JP7368642B2 - 妊婦の子宮頸部剥離細胞から胎盤栄養膜細胞を分離する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞分離の技術分野に属する。より具体的には、妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別する方法に関する。
中国では、妊娠前、出生前、及び新生児という３段階予防及び管理システムは、先天性欠損症を減らし、人口の質を向上させる重要な手段の１つであり、そのうち、出生前検査及び診断は、最も複雑で難易度が最も高い一環である。
現在、臨床で出生前診断に使用される羊水穿刺又は臍静脈穿刺、及び胎児遊離核酸配列決定などの非侵襲的出生前診断技術にはいずれも様々な欠点がある。羊水穿刺又は臍静脈穿刺による採取方法は、感染や流産のリスクが高く、分析時間が長く、検出項目及び範囲が限られており、更に診断時間が妊娠中期及び後期に限られており、妊婦にあまり受け入れられず、臨床処置に不利である。胎児遊離核酸配列決定技術は、検出範囲が非常に限られており、また、３～５本の指定された染色体倍数性しか検出できず、偽陽性や偽陰性が避けられず、一般的な変異に対する検出能力が不十分であり、母体血中の胎児遊離核酸の含有量にも個人差があるなどの問題が存在する。
本出願人の特許出願ＣＮ１１１３０４１５３Ａは、栄養膜細胞を分離する方法を開示しており、この方法は、栄養膜細胞表面に発現する特異的抗原を特定することにより、対応する特異的抗体を有する免疫磁気ビーズ技術を使用して、胎盤栄養膜サンプル細胞懸濁液から胎盤栄養膜細胞を分離及び精製する。この技術は、従来の羊水穿刺及び絨毛生検と比較して、非侵襲性という利点を有し、また、早期に採取するため、感染や流産のリスクが低く、検査結果の信頼性も同等である。一方で、この技術にはまだ改善の余地があり、開示された適用可能な抗体の組み合わせは限られており、精度及び特異性を更に改善する必要がある。出願人チームは、このプロジェクトに対して継続的に研究開発を行っている。
本発明の目的は、フローサイトメトリー又はマイクロ流体技術に基づいて、妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別する方法を提供することであり、この方法は、従来の方法の問題及び欠点を克服するだけでなく、より多くの抗原の同時標識並びに特徴的な蛍光シグナルの識別及び選別を同時に実現することもでき、精度が大幅に向上し、特異性も以前の免疫磁気ビーズ法よりも優れており、更に細胞の数及び質を両立できるという利点を有し、得られた細胞の数が多く、特異性及び感度が高い。
本発明の上記の目的は、以下の技術的解決手段によって達成される。
栄養膜細胞を分離する方法であって、この方法は、
（１）子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製するステップと、
（２）サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートするステップであって、この特異的抗体は、栄養膜細胞表面又は細胞内に発現する特異的抗原に対応する抗体の組み合わせであり、好ましくは、特異的抗体の組み合わせは、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ７、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ、ＣＤ３１＋ＨＰＬ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋ＨＰＬ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＭＰ９、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋Ｐ、ＣＤ３１＋Ｐ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＫ７＋ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ＋ＣＤ３１、ＣＤ３１＋ＨＰＬ＋ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１＋ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ３１＋Ｐ＋ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５＋ＣＤ３１である、ステップと、
（３）フローサイトメーターを使用して、ステップ（２）でインキュベートした細胞再懸濁液に選別を行い、分離及び精製された胎盤栄養膜細胞を得るか、又は、
マイクロ流体選別チップを使用して、ステップ（２）でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識してマイクロ流体細胞選別を行い、分離及び精製された胎盤栄養膜細胞を得るステップとを含む。
（１）子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製するステップと、
（２）サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートするステップであって、この特異的抗体は、栄養膜細胞表面又は細胞内に発現する特異的抗原に対応する抗体の組み合わせであり、好ましくは、特異的抗体の組み合わせは、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ７、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ、ＣＤ３１＋ＨＰＬ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋ＨＰＬ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＭＰ９、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋Ｐ、ＣＤ３１＋Ｐ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＫ７＋ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ＋ＣＤ３１、ＣＤ３１＋ＨＰＬ＋ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１＋ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ３１＋Ｐ＋ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５＋ＣＤ３１である、ステップと、
（３）フローサイトメーターを使用して、ステップ（２）でインキュベートした細胞再懸濁液に選別を行い、分離及び精製された胎盤栄養膜細胞を得るか、又は、
マイクロ流体選別チップを使用して、ステップ（２）でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識してマイクロ流体細胞選別を行い、分離及び精製された胎盤栄養膜細胞を得るステップとを含む。
好ましくは、ステップ（３）で使用されるマイクロ流体選別チップは、基板及びそれと貼り合わされたカバーシートを含み、アクリルを含むがこれに限定されないものを基本材料として射出成形技術によって製造され、
上記基板の一方の面には、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂが設けられており、２つの側流路はそれぞれ、主流路の左端及び右端に近接しており、
上記基板の他方の面には、Ｃ入口、Ｓ入口、Ｎ出口及びＴ出口が設けられており、４つの口はすべて、上記基板の一方の面に貫通して流路と連通しており、且つＣ入口の位置が主流路の左端に対応し、Ｓ入口の位置が側流路Ａの端部に対応し、Ｎ出口の位置が主流路の右端に対応し、Ｔ出口の位置が側流路Ｂの端部に対応しており、
上記主流路内には、Ｎ出口とＴ出口の合流点に偏向電極装置も設けられている。
上記基板の一方の面には、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂが設けられており、２つの側流路はそれぞれ、主流路の左端及び右端に近接しており、
上記基板の他方の面には、Ｃ入口、Ｓ入口、Ｎ出口及びＴ出口が設けられており、４つの口はすべて、上記基板の一方の面に貫通して流路と連通しており、且つＣ入口の位置が主流路の左端に対応し、Ｓ入口の位置が側流路Ａの端部に対応し、Ｎ出口の位置が主流路の右端に対応し、Ｔ出口の位置が側流路Ｂの端部に対応しており、
上記主流路内には、Ｎ出口とＴ出口の合流点に偏向電極装置も設けられている。
好ましくは、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂの流路幅はいずれも１０００μｍ以下であり、深さはいずれも５００μｍ以下である。
より好ましくは、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂの流路幅はいずれも５００～１０００μｍである。
より好ましくは、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂの流路幅はいずれも１０００μｍである。
マイクロ流体選別チップでは、Ｃ入口には選別対象の混合細胞サンプルを通すことができ、Ｓ入口には緩衝液を通すことができ、Ｔ出口は標的細胞の収集用であり、Ｎ出口は非標的細胞の収集用である。
選別工程において、標的細胞を含む混合サンプルはＣ入口からチップの主流路に流れ込み、緩衝液はＳ入口からチップの側流路に入り、両者は流路の交差点で混合してから、主流路に沿って同じ方向に流れ続ける。混合細胞が偏向電極装置を通って流れるとき、電極の開閉を制御することにより細胞が流入するパイプが選択され、標的細胞は選別されてＴ出口に到達し、非標的細胞は引き続き主流路に沿ってＮ出口に到達し、選別が完了する。
また、好ましくは、ステップ（２）において、一次抗体のインキュベーション条件は、４℃で３０～９０分間、好ましくは、４℃で６０分間、反応させることであり、二次抗体‐蛍光標識複合体のインキュベーション条件は、２℃～８℃で２０分間反応させることである。
好ましくは、ステップ（２）の具体的な方法は、インキュベーションによって一次抗体、二次抗体‐蛍光標識複合体を前後して段階的に標的抗原に特異的に結合させ、途中で洗浄及び遠心分離技術を用いて交叉汚染を回避することである。
好ましくは、ステップ（３）の具体的な方法は、インキュベートした細胞再懸濁液をマイクロ流体選別チップのＣ入口に通し、Ｓ入口に緩衝液を通し、次に、マイクロ流体選別チップをセルソーターに置いて選別プログラムを実行し、プログラム終了後、Ｔ出口から検体を収集して選別された栄養膜細胞を得ることである。
好ましくは、ステップ（３）における細胞選別の液相系は０．２％～０．４％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００、好ましくは０．３％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００である。より好ましくは、ＰＢＳを使用して調製する。
好ましくは、ステップ（３）におけるフローサイトメーターによる選別の条件は、サンプルローディング速度を１０００～２０００イベント／秒に調整し、収集速度を５．０に調整することである。
好ましくは、ステップ（１）における細胞懸濁液の最適な系は、０．２％～０．４％のＦＢＳを含む１×ＰＢＳ、好ましくは０．３％のＦＢＳを含む１×ＰＢＳである。
更に、ヒトＳＴＲ同定、ヒト染色体倍数性検出、サラセミア遺伝子検出、難聴遺伝子検出、全エクソーム遺伝子配列決定、染色体微小欠失／重複検出（ハイスループット配列決定法）、又は染色体構造変異検出（高密度チップ法）の製品の構築における上記方法の応用も、本発明の保護範囲に含まれるべきである。
本発明は、以下の有益な効果を有する。
本発明が提供するフローサイトメトリー又はマイクロ流体技術に基づいて胎盤栄養膜細胞を分離する方法は、従来の羊水穿刺及び絨毛生検と比較して、非侵襲的に検体を取得するという利点を有し、また、早期に採取するため、感染や流産のリスクが低く、検出結果の信頼性が高く、検出範囲も広い。この種の検体から胎児の完全なゲノム核酸サンプルを得ることができ、すべての遺伝性疾患の検出及び分析が可能になり、基本的に遺伝性疾患の検出（染色体倍数性、染色体構造変異ＣＮＶ、ミトコンドリア、微小欠失／重複、単一遺伝子変異、ＳＮＰ／ＳＴＲ遺伝特性検査など）を網羅することができる。
本発明の方法は、かなりの数の細胞（数千、品質管理の設計された最低基準は２０００を超える陽性細胞）を得ることができ、特別な操作なしで従来の分子検査技術を使用して検体を検出することができ、技術者及び実験装置に対する要件が高くなく、技術的難易度を下げ、使用コストを削減し、より多くの医療機関で実施でき、広く普及させることができる。
また、本発明が提供する方法は、多重マーカーに基づく並行選別手段であり、より多くの抗原の同時標識並びに特徴的な蛍光シグナルの識別及び選別を同時に実現することができ、精度が大幅に向上し、従来の磁気ビーズ法などの技術と比較して、細胞の数及び質を両立できるという利点を有し、得られた細胞の数が多いだけでなく、細胞への損傷も少なく、更に得られた細胞の品質が良く、検出の特異性が高く、感度が高い。
以下、具体的な実施例と併せて本発明を更に説明するが、実施例は、いかなる形態においても本発明を限定するものではない。特に明記しない限り、本発明で使用される試薬、方法及び装置は、本技術分野における一般的な試薬、方法及び装置である。
特に明記しない限り、以下の実施例で使用される試薬及び材料はいずれも市販されているものである。
実施例１ マイクロ流体選別チップの設計
妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別するために使用されるマイクロ流体選別チップの概略図を図１に示す。
マイクロ流体選別チップの構造設計は以下のとおりである。アクリルを含むがこれに限定されないものを基本材料として選択してチップを製造する。射出成形技術によって１つの基材に図１に示すパイプ形状を形成し、パイプの幅を１０００μｍ以下とし、深さを５００μｍ以下とし、そして、もう１つの基材を貼り合わせて完全なチップを形成する。
具体的には、マイクロ流体選別チップは、基板及びそれと貼り合わされたカバーシートを含み、
図１に示すように、上記基板の一方の面には、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂが設けられており、２つの側流路はそれぞれ、主流路の左端及び右端に近接しており、すべての流路の幅はいずれも１０００μｍであり、
上記基板の他方の面には、Ｃ入口（細胞サンプル注入口）、Ｓ入口（緩衝液注入口）、Ｎ出口（非標的細胞貯蔵口）及びＴ出口（標的細胞貯蔵口）が設けられており、４つの口はすべて、上記基板の一方の面に貫通して流路と連通しており、且つＣ入口の位置が主流路の左端に対応し、Ｓ入口の位置が側流路Ａの端部に対応し、Ｎ出口の位置が主流路の右端に対応し、Ｔ出口の位置が側流路Ｂの端部に対応しており、
Ｃ入口には選別対象の混合細胞サンプルを通すことができ、Ｓ入口には緩衝液を通すことができ、Ｔ出口は標的細胞の収集用であり、Ｎ出口は非標的細胞の収集用である。
図１に示すように、上記基板の一方の面には、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂが設けられており、２つの側流路はそれぞれ、主流路の左端及び右端に近接しており、すべての流路の幅はいずれも１０００μｍであり、
上記基板の他方の面には、Ｃ入口（細胞サンプル注入口）、Ｓ入口（緩衝液注入口）、Ｎ出口（非標的細胞貯蔵口）及びＴ出口（標的細胞貯蔵口）が設けられており、４つの口はすべて、上記基板の一方の面に貫通して流路と連通しており、且つＣ入口の位置が主流路の左端に対応し、Ｓ入口の位置が側流路Ａの端部に対応し、Ｎ出口の位置が主流路の右端に対応し、Ｔ出口の位置が側流路Ｂの端部に対応しており、
Ｃ入口には選別対象の混合細胞サンプルを通すことができ、Ｓ入口には緩衝液を通すことができ、Ｔ出口は標的細胞の収集用であり、Ｎ出口は非標的細胞の収集用である。
また、上記主流路には、細胞選別用の偏向電極装置も設けられており、偏向電極装置は具体的には、Ｎ出口とＴ出口の合流点に位置する。流動細胞シグナルの有無に応じて電極をオン／オフすることができる。負に帯電した細胞は、電極によって生成された電磁場において偏向され、Ｎ出口又はＴ出口のいずれかに通じる指定されたパイプに入る。
選別工程において、標的細胞を含む混合サンプルはＣ入口からチップの主流路に流れ込み、緩衝液はＳ入口からチップの側流路に入り、両者は流路の交差点で混合してから、主流路に沿って同じ方向に流れ続ける。混合細胞が偏向電極装置を通って流れるとき、電極の開閉を制御することにより細胞が流入するパイプが選択され、標的細胞は選別されてＴ出口に到達し、非標的細胞は引き続き主流路に沿ってＮ出口に到達し、選別が完了する。
選別が完了すると、チップを直ちに廃棄する。選別環境が清潔で、制御可能で、交叉汚染がないように、チップは、毎回選別する前に交換する必要がある。
実施例２ マイクロ流体選別チップに基づいて妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別する
一、栄養膜細胞を選別する方法は、以下のステップを含む。
１、子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製する。具体的な方法は以下の（１）～（５）に示すとおりである。
２、サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートする。具体的な方法は以下の（６）～（１４）に示すとおりである。
３、実施例１のマイクロ流体選別チップを使用して、ステップ２でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識してマイクロ流体細胞選別を行う。具体的な方法は以下の（１５）～（１８）に示すとおりである。
１、子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製する。具体的な方法は以下の（１）～（５）に示すとおりである。
２、サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートする。具体的な方法は以下の（６）～（１４）に示すとおりである。
３、実施例１のマイクロ流体選別チップを使用して、ステップ２でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識してマイクロ流体細胞選別を行う。具体的な方法は以下の（１５）～（１８）に示すとおりである。
ここで、特異的抗体の組み合わせを表１に示す。
二、具体的には、栄養膜細胞を選別する方法は以下のステップを含む。
（１）細胞保存液（子宮頸部剥離細胞）をシェーカーで５分間均一に混合する。
（２）保存液を取り出して１５ｍｌの遠心管に入れ、保存液の瓶に３ｍｌの１×ＰＢＳを更に加え、振とうして均一に混合した後、取り出して１５ｍｌの遠心管に入れる。
（３）３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（４）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（５）ステップ４を２回繰り返して細胞懸濁液を調製する。
（６）２００μｌの０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、均一に混合した後に室温で２０分間透過処理する。
（７）ステップ４を３回繰り返す。
（８）一次抗体を加える。一定割合で希釈したマウス抗ヒトＣＫ７モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＣＫ１８モノクローナル抗体、マウス抗ヒトβ‐ＨＣＧモノクローナル抗体、マウス抗ヒトＭＭＰ９モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＣＤＨ５モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＰモノクローナル抗体、マウス抗ヒトｈＰＬモノクローナル抗体、ウサギ抗ヒトＨＬＡ‐Ｇモノクローナル抗体、ウサギ抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体 (ａｂｃａｍ社)をそれぞれ２００μｌ加え、均一に混合した後、４℃で６０分間インキュベートする。
（９）ステップ４を３回繰り返す。
（１０）二次抗体‐蛍光標識複合体を加える。一定割合で希釈したヤギ抗ウサギ抗体及びヤギ抗マウス抗体を２００μｌ加え、均一に混合した後、３７℃で６０分間インキュベートする。
（１１）ステップ４を３回繰り返した後、２００μｌの緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で再懸濁する。
（１２）２℃～８℃で２０分間反応させる。
（１３）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（１４）ステップ（１３）を２～３回繰り返し、２００μｌの１×ＰＢＳＴを加えて再懸濁し、細胞再懸濁液を得る。
（１５）得られた細胞再懸濁液を実施例１のマイクロ流体選別チップのＣ入口に通し、Ｓ入口に１×ＰＢＳＴを通す。
（１６）マイクロ流体選別チップをセルソーターのステージに載せて固定し、電源を入れて指定されたプログラムを設定して実行する。
（１７）プログラム終了後、Ｔ出口から検体を収集して選別された栄養膜細胞を得る。
（１８）Ｎ出口から検体を収集し、この検体は、栄養膜細胞が除去された子宮頸部剥離細胞の残りの細胞である。
（１）細胞保存液（子宮頸部剥離細胞）をシェーカーで５分間均一に混合する。
（２）保存液を取り出して１５ｍｌの遠心管に入れ、保存液の瓶に３ｍｌの１×ＰＢＳを更に加え、振とうして均一に混合した後、取り出して１５ｍｌの遠心管に入れる。
（３）３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（４）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（５）ステップ４を２回繰り返して細胞懸濁液を調製する。
（６）２００μｌの０．３％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、均一に混合した後に室温で２０分間透過処理する。
（７）ステップ４を３回繰り返す。
（８）一次抗体を加える。一定割合で希釈したマウス抗ヒトＣＫ７モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＣＫ１８モノクローナル抗体、マウス抗ヒトβ‐ＨＣＧモノクローナル抗体、マウス抗ヒトＭＭＰ９モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＣＤＨ５モノクローナル抗体、マウス抗ヒトＰモノクローナル抗体、マウス抗ヒトｈＰＬモノクローナル抗体、ウサギ抗ヒトＨＬＡ‐Ｇモノクローナル抗体、ウサギ抗ヒトＣＤ３１モノクローナル抗体 (ａｂｃａｍ社)をそれぞれ２００μｌ加え、均一に混合した後、４℃で６０分間インキュベートする。
（９）ステップ４を３回繰り返す。
（１０）二次抗体‐蛍光標識複合体を加える。一定割合で希釈したヤギ抗ウサギ抗体及びヤギ抗マウス抗体を２００μｌ加え、均一に混合した後、３７℃で６０分間インキュベートする。
（１１）ステップ４を３回繰り返した後、２００μｌの緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で再懸濁する。
（１２）２℃～８℃で２０分間反応させる。
（１３）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てる。
（１４）ステップ（１３）を２～３回繰り返し、２００μｌの１×ＰＢＳＴを加えて再懸濁し、細胞再懸濁液を得る。
（１５）得られた細胞再懸濁液を実施例１のマイクロ流体選別チップのＣ入口に通し、Ｓ入口に１×ＰＢＳＴを通す。
（１６）マイクロ流体選別チップをセルソーターのステージに載せて固定し、電源を入れて指定されたプログラムを設定して実行する。
（１７）プログラム終了後、Ｔ出口から検体を収集して選別された栄養膜細胞を得る。
（１８）Ｎ出口から検体を収集し、この検体は、栄養膜細胞が除去された子宮頸部剥離細胞の残りの細胞である。
実施例３ フローサイトメーターに基づいて妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別する方法
栄養膜細胞を選別する方法は以下のステップを含む。
１、子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製した。具体的な方法は実施例２の（１）～（５）に示すとおりである。
２、サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートした。具体的な方法は実施例２の（６）～（１４）に示すとおりである。ここで、特異的抗体の組み合わせは上記の表１に示す通りである。
３、フローセルソーター（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ型、米国）を使用して、ステップ２でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識して選別した。以下のステップを含む。
１）フローサイトメーターの電源を入れ、操作説明に従って日常の起動操作をした。
２）液体の流れのブレイクオフポイントが窓の中上部にあるように、機器の液体の流れを調整した。
３）選別経路を調整し、ドロップディレイを確認し、サンプルローディング速度を１０００～２０００イベント／秒に調整した。
４）収集装置として５ｍｌのフローサイトメトリー用チューブを選択し、選別細胞数を３０００とし、方向を左とし、選別する細胞集団を追加し、順番にゲーティングを行い、収集チューブに入れた。
５）インキュベートした細胞懸濁液をサンプル注入チャンバに入れ、収集速度を５．０に設定し、サンプルをロードした。
６）電圧を３００～ ５００Ｖの範囲で調整して、蛍光色素間の補償をできるだけ小さくし、陽性細胞が中央になるようにゲート位置を調整し、ゲート内の細胞を収集した。収集チューブ内の細胞は選択された標的細胞であった。
１、子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製した。具体的な方法は実施例２の（１）～（５）に示すとおりである。
２、サンプル細胞懸濁液に特異的抗体を加えてインキュベートした。具体的な方法は実施例２の（６）～（１４）に示すとおりである。ここで、特異的抗体の組み合わせは上記の表１に示す通りである。
３、フローセルソーター（ＢＤＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ型、米国）を使用して、ステップ２でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識して選別した。以下のステップを含む。
１）フローサイトメーターの電源を入れ、操作説明に従って日常の起動操作をした。
２）液体の流れのブレイクオフポイントが窓の中上部にあるように、機器の液体の流れを調整した。
３）選別経路を調整し、ドロップディレイを確認し、サンプルローディング速度を１０００～２０００イベント／秒に調整した。
４）収集装置として５ｍｌのフローサイトメトリー用チューブを選択し、選別細胞数を３０００とし、方向を左とし、選別する細胞集団を追加し、順番にゲーティングを行い、収集チューブに入れた。
５）インキュベートした細胞懸濁液をサンプル注入チャンバに入れ、収集速度を５．０に設定し、サンプルをロードした。
６）電圧を３００～ ５００Ｖの範囲で調整して、蛍光色素間の補償をできるだけ小さくし、陽性細胞が中央になるようにゲート位置を調整し、ゲート内の細胞を収集した。収集チューブ内の細胞は選択された標的細胞であった。
図２及び図３に示すように、特定の標識の組み合わせに従って、標的細胞集団を得た。ここで、図２は単一蛍光標識の選別結果であり、図３は二重蛍光標識の選別結果である。
実施例４ 方法の応用例―ヒトＳＴＲ同定
１、上記実施例２の方法に従って、サンプル（子宮頸部剥離細胞）から栄養膜細胞を選別及び分離した。
２、分離した栄養膜細胞及び妊婦の子宮頸部剥離細胞からＤＮＡを抽出した。
１）選別した栄養膜細胞（実施例２の方法による細胞選別のステップ１７で得られた栄養膜細胞）、及び実施例２の方法による細胞選別のステップ１８で得られた細胞（栄養膜細胞が除去された子宮頸部剥離細胞の残りの細胞）をそれぞれ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）上澄みを捨て、２００μｌの溶液Ｐを加えてペレットを再懸濁した。
３）２０μｌのプロテアーゼＫ及び２００μｌの溶液Ｌを加えて、均一に混合した。
４）５６℃で２０分間インキュベートし、転倒して均一に混合した。
５）２００μｌの無水エタノールを加えてよく混合し、吸着カラムに移し、１００００ｒｐｍ で１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
６）５００μｌのＷ１を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
７）５００μｌのＷ２を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
８）５００μｌのＷ２を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
９）空のチューブを１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、収集チューブを捨てた。
１０）吸着カラムを新しい１．５ｍｌの遠心管に入れ、キャップを開けて２分間静置し、５０μｌのＴＥを加え、５分間静置した後、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、カラムを捨てた。
１１）抽出したＤＮＡの濃度及び純度を測定した。
１）選別した栄養膜細胞（実施例２の方法による細胞選別のステップ１７で得られた栄養膜細胞）、及び実施例２の方法による細胞選別のステップ１８で得られた細胞（栄養膜細胞が除去された子宮頸部剥離細胞の残りの細胞）をそれぞれ、１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。
２）上澄みを捨て、２００μｌの溶液Ｐを加えてペレットを再懸濁した。
３）２０μｌのプロテアーゼＫ及び２００μｌの溶液Ｌを加えて、均一に混合した。
４）５６℃で２０分間インキュベートし、転倒して均一に混合した。
５）２００μｌの無水エタノールを加えてよく混合し、吸着カラムに移し、１００００ｒｐｍ で１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
６）５００μｌのＷ１を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
７）５００μｌのＷ２を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
８）５００μｌのＷ２を加え、１００００ｒｐｍで１分間遠心分離し、収集チューブ内の廃液を捨てた。
９）空のチューブを１２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、収集チューブを捨てた。
１０）吸着カラムを新しい１．５ｍｌの遠心管に入れ、キャップを開けて２分間静置し、５０μｌのＴＥを加え、５分間静置した後、１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、カラムを捨てた。
１１）抽出したＤＮＡの濃度及び純度を測定した。
３、分離した栄養膜細胞及び妊婦の子宮頸部剥離細胞からＤＮＡを抽出した後、Ｍｉｃｒｏｒｅａｄ Ｄ‐２１ヒトＳＴＲ同定キットを使用してＰＣＲ増幅を行い、３５００ｘＬシーケンサーを使用してＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動分析を行い、Ｇ５－Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄを使用して機器の蛍光キャリブレーションを行うと同時に、対応するＰａｎｅｌｓ、ｂｉｎｓファイルを作成し、ソフトウェアＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０で結果を分析した。
４、ＳＴＲ検出を行った。
１）ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅系は表２に示すとおりである。
ＰＣＲ反応プログラム：５０℃、１０分間；９６℃、４分間；（９４℃、５秒；６０℃、１ 分１０秒）×２７サイクル；６０℃、３０分間；１５℃、保存。
２）ＳＴＲ検出結果
説明書に従って８．７μｌのＨｉｄｉと０．３μｌのインターナルコントロールを均一に混合し、１ｍｌの増幅産物を加え、３５００ｘＬシーケンサーを使用してＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動分析を行い、Ｇ５－Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄを使用して機器の蛍光キャリブレーションを行うと同時に、対応するＰａｎｅｌｓ、ｂｉｎｓファイルを作成し、ソフトウェアＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０で結果を分析した。結果を図４～図７に示す。この結果は、妊婦自身のＤＮＡに加えて、検体には実際に別の独立した個人のＤＮＡ情報が存在し、且つそれが妊婦自身と強い血縁関係を持っていることを示す。
３）Ｙ‐ＳＴＲ検出
Ｍｉｃｒｏｒｅａｄ４０Ｙキットを使用して、ＳＴＲで検出したＹ染色体の検体にＹ‐ＳＴＲ検出を行った。結果を図８に示す。この結果は、この検体に男性のＤＮＡが存在することを示す。
１）ＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲ増幅系は表２に示すとおりである。
２）ＳＴＲ検出結果
説明書に従って８．７μｌのＨｉｄｉと０．３μｌのインターナルコントロールを均一に混合し、１ｍｌの増幅産物を加え、３５００ｘＬシーケンサーを使用してＰＣＲ産物のキャピラリー電気泳動分析を行い、Ｇ５－Ｍａｔｒｉｘ Ｓｔａｎｄａｒｄを使用して機器の蛍光キャリブレーションを行うと同時に、対応するＰａｎｅｌｓ、ｂｉｎｓファイルを作成し、ソフトウェアＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ ＩＤ ｖｅｒｓｉｏｎ ３．０で結果を分析した。結果を図４～図７に示す。この結果は、妊婦自身のＤＮＡに加えて、検体には実際に別の独立した個人のＤＮＡ情報が存在し、且つそれが妊婦自身と強い血縁関係を持っていることを示す。
３）Ｙ‐ＳＴＲ検出
Ｍｉｃｒｏｒｅａｄ４０Ｙキットを使用して、ＳＴＲで検出したＹ染色体の検体にＹ‐ＳＴＲ検出を行った。結果を図８に示す。この結果は、この検体に男性のＤＮＡが存在することを示す。
実施例５ 方法の応用例―難聴感受性遺伝子の検出
実施例２に記載の方法及び市販キット（難聴感受性遺伝子検出キット（ＰＣＲ＋フロースルーハイブリダイゼーション法）、潮州凱普生物化学有限公司、国械注準２０１５３４０１６９８）を使用して妊婦の子宮頸部剥離細胞（サンプル源：広州凱普医学検験所）に対して難聴感受性遺伝子の検出を行い、具体的には、難聴関連遺伝子（ＧＪＢ２、ＧＪＢ３、ＳＬＣ２６Ａ４及びｍｔＤＮＡ）の９つの変異部位（ｍｔＤＮＡ１４９４、ｍｔＤＮＡ１５５５、ＳＬＣ２６Ａ４－ＩＶＳ７（－２）、ＳＬＣ２６Ａ４－２１６８、ＧＪＢ２－３５、ＧＪＢ２－１７６、ＧＪＢ２－２３５、ＧＪＢ２－２９９、ＧＪＢ３－５３８）を検出した。
実施例４に記載の妊婦の子宮頸部剥離細胞からＤＮＡを抽出する方法で抽出し、次に市販キット（難聴感受性遺伝子検出キット（ＰＣＲ＋フロースルーハイブリダイゼーション法）、潮州凱普生物化学有限公司、国械注準２０１５３４０１６９８）を使用して後続の検出を行った。具体的な操作については説明書を参照されたい。元の結果を図９に示し、結果分析を表３に示す。
この結果は、この試験の検出結果が臨床検出結果と一致することを示す。
実施例６ 方法の応用例―サラセミア関連遺伝子の検出
実施例２に記載の方法及び市販キット（α‐及びβ‐ラセミア遺伝子検出キット（ＰＣＲ＋膜ハイブリダイゼーション法）、潮州凱普生物化学有限公司、国食薬監械（準）字２０１２第３４００３９９ 号）を使用して妊婦の子宮頸部剥離細胞（サンプル源：凱普医学検験所によって検出されたヒト由来検体の残りの核酸サンプル）に対して難聴感受性遺伝子の検出を行い、具体的には、一般的な３種のα‐サラセミア欠失型（－－SEA、－α3.7、－α4.2）、２種のα‐サラセミア変異型（ＣＳ、ＱＳ）及び１１種のβ‐サラセミア変異型（ＣＤ１４－１５、ＣＤ１７、ＣＤ２７－２８、ＣＤ４１－４２、ＣＤ４３、ＣＤ７１－７２、－２８、－２９、ＩＶＳ－Ｉ－１、ＩＶＳ－ＩＩ－６５４、β ＥＮ）を検出した。
実施例４に記載の妊婦の子宮頸部剥離細胞からＤＮＡを抽出する方法で抽出し、次に市販キット（α‐及びβ‐ラセミア遺伝子検出キット（ＰＣＲ＋膜ハイブリダイゼーション法）、潮州凱普生物化学有限公司、国食薬監械（準）字２０１２第３４００３９９ 号）を使用して後続の検出を行った。具体的な操作については説明書を参照されたい。元の結果を図１０に示し、結果分析を表４に示す。
この結果は、この試験の検出結果が臨床検出結果と一致することを示す。
実施例７ 方法の応用例―全エクソーム遺伝子配列決定
１、実施例２に記載の方法に従って、既知の難聴家系（父、母（妊娠１６週）、長男（ろう児）、末っ子（ろう児））から、妊婦の子宮頸部剥離細胞検体及び羊水検体を得て、そして妊婦自身及び他の家族メンバーから全血検体を採取し、ＤＮＡを抽出し（妊婦の子宮頸部剥離細胞を選別した後、実施例４に記載の抽出方法に従って検体を取得し、羊水及び全血検体をヒト全血ゲノムＤＮＡ抽出キット（凱普生物、中国）で抽出した（サンプル源：凱普医学検験所によって検出されたヒト由来検体））、得られたヒトゲノムＤＮＡに対してヒト全エクソーム検出キット（艾吉泰康生物科技（北京）有限公司、製品番号Ｔ０８６Ｖ４）を使用して全エクソーム遺伝子配列決定（ＷＥＳ）を行った。
ゲノムＤＮＡをトランスポザーゼＴｎ５で処理して３００ｂｐ断片を生成し、ＤＮＡライブラリを構築した。両端にアダプターＰ５、Ｐ７、ｉｎｄｅｘ１、２を付加した。適切な長さのＤＮＡ断片を選択し、増幅及び精製した。ビオチンを含むエクソンプローブライブラリとハイブリダイズした。ビオチンｂｉｏｔｉｎとストレプトアビジンの強い結合能力を利用して、ストレプトアビジンを含む磁気ビーズを標的ライブラリに結合したプローブと結合させた。磁気ビーズを吸着し、上澄みを取り除いた。磁気ビーズ上のＤＮＡを溶出し、ライブラリをＰＣＲで増幅した。ライブラリの品質を確認した。機器で配列決定した。
２、全エクソーム配列決定結果
ハイスループット配列決定技術を使用して全エクソーム検出を行い、検出した病原性遺伝子座又は疑似病原性遺伝子座をＳａｎｇｅｒ配列決定を使用して検証した。検査に送るサンプルは、妊娠１６週の羊水検体であり、兄２人は聾唖で、両親は正常であった。サンプルからＣＤＨ２３遺伝子ｃ．８３６３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ２７８８Ｐｒｏ）ヘテロ接合変異、及びＧＪＢ２遺伝子ｃ．１０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２７Ｉｌｅ）ヘテロ接合変異を検出した。家系図を図１１に示す。
ハイスループット配列決定技術を使用して全エクソーム検出を行い、検出した病原性遺伝子座又は疑似病原性遺伝子座をＳａｎｇｅｒ配列決定を使用して検証した。検査に送るサンプルは、妊娠１６週の羊水検体であり、兄２人は聾唖で、両親は正常であった。サンプルからＣＤＨ２３遺伝子ｃ．８３６３Ｔ＞Ｃ（ｐ．Ｌｅｕ２７８８Ｐｒｏ）ヘテロ接合変異、及びＧＪＢ２遺伝子ｃ．１０９Ｇ＞Ａ（ｐ．Ｖａｌ２７Ｉｌｅ）ヘテロ接合変異を検出した。家系図を図１１に示す。
この結果は、選別後の剥離細胞検体から病原性変異を効果的に検出することができることを示しており、これは、羊水検体と完全に一致している。検出結果により、この家系の病因及び病原性変異の保因者を突き止めることができる。
実施例８ 方法の応用例―全ゲノムＤＮＡコピー数多型（ＣＮＶ）検出
１、Ｐｈａｌａｎｘ Ｂｉｏｔｅｃｈ社のＣｙｔｏＯｎｅＡｒｒａｙ染色体チップ及び付属の検出キットを使用して、比較ゲノムハイブリダイゼーション技術の原理（ａＣＧＨ）に従って全ゲノムＤＮＡコピー数多型を検出した。
実施例２の方法によって選別された栄養膜細胞を、実施例４に記載の妊婦の子宮頸部剥脱細胞からＤＮＡを抽出する方法で抽出し、得られたヒトゲノムＤＮＡを断片化し、予備増幅し、増幅し、ＰＣＲ産物を精製した後、２種類の異なる蛍光色素で標識した（正常サンプルはＣｙ３で標識されて緑色を呈し、患者サンプルはＣｙ５で標識されて赤色を呈した）。
蛍光産物を精製してチップに注入し、チップを洗浄してスキャンして結果を得た。
実施例２の方法によって選別された栄養膜細胞を、実施例４に記載の妊婦の子宮頸部剥脱細胞からＤＮＡを抽出する方法で抽出し、得られたヒトゲノムＤＮＡを断片化し、予備増幅し、増幅し、ＰＣＲ産物を精製した後、２種類の異なる蛍光色素で標識した（正常サンプルはＣｙ３で標識されて緑色を呈し、患者サンプルはＣｙ５で標識されて赤色を呈した）。
蛍光産物を精製してチップに注入し、チップを洗浄してスキャンして結果を得た。
２、全ゲノムＤＮＡコピー数多型（ＣＮＶ）検出結果
全染色体の概略図を図１２に示し、異常染色体の概略図を図１３に示す。図１３において、横軸は染色体バンドの概略図であり、縦軸はサンプルと標準サンプルとのシグナル比（ｌｏｇ２比で表す）である。染色体のコピー数に有意な差がある場合、異なる色で示す。染色体が増幅される領域（Ｇａｉｎ）を青色で、染色体が欠失する領域（Ｌｏｓｓ）を赤色で示す。図中の黒い線の長さと値は、それぞれ各セグメント（Ｓｅｇｍｅｎｔ）のサイズと信号の平均値を表す。
このサンプルでは、１つの異常が検出され、この異常は２２ｑ１１．２１欠失であり、異常断片の始点‐終点［ＵＣＳＣ ｈｇ１９］はａｒｒ２２ｑ１１．２１（１９００６９４３＿２１４６１０６８）ｘ１であり、異常断片のサイズは２．４５４Ｍｂである。関連疾患領域はＰａｔｈｏｇｅｎｉｃ（病原性、ＡＣＭＧ分類）であり、この異常は、ＴＢＸ１、ＣＲＫＬ、ＧＰ１ＢＢ、ＳＬＣ２５Ａ１、ＤＧＣＲ１０、ＴＳＳＫ１Ａ、ＧＳＣ２、ＣＬＴＣＬ１などの１０６個のＩＳＣＡ遺伝子をカバーしている。この領域の異常は、２２ｑ１１．２重複（ＤＧＳ／ＶＣＦＳ）領域（ＴＢＸ１を含む）にある。２２ｑ１１．２近端（Ａ～Ｄ）領域の欠失は、ディジョージ／口蓋心臓顔面（ＤＧＳ／ＶＣＦＳ）症候群に関連しており、臨床症状は通常、先天性心疾患、心臓異常、特徴的な顔面特徴、ＤＤ／ＩＤ、行動上の問題、免疫不全、及び低カルシウム血症（ＰＭＩＤ２５２１７９５８）である。この領域の異常は、２２ｑ１１．２重複領域（中央、Ｂ／Ｃ－Ｄ）（ＣＲＫＬを含む）にあり、この領域の欠失から生じる可能性のある臨床表現型は、顔面異形症、発育不全／低身長、中枢神経系の異常／発作、発達遅延、知的障害、骨格異常、心血管障害、泌尿生殖器異常、及び免疫不全／反復性感染症（ＰＭＩＤ２５１２３９７６）を含む。
この結果は、この選別された細胞検体から染色体構造変異を効果的に検出し、対応する突然変異を検出することができることを示す。
実施例９ マイクロ流体選別チップに基づいて妊婦の子宮頸部剥離細胞から栄養膜細胞を分離及び選別する方法と磁気ビーズ法との比較
（１）実験サンプル
凱普医学検験所によって検出されたヒト由来検体からの２つの子宮頸部剥離細胞液サンプル。
凱普医学検験所によって検出されたヒト由来検体からの２つの子宮頸部剥離細胞液サンプル。
（２）対照実験として磁気ビーズ法を使用して、２つの方法の効果の違いを比較した。本発明の方法は実施例２と同じである。
磁気ビーズ法による栄養膜細胞の選別プロセスは、以下のとおりである。
（１）採取した妊婦の子宮頸部剥離細胞保存液検体を５分間振とうして均一に混合した。
（２）保存液を取り出して１５ｍｌの遠心管に入れ、保存液の瓶に３ｍｌの細胞分離液を更に加え、振とうして均一に混合した後、取り出して１５ｍｌの遠心管に入れた。
（３）３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
（４）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
（５）ステップ４を２回繰り返した。
（６）２００μｌの０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、均一に混合した後に室温で２０分間透過処理した。
（７）ステップ４を３回繰り返した。
（８）２００μｌの一次抗体を加えて均一に混合し、４℃で一晩保存した。
（９）ステップ４を３回繰り返した。
（１０）２００μｌの二次抗体を加えて均一に混合し、３７℃で１時間反応させた。
（１１）ステップ４を３回繰り返した後、２００μｌの緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で再懸濁した。
（１２）２５μｌのビーズと５０μｌの緩衝液をよく混合し、６００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを捨て、２５μｌの緩衝液で再懸濁し、ステップ（１１）の混合液に加えた。
（１３）２℃～８℃で２０分間反応させた。
（１４）１ｍｌの緩衝液を加えて均一に混合し、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを捨てた（比較用に２００μｌ残した）。
（１５）ステップ（１４）を２～３回繰り返した。
（１６）３７℃で予熱した緩衝液２００μｌを加えて再懸濁し、４μｌの放出緩衝液を加えて均一に混合した。
（１７）室温で１５分後、ピペットで５～１０回ピペッティングし、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを収集した。
（１８）２００μｌの緩衝液を加え、５～１０回ピペッティングし、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを収集した。
（１９）ステップ（１８）を３回繰り返し、最終的に栄養膜細胞を得た。
（１）採取した妊婦の子宮頸部剥離細胞保存液検体を５分間振とうして均一に混合した。
（２）保存液を取り出して１５ｍｌの遠心管に入れ、保存液の瓶に３ｍｌの細胞分離液を更に加え、振とうして均一に混合した後、取り出して１５ｍｌの遠心管に入れた。
（３）３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
（４）１ｍｌの１×ＰＢＳＴを加え、均一に混合した後に１．５ｍｌのＥＰ管に移し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを捨てた。
（５）ステップ４を２回繰り返した。
（６）２００μｌの０．５％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を加え、均一に混合した後に室温で２０分間透過処理した。
（７）ステップ４を３回繰り返した。
（８）２００μｌの一次抗体を加えて均一に混合し、４℃で一晩保存した。
（９）ステップ４を３回繰り返した。
（１０）２００μｌの二次抗体を加えて均一に混合し、３７℃で１時間反応させた。
（１１）ステップ４を３回繰り返した後、２００μｌの緩衝液（ＤＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で再懸濁した。
（１２）２５μｌのビーズと５０μｌの緩衝液をよく混合し、６００ｇで１０分間遠心分離し、上澄みを捨て、２５μｌの緩衝液で再懸濁し、ステップ（１１）の混合液に加えた。
（１３）２℃～８℃で２０分間反応させた。
（１４）１ｍｌの緩衝液を加えて均一に混合し、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを捨てた（比較用に２００μｌ残した）。
（１５）ステップ（１４）を２～３回繰り返した。
（１６）３７℃で予熱した緩衝液２００μｌを加えて再懸濁し、４μｌの放出緩衝液を加えて均一に混合した。
（１７）室温で１５分後、ピペットで５～１０回ピペッティングし、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを収集した。
（１８）２００μｌの緩衝液を加え、５～１０回ピペッティングし、磁気スタンド上に２分間静置した後、上澄みを収集した。
（１９）ステップ（１８）を３回繰り返し、最終的に栄養膜細胞を得た。
（三）結果
図１４～図１６に示すように、選別によって得られた陽性細胞を舜宇ＲＸ５０蛍光顕微鏡で撮影した。図１４は、本発明の方法によって選別された陽性細胞の写真であり、図１５は、本発明の方法による選別前後の陽性細胞及び陰性細胞の比較写真であり、図１６は、磁気ビーズ法によって選別された陽性細胞の写真である。比較から、２つの方法で選別された細胞数の桁数が大きく異なることが明らかに分かる。本発明の方法は、磁気ビーズ法よりも有意に優れており、統計によれば、本発明の方法によって選別された陽性細胞の数は、約３０００～１３０００に達する可能性があることが示されている。
図１４～図１６に示すように、選別によって得られた陽性細胞を舜宇ＲＸ５０蛍光顕微鏡で撮影した。図１４は、本発明の方法によって選別された陽性細胞の写真であり、図１５は、本発明の方法による選別前後の陽性細胞及び陰性細胞の比較写真であり、図１６は、磁気ビーズ法によって選別された陽性細胞の写真である。比較から、２つの方法で選別された細胞数の桁数が大きく異なることが明らかに分かる。本発明の方法は、磁気ビーズ法よりも有意に優れており、統計によれば、本発明の方法によって選別された陽性細胞の数は、約３０００～１３０００に達する可能性があることが示されている。
上記の実施例は、本発明のいくつかの実施形態を示すものに過ぎず、その説明は具体的且つ詳細であるが、本発明の特許の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、本発明の概念から逸脱することなく、いくつかの修正及び改善を行うことができ、それらはすべて本発明の保護範囲に属することに留意されたい。したがって、本発明の特許の保護範囲は、添付の特許請求の範囲に従うものとする。
Claims (10)
- 栄養膜細胞を分離する方法であって、
（１）子宮頸部剥離細胞液サンプルをサンプル細胞懸濁液に調製するステップであって、該細胞懸濁液の系が、０．２％～０．４％のＦＢＳを含む１×ＰＢＳであるステップと、
（２）サンプル細胞懸濁液に一次抗体および二次抗体－蛍光標識複合体を加えてインキュベートするステップであって、
前記一次抗体のインキュベーション条件は、４℃で３０～９０分間反応させることであり、
前記二次抗体‐蛍光標識複合体のインキュベーション条件は、２℃～８℃で２０分間反応させることであり、
前記一次抗体は、栄養膜細胞表面又は細胞内に発現する特異的抗原に対応する抗体の組み合わせであり、前記特異的抗原はＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ７、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ、ＣＤ３１＋ＨＰＬ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋ＨＰＬ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＭＭＰ９、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋Ｐ、ＣＤ３１＋Ｐ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＤＨ５、ＣＤ３１＋ＣＫ７＋ＨＬＡ－Ｇ、ＨＬＡ－Ｇ＋ＣＫ１８＋ＣＤ３１、ＨＬＡ－Ｇ＋β－ＨＣＧ＋ＣＤ３１、ＣＤ３１＋ＨＰＬ＋ＨＬＡ－Ｇ、ＭＭＰ９＋ＣＤ３１＋ＨＬＡ－Ｇ、ＣＤ３１＋Ｐ＋ＨＬＡ－Ｇ又はＨＬＡ－Ｇ＋ＣＤＨ５＋ＣＤ３１である、ステップと、
（３）マイクロ流体選別チップを使用して、ステップ（２）でインキュベートした細胞再懸濁液を蛍光標識してマイクロ流体細胞選別を行い、分離及び精製された胎盤栄養膜細胞を得るステップとを含み、
細胞選別の液相系が０．２％～０．４％のＴｒｉｔｏｎ‐Ｘ‐１００であり、
前記マイクロ流体選別チップは、基板及びそれと貼り合わされたカバーシートを含み、
前記基板の一方の面には、主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂが設けられており、２つの側流路はそれぞれ、主流路の左端及び右端に近接しており、
前記基板の他方の面には、Ｃ入口、Ｓ入口、Ｎ出口及びＴ出口が設けられており、２つの入口及び２つの出口はすべて、前記基板の一方の面に貫通して流路と連通しており、且つＣ入口の位置が主流路の左端に対応し、Ｓ入口の位置が側流路Ａの端部に対応し、Ｎ出口の位置が主流路の右端に対応し、Ｔ出口の位置が側流路Ｂの端部に対応しており、
前記主流路内には、Ｎ出口とＴ出口の合流点に偏向電極装置も設けられており、
主流路、側流路Ａ及び側流路Ｂの流路幅がいずれも１０００μｍ以下であり、深さがいずれも５００μｍ以下である、ことを特徴とする方法。 - ステップ（２）の具体的な方法は、インキュベーションによって前記一次抗体、前記二次抗体‐蛍光標識複合体を前後して段階的に標的抗原に特異的に結合させ、途中で洗浄及び遠心分離技術を用いて交叉汚染を回避することである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ステップ（３）の具体的な方法は、インキュベートした細胞再懸濁液をマイクロ流体選別チップのＣ入口に通し、Ｓ入口に緩衝液を通し、次に、マイクロ流体選別チップをセルソーターに置いて選別プログラムを実行し、プログラム終了後、Ｔ出口から検体を収集して選別された栄養膜細胞を得ることである、ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
- ヒトＳＴＲ同定の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- ヒト染色体倍数性検出の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- サラセミア遺伝子検出の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- 難聴遺伝子検出の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- 全エクソーム遺伝子配列決定の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- 染色体微小欠失／重複検出の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
- 染色体構造変異検出の製品の構築における請求項１～３のいずれか一項に記載の方法の応用。
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