラフェニブ、または抗ｘＣＴ抗体であり、
    前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、グルタチオンアナログ、ケトプロフェン、インドメタシン、エタクリン酸、ピロプロスト、抗ＧＳＴ抗体、またはＧＳＴのドミナントネガティブ変異体である、抗腫瘍剤。
  5. 前記式（Ｉ）で表される化合物がジクロニン、BAS00363846、STL327701、PHAR033081、PHAR298639、またはAlid-2である、請求項４に記載の抗腫瘍剤。
  6. 前記グルタチオン濃度低下剤または前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤に耐性を有する腫瘍細胞を含む腫瘍に対する抗腫瘍剤である、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
  7. ＣＤ４４ｖが発現している腫瘍細胞を含む腫瘍に対する抗腫瘍剤である、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗腫瘍剤。
  8. アルデヒド脱水素酵素阻害剤とグルタチオン濃度低下剤またはグルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤をin vitroで腫瘍細胞に同時に投与する工程と、
    前記腫瘍細胞の増殖速度または細胞生存率を測定する工程と、を含み、
    前記アルデヒド脱水素酵素阻害剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物、またはその薬理学的に許容される塩であり、
    Figure 0007388702000007
    （Ｉ）
    （式中、Ｒ１はＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であり、Ｒ２及びＲ３は独立して選択されるＣ１～６の直鎖または分岐アルキル基であるか、Ｒ２とＲ３が一緒になってそれらが結合するＮをヘテロ原子とする４員環、５員環、６員環、または７員環のアザシクロアルキル基を形成し、Ｒ４は水素またはハロゲンである。）
    前記グルタチオン濃度低下剤はスルファサラジン、エラスチン、ソラフェニブ、または抗ｘＣＴ抗体であり、
    前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤は、グルタチオンアナログ、ケトプロフェン、インドメタシン、エタクリン酸、ピロプロスト、抗ＧＳＴ抗体、またはＧＳＴのドミナントネガティブ変異体である、測定方法。
  9. 前記腫瘍細胞が、前記グルタチオン濃度低下剤または前記グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ阻害剤に耐性である腫瘍細胞を含む、請求項８に記載の測定方法。
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