JP7369976B2 - 乳酸菌、該乳酸菌由来の自然免疫活性化剤、感染症予防・治療薬及び飲食品 - Google Patents
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Description
また、特許文献2には、特定の抗菌性ペプチドを含有する食品が記載され、該抗菌性ペプチドを産生する菌として、ワイセラ・ヘレニカに属する特定の菌株が挙げられている。
特許文献4には、ワイセラ属に属する消炎性乳酸菌の破砕物が、自己免疫疾患の一種である関節炎の予防・改善作用があるとされ、ワイセラ・ヘレニカ種も列挙されている。そして、このワイセラ属に属する乳酸菌の破砕物によれば、自然免疫の活性化が抑制されたと記載されている。
また、カイコが感染症に対する抵抗性評価のモデル動物として有用であることは、本発明者らにより確かめられている(特許文献6、7等)。
しかし、乳酸菌が科学的なエビデンスをもって上記効果があることを示したケースは殆どなく、優れた自然免疫活性化剤や、自然免疫を活性化することによる感染症予防治療剤の開発が望まれていた。
また、乳酸菌由来物又は自然免疫活性化剤を含有する飲食品や、上記性能に優れた乳酸菌を利用した飲食品の開発も望まれていた。
また、高い自然免疫活性化能を有する新規な乳酸菌(亜種・菌株)を提供することであり、該新規の乳酸菌に由来する有効成分を含有する感染症予防・治療薬や、該乳酸菌を用いて発酵させた(自然免疫活性化用発酵)飲食品を提供することにある。
すなわち、本発明者は、カイコを実験動物とした感染モデルを用いて、複数の病原菌に対して感染症を予防又は治療できる、「乳酸菌(由来物)」、「該乳酸菌(由来物)を有効成分として含有する自然免疫活性化剤」、「該乳酸菌で発酵させた自然免疫能を有する飲食品」等を見出して本発明に至った。
上記乳酸菌の処理物は、乳酸菌の、培養物、培養上清、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも1つの処理物であることを特徴とする自然免疫活性化剤を提供するものである。
また、本発明は、配列表の配列番号1で示される16SrDNA領域の塩基配列を有する上記の乳酸菌を提供するものである。
更に、本発明においては、自然免疫を活性化するので、上記病原菌が(多剤)薬剤耐性菌であるときに特に有用であり、また、自然免疫能が低下したときに(又は低下した人)が発病すると言われ、多くの種類がある(多くの菌がその原因菌となる)日和見感染症の予防若しくは治療に特に有用である。
しかも、ワイセラ・ヘレニカ乳酸菌由来物を、病原菌と同時にカイコに投与した場合には、該カイコの生存率に有意差が見られなかった(生存率の上昇が見られなかった)。すなわち、ワイセラ・ヘレニカ乳酸菌由来物の病原菌感染に対する抵抗性付与には、その前投与が必要であった(実施例、特に実施例6参照)。
しかも、ワイセラ・ヘレニカ乳酸菌由来物の病原菌に対する抵抗性は、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)等、複数の病原菌で確かめられた(実施例7、表8参照)。このことからも、ワイセラ・ヘレニカ乳酸菌由来物は、特定の病原菌に対してのみ有効と言うのではなく、自然免疫機構自体を活性化する性質があると言える。
一方、表1~3のワイセラ(Weissella)属に属さない乳酸菌の亜種、及び、ワイセラ(Weissella)属には属するが、ヘレニカ(hellenica)種には属さない乳酸菌の亜種では、上記のことは言えず、それらの乳酸菌(由来物)には、自然免疫活性化能が極めて低い(若しくは、ない)ことが確かめられた(実施例1~4、表1~6、図1参照)。
そして、本発明の自然免疫活性化剤を含有する(醗酵)飲食品としては、醗酵(豆)乳、乳酸菌飲料、ヨーグルト、漬物等が挙げられ、該(発酵)飲食品は、自然免疫活性化能があることに加えて、風味にも優れると言う効果もある。すなわち、本発明の乳酸菌は、上記製品製造用乳酸菌スターター等としての用途に有用である。
また、乳酸菌Wh0916-4-2で発酵させた飲食品は美味しく、新たな味の飲食品群を提供できる。
実施例1~4に示すように、ワイセラ(Weissella)属、ヘレニカ(hellenica)種に属する乳酸菌は、評価した乳酸菌の全てで自然免疫活性化能が高く、ワイセラ属に属さない乳酸菌、及び、ワイセラ属に属していてもヘレニカ(hellenica)種に属さない乳酸菌では、評価した乳酸菌の全てで自然免疫活性化能が低かった。
カイコのような無脊椎動物には抗体がなく、従って獲得免疫機構は存在しない。感染防御に働いているのは、自然免疫と呼ばれる機構である。近年の研究により、哺乳類にも自然免疫機構があり、その分子機構は無脊椎動物と共通していることが明らかとなっている。本発明は、ヒト等の哺乳類の自然免疫を活性化するものである。
評価試料と病原菌等を同時に投与したときの生存率も測定し、該評価試料の投与後に該病原菌等の投与を行ったときのみ有意に生存率が上がることを確かめて、該生存率の上昇が自然免疫の活性化に起因することを確かめた。
上記「乳酸菌の処理物」は、乳酸菌の、培養物、培養上清、濃縮物、ペースト化物、乾燥物、液状化物、希釈物、破砕物、殺菌加工物、及び、培養物からの抽出物よりなる群から選ばれる少なくとも1つの処理物である。なお、上記表現には、一部「物」として重複している場合も存在する。
前記自然免疫活性化剤における、上記「他の成分」としては、特に制限はなく、本発明の効果を損なわない範囲内で、目的に応じて適宜選択することができ、薬学的に許容され得る担体等が挙げられる。かかる担体としては、特に制限はなく、例えば、後述する「剤型等に応じて配合して使用されるもの」と同様のものも挙げられる。
カイコ感染モデルは、コストが安いばかりでなく、従来使われてきたマウスの系で問題となる、動物愛護の観点からの倫理的問題を回避できるという利点を有している。本発明は、マウスの系では動物愛護の観点から問題となる程の多くの乳酸菌をスクリーニングし、抗菌効果とは関係なく治療効果まで含めて評価する(具体的には生存率を測定する)ことによってなされた。
従って、本発明は、自然免疫活性化剤を含有することを特徴とする飲食品でもあり、また、ワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌を用いて発酵させて得られるものであることを特徴とする自然免疫活性化用発酵飲食品でもある。
本発明においては、最も前記した本発明の効果が高かった、表1における上記「No.18(株名(亜種名)0916-4-2)」の菌株(乳酸菌亜種)を「乳酸菌Wh0916-4-2」と命名した。
以下、このワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌の亜種である乳酸菌Wh0916-4-2について詳述する。
(a)グラム染色結果:陽性
(b)菌体の形状:球形
(c)酸素に対する性質(好気/嫌気):嫌気的
(d)乳酸産生能:あり
(2)アルカリフォスファターゼ:-
(3)エステラーゼ(C4):-
(4)エステラーゼリパーゼ(C8):-
(5)リパーゼ(C14):-
(6)ロイシンアリルアミダーゼ:-
(7)バリンアリルアミダーゼ:-
(8)シスチンアリルアミダーゼ:-
(9)トリプシン:-
(10)α-キモトリプシン:-
(11)酸性フォスファターゼ:+
(12)ナフトール-AS-BI-フォスフォヒドロラーゼ:+
(13)α-ガラクトシダーゼ:-
(14)β-ガラクトシダーゼ:-
(15)β-グルクロニダーゼ:-
(16)α-グルコシダーゼ:-
(17)β-グルコシダーゼ:-
(18)N-アセチル-β-グルコサミニダーゼ:-
(19)α-マンノシダーゼ:-
(20)α-フコシダーゼ:-
「乳酸菌Wh0916-4-2」は、その後、千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室、独立行政法人製品評価技術基盤機構(NITE)の特許微生物寄託センター(NPMD)に、原寄託申請書を提出して、国内寄託(原寄託日:2018年5月14日)から、ブタペスト条約に基づく寄託への移管申請を行い(移管日(国際寄託日):2018年10月1日)、生存が証明され、ブタペスト条約に基づく寄託(国際寄託)への移管申請が受領された結果、受託番号「NITE BP-02710」を受けているものである。
培養は嫌気条件下で行うことが好ましい。培地中の炭素源としては、例えば、D-リボース、D-ガラクトース、D-グルコース、D-フルクトース、D-マンノース、D-マンニトール、N-アセチルグルコサミン、アミグダリン、アルブチン、エスクリン、サリシン、D-セロビオース、D-マルトース、シュクロース、D-トレハロース、ゲンチオビオース、糖蜜、水飴、油脂類等の有機炭素化合物が用いられ、窒素源としては、肉エキス、カゼイン、ペプトン、酵母エキス、乾燥酵母、胚芽、大豆粉、尿素、アミノ酸、アンモニウム塩等の有機・無機窒素化合物を用いることができる。
また、塩類は、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、リン酸塩、鉄塩、銅塩、亜鉛塩、コバルト塩等の無機塩類を必要に応じて適宜添加する。更に、ビオチン、ビタミンB1、シスチン、オレイン酸メチル、ラード油等の生育促進物質を添加することが、目的物の産生量を増加させる点で好ましい。
また、シリコン油、界面活性剤等の消泡剤を添加してもよい。調製済みの培地としては、例えば、MRS培地、GAM培地等を用いることが好ましい。
培養温度は、25℃~37℃間に保つことが好ましく、28℃~32℃で行うことがより好ましい。培養pHは7付近で行うことが好ましい。培養期間は、用いた培地組成、培養温度等により変動するファクターであるが、乳酸菌Wh0916-4-2の場合、好ましくは12~72時間、より好ましくは24~48時間で充分な量の目的物を確保することができる。
培養して得られたコロニーをピックアップし、再度培地上でシングルコロニー形成を行うことも好ましい。
また、本発明は、受託番号がNITE BP-02710であるワイセラ(Weissella)属に属する乳酸菌又はその自然的若しくは人工的に変異した乳酸菌でもある。
また、本発明は、配列表の配列番号1で示される16SrDNA領域の塩基配列を有する上記の乳酸菌でもある。受託番号がNITE BP-02710の乳酸菌は、前記した「乳酸菌Wh0916-4-2」である。
また、前記した本発明におけるワイセラ・ヘレニカに属する乳酸菌で醗酵する工程を用いて製造された飲食品は、乳酸菌の通常の効果に加え、本発明に特有の自然免疫活性化効果を発揮し易いために好ましい。
具体的には、例えば、経口固形剤(錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、ハードカプセル剤、ソフトカプセル剤等)、経口液剤(内服液剤、シロップ剤、エリキシル剤等)、注射剤(溶剤、懸濁剤等)、ゲル剤、クリーム剤、外用散剤、スプレー剤、吸入散布剤等が挙げられる。
前記結合剤としては、例えば、水、エタノール、プロパノール、単シロップ、ブドウ糖液、デンプン液、ゼラチン液、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルスターチ、メチルセルロース、エチルセルロース、シェラック、リン酸カルシウム、ポリビニルピロリドン等が挙げられる。
前記崩壊剤としては、例えば、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられる。
前記滑沢剤としては、例えば、精製タルク、ステアリン酸塩、ホウ砂、ポリエチレングリコール等が挙げられる。
前記着色剤としては、例えば、酸化チタン、酸化鉄等が挙げられる。
前記矯味・矯臭剤としては、例えば、白糖、橙皮、クエン酸、酒石酸等が挙げられる。
前記pH調節剤及び前記緩衝剤としては、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム等が挙げられる。
前記安定化剤としては、例えば、ピロ亜硫酸ナトリウム、EDTA、チオグリコール酸、チオ乳酸等が挙げられる。
前記等張化剤としては、例えば、塩化ナトリウム、ブドウ糖等が挙げられる。前記局所麻酔剤としては、例えば、塩酸プロカイン、塩酸リドカイン等が挙げられる。
具体的には、例えば、健康維持や疲労回復を必要とする個体;癌や生活習慣病の予防や治療を必要とする個体;細菌、真菌、ウイルス等に感染した個体;等に投与することにより使用することができる。
また、投与時期としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、予防的に投与されてもよいし、治療的に投与されてもよい。
本発明の飲食品は、前記した本発明の自然免疫活性化剤に加えて、更に、「その他の成分」を含有することができる。
また、ワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌を用いて発酵させて得られる自然免疫活性化用発酵飲食品の場合は、該発酵に伴って生成される種々の物質をも含むことができる。
本発明の乳酸菌、該死菌若しくは処理物等を飲食品の製造に使用する場合、製造方法は当業者に周知の方法によって行うことができる。当業者であれば、本発明の乳酸菌の(死)菌体又は処理物を他の成分と混合する工程、成形工程、殺菌工程、醗酵工程、焼成工程、乾燥工程、冷却工程、造粒工程、包装工程等を適宜組み合わせ、目的の飲食品を作ることが可能である。
乳酸菌スターターとして本発明の乳酸菌を用いて醗酵を行う場合、本発明の乳酸菌の培養条件と同様の条件等で行うことができる。
以下の表1~3に示したように、124株の乳酸菌を分離し、乳酸産生能を確認しライブラリー化した。このライブラリー(表1~3)から、カイコの緑膿菌PAO1株への感染に対して耐性を与える乳酸菌を探索した。
生存していたカイコは、例えば図2(A)のようであり、死亡していたカイコは、例えば図2(B)のようであった。カイコの生存率の推移の結果を図1に示す。
フルグロースにまで培養した乳酸菌のフルグロース20mLを遠心して菌を集め、抗生物質を含まないカイコ人工餌1gと混ぜ、1日間カイコに給餌した。その後、緑膿菌PAO1株の一晩培養液を生理食塩水で10-5倍に希釈し、該希釈液50μLをカイコに血中注射し、経時的なカイコの生存個体数の減少を観察した。このような方法で、実験1と実験2を行った。
1群のカイコを6匹とし、半数(3匹)が死亡するまでの時間(hrs)を「LT50」とした。評価した乳酸菌について、乳酸菌無しのコントロールのLT50との比を、表4と表5に示した。
既に発明者が論文報告しているLactococcu lactis 11/19-B1株による延命効果は、実験1及び実験2の何れも、1.1倍であった。これに対して、Weissella hellenicaに属する乳酸菌Wh0916-4-2は、3.6倍以上の延命効果を示した。
これに対して、Weissella hellenicaに属する乳酸菌Wh0916-4-2は、2.9倍以上の延命効果を示した。この効果は調べた乳酸菌の中で突出していた。
表1~3に記載した乳酸菌124株の中から、ワイセラ属ヘレニカ種に属する乳酸菌4種(表1~3のNo.18、27、48、75)について、実施例1において、試験試料を乳酸菌ではなく乳酸菌培養上清の67%エチルアルコール可溶性画分とし、緑膿菌PAO1株の一晩培養液を生理食塩水で10-6倍に希釈した以外は実施例1と同様にして、経時的なカイコの生存個体数の減少を観察し、1~3日後の生存を確認した。
ワイセラ・ヘレニカ種に属する乳酸菌は、他の属に属する乳酸菌や、ワイセラ属に属するがヘレニカ種に属さない乳酸菌に比べて、特異的に緑膿菌耐性付与活性を有しており、自然免疫活性能が高かった。
乳酸菌をMRS液体培地で2日間培養し、カイコの人工餌6gと混ぜ、5齢カイコ6匹に与えた。21時間後、10-5倍に生理食塩水で希釈した緑膿菌の菌液をカイコの血液内に注射し、51時間後のカイコの生存数を調べた。結果を表6に示す。
5齢のカイコに1gの人工餌を与え1日後、表1~4の中の4種のワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌(No.18、27、48、75)の培養上清を、生理食塩水で、それぞれ、10-4倍と10-3倍とに希釈し、その50μLを5齢カイコの血液内に注射した。
更にその6時間後に、生理食塩水で1000倍に希釈した緑膿菌PAO1株50μLをカイコの血液内に注射した。
その34時間後にカイコの生存数(1群3匹)を数えた。結果を表7に示す。
4株何れのワイセラ・ヘレニカも治療効果を示したが、中でも乳酸菌Wh0916-4-2は最も顕著な効果を示した。
乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清をカイコの人工餌に混ぜ、1日間経口摂取させても、生菌と同様に、カイコに緑膿菌感染に対する抵抗性が付与された。
また、乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清には、緑膿菌の増殖を阻害する活性は認められなかった。すなわち、これは抗菌物質ではないことが分かった。
また、この前投与から緑膿菌の投与までの時間を2日以上にすると、乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清の活性は失われた。従って、乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清に含まれる活性成分はカイコの体内から消失し、その活性が失われたと考えられる
5齢カイコに、乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清のエタノール分画を染み込ませた1gの人工餌1gを与えた。17時間後、表8に示した菌液50μLをカイコの血液内に注射した。
緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)については、一晩培養液を10-6倍に希釈して使用し、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)については、菌の一晩培養液5mLを遠心(8000rpm、5分間)して菌を集め、5mLの生理食塩水に懸濁して使用した。
その後、カイコの生存数を継時的に観察した。結果を表8に示す。
緑膿菌による感染だけでなく、肺炎桿菌による感染に対しても治療効果を示した。従って、本発明にかかる剤は、自然免疫活性化剤であると言える。
実施例6において、菌を多剤耐性緑膿菌(MDRP)に代えて同様に評価した。
乳酸菌Wh0916-4-2の培養上清(に含まれる活性成分)は、臨床分離されたMDRPに対しても効果を示した。
ヒト臨床において、MDRPと呼ばれる多剤耐性緑膿菌が問題となっているが、本発明の自然免疫活性化剤は、多剤耐性緑膿菌(MDRP)に対しても有効であり、院内感染対策等に対しても有効であることが示唆された。
乳酸菌Wh0916-4-2を用いて豆乳ヨーグルトを作製した。一般にワイセラ・ヘレニカに属する乳酸菌は、植物性乳酸菌として知られている。
乳酸菌Wh0916-4-2は、牛乳中ではアミノ酸の不足のため増殖し難いが、豆乳中では増殖し酸性状態を形成した。すなわち、乳酸菌Wh0916-4-2を豆乳中で培養することで、ヨーグルトを作製できた。このヨーグルトは味が豆腐に似ており美味であった。
Claims (7)
- ワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌、又は、該乳酸菌の処理物を有効成分とする自然免疫活性化剤であって、
該乳酸菌の処理物は、乳酸菌の、培養物の全体、並びに、培養上清の全体及びそのエタノール可溶性画分の全体よりなる群から選ばれる少なくとも1つの処理物であることを特徴とする自然免疫活性化剤。 - 請求項1に記載の自然免疫活性化剤を含有し、病原菌又はウイルスに対する感染症の予防用若しくは治療用であることを特徴とする感染症予防・治療薬。
- 上記病原菌が薬剤耐性菌である請求項2に記載の感染症予防・治療薬。
- 上記病原菌が緑膿菌又は肺炎桿菌である請求項2又は請求項3に記載の感染症予防・治療薬。
- 上記感染症が日和見感染症である請求項2ないし請求項4の何れかの請求項に記載の感染症予防・治療薬。
- 請求項1に記載の自然免疫活性化剤を含有することを特徴とする自然免疫活性化用飲食品。
- ワイセラ・ヘレニカ(Weissella hellenica)に属する乳酸菌を用いて飲食品を発酵させて自然免疫活性化用発酵飲食品を得ることを特徴とする自然免疫活性化用発酵飲食品の製造方法。
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