JP7368007B2 - 免疫関連疾患の予防または治療用組成物 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫関連疾患を効果的に予防または治療できる組成物に関する。
免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）は、４個のポリペプチド鎖、すなわち鎖間ジスルフィド結合により会合された２個の重鎖および２個の軽鎖を含む。それぞれの軽鎖は、２個のドメイン、すなわち可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）および不変軽鎖ドメイン（ＣＬ）を有し、それぞれの重鎖は、２個の領域、すなわち可変重鎖領域（ＶＨ）および不変重鎖領域（ＣＨ）を有する。不変重鎖領域（ＣＨ）は、数字によって指定された不変重鎖領域（例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３など）からなる（例えば、ＵＳ６，０８６，８７５（ブルムバーグＲ．Ｓ．（Ｂｌｕｍｂｅｒｇ Ｒ．Ｓ．）など）、ＵＳ５，６２４，８２１（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ Ｇ．Ｐ．）など）およびＵＳ５，１１６，９６４（カポンＤ．Ｊ．（Ｃａｐｏｎ Ｄ．Ｊ．）およびラスキーＬ．Ａ．（Ｌａｓｋｙ Ｌ．Ａ．））参照）。免疫グロブリンは、その生物学的特性、有機体内の位置および異なる抗原を処理する能力に基づいて異なるアイソタイプ（すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥ）に分類される。イムノグロブリンのアイソタイプによって、不変重鎖領域（ＣＨ）は３個または４個のＣＨドメインを有することができる。また、一部のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧ）において、重鎖は分子に柔軟性を付加するヒンジ領域を含む（Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．２００１，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．）。
ヒトには４個のＩｇＧ下位クラス（ＩｇＧ１、２、３、４）があり、このようなＩｇＧは血清に豊富な順序によって名付けられる（すなわち、ＩｇＧ１が最も豊富である）。ＩｇＧアイソタイプは、２個の軽鎖および２個の重鎖からなり、それぞれの重鎖は、３個の不変重鎖ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）を含む。ＩｇＧの２個の重鎖は、互いに対しておよび軽鎖にそれぞれジスルフィド結合（－Ｓ－Ｓ－）によって連結されている。ＩｇＧの抗原結合部位は、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）ドメインのみならず、不変軽鎖（ＣＬ）および不変重鎖（ＣＨ１）ドメインを含む断片抗原結合領域（Ｆａｂ領域）に位置する。ＩｇＧの断片結晶化可能領域（Ｆｃ領域）は、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を含む特定細胞の表面で発見されるＦｃ受容体に結合するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含有する重鎖の一部である。ＩｇＧの重鎖はさらに、Ｆａｂ領域をＦｃ領域から分離し、２個の重鎖をジスルフィド結合によりともに連結する時に参加する、ＣＨ１とＣＨ２との間のヒンジ領域を有する。ヒンジ領域の構造は、４個のＩｇＧ下位クラスそれぞれ特有の生物学的特性に寄与する。
ＩｇＧは容易に組織を潅流できるサイズの小さい単量体で分泌される。これは、子宮内の胎児を保護するためにヒト胎盤を通過することを促進する受容体（新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））を有する唯一のアイソタイプである。胎盤を通して吸収されたＩｇＧは、それ自体の免疫系が発達する前に体液性免疫を新生児に提供する。
ＩｇＧ新生児Ｆｃ受容体結合部位は、抗体のＦｃ領域に位置する。ＦｃＲｎは、一般的にヒトの胎盤および上皮細胞で発現し、ＩｇＧの分解を防ぐ細胞内移入サルベージ経路に関わる。このサルベージ経路は、酸性ｐＨでＦｃＲｎに対するＩｇＧの高いｐＨ依存性結合親和度によって媒介される。酸性ｐＨでＦｃＲｎに対するＩｇＧの高い親和度は、酸性エンドソーム内への吸収後に内在化されたＩｇＧのＦｃＲｎに対する結合を誘発すると考えられる（［Ｇｏｅｂｌ ＮＡ，ｅｔ ａｌ．，２００８］；［Ｊｕｎｇｈａｎｓ ＲＰ，ｅｔ ａｌ．，１９９６］）。大部分の可溶性タンパク質は、内在化後にリソソームに向かうが、内在化されたＦｃＲｎ－結合ＩｇＧは形質膜に戻り、基本分解経路から効果的に救出される。細胞外空間の中性ｐＨに露出時、ＩｇＧはＦｃＲｎから解離して循環系に戻ることができる。したがって、抗体の延長された血清半減期特性はＦｃ断片で維持される。
前記サルベージ経路は、非変形のタンパク質薬物に比べて、血液循環において半減期が延長された次世代タンパク質薬物の開発のための１つのメカニズムを提供する。特に、非変形のタンパク質薬物は循環半減期が短く、よって、必要な長期間の治療期間にわたって頻繁な投与が必要である。ＰＥＧ化融合タンパク質技術（米国食品医薬局（Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、［Ｏｓｂｏｒｎ ＢＬ，ｅｔ ａｌ．，２００２］）を含む多くの方法によってタンパク質薬物の半減期を延長するための広範な努力が行われていたが、その努力の結果は理想的ではなかった。
免疫疾患は、哺乳類免疫系の構成成分が哺乳類の病理状態を引き起こしたり、媒介したり、またはその他寄与する疾患であって、特に、炎症性障害は全世界で最も重要な健康問題の一つである。炎症は一般的に外部物質または有害な刺激による宿主の侵入に対して身体組織の局所化された保護反応である。炎症の原因は、バクテリア、ウイルスおよび寄生虫のような感染性原因；火傷または放射線照射のような物理的原因；毒素、薬物または産業的製剤のような化学薬品；アレルギーおよび自己免疫反応のような免疫的反応、または酸化性ストレスに関連する状態であり得る。
炎症は、痛み、赤化現象、腫れ、熱および感染した領域の窮極的な機能損失をその特徴とする。これらの症状は、免疫系の細胞間で起こる一連の複雑な相互作用の結果である。細胞の反応によって、結果的に複数グループの炎症メディエーターの相互作用ネットワークが生成される：タンパク質（例えば、サイトカイン、酵素（例えば、プロテアーゼ、ペルオキシダーゼ）、主要塩基性タンパク質、粘着分子（ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭ）、脂質メディエーター（例えば、エイコサノイド、プロスタグランジン、ロイコトリエン、血小板活性化因子（ＰＡＦ））、反応性酸素種（例えば、ヒドロペルオキシド、スーパーオキシドアニオンＯ２－、酸化窒素（ＮＯ）など）。しかし、炎症のこれらメディエーターの大部分はまた、正常な細胞活性の調節子である。したがって、炎症反応の欠乏によって宿主が制御されず、かつ損傷（すなわち、感染）し、よって、慢性炎症によって、部分的には前記言及されたメディエーターのいくつかが過剰生成されることで媒介される炎症性疾患が引き起こされる。
また、免疫疾患の一つである自己免疫疾患は、免疫体系が自らの器官を攻撃して自発的な反応を起こすことを特徴とする。このような反応は、Ｔリンパ球による自己抗原（ａｕｔｏ－ａｎｔｉｇｅｎ）の認識に起因し、これによって、体液性（自己抗原生成）および細胞性（リンパ球および大食細胞の細胞毒性の活性増加）免疫反応が誘発される。自己免疫疾患としては次のものが挙げられる：リウマチ性疾患、乾癬、全身性皮膚筋炎、多発性硬化症、紅斑性狼瘡、または抗原による免疫反応悪化、すなわち、喘息、薬物または食物に対するアレルギーなど。これらの疾患はすべて制限性かつ慢性の疾患であり、場合によっては致命的で、現在まで前記疾患を治療できる効果的な治療方法が存在しないのが現状である。そのため、これらの疾患の進行中に疾患を軽減または緩和させることができる薬物、医薬または媒体であれば、患者の健康のために重要な解決手段になるというべきであろう。
多くの研究者は自己免疫疾患の治療方法を探索して適当な薬物と方法を見出すべく集中的な努力を行ってきており、今日、自己免疫疾患の治療は、主に免疫抑制薬物、例えば、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、カルシニューリン抑制剤（ｃａｌｃｉｎｅｕｒｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ）および増殖抑制剤－代謝拮抗剤（ａｎｔｉｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｓ－ａｎｔｉｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）の使用に基づいたものである。しかし、このような薬理療法は多様な標的に対して作用するので、全体的には免疫機能を低下させることがある。そうでなければ、このような薬理療法を長期間使用した場合、様々な細胞毒性作用が問題になって、免疫体系を非特異的な方式で抑制することにより、患者を感染症および免疫関連疾患にかかる危険に曝す可能性がある。カルシニューリンとグルココルチコイドは、それらの腎毒性と糖尿病誘発特性に起因してさらに他の問題点を露呈するため、いくつかの臨床学的症状の場合（例：腎機能不全、糖尿病など）にはその使用が制限される。
したがって、自己免疫疾患、炎症性疾患、移植拒絶反応などのような免疫関連疾患を治療できる物質として、副作用がなく、かつ治療効果に優れた新たな治療剤の開発が必要なのが現状である。
本発明の一目的は、Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）と免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）Ｆｃ領域とを含む融合タンパク質を有効成分として含む免疫関連疾患の予防、改善または治療用組成物を提供することである。
本発明の他の目的は、前記免疫関連疾患の予防、改善または治療方法を提供することである。
しかし、本発明がなそうとする技術的課題は以上に述べた課題に制限されず、述べていないさらに他の課題は以下の記載から当業界における通常の知識を有する者に明確に理解されるであろう。
［１．免疫関連疾患の予防、改善または治療用組成物］
本発明の一実施形態では、免疫関連疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。
本発明の前記組成物は、薬学組成物；食品組成物；または化粧料組成物に使用可能である。
本発明の前記組成物は、Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ１）タンパク質の細胞外ドメイン（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ）および免疫グロブリン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）Ｆｃ領域を含む融合タンパク質；これをコードする核酸分子；前記核酸分子を含む発現ベクター；または前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を有効成分として含む。
以下、本発明の各構成について詳しく説明する。
［有効成分］
１）融合タンパク質
＜Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン＞
本発明において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質は、調節Ｔ免疫細胞の表面に存在する１０９１個のアミノ酸からなる膜貫通タンパク質であって、細胞外あるいはルーメン側のロイシンリッチリピート（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ（ＬＲＲ））と３個の免疫グロブリン様ドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ）、細胞膜貫通配列および細胞質尾部から構成されている。ＬＲＩＧ遺伝子ファミリーは、ＬＲＩＧ１、ＬＲＩＧ２とＬＲＩＧ３が存在し、これらの間のアミノ酸は非常に保存的に構成されている。前記ＬＲＩＧ１遺伝子は、正常皮膚において高く発現しており、基底および毛包細胞に発現して上皮幹細胞の増殖を調節することができる。
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインであってもよい。本発明の目的上、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外タンパク質は、ヒトまたはマウスに由来するＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、ヒト由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目アミノ酸配列に相当する配列番号１で表され、これは配列番号２で表される核酸配列によってコードされてもよいが、これに限定されるものではない（表１参照）。
本発明の他の例において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインは、マウス由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質の３５番目～７９４番目アミノ酸配列に相当する配列番号３で表され、これは配列番号４で表される核酸配列によってコードされてもよいが、これに限定されるものではない（表２参照）。
＜免疫グロブリンＦｃ領域＞
本発明において、「免疫グロブリンＦｃ領域」は、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域を除いた、重鎖不変領域２（ＣＨ２）および／または重鎖不変領域３（ＣＨ３）部分を含む部位を意味する。前記免疫グロブリンＦｃ領域は、本発明のタンパク質結合体の部分をなす一構成であってもよい。
本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、重鎖不変領域にヒンジ部分を含むことにより、最終的に製造される融合タンパク質の構造的柔軟性に影響を与えることができ、融合タンパク質の生産性および安定性をより高めることができるが、これに限定されるものではない。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型と実質的に同等であるか向上した効果を有する限り、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域だけを除いて、一部または全体が重鎖不変領域１（ＣＨ１）および／または軽鎖不変領域１（ＣＬ１）を含む拡張されたＦｃ領域であってもよい。さらに、ＣＨ２および／またはＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。
例えば、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、５）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメインのうちの１個または２個以上のドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（またはヒンジ領域の一部）との組み合わせ、６）重鎖不変領域の各ドメインと軽鎖不変領域の二量体であってもよい。しかし、これに限定されるものではない。
本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体を含む。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはこれらの組み合わせによって異なる配列を有するものを意味する。
本発明において、例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要と知られている２１４～２３８、２９７～２９９、３１８～３２２または３２７～３３１番目アミノ酸残基が変形のために適当な部位として用いられる。
本発明において、ジスルフィド結合を形成できる部位が除去されるか、天然型ＦｃにおいてＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去されるか、または天然型ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加されてもよいなど、多様な種類の誘導体が可能である。また、エフェクター機能を無くすために補体結合部位、例として、Ｃ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｃｅｌｌ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリンＦｃ領域の配列誘導体を製造する技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号、国際特許公開第ＷＯ９６／３２４７８号などに開示されている。
本発明において、分子の活性を全体的に変更させないタンパク質およびペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野で公知である（Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７９）。最も通常に起こる交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｙ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化、硫化、アクリル化、糖化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化およびアミド化などで修飾されてもよい。
本発明において、前述したＦｃ誘導体は、本発明のＦｃ領域と同等の生物学的活性を示し、Ｆｃ領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を増大させたものであってもよい。
本発明において、前記Ｆｃ領域は、ヒト、ウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラットまたはモルモットなどの動物の生体内で分離した天然型から得られてもよく、形質転換された動物細胞または微生物から得られた組換え型またはその誘導体であってもよい。ここで、天然型から取得する方法は、全体免疫グロブリンをヒトまたは動物の生体から分離した後、タンパク質分解酵素を処理して取得する方法であってもよい。パパインで処理する場合には、ＦａｂおよびＦｃに切断され、ペプシンで処理する場合には、ｐＦ’ｃおよびＦ（ａｂ）２に切断される。サイズ排除クロマトグラフィーなどを用いてＦｃまたはｐＦ’ｃを分離することができる。より具体的な実施形態では、ヒトまたはマウス由来のＦｃ領域を微生物から得た組換え型免疫グロブリンＦｃ領域である。
本発明において、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、天然型糖鎖、天然型に比べて増加した糖鎖、天然型に比べて減少した糖鎖、または糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリンＦｃ糖鎖の増減または除去には、化学的方法、酵素学的方法および微生物を用いた遺伝工学的方法のような通常の方法が利用可能である。ここで、Ｆｃから糖鎖の除去された免疫グロブリンＦｃ領域は、補体（ｃ１ｑ）との結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞毒性または補体依存性細胞毒性が減少または除去されるので、生体内で不必要な免疫反応を誘発しない。この点で、薬物のキャリアとしての本来の目的により符合する形態は、糖鎖の除去または非糖鎖化された免疫グロブリンＦｃ領域というべきであろう。
本発明において、「糖鎖の除去（Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）」は、酵素で糖を除去したＦｃ領域をいい、非糖鎖化（Ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）は、原核動物、より具体的な実施形態では、大膓菌で生産して糖鎖化されていないＦｃ領域を意味する。
一方、免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒトまたはウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物由来であってもよいし、好ましい一例として、ヒトまたはマウス由来であってもよい。
また、本発明の免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来Ｆｃ領域、重鎖不変領域２（ＣＨ２）、重鎖不変領域３（ＣＨ３）、ヒンジ（ｈｉｎｇｅ）、その断片、またはこれらのコンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）、またはこれらの組み合わせを含むハイブリッドＦｃ（ｈｙｂｒｉｄ Ｆｃ）であってもよい。
一方、本発明において、「コンビネーション（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」とは、二量体または多量体を形成する時、同一起源の単鎖免疫グロブリンＦｃ領域、重鎖不変領域２（ＣＨ２）または重鎖不変領域３（ＣＨ３）をコードするポリペプチドが、異なる起源の単鎖ポリペプチドと結合を形成することを意味する。すなわち、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ由来のＦｃ領域、重鎖不変領域２（ＣＨ２）または重鎖不変領域３（ＣＨ３）から選択された２個以上の断片から二量体または多量体の製造が可能である。
本発明において、前記「ハイブリッドＦｃ」は、ヒトＩｇＧサブクラスの組み合わせ、またはヒトＩｇＤおよびＩｇＧの組み合わせから誘導される。一つの実施例において、前記ハイブリッドＦｃは、例えば、ＩｇＤヒンジ領域およびＣＨ２ Ｎ末端領域＋ＩｇＧ４ ＣＨ２およびＣＨ３領域を含むことができ、例えば、韓国登録特許第０８９７９３８号に開示されたハイブリッドＦｃ形態を同一に借りて用いることができ、本明細書に参照として導入される。本発明において、前記ハイブリッドＦｃは、生物学的活性分子、ポリペプチドなどに結合する場合、生物学的活性分子の血清半減期を増加させるだけでなく、Ｆｃ－ポリペプチド融合タンパク質をコードする核酸分子が発現する時、ポリペプチドの発現レベルを高める効果がある。
本発明において、一例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ由来のＦｃ領域であるか、あるいは前記ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＥ由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、一例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒト血液に最も豊富なＩｇＧまたはＩｇＭ由来Ｆｃ領域であるか、あるいは前記ＩｇＧまたはＩｇＭ由来重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができ、他の例として、リガンド結合タンパク質の半減期を向上させることが公知であるＩｇＧ由来Ｆｃ領域であるか、あるいは前記ＩｇＧ由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができ、さらに他の例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来Ｆｃ領域であるか、あるいは前記ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができ、さらに他の例として、ＩｇＧ１またはＩｇＧ２由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができる。
本発明において、好ましい例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むか、配列番号６で表されるマウスＩｇＧ２由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含むことができるが、これに限定されるものではない（下記表３参照）。
本発明の一例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはアバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）由来のヒンジ領域を含むことができ、他の例として、ＩｇＧ、ＩｇＤまたはアバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）由来のヒンジ領域を含むことができ、あるいはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤまたはアバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）由来のヒンジ領域を含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、好ましい例として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号７で表されるヒトＩｇＧ１由来のヒンジ領域；配列番号８で表されるマウスＩｇＧ２由来のヒンジ領域；配列番号９で表されるヒトＩｇＤ由来のヒンジ領域；および配列番号１０で表されるアバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）のヒンジ領域；からなる群より選択された１種以上を含むことにより（下記表４参照）、最終的に製造される融合タンパク質の構造的柔軟性を高め、融合タンパク質の生産性および安定性を著しく向上させることができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインとＦｃ領域とがリンカーを介して連結される場合、前記リンカーは、Ｆｃ断片のＮ末端、Ｃ末端または遊離基（ｆｒｅｅ ｒａｄｉｃａｌ）に連結され、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのＮ末端、Ｃ末端または遊離基に連結されてもよい。リンカーがペプチドリンカーの場合、連結は任意の部位で起こり得る。例えば、前記リンカーは、前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのＣ末端および前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端に連結され、あるいは前記免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ末端および前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのＮ末端に連結されてもよい。
＜リンカー＞
本発明において、前記「リンカー」は、融合タンパク質内Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインと免疫グロブリンＦｃ領域との間の干渉効果を低減して、ターゲット細胞において前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの目的とする活性を高めることができる。また、本発明において、前記リンカーは、目的とする疾患の組織または細胞内で過発現する酵素によって切断可能な配列を含むことができる。前記のように過発現する酵素によって切断可能な場合には、Ｆｃ部分によってポリペプチドの活性が低下するのを効果的に防止することができる。
本発明の一例として、前記リンカーは、１～１００個のアミノ酸を有することが好ましいが、これに限定されず、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインと免疫グロブリンＦｃ領域を分離させることができるいかなるペプチドでも可能である。前記リンカーを構成するアミノ酸配列には特別な制限はないが、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）を含むか、これらを繰り返しまたはランダムパターンで含むことが好ましい。その例として、前記リンカーは、配列番号１１で表されるペプチドリンカー；および配列番号１２で表されるペプチドリンカー；のうちの少なくとも１つを含むことができ（下記表５参照）、あるいは下記式１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーから構成された群より選択される少なくとも１つであってもよい：
（式１） （Ｇ）ｎ
（式２） （ＧＧＧＧＳ）ｍ
（式３） （ＥＡＡＡＫ）ｐ
（式４） （ＸＰ）ｑ
前記式１～４中、
ｎ、ｍおよびｐは、それぞれ独立して、１以上の整数であり；
ｑは、５～４０の整数であり；
Ｘは、Ａ（Ａｌａ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｇ（Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｏ（Ｐｙｌ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｕ（Ｓｅｃ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）およびＹ（Ｔｙｒ）から構成された群より選択されるいずれか１つのアミノ酸である。
本発明において、前記式１～式３の前記ｎ、ｍおよびｑは、１以上の整数、好ましくは１～２０の整数であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記式４の前記Ｘは、Ａ（Ａｌａ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明において、一例として、前記リンカーは、配列番号９６で表されるペプチドリンカー（Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ）；配列番号９７で表されるペプチドリンカー（ＰＡＰＡＰ）；配列番号９８で表されるペプチドリンカー（ＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ）；配列番号９９で表されるペプチドリンカー（ＩＥＧＲＭＤ）；および配列番号１００で表されるペプチドリンカー（ＤＩＥＧＲＭＤ）から構成された群より選択される少なくとも１つを含むことができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記融合タンパク質が前記ペプチドリンカーをさらに含む場合、細胞内活性物質の安定性を高め、生産性をより向上させることができる。
また、本発明において、前記リンカーの一例として、血液内に最も多く存在するヒトアルブミンの２８２番～３１４番目部分に位置した３３個のアミノ酸からなるペプチドリンカー、より好ましくは、２９２番～３０４番目部分に位置した１３個のアミノ酸からなるペプチドリンカーであってもよいし、このような部分は、３次元的な構造上、ほとんど外部に露出した部分であって、体内で免疫反応を誘導する可能性が最小化された部分である。ただし、これに限定されるものではない。
さらに、本発明において、前記リンカーおよびＦｃ領域が別個に発現した後に互いに結合される時、リンカーは、当業界で知られた架橋剤であってもよい。前記架橋剤は、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニルエタン（１，１－ｂｉｓ（ｄｉａｚｏａｃｅｔｙｌ）－２－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｅ）、グルタルアルデヒド（ｇｌｕｔａｒａｌｄｅｈｙｄｅ）、４－アジドサリチル酸（４－ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ）のようなＮ－ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ ｅｓｔｅｒ）、３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（３，３’－ｄｉｔｈｉｏｂｉｓ（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ））のようなジスクシンイミジルエステル（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒｓ）を含むイミドエステル（ｉｍｉｄｏｅｓｔｅｒｓ）、およびビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタンのような二重機能的マレイミド（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ）であってもよいが、これに限定されるものではない。
＜Ｌｒｉｇ－１細胞外ドメイン；および免疫グロブリンを含む融合タンパク質＞
本発明で提供する融合タンパク質の一例は、前記配列番号１で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表６参照）。下記表６の配列番号１３～１６で表される融合タンパク質は、下記表７の配列番号１７～２０で表される核酸配列によってコードされる（下記表７参照）。
本発明で提供する融合タンパク質の一例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表８参照）。下記表８の配列番号２１～２４で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表９の配列番号２５～２８で表される核酸配列によってコードされる（下記表９参照）。
本発明で提供する融合タンパク質の他の例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号６で表されるマウスＩｇＧ２由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表１０参照）。下記表１０の配列番号２９～３２で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表１１の配列番号３３～３６で表される核酸配列によってコードされる（下記表１１参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号１で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表１２参照）。下記表１２の配列番号３７～４０で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表１３の配列番号４１～４４で表される核酸配列によってコードされる（下記表１３参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表１４参照）。下記表１４の配列番号４５～４８で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表１５の配列番号４９～５２で表される核酸配列によってコードされる（下記表１５参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号６で表されるマウスＩｇＧ２由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表１６参照）。下記表１６の配列番号５３～５６で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表１７の配列番号５７～６０で表される核酸配列によってコードされる（下記表１７参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号１で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１２で表されるリンカー；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表１８参照）。下記表１８の配列番号６１～６４で表される融合タンパク質は、下記表１９の配列番号６５～６８で表される核酸配列によってコードされる（下記表１９参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１２で表されるリンカー；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号５で表されるヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表２０参照）。下記表２０の配列番号６９～７２で表される融合タンパク質は、それぞれ下記表２１の配列番号７３～７６で表される核酸配列によってコードされる（下記表２１参照）。
本発明で提供する融合タンパク質のさらに他の例は、前記配列番号３で表されるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン；配列番号１２で表されるリンカー；配列番号１１で表されるリンカー；配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域；配列番号６で表されるマウスＩｇＧ２由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）を含む融合タンパク質であってもよい（下記表２２参照）。下記表２２の配列番号７７～８０で表される融合タンパク質は、下記表２３の配列番号８１～８４で表される核酸配列によってコードされる（下記表２３参照）。
２）核酸分子
本発明の組成物は、本発明で提供する前記融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。
本発明の核酸分子は、本発明で提供する融合タンパク質のアミノ酸配列を、当業者に知られているように、ポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子のすべてを含む。そのため、ＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）による多様なポリヌクレオチド配列が製造可能であり、これもすべて本発明の核酸分子に含まれる。
３）発現ベクター
本発明の組成物は、本発明で提供する前記単離された核酸分子が挿入された発現ベクターを提供する。
本発明において、前記「ベクター」は、ある核酸分子が連結された他の核酸を輸送できる前記核酸分子である。ベクターの一類型は、追加的なＤＮＡセグメントがライゲーション可能な円形二重鎖ＤＮＡを指す「プラスミド」である。また、他の類型のベクターはファージベクターである。さらに他の類型のベクターはウイルス性ベクターで、追加的なＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲーションできる。あるベクターは、それらが流入した宿主細胞で自律的な複製が可能である（例えば、バクテリア性ベクターはバクテリア性複製起源を有するエピゾーム哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば、非－エピゾーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞に流入しながら宿主細胞のゲノムに統合され、それによって、宿主ゲノムとともに複製される。それだけでなく、あるベクターは、これらが作動レベルで連結された遺伝子の発現を指示することができる。このようなベクターは、本願において、「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と名付けられる。一般的に、組換えＤＮＡ手法で有用な発現ベクターは、たびたびプラスミドの形態で存在する。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドがベクターのうち最も通常使用される形態であるため、相互交換して使用可能である。
本発明において、前記発現ベクターの具体例としては、商業的に広く使用されるｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター；コスミド；ラムダ、ラムダ状（ｌａｍｂｄｏｉｄ）、Ｍ１３、Ｍｕ、ｐ１ Ｐ２２、Ｑμ、Ｔ－ｅｖｅｎ、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ７などのファージ；植物ウイルスからなる群より選択できるが、これに限定されるものではなく、当業者に発現ベクターとして知られたすべての発現ベクターは本発明に使用可能であり、発現ベクターを選択する時には目的とする宿主細胞の性質による。宿主細胞へのベクターの導入時、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥデキストラン調節トランスフェクション、リポフェクタミントランスフェクションまたは電気穿孔法によって行われるが、これに限定されるものではなく、当業者は使用する発現ベクターおよび宿主細胞に適した導入方法を選択して用いることができる。好ましくは、ベクターは、１つ以上の選別マーカーを含むが、これに限定されず、選別マーカーを含まないベクターを用いて生産物の生産の有無によって選別可能である。選別マーカーの選択は、目的とする宿主細胞によって選別され、これはすでに当業者に知られた方法を利用するので、本発明はこれに制限を設けない。
本発明の核酸分子を、精製を容易にするために、タグ配列を発現ベクター上に挿入して融合させることができる。前記タグとしては、ヘキサ－ヒスチジンタグ、ヘマグルチニンタグ、ｍｙｃタグまたはｆｌａｇタグを含むが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた精製を容易にするタグはすべて本発明で利用可能である。
４）宿主細胞
本発明の組成物は、本発明で提供する前記発現ベクターが形質感染した宿主細胞を提供する。
本発明において、前記「宿主細胞」には、ポリペプチド挿入物の組込みのためのベクターのレシピエント（ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ）であり得るか、またはレシピエントであった個別的な細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には単一宿主細胞の子孫が含まれ、前記子孫は自然的な、偶発的なまたは故意の突然変異のため必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態学上またはゲノムＤＮＡ補完体において）でなくてもよい。宿主細胞には本願のポリペプチドによって体内で形質注入された細胞が含まれる。
本発明において、前記宿主細胞としては、哺乳動物、植物、昆虫、菌類または細胞性起源の細胞を含むことができ、例えば、大膓菌、ストレプトミセス、サルモネラ・ティフィムリウムなどのバクテリア細胞；酵母細胞、ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトリンパ芽球（Ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボウズメラノーマ細胞、ＨＴ－１０８０、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞、Ｂａｂｙ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚腎臓細胞、Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）またはＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）の動物細胞；または植物細胞であってもよいが、これに限定されるものではなく、当業者に知られた宿主細胞株として使用可能な細胞はすべて利用可能である。
５）ＶＩＳＴＡ（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）との併用
本発明において、前記組成物は、ＶＩＳＴＡ（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）またはその一断片をさらに含むことができる。
本発明において、前記組成物は、ＶＩＳＴＡまたはその一断片；および免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質をさらに含むことができる。ここで、前記ＶＩＳＴＡまたはその一断片と免疫グロブリンＦｃ領域との間にリンカーを追加的にさらに含んでもよい。
本発明において、前記「Ｖドメイン免疫グロブリン抑制子（ＶＩＳＴＡ）」は、Ｔ細胞に対して免疫活性抑制機能をする免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）タンパク質に相当する。ＶＩＳＴＡは、ＩｇＧ Ｖドメインを含む細胞外（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ）ドメインと、ＩＴＡＭ、ＩＴＩＭを含まない短い細胞質（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ）ドメインとを含む表面タンパク質に相当する。ＶＩＳＴＡは、ＣＤ１１ｂ＋骨髄性樹状細胞（ｍｙｅｌｏｉｄ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ；ＤＣｓ）、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋制御性Ｔ細胞で発現し、Ｔ細胞の活性化によるサイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）の分泌と増殖を抑制する機能を果たすことができる。ＶＩＳＴＡのないノックアウト（ｋｎｏｃｋ－ｏｕｔ）マウスでは慢性炎症によって臓器の機能が低下しており、多発性硬化症の症状が正常マウスに比べてはるかに急速に現れる。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などを含む哺乳類に由来するものであってもよい。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡは、ヒト由来ＶＩＳＴＡである配列番号８５で表されるアミノ酸配列からなるか、配列番号８７で表されるヌクレオチドによってコードされてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡは、マウス由来ＶＩＳＴＡである配列番号８６で表されるアミノ酸配列からなるか、配列番号８８で表されるヌクレオチドによってコードされてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡの一断片は、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインは、ヒト由来ＶＩＳＴＡの３３番目～１９４番目アミノ酸配列に相当する配列番号８９で表されるアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインは、マウス由来ＶＩＳＴＡの３３番目～１９１番目アミノ酸配列に相当する配列番号９０で表されるアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明の一例において、前記ＶＩＳＴＡの一断片は、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの一断片であってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの断片は、ヒト由来ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの一部の断片である配列番号９１～９３のうちのいずれか１つで表されるアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの断片は、マウス由来ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの一部の断片である配列番号９４または９５で表されたアミノ酸配列からなってもよいが、これに限定されるものではない。
ここで、前記免疫グロブリンＦｃ領域、リンカーに関する記載は上述したものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下その記載を省略する。
本発明において、ＶＩＳＴＡまたはこれらの一断片や、これを含む融合タンパク質は、本発明で提供される前記アミノ酸配列を、当業者に知られているように、ポリヌクレオチド配列に翻訳された核酸分子が挿入された発現ベクターを宿主細胞に挿入および培養した後、クロマトグラフィーなどを用いて精製する過程により容易に得られる。
ここで、前記核酸分子、発現ベクターおよび宿主細胞に関する記載も上述したものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために、以下その記載を省略する。
６）免疫関連疾患および併用
＜免疫関連疾患＞
本発明において、前記「免疫関連疾患」は、多様な免疫細胞、例えば、エフェクターＴ細胞（ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ）または毒性Ｔ細胞（ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ）および炎症細胞の過度の活性化および／または増殖によって誘導される疾患であって、自己免疫疾患；移植片対宿主疾患；臓器移植拒絶反応；喘息；アトピー；または急性または慢性の炎症疾患などであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記「自己免疫疾患」は、リウマチ性関節炎、第１型糖尿、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、全身紅斑ループス、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット病、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症侯群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、多発性筋炎、強直性脊椎炎、線維筋痛症および結節性多発性動脈炎から構成された群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これに限定されるものではない。
また、本発明において、前記「自己免疫疾患」は、活性化されたＴ細胞が神経を構成する細胞に浸透して炎症を誘発するか、細胞の死滅を誘導する過程により発生したものであってもよく、例えば、神経退行性疾患または神経炎症性疾患であってもよい（Neuromolecular Med.2005;7(3):255-64.参照）。
本発明において、前記神経退行性疾患または神経炎症性疾患は、脳卒中、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ニーマン・ピック病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭認知症、レビー小体型認知症、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍随伴症候群（Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮質基底核変性症、多系統萎縮病、進行性核上性麻痺、神経系自己免疫疾患、脊髄小脳失調（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、炎症性および神経病症性痛み、脳血管疾患、脊髄損傷およびタウオパチー病からなる群より選択されてもよいが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記免疫関連疾患、例えば、自己免疫疾患の場合、健康な対照群と比較して、疾患が誘発された患者において自己免疫性Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞または毒性Ｔ細胞など）が高いレベルの頻度で存在するか、その活性が著しく増加していることにより、過度の免疫反応を誘導するか、特定器官の細胞を破壊することにより誘導されるものであってもよい（Clinical&Experimental Immunology,180:353-360.,Immunity,Vol.17,1-6,July,2002.,Ann Rheum Dis2004;63(Suppl II):96-101.,Immunol Res.2013December;57(0):12-22.参照）。
本発明において、前記免疫関連疾患は、Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞または毒性Ｔ細胞）、好ましくは、自己反応性Ｔ細胞の活性化および／または増殖に必須の細胞内シグナル伝達経路を妨げることにより予防、改善または治療できる（Ann Rheum Dis2004;63(Suppl II):96-101.参照）。具体的には、本発明による前記融合タンパク質は、エフェクターＴ細胞に同時抑制シグナル（ｃｏ－ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌ）を誘導してエフェクターＴ細胞の増殖抑制および活性化を調節することができる。したがって、Ｔ細胞（例えば、エフェクターＴ細胞または毒性Ｔ細胞）の過度の活性化および／または増殖によって発生しうる多様な免疫関連疾患を効果的に予防、改善または治療することができる。
＜免疫関連疾患治療剤との併用＞
本発明の組成物は、前記免疫関連疾患を治療するための他の薬剤と併用することができる。例えば、自己免疫疾患は非制限的に、免疫抑制剤、例えば、コルチコステロイド、シクロスポリン、シクロホスファミド、プレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキサート、ラパマイシン、タクロリムス、生物学的製剤、例えば、ＴＮＦ－α遮断剤または拮抗剤、または任意の炎症性サイトカインを標的化する任意の他の生物学的製剤、非ステロイド性抗炎症薬物／Ｃｏｘ－２阻害剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン（ｓｕｌｐｈａｓａｌａｚｏｐｒｙｉｎｅ）、金塩、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、ミコフェノレートモフェチル（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ ｍｏｆｅｔｉｌ）、バシリキシマブ（ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ）、アタシセプト（ａｔａｃｉｃｅｐｔ）、リツキシマブ、サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ）、インターフェロンβ－１ａ、インターフェロンβ－１ｂ、グラチラマーアセテート（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ ａｃｅｔａｔｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）ヒドロクロライド、アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）および／またはその他の生物学的物質および／または静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）とともに、本発明の少なくとも一部の実施形態による分子で治療できる。このような公知の治療剤の非制限的な例には、インターフェロン、例えば、ＩＦＮ－β－１ａ（レビフ（ＲＥＢＩＦ）（登録商標）、アボネックス（ＡＶＯＮＥＸ）（登録商標）およびシノベックス（ＣＩＮＮＯＶＥＸ）（登録商標））およびＩＦＮ－β－１ｂ（ベータセロン（ＢＥＴＡＳＥＲＯＮ）（登録商標）、エクスタヴィア（ＥＸＴＡＶＩＡ）（登録商標）、ベタフェロン（ＢＥＴＡＦＥＲＯＮ）（登録商標）、ジフェロン（ＺＩＦＥＲＯＮ）（登録商標））；グラチラマーアセテート（ｇｌａｔｉｒａｍｅｒ ａｃｅｔａｔｅ）（コパキソン（ＣＯＰＡＸＯＮＥ）（登録商標））、ポリペプチド；ナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｕｍａｂ）（タイサブリ（ＴＹＳＡＢＲＩ）（登録商標））；およびミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）（ノバントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）（登録商標））、細胞毒性剤が含まれる。
また、本発明の組成物は、任意の公知の多発性硬化症治療用治療剤または多発性硬化症治療方法と併用することができる。このような公知の多発性硬化症治療用治療剤または多発性硬化症治療方法の非制限的な例には、インターフェロン類、ＩＦＮ－β－１ａ（レビフ（登録商標）、アボネックス（登録商標）およびシノベックス（登録商標））およびＩＦＮ－β－１ｂ（ベータセロン（登録商標）、エクスタヴィア（ＥＸＴＡＶＩＡ）（登録商標）、ベタフェロン（登録商標）、ジフェロン（登録商標））；グラチラマーアセテート（コパキソン（登録商標））、ポリペプチド；ナタリズマブ（タイサブリ（登録商標））；およびミトキサントロン（ノバントロン（登録商標））、細胞毒性剤、ファムプリジン（Ｆａｍｐｒｉｄｉｎｅ）（アンピラ（ＡＭＰＹＲＡ）（登録商標））が含まれる。他の薬物には、コルチコステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、アザチオプリンおよび静脈免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、イノシン、オクレリズマブ（Ｒ１５９４）、ミリナックス（Ｍｙｌｉｎａｘ）（クラドリビン（Ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ））、アレムツズマブ（キャンパス（Ｃａｍｐａｔｈ））、ダクリズマブ（ゼナパックス（Ｚｅｎａｐａｘ））、パナクラール／ジメチルフマレート（ＢＧ－１２）、テリフルノミド（Ｔｅｒｉｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（ＨＭＲ１７２６）、フィンゴリモド（ＦＴＹ７２０）、ラキニモド（ＡＢＲ２１６０６２）だけでなく、造血幹細胞移植、ニューロバックス（Ｎｅｕｒｏｖａｘ）、リツキシマブ（リツキサン（Ｒｉｔｕｘａｎ））ＢＣＧワクチン、低用量ナルトレキソン（ｎａｌｔｒｅｘｏｎｅ）、駆虫治療法、血管成形術、静脈ステント（ｖｅｎｏｕｓ ｓｔｅｎｔ）および代替療法、例えば、ビタミンＤ、多重不飽和脂肪、医療用マリファナが含まれる。
また、本発明の組成物は、任意の公知のリウマチ関節炎の治療用治療剤またはリウマチ関節炎の治療方法と併用できる。このような公知のリウマチ関節炎の治療用治療剤またはリウマチ関節炎の治療方法の非制限的な例には、グルココルチコイド、非ステロイド性抗炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）、例えば、サリチレートまたはシクロオキシゲナーゼ－２阻害剤、イブプロフェン（ｉｂｕｐｒｏｆｅｎ）およびナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）、ジクロフェナク（ｄｉｃｌｏｆｅｎａｃ）、インドメタシン（ｉｎｄｏｍｅｔｈａｃｉｎ）、エトドラク（ｅｔｏｄｏｌａｃ）、疾患修飾性抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）－経口ＤＭＡＲＤ：アウラノフィン（Ａｕｒａｎｏｆｉｎ）（リダウラ（Ｒｉｄａｕｒａ））、アザチオプリン（イムラン（Ｉｍｕｒａｎ））、シクロスポリン（Ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎｅ）（サンディミュン（Ｓａｎｄｉｍｍｕｎｅ）、ジェングラフ（Ｇｅｎｇｒａｆ）、ネオラール（Ｎｅｏｒａｌ）、ジェネリック（ｇｅｎｅｒｉｃ））、Ｄ－ペニシラミン（クプリミン（Ｃｕｐｒｉｍｉｎｅ））、ヒドロキシクロロキン（プラケニル（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ））、ＩＭゴールドゴールドソジウムチオマレート（ミオクリシン（Ｍｙｏｃｈｒｙｓｉｎｅ））オーロチオグルコース（Ａｕｒｏｔｈｉｏｇｌｕｃｏｓｅ）（ソルガナール（Ｓｏｌｇａｎａｌ））、レフルノミド（Ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅ）（アラバ（Ａｒａｖａ））、メトトレキサート（リウマトレックス（Ｒｈｅｕｍａｔｒｅｘ））、ミノサイクリン（Ｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）（ミノシン（Ｍｉｎｏｃｉｎ））、スタフィロコッカルタンパク質Ａ免疫吸着（プロソルバカラム（Ｐｒｏｓｏｒｂａ ｃｏｌｕｍｎ））、スルファサラジン（Ｓｕｌｆａｓａｌａｚｉｎｅ）（アズルフィジン（Ａｚｕｌｆｉｄｉｎｅ））、生物学的ＤＭＡＲＤ：ＴＮＦ－α遮断剤、例えば、アダリムマブ（Ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）（ヒュミラ（Ｈｕｍｉｒａ））、エタネルセプト（Ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）（エンブレル（Ｅｎｂｒｅｌ））、インフリキシマブ（Ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）（レミケード（Ｒｅｍｉｃａｄｅ））、ゴリムマブ（ｇｏｌｉｍｕｍａｂ）（シンポニー（Ｓｉｍｐｏｎｉ））、セルトリズマブペゴル（ｃｅｒｔｏｌｉｚｕｍａｂ ｐｅｇｏｌ）（シムジア（Ｃｉｍｚｉａ））およびその他の生物学的ＤＭＡＲＤ、例えば、アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）（キネレット（Ｋｉｎｅｒｅｔ））、リツキシマブ（リツキサン）、トシリズマブ（Ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）（アクテムラ（Ａｃｔｅｍｒａ））、ＣＤ２８阻害剤、例えば、アバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）（オレンシア）およびベルラタセプト（Ｂｅｌａｔａｃｅｐｔ）が含まれる。
また、本発明の組成物は、任意の公知の１型糖尿病用治療剤または１型糖尿病治療方法と併用できる。このような公知の１型糖尿病の治療用治療剤の非制限的な例には、インスリン、インスリン類似体、膵島移植、幹細胞治療法、例えば、プロキマール（ＰＲＯＣＨＹＭＡＬ）（登録商標）、非インスリン治療法、例えば、ＩＬ－１β阻害剤、例えば、アナキンラ（キネレット（登録商標））、アバタセプト（オレンシア（登録商標））、ディアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、アレファセプト（ａｌｅｆａｃｅｐｔ）（アメビブ（Ａｍｅｖｉｖ）（登録商標））、オテリキシズマブ（Ｏｔｅｌｉｘｉｚｕｍａｂ）、ＤｉａＰｅｐ２７７（Ｈｓｐ６０由来ペプチド）、アルファ１－抗トリプシン、プレドニゾン、アザチオプリン、シクロスポリン（Ｃｉｃｌｏｓｐｏｒｉｎ）、Ｅ１－ＩＮＴ（上皮成長因子類似体およびガストリン類似体を含む注射可能な小島新生治療法）、スタチン（ｓｔａｔｉｎ）、例えば、ゾコール（Ｚｏｃｏｒ）（登録商標）、シムラップ（Ｓｉｍｌｕｐ）（登録商標）、シムカード（Ｓｉｍｃａｒｄ）（登録商標）、シンバコール（Ｓｉｍｖａｃｏｒ）（登録商標）、シタグリプチン（Ｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ）（ジペプチジルペプチダーゼ（ＤＰＰ－４）阻害剤）、抗ＣＤ３ ｍＡｂ（例えば、テプリズマブ（Ｔｅｐｌｉｚｕｍａｂ））；ＣＴＬＡ４－Ｉｇ（アバタセプト（ａｂａｔａｃｅｐｔ））、抗ＩＬ－１β（カナキヌマブ（Ｃａｎａｋｉｎｕｍａｂ））、抗ＣＤ２０ ｍＡｂ（例えば、リツキシマブ）が含まれる。
また、本発明の組成物は、任意の公知のシェーグレン症候群の治療用治療剤またはシェーグレン症候群の治療方法と併用できる。このような公知のシェーグレン症候群の治療用治療剤の非制限的な例には、シクロスポリン、ヒロカルピン（ｐｉｌｏｃａｒｐｉｎｅ）（サラジェン（Ｓａｌａｇｅｎ））およびセビメリン（ｃｅｖｉｍｅｌｉｎｅ）（エボザック（Ｅｖｏｘａｃ））、ヒドロクロロキン（プラケニル（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ））、コルチゾン（プレドニゾンおよびその他）および／またはアザチオプリン（イムラン）またはシクロホスファミド（サイトキサン（Ｃｙｔｏｘａｎ））、デキサメタゾン、サリドマイド（Ｔｈａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、デヒドロエピアンドロステロン、ＮＧＸ２６７、レバミピド（Ｒｅｂａｍｉｐｉｄｅ）、ＦＩＤ１１４６５７、エタネルセプト、ラプティバ（Ｒａｐｔｉｖａ）、ベリムマブ（Ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）、マブセラ（ＭａｂＴｈｅｒａ）（リツキシマブ）；アナキンラ、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、同種異系中間葉幹細胞（ＡｌｌｏＭＳＣ）、「サリウェルクラウン（Ｓａｌｉｗｅｌｌ Ｃｒｏｗｎ）」による自動神経－電気刺激が含まれる。
また、本発明の組成物は、任意の公知の全身性エリテマトーデスの治療用治療剤または全身性エリテマトーデスの治療方法と併用できる。このような公知の全身性エリテマトーデスの治療用治療剤の非制限的な例には、コルチコステロイドおよび疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、通常、抗マラリア薬物、例えば、プラケニルおよび免疫抑制剤（例えば、メトトレキサートおよびアザチオプリン）、ヒドロキシクロロキン、細胞毒性薬物（例えば、シクロホスファミドおよびミコフェノレート）、ヒドロキシクロロキン（ＨＣＱ）、ベンリスタ（Ｂｅｎｌｙｓｔａ）（ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ））、非ステロイド性抗炎症薬物、プレドニゾン、セルセプト（Ｃｅｌｌｃｅｐｔ）、プログラフ（Ｐｒｏｇｒａｆ）、アタシセプト（Ａｔａｃｉｃｅｐｔ）、ルプゾール（Ｌｕｐｕｚｏｒ）、静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）、セルセプト（ミコフェノレートモフェチル）、オレンシア（Ｏｒｅｎｃｉａ）、ＣＴＬＡ４－ＩｇＧ４ｍ（ＲＧ２０７７）、リツキシマブ、オクレリズマブ、エプラツズマブ（Ｅｐｒａｔｕｚｕｍａｂ）、ＣＮＴＯ１３６、シファリムマブ（Ｓｉｆａｌｉｍｕｍａｂ）（ＭＥＤＩ－５４５）、Ａ－６２３（従来はＡＭＧ６２３）、ＡＭＧ５５７、ロンタリズマブ（Ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、パキニモド（ｐａｑｕｉｎｉｍｏｄ）（ＡＢＲ－２１５７５７）、ＬＹ２１２７３９９、ＣＥＰ－３３４５７、デヒドロエピアンドロステロン（Ｄｅｈｙｄｒｏｅｐｉａｎｄｒｏｓｔｅｒｏｎｅ）、レボチロキシン（Ｌｅｖｏｔｈｙｒｏｘｉｎｅ）、アベチムスソジウム（ａｂｅｔｉｍｕｓ ｓｏｄｉｕｍ）（ＬＪＰ３９４）、メマンチン（Ｍｅｍａｎｔｉｎｅ）、アヘン剤、ラパマイシン、腎臓移植、幹細胞移植が含まれる。
７）用語および組成物
本発明において、「予防」は、本発明の組成物を用いて疾患の症状を遮断するか、その症状を抑制または遅延させるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
本発明において、「改善」または「治療」は、本発明の組成物を用いて疾患の症状が好転するか、有利になるすべての行為であれば制限なく含むことができる。
本発明において、前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料形態であることを特徴とし、前記薬学組成物は、ヒトを対象にすることを特徴とすることができる。
本発明において、前記薬学組成物はこれらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤形、外用剤、坐剤および滅菌注射溶液の形態に剤形化して使用できる。本発明の薬学組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。薬学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用することができ、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用することができ、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤形は、上述のような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウエハなどの形態に製造することができ、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などに剤形化することができる。
一方、製剤化に適した担体、賦形剤および希釈剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートまたは鉱物油などが使用できる。また、充填剤、抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤、防腐剤などを追加的に含んでもよい。
本発明において、前記薬学組成物の投与経路はこれらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髓内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投下が好ましい。
本発明において、前記「非経口」とは、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物はさらに、直腸投与のための坐剤の形態で投与可能である。
本発明の前記薬学組成物は、使用された特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定式、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合および予防または治療される特定疾患の重症を含んだ様々な要因によって多様に変化可能であり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路および期間によって異なるが、当業者によって適宜選択可能であり、１日０．０００１～５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１～５０ｍｇ／ｋｇ投与することができる。投与は、１日に１回投与してもよく、数回分けて投与してもよい。前記投与量は、いかなる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に製剤化可能である。
本発明において、前記食品組成物は、各種食品類、例えば、飲料、ガム、お茶、ビタミン複合剤、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、お菓子、餠、パンなどの形態に製造できる。
本発明において、前記有効成分が食品組成物に含まれる時、その量は全重量の０．１～５０％の比率で添加することができるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記食品組成物が飲料形態に製造される場合、指示された比率で前記食品組成物を含む以外に特別な制限はなく、通常の飲料のように多様な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。具体的には、天然炭水化物として、ブドウ糖などのモノサッカライド、果糖などのジサッカライド、スクロースなどのおよびポリサッカライド、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖およびキシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールなどを含むことができる。前記香味剤としては、天然香味剤（ソーマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルリチンなど）および合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）などであってもよい。
本発明において、前記食品組成物は、様々な栄養剤、ビタミン、ミネラル（電解質）、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤、ペクチン酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などをさらに含んでもよい。
本発明において、前記成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。前記添加剤の比率は、本発明の核心的な要素に該当しないものの、本発明の食品組成物１００重量部あたり０．１～約５０重量部の範囲で選択できるが、これに限定されるものではない。
本発明において、前記化粧料組成物は、化粧水、栄養ローション、栄養エッセンス、マッサージクリーム、美容入浴添加剤、ボディローション、ボディミルク、バスオイル、ベビーオイル、ベビーパウダー、シャワージェル、シャワークリーム、サンスクリーンローション、サンスクリーンクリーム、日焼けクリーム、スキンローション、スキンクリーム、紫外線遮断用化粧品、クレンジングミルク、脱毛剤化粧用、フェイスおよびボディローション、フェイスおよびボディクリーム、皮膚美白クリーム、ハンドローション、ヘアローション、化粧用クリーム、ジャスミンオイル、入浴石けん、水石けん、美容石けん、シャンプー、手洗浄剤（ハンドクリーナー）、薬用石けん非医療用、クリーム石けん、フェイシャルウォッシュ、全身洗浄剤、頭皮洗浄剤、ヘアリンス、化粧石けん、歯美白用ゲル、歯磨き粉などの形態に製造できる。本発明の組成物は、化粧料組成物の製造に通常使用する溶媒や、適切な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含んでもよい。
本発明において、前記化粧料組成物内にさらに追加できる溶媒の種類は特に限定しないが、例えば、水、食塩水、ＤＭＳＯまたはこれらの組み合わせを使用することができる。また、担体、賦形剤または希釈剤としては、精製水、オイル、ワックス、脂肪酸、脂肪酸アルコール、脂肪酸エステル、界面活性剤、吸湿剤（ｈｕｍｅｃｔａｎｔ）、増粘剤、抗酸化剤、粘度安定化剤、キレート剤、緩衝剤、低級アルコールなどが含まれるが、これらに限定されるものではない。また、必要に応じて、美白剤、保湿剤、ビタミン、紫外線遮断剤、香料、染料、抗生剤、抗バクテリア剤、抗真菌剤を含むことができる。
本発明において、前記オイルとしては、水素化植物性油、ヒマシ油、綿実油、オリーブ油、パーム核油、ホホバ油、アボカド油が用いられ、ワックスとしては、密蝋、鯨蝋、カルナウバ、カンデリラ、モンテイン、セレシン、液体パラフィン、ラノリンが用いられる。
本発明において、前記脂肪酸としては、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸が用いられ、脂肪酸アルコールとしては、セチルアルコール、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、パンテノール、ラノリンアルコール、ステアリルアルコール、ヘキサデカノールが用いられ、脂肪酸エステルとしては、イソプロピルミリステート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレートが用いられる。界面活性剤としては、当業界で知られた陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤および非イオン性界面活性剤が使用可能であり、できる限り天産物由来の界面活性剤が好ましい。その他にも、化粧品分野で広く知られた吸湿剤、増粘剤、抗酸化剤などを含むことができ、これらの種類と量は当業界における公知のものによる。
［２．免疫関連疾患の予防、改善または治療方法］
本発明のさらに他の実施形態によれば、本発明による融合タンパク質；これをコードする核酸分子；前記核酸分子を含む発現ベクター；前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞；またはこれを含む組成物を個体に投与するステップを含む免疫関連疾患の予防、改善または治療方法に関する。
本発明において、前記融合タンパク質、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、組成物および免疫関連疾患に関連する内容は前記薬学組成物で記載したものと重複し、明細書の過度の複雑性を避けるために省略する。
本発明において、前記「個体」は、免疫関連疾患の発病が疑われる個体であって、前記免疫関連疾患発病の疑われる固体は、当該疾患が発病したか発病しうるヒトを含むネズミ、家畜などを含む哺乳動物を意味するが、本発明の融合タンパク質またはこれを含む前記組成物で治療可能な個体は制限なく含まれる。
本発明の方法は、融合タンパク質またはこれを含む組成物を薬学的有効量で投与することを含むことができる。好適な１日の総使用量は正しい医学的判断範囲内で処置医師によって決定可能であり、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物とともに使用されるか同時使用される薬物をはじめとする多様な因子と医薬分野でよく知られた類似因子によって異なって適用することが好ましい。
一方、これに限定されないが、前記免疫関連疾患の予防、改善または治療方法は、１つ以上の免疫関連疾患に対する治療的活性を有する化合物または物質を投与することをさらに含む併用療法であってもよい。
本発明において、前記「併用」は、同時、個別または順次投与を示すことが理解されなければならない。前記投与が順次または個別的な場合、２次成分投与の間隔は、前記併用の有利な効果を失わないようにするものでなければならない。
本発明において、前記融合タンパク質の投与用量は、患者の体重１ｋｇあたり約０．０００１μｇ～５００ｍｇであってもよいが、これに限定されるものではない。
本発明で提供する上記の融合タンパク質は、活性化されたＴ細胞に存在するＬｒｉｇ－１タンパク質に対するリガンドと相互作用して、活性化されたＴ細胞に同時抑制（ｃｏ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）シグナルを与えることで、前記活性化されたＴ細胞の死滅または活性の抑制を誘導することにより、免疫関連疾患を非常に効果的に予防、改善または治療することができる。
図１は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の構造を示す図である。 図２は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の構造を示す図である。 図３は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１タンパク質の発現程度を示す図である。 図４は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。 図５は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現程度を示す図である。 図６は、本発明の一実施例によるＬｒｉｇ－１、Ｌｒｉｇ－２およびＬｒｉｇ－３ ｍＲＮＡの発現程度を比較した結果をグラフで示す図である。 図７は、本発明の一実施例による制御性Ｔ細胞と非制御性Ｔ細胞内Ｌｒｉｇ－１タンパク質の発現レベルを比較した結果を示す図である。 図８は、本発明の一実施例による多様な免疫細胞の表面におけるＬｒｉｇ－１タンパク質の発現レベルを確認した結果を示す図である。 図９は、本発明の一実施例による融合タンパク質によって認識されるリガンドが存在するＴ細胞のサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）を示す図である。 図１０は、本発明の一実施例によるナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）と抗ＣＤ３／２８抗体を用いて活性化させた、活性化されたＴ細胞を融合タンパク質とＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧを用いて濃度ごとに染色した結果を示す図である。 図１１は、本発明の一実施例による活性化されたＴ細胞（Ａｃｔ）およびＴｈ１細胞（ＴＨ１）で免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を行った後、抗ＶＩＳＴＡ抗体を用いてウェスタンブロット分析を行った結果を示す図である。 図１２Ａおよび図１２ＢのＡおよびＢは、本発明の一実施例による細胞を抗ＣＤ３／２８抗体を用いて活性化させた後、ＶＩＳＴＡ抗体を用いて３０分間細胞表面に結合させた後、Ｌｒｉｇ－１－ＩｇＧを用いて細胞表面を染色してフローサイトメーターにより分析した結果（Ａ）と、活性化されたＴ細胞の表面に融合タンパク質を先に３０分間結合させた後、ＶＩＳＴＡ抗体を用いて細胞表面を染色した後、フローサイトメーターにより分析した結果（Ｂ）を示す図である。 図１３Ａおよび図１３ＢのＡおよびＢは、ナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３／２８抗体で活性化させた後、ＶＩＳＴＡ抗体を用いて２４時間ごとにＴ細胞の表面を染色して、フローサイトメーターによりＶＩＳＴＡの発現レベルの変化を測定した結果（Ａ）と、活性化されたＴ細胞の培養液に存在するＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの量を測定するために、２４時間ごとに培養液を回収した後、ＶＩＳＴＡ ＥＬＩＳＡキットを用いて前記細胞外ドメインの発現レベルを測定した結果（Ｂ）を示す図である。 図１４Ａおよび図１４ＢのＡおよびＢは、本発明の一実施例による正常マウスとリウマチ関節炎（ＲＡ）または炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が誘導されたマウス動物モデルから血液を抽出して遠心分離により血清を分離した後、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインをターゲットするＥＬＩＳＡを用いて前記血清内ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの濃度を測定した結果をグラフで示す図である。 図１５は、本発明の一実施例によるナイーブＴ細胞を活性化した後、細胞表面に誘導される表面タンパク質であるＣＤ２５の発現程度をＦＡＣＳで分析した結果を示す図である。 図１６Ａ、図１６Ｂ、図１６Ｃおよび図１７は、本発明の一実施例による融合タンパク質の活性化されたＴ細胞において本発明による融合タンパク質による増殖抑制効果を確認した結果を示す図である。
本発明の一実施形態によれば、配列番号２１で表されるアミノ酸配列からなる融合タンパク質；これをコードする核酸分子；前記核酸分子を含む発現ベクター；または前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を有効成分として含む免疫関連疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。
本発明の他の実施形態によれば、配列番号２５で表される塩基配列によってコードされる融合タンパク質；これをコードする核酸分子；前記核酸分子を含む発現ベクター；または前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞を有効成分として含む免疫関連疾患の予防、改善または治療用組成物を提供する。
以下、実施例を通じて本発明をより詳しく説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨によって本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって自明であろう。
［実施例］
［準備例１］Ｔ細胞の亜型細胞の培養
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）でのみＬｒｉｇ－１タンパク質が発現するかを確認するために、Ｔ細胞の亜型（ｓｕｂｓｅｔ）であるＴｈ０、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびｉＴｒｅｇを用意した。前記ｉＴｒｅｇは、自然的に分離したｎＴｒｅｇとは異なり、下記の組成を含む培地で分化を人工的に誘導した細胞を意味する。
Ｔ細胞の亜型はまず、ネズミの脾臓から得たナイーブ（ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞を分離した後、ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ｈｙｃｌｏｎｅ、ｌｏｇａｎ、ＵＴ）１０％を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｇｉｂｃｏ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）栄養培地に下記表２４の成分をそれぞれさらに含ませて、３７℃、５％ＣＯ２培養器内で７２時間培養によりそれぞれの細胞に分化誘導した。
［実施例１］Ｌｒｉｇ－１構造の分析
制御性Ｔ細胞の表面タンパク質であるＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインを含む融合タンパク質を作製するために、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインの３次元立体構造を予測した。
まず、抗原決定基（エピトープ）の塩基配列予測のためにＬｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメイン（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｄｏｍａｉｎ；ＥＣＤ）の構造を確認するために、Ｕｎｉｐｒｏｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）とＲＣＳＢ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）ツールを用いて３次元立体構造を予測した後、その結果を図１および２に示した。
図１に示すように、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ－ＬＲＲドメイン（アミノ酸配列４１～４９４番）内にはＬＲＲ１～ＬＲＲ１５の計１５個のロイシンリッチ領域が存在した。前記ＬＲＲドメインそれぞれは２３～２７個のアミノ酸から構成され、ロイシンは３～５個が存在した。
また、図２に示すように、Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインのうち、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のアミノ酸配列４９４～７８１番には免疫グロブリン様ドメインが３個存在した。
［実施例２］Ｌｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの制御性Ｔ細胞での特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞に特異的なバイオマーカーとして作用できるかを検証した。
前記検証のために、ネズミの脾臓からＣＤ４ビーズを通して磁気活性化細胞選別機（ｍａｇｎｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞を分離した。以後、ＣＤ２５抗体を用いて、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を用いて制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ）細胞および非制御性Ｔ（ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ）細胞を分離した。それぞれの細胞および前記準備例１で分化された細胞はＴｒｉｚｏｌを用いてｍＲＮＡを抽出した後、ゲノミックＲＮＡは、ｇＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、会社で提供したプロトコルにより、ｇＤＮＡを除去した。ｇＤＮＡの除去されたｍＲＮＡは、ＢＤｓｐｒｉｎｔ ｃＤＮＡ合成キット（Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ）によりｃＤＮＡに合成した。
前記ｃＤＮＡでＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現量を定量的に確認するためにリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ）を行った。
前記リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を用いて、会社で提供したプロトコルにより、９５℃で３分、６１℃で１５秒、７２℃で３０秒ずつ、４０サイクルの条件で、下記表２５のプライマーを用いて行い、相対的な遺伝子発現量はデルタＣＴ方法を用いて計算し、ＨＰＲＴを用いて規格化して、その結果を図４～６に示した。
図３に示すように、非制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５－ Ｔ ｃｅｌｌ）に比べて、制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ Ｔ ｃｅｌｌ）でＬｒｉｇ－１の発現が１８．１倍高いことが分かる。これは、従来知られている制御性Ｔ細胞のマーカーであるＬａｇ３およびＩｋｚｆ４と比較した時、約１０倍程度発現量が高いレベルであった。
また、図４および５に示すように、他の種類の免疫細胞に比べて、制御性Ｔ細胞、特に誘導された制御性Ｔ細胞（ｉＴｒｅｇ）に比べて、自然的に分離した制御性Ｔ細胞（ｎＴｒｅｇ）でＬｒｉｇ－１ ｍＲＮＡの発現が著しく高かった。
さらに、図６に示すように、Ｌｒｉｇファミリーに相当するＬｒｉｇ－１、Ｌｒｉｇ－２およびＬｒｉｇ－３の中でＬｒｉｇ－１の発現が最も高かった。
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞、特に自然的に存在する制御性Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
［実施例３］Ｌｒｉｇ－１タンパク質の制御性Ｔ細胞での特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１ ｍＲＮＡから発現したＬｒｉｇ－１タンパク質が制御性Ｔ細胞でのみ特異的に発現するかを確認した。
制御性Ｔ細胞特異的な転写因子であるＦＯＸＰ３プロモーターにＲＦＰ（Ｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）が結合したＦＯＸＰ３－ＲＦＰ注入（Ｋｎｏｃｋ－ｉｎ）ネズミを用いて、前記ネズミの脾臓から、ＣＤ４ビーズで磁石活性化セルソーティング（ｍａｇｎｅｔ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ；ＭＡＣＳ）を用いてＣＤ４＋ Ｔ細胞を分離した。以後、ＲＦＰタンパク質を用いて、蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）により制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＲＦＰ＋ Ｔ ｃｅｌｌ）および非制御性Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＲＦＰ－ Ｔ ｃｅｌｌ）を分離して得た。それぞれの前記細胞は、購入したＬｒｉｇ－１抗体および陰性対照群はアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）により染色して蛍光活性細胞分類機でＬｒｉｇ－１の発現量を測定して、その結果を図７に示した。
図７に示すように、点線で表される非制御性Ｔ細胞の場合、陰性対照群とほぼ同じＬｒｉｇ－１の発現レベルを見せたが、制御性Ｔ細胞の場合、Ｌｒｉｇ－１の発現レベルの高い細胞が多数存在した。
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞で特異的に発現することが分かる。
［実施例４］制御性Ｔ細胞の表面でのＬｒｉｇ－１タンパク質特異的発現の確認
Ｌｒｉｇ－１タンパク質が細胞治療のターゲットになるためには、制御性Ｔ細胞の表面で発現するかを確認した。
前記準備例１のそれぞれの分化されたＴ細胞の亜型を抗ＣＤ４－ＡＰＣおよび抗Ｌｒｉｇ－１－ＰＥ抗体で染色し、蛍光活性化セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いてそれぞれの細胞表面でＬｒｉｇ－１タンパク質の発現レベルを測定して、その結果を図８に示した。
図８に示すように、活性化されたＴ細胞（ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞およびナイーブ（Ｎａｉｖｅ）Ｔ細胞ではＬｒｉｇ－１の発現が０．７７～１５．３の量で発現するのに対し、分化が誘導されたＴ細胞（ｉＴｒｅｇ）では８３．９と高く発現した。
前記結果を通して、本発明によるＬｒｉｇ－１タンパク質は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の細胞で特異的に発現するだけでなく、特に前記制御性Ｔ細胞の表面で特異的にさらに高いレベルに発現することが分かる。
［製造例］融合タンパク質の作製
（１．発現ベクターの作製）
本発明による融合タンパク質を製造するために、下記表２６のそれぞれの融合タンパク質をコーディングする各核酸配列を合成した。核酸配列の５’末端と３’末端にそれぞれＮｈｅＩとＥｃｏＲＩ制限酵素配列を添加し、５’末端の制限酵素配列の後にコザック配列（Ｋｏｚａｋ’ｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＧＣＣＡＣＣ）と、タンパク質翻訳のための開始コドンと発現したタンパク質を細胞外に分泌させるマウスＩｇＧカッパ軽鎖シグナルペプチド（Ｍｏｕｓｅ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）（ＡＴＧＧＡＡＡＣＣＧＡＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＧＧ）を挿入した。以後、下記表２６のそれぞれの融合タンパク質をコーディングする核酸配列で、ヒト由来Ｌｒｉｇ－１タンパク質またはＶＩＳＴＡタンパク質の細胞外ドメイン；選択的に、リンカー；ヒンジ領域；ヒトＩｇＧ１由来の重鎖不変領域２（ＣＨ２）および重鎖不変領域３（ＣＨ３）；をコーディング化する核酸配列の後には終結コドンを挿入した。ＮｈｅＩとＥｃｏＲＩの２つの制限酵素配列を用いて本発明の融合タンパク質をコーディングする核酸配列をｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターにクローニングした。
（２．融合タンパク質の精製）
２９３Ｆ細胞にポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を用いて前記１．で作製した発現ベクターを形質転換させた後、３７℃および８％ＣＯ２条件下、６日間培養した。培養上澄液を濾過した後、タンパク質Ａレジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ ｒｅｓｉｎ）に流した後、１Ｘ ＰＢＳで洗浄した。ｐＨ３．５の０．１Ｍグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）溶液を用いて溶出した後、得られた溶液にｐＨ９．０の１Ｍ ＴＲＩＳ溶液を添加してｐＨ中和した。以後、溶液を透析してＰＢＳ溶液状態にした後、濃縮して使用した。
［実施例５］本発明による融合タンパク質によって認識されるＬｒｉｇ－１リガンドの分布の確認
前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質のリガンドが存在する免疫細胞を発掘するために、制御性Ｔ細胞のターゲットとされるナイーブＴ細胞（ｎａｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌ）から、活性化されたＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞またはＴｈ１７細胞に分化を誘導させた後、これらの細胞を前記製造例５の融合タンパク質（一次抗体）および抗ヒトＰＥ抗体（二次抗体）で染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）した。蛍光活性細胞分類機（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いてそれぞれの細胞表面における前記製造例５の融合タンパク質が結合したレベルを測定して、その結果を図９に示した。
図９に示すように、製造例５の融合タンパク質は、ナイーブＴ細胞の表面にある抗原（ａｎｔｉｇｅｎ）とほとんど結合せず、染色が弱く観察され（０．７１％）、活性化されたＴ細胞、Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞およびＴｈ１７細胞の表面にある抗原と前記製造例５の融合タンパク質は非常に高いレベルに結合して９６％以上染色されたことが観察された。
これを通して、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のリガンドは、Ｔ細胞レセプター（ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の刺激によって誘導される表面タンパク質であることが分かった。
［実施例６］活性化されたＴ細胞でのＬｒｉｇ－１タンパク質の発現レベルの確認
比較のために、従来活性化されたＴ細胞とＴ細胞のサブセットで高く発現することが知られたＰＤ－１を認知できるＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ融合タンパク質（製品名：ｒｍＢ７－Ｈ１／Ｆｃ Ｃｈｉｍｅｒａ、製造会社：Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｔ Ｎｏ．：１０１９－Ｂ７）（以下、「ＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧ」という。）；または前記製造例５の融合タンパク質でナイーブＴ細胞と活性化されたＴ細胞の表面に濃度依存的に染色し、細胞分類機を用いてそれぞれの細胞表面における前記製造例５の融合タンパク質が結合したレベルを測定して、その結果を図１０に示した。
図１０に示すように、ＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧで染色された比率に比べて製造例５の融合タンパク質で染色した時、濃度依存的に活性化されたＴ細胞の表面ではるかに高い発現レベルを確認した。
これを通して、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のリガンドがナイーブＴ細胞に比べて活性化されたＴ細胞あるいはＴ細胞のサブセットの表面に高い発現量で発現することを確認することができた。
［実施例７］活性化されたＴ細胞のＬｒｉｇ－１タンパク質のリガンドの確認
前記実施例６において、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のリガンドが活性化されたＴ細胞の表面で高く発現するという事実を確認した後、活性化されたＴ細胞で発現するリガンドがどのような分子であるかを確認するために、製造例５の融合タンパク質を用いて活性化されたＴ細胞およびＴｈ１細胞の細胞溶解物（ｃｅｌｌ ｌｙｓａｔｅ）を免疫沈降（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）させた。Ｌｒｉｇ－１タンパク質の候補リガンドの中で様々な抗体を用いて確認した結果、免疫チェックポイント（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ）であるＶＩＳＴＡ（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）の単クローン抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）によりウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）を行って、その結果を図１１に示した。
図１１に示すように、製造例５の融合タンパク質に結合する分子はＶＩＳＴＡであることが分かった。また、活性化されたＴ細胞（Ａｃｔ）とＴｈ１細胞（ＴＨ１）ですべて製造例５の融合タンパク質にＶＩＳＴＡが非常に高いレベルに結合することを確認することができた。これを通して、Ｌｒｉｇ－１タンパク質のリガンドがＶＩＳＴＡであることが分かる。
［実施例８］活性化されたＴ細胞のＶＩＳＴＡとＬｒｉｇ－１タンパク質との間の相互作用の確認
活性化されたＴ細胞の表面に存在するＶＩＳＴＡが直接的にＬｒｉｇ－１タンパク質と相互作用するかを確認するために、活性化されたＴ細胞の表面にＶＩＳＴＡ ｍＡｂを濃度依存的に結合させた後、製造例５の融合タンパク質を用いて染色した後、セルソーター（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｅｒ；ＦＡＣＳ）を用いて染色程度を確認し、その結果を図１２のＡおよびＢに示した。
図１２のＡに示すように、製造例５の融合タンパク質のみを通して細胞表面を染色した時には９５％程度の結合率を示すのに対し、濃度依存的にＶＩＳＴＡ ｍＡｂを先に結合させた場合、競争的阻害（ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ）によって製造例５の融合タンパク質の結合する比率が著しく低くなることを確認することができた。
これとは逆に、図１２のＢに示すように、活性化されたＴ細胞の表面に製造例５の融合タンパク質を先に結合させ、ＶＩＳＴＡ ｍＡｂを結合させた場合にも、ＶＩＳＴＡの染色比率が減少することを確認することができた。
これを通して、活性化されたＴ細胞の表面でＶＩＳＴＡが発現し、これをＬｒｉｇ－１タンパク質が認知して互いに相互作用をすることが分かった。
［実施例９］Ｔ細胞の表面におけるＶＩＳＴＡの発現パターンの確認
Ｔ細胞の表面におけるＶＩＳＴＡの発現パターンを確認するために、マウスナイーブＴ細胞を抗ＣＤ３／２８抗体で活性化させた後、各時間のＶＩＳＴＡの発現レベルを確認した。その結果を図１３のＡに示した。
図１３のＡに示すように、活性化７２時間目まではＶＩＳＴＡの発現レベルがますます増加したが、９６時間経過後からは表面で発現レベルが次第に減少することが確認された。
上記現象の原因を確認するために、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインを認知するＥＬＩＳＡにより活性化されたＴ細胞の細胞培養培地に存在するＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの発現レベルを時間ごとに測定して、その結果を図１３のＢに示した。
図１３のＢに示すように、活性化後７２時間経過するまでは前記培養培地でＶＩＳＴＡの細胞外ドメインがほとんど検出されなかったが、９６時間経過後から前記培養培地内でＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの発現レベルが急激に増加することを確認することができた（図１３（Ｂ））。すなわち、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの発現レベルは、活性化されたＴ細胞の表面に存在するＶＩＳＴＡの発現レベルとは正反対のパターンを示すことから、前記培養培地内のＶＩＳＴＡ細胞外ドメインは、活性化されたＴ細胞の表面に存在するＶＩＳＴＡが切断されて分泌されたものであることが分かった。
［実施例１０］ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの分泌と自己免疫疾患の発病との間の相関関係の確認
ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの分泌と自己免疫疾患の発病との間の相関関係を究明するために、リウマチ関節炎（Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ、ＲＡ）または炎症性腸疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）の自己免疫疾患が誘導されたマウス動物モデルの血清を用意した後、ＶＩＳＴＡ特異的な抗体を用いて前記血清内に存在するＶＩＳＴＡ細胞外ドメインの量をＥＬＩＳＡで分析して、その結果を図１４に示した。
図１４に示すように、正常なマウスの血清と比較して前記ＲＡまたはＩＢＤ自己免疫疾患が誘導されたマウスの血清において、ＶＩＳＴＡ細胞外ドメインが多量検出されることを確認することができた。
［実施例１１］ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインの分泌と自己免疫疾患の発病との間の相関関係の確認
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からナイーブＴ細胞であるＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞を分離した後、プレートに固相化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｍＡｂを用いて前記ナイーブＴ細胞を活性化させた後、Ｔ細胞の活性化程度をＴ細胞表面に誘導発現するＣＤ２５表面タンパク質の発現程度をＦＡＣＳで分析して、その結果を図１５に示した。図１５に示すように、Ｔ細胞の活性化を抑制する比較群としては、臨床で使用されている免疫抑制剤のシクロスポリン（ＣｓＡ）を処理すると、Ｔ細胞の活性化が阻害されて、ＣＤ２５の発現が４３．１％から０．３３％に減少することが分かった。
これを通して、ＶＩＳＴＡを前記ＶＩＳＴＡのリガンドであるＬｒｉｇ１－ＩｇＧで刺激した時、活性化されたＴ細胞に共抑制シグナルが発生してＴ細胞の活性化が著しく阻害され、製造例５の融合タンパク質のＴ細胞の活性化の阻害程度はＰＤ－１を刺激するＰＤ－Ｌ１－ＩｇＧよりさらに優れていることが分かる。
さらに、ＶＩＳＴＡの細胞外ドメインまたはその断片；またはＶＩＳＴＡの細胞外ドメインまたはその断片；および免疫グロブリンを含む融合タンパク質と、前記製造例５の融合タンパク質を併用して投与する場合には、Ｔ細胞に共抑制シグナルがさらに効率的に誘導されてＴ細胞の活性化をさらに効果的に誘導できることが分かる。
［実施例１２］本発明による融合タンパク質の免疫関連疾患の治療効果
８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾臓からナイーブＴ細胞であるＣＤ４＋ＣＤ６２Ｌ＋ Ｔ細胞を分離した後、プレートに固相化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ ｍＡｂを用いて前記ナイーブＴ細胞を活性化させた後、前記活性化されたＴ細胞を９６ウェルプレートに分注した。その後、前記９６ウェルプレートに１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３ ｍＡｂと、１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌまたは１０μｇ／ｍｌの濃度に相当する製造例５の融合タンパク質を処理した後、ＣＳＦＥを用いて染色した後、ＦＡＣＳで観察する方式で細胞の増殖程度を分析して、その結果を図１６および図１７に示した。この時、対照群としては、製造例５の融合タンパク質の代わりに抗ＦＬＡＧ抗体を使用した。
図１７および図１８に示すように、対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＣＤ３単独で処理された場合には、活性化されたＴ細胞の増殖の抑制程度が最大７．８７％または９．８２％に相当するのに対し、製造例５の融合タンパク質であるＬｒｉｇ－１－ＩｇＧ（ｍＬ１－ｈＦｃ）を処理した場合には、５μｇ／ｍｌの濃度では１８．１７％、１０μｇ／ｍｌの濃度では４７．６０％の活性化されたＴ細胞の増殖が抑制されることを確認した（図１７および図１８）。
これを通して、本発明による融合タンパク質が処理された時、活性化されたＴ細胞に共抑制シグナルが発生してＴ細胞の活性化が著しく阻害可能であり、これによって、活性化されたＴ細胞によって発生する免疫関連疾患の予防、改善または治療に非常に効果的に適用可能である。
以上、本発明について詳しく説明したが、本発明の権利範囲はこれに限定されるものではなく、請求の範囲に記載の本発明の技術的思想を逸脱しない範囲内で多様な修正および変形が可能であることは、当技術分野における通常の知識を有する者には自明であろう。
本発明で提供する上記の融合タンパク質は、活性化されたＴ細胞に存在するＬｒｉｇ－１タンパク質に対するリガンドと相互作用して、活性化されたＴ細胞に共抑制シグナルを与えることで、前記活性化されたＴ細胞の死滅または活性の抑制を誘導することにより、免疫関連疾患の予防、改善または治療分野に非常に効果的に使用できる。

Claims (20)

  1. Ｌｒｉｇ－１（ｌｅｕｃｉｎｅ－ｒｉｃｈ ａｎｄ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｄｏｍａｉｎｓ １）タンパク質の細胞外ドメインおよび免疫グロブリンＦｃ領域を含む融合タンパク質であって、活性化されたＴ細胞に存在するＬｒｉｇ－１タンパク質に対するリガンドと相互作用することができる、融合タンパク質；
    前記融合タンパク質をコードする核酸分子；
    前記核酸分子を含む発現ベクター；または
    前記発現ベクターが形質転換された宿主細胞
    を有効成分として含む、免疫関連疾患の予防または治療用薬学組成物であって、
    前記免疫関連疾患が、自己免疫疾患；移植片対宿主疾患；臓器移植拒絶反応；喘息；アトピー；または急性または慢性の炎症性疾患からなる群より選択される少なくともいずれか１つである、薬学組成物。
  2. 前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインが、配列番号１または３で表されるアミノ酸配列からなる、請求項１に記載の薬学組成物。
  3. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４ドメインからなる群より選択される１～４個のドメインを含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  4. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来Ｆｃ領域、重鎖不変領域２（ＣＨ２）、重鎖不変領域３（ＣＨ３）、ヒンジ、その断片、それらのコンビネーション、またはそれらの組み合わせを含むハイブリッドＦｃである、請求項１に記載の薬学組成物。
  5. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  6. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４由来のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  7. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ヒンジ領域を含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  8. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはアバタセプト（Ａｂａｔａｃｅｐｔ）由来のヒンジ領域を含む、請求項７に記載の薬学組成物。
  9. 前記ヒンジ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤまたはアバタセプト由来のヒンジ領域を含む、請求項７に記載の薬学組成物。
  10. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号５または６で表されるＣＨ２およびＣＨ３を含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  11. 前記免疫グロブリンＦｃ領域が、配列番号７～１０のうちのいずれか１つで表されるヒンジ領域を含む、請求項１に記載の薬学組成物。
  12. 前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインが、前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に直接連結される、請求項１に記載の薬学組成物。
  13. 前記Ｌｒｉｇ－１タンパク質の細胞外ドメインが、リンカーを介して前記免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に連結される、請求項１に記載の薬学組成物。
  14. 前記リンカーが、配列番号１１で表されるペプチドリンカー；および配列番号１２で表されるペプチドリンカー；のうちの少なくとも１つである、請求項１３に記載の薬学組成物。
  15. 前記リンカーが、下記式１～４で表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の薬学組成物：
    （式１） （Ｇ）ｎ
    （式２） （ＧＧＧＧＳ）ｍ
    （式３） （ＥＡＡＡＫ）ｐ
    （式４） （ＸＰ）ｑ
    ｎ、ｍおよびｐは、それぞれ独立して、１以上の整数であり；
    ｑが、５～４０の整数であり；
    Ｘが、Ａ（Ａｌａ）、Ｃ（Ｃｙｓ）、Ｄ（Ａｓｐ）、Ｅ（Ｇｌｕ）、Ｆ（Ｐｈｅ）、Ｇ
    （Ｇｌｙ）、Ｈ（Ｈｉｓ）、Ｉ（Ｉｌｅ）、Ｋ（Ｌｙｓ）、Ｌ（Ｌｅｕ）、Ｍ（Ｍｅｔ）、Ｎ（Ａｓｎ）、Ｏ（Ｐｙｌ）、Ｐ（Ｐｒｏ）、Ｑ（Ｇｌｎ）、Ｒ（Ａｒｇ）、Ｓ（Ｓｅｒ）、Ｔ（Ｔｈｒ）、Ｕ（Ｓｅｃ）、Ｖ（Ｖａｌ）、Ｗ（Ｔｒｐ）およびＹ（Ｔｙｒ）からなる群より選択されるいずれか１つのアミノ酸である。
  16. 前記リンカーが、配列番号９６～配列番号１００で表されるペプチドリンカーからなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１３に記載の薬学組成物。
  17. 前記薬学組成物は、ＶＩＳＴＡ（Ｖ－ｄｏｍａｉｎ Ｉｇ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）またはその一断片；または
    ＶＩＳＴＡまたはその一断片と、免疫グロブリンＦｃ領域とを含む融合タンパク質；をさらに含むものである、請求項１に記載の薬学組成物。
  18. 前記自己免疫疾患は、リウマチ性関節炎、第１型糖尿、全身性強皮症、全身性エリテマトーデス、アトピー皮膚炎、乾癬、円形脱毛症、喘息、クローン病、ベーチェット病、シェーグレン症候群、ギラン・バレー症侯群、慢性甲状腺炎、多発性硬化症、多発性筋炎、強直性脊椎炎、線維筋痛症および結節性多発性動脈炎から構成された群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の薬学組成物。
  19. 前記自己免疫疾患は、神経退行性疾患または神経炎症性疾患である、請求項１に記載の薬学組成物。
  20. 前記神経退行性疾患または神経炎症性疾患は、脳卒中、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ニーマン・ピック病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、前頭側頭認知症、レビー小体型認知症、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍随伴症候群
    （Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、皮質基底核変性症、多系統萎縮病、進行性核上性麻痺、神経系自己免疫疾患、脊髄小脳失調（ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ ａｔａｘｉａ）、炎症性および神経病症性痛み、脳血管疾患、脊髄損傷（ｓｐｉｎａｌ ｃｏｒｄ ｉｎｊｕｒｙ）およびタウオパチー病からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１９に記載の薬学組成物。
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