CN108070616B - 一种低压基因枪介导的植物原位转化方法 - Google Patents
一种低压基因枪介导的植物原位转化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物学和生物技术领域，公开了一种低压基因枪介导的植物原位转化的方法。本方法是将植物去除顶端生长组织，待其伤口形成愈伤组织作为受体，利用低压基因枪轰击将外源DNA转化进入愈伤组织细胞，通过愈伤组织分化丛生芽从而获得转基因再生芽。与传统的结合组培的农杆菌介导的植物遗传转化相比，本发明避免了困难重重的组织培养过程，通过简易的基因枪就可以实现外源DNA的遗传转化，为植物的遗传转化提供了新的技术平台，同时本发明也建立了一种新的植物再生体系，为植物发育生物学研究提供了供试***。
Description
技术领域：
本发明属于生物学和生物技术领域，涉及了一种植物细胞原位器官再生结合低压基因枪的遗传转化方法。
背景技术
转基因技术在基因水平上打破了常规生物的种属界限，实现了不同物种间遗传物质的重组，大大提高了育种工作的效率，为改良生物或利用生物体作为生物反应器等提供了新的途径。自1983年第一株转基因植物诞生以来，植物转基因技术得到了迅速发展，通过转基因技术培育出的高产量、高品质的农作物新品种及生物药等已成功应用到人类日常生活中。并且该技术在很多方面的应用前景非常广阔，如抗除草剂，抗病虫害，抗逆，生物反应器，功能食品，生物材料甚至生物质能源等，从而为解决人口、粮食、能源和环境等重重危机提供新的途径。
高效的植物遗传转化技术是转基因的重要环节。在短短的几十年中植物遗传转化技术发展异常迅速，归纳起来，植物遗传转化技术可分为直接转化(包括PEG介导法、脂质体介导法、电击法、基因枪轰击法、微针注射法、超声波介导法、脉冲电泳法、激光微束法、碳硅纤维导入法、离子束介导法)、间接转化法(农杆菌介导法、病毒介导法、染色体介导的直接转化)和生殖细胞转化法(花粉管通道法、花粉介导法、种胚浸泡法)。实际工作中常用的方法有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。
农杆菌介导法是利用具有天然感染植物细胞能力的根癌农杆菌，将外源DNA导入植物细胞核基因组中，并进行整合表达的转化方法。该方法应用广泛，但要依靠转化细胞的再生，即组织培养过程获得转基因植株。植物组培的难易受基因型的影响较大，同一物种的某些基因型易于组培，而另外一些基因型很难组培成功。况且有些物种，目前还难于进行组织培养。因此植物再生体系是限制农杆菌介导的植物遗传转化进一步发展应用的瓶颈。
花粉管通道法是将含有目的基因的DNA溶液注射进入花粉管，对尚未发育完全的胚胎细胞进行转化，通过观察后代的变异，最终筛选出转基因植株。该方法简单、方便、育种时间短，但是只适用于开花植物。目前只有棉花、拟南芥应用成熟。
基因枪法又称生物弹法或微粒枪法、微粒轰击法，是依赖高速度的金、钨或其他惰性金属颗粒微粒将外源基因引入活体细胞的一种转化技术，广泛应用于对农杆菌侵染不敏感的植物的遗传转化中。基因枪转化法相对于农杆菌介导法方法而言操作简便快速，可控度高，对DNA的转移过程与基因型的依赖性没有任何生物限制，由于能够产生微创伤有利于基因转移而具有相对高的转化率，能够转移多拷贝的重组DNA或者DNA片段(基因)。但传统基因枪设备昂贵，技术难，转基因植物培养的设备成本和人力成本居高不下，在一定程度上阻碍了转基因技术的推广和应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种全新的低压基因枪介导的植物遗传转化方法，利用植物的原位愈伤组织分化，获得转基因再生苗，既降低了基因枪法的使用成本，又避免了细胞再生的组培过程，简化转基因再生步骤，减低转基因植物培养成本，应用本方法可以快速建立各种植物的遗传转化体系。
本发明可通过如下技术方案实现：一种低压基因枪介导植物原位转化方法，包括外源DNA准备、低压基因枪轰击植物原位愈伤组织、愈伤组织原位分化形成转基因再生芽。
所述外源DNA准备为：用外源DNA包埋钨粉微粒。
所述外源DNA包埋钨粉微步骤包括：制备钨粉母液，制备亚精胺溶液，DNA包裹
钨粉微粒。
所述低压基因枪轰击植物原位愈伤组织的方法为：将用外源DNA包埋的钨粉微粒
滴至枪口金属网表面，打开气阀，压缩气体急速进入枪管而形成一个冲击波，将枪口金
属网上的DNA微粒射出进入植物愈伤组织。
所述低压基因枪轰击植物原位愈伤组织的条件为：枪头距离愈伤组织1cm，轰击压
力为0.3MPa。
所述钨粉母液制备方法为：
(1)称40mg钨粉于1.5ml EP管中，加入1ml100％乙醇；
(2)漩涡震荡使钨粉充分混匀，离心使其沉淀；
(3)倒掉乙醇，重复步骤2两次；
(4)最后一次离心后，去除乙醇，加入1ml无菌水漩涡震荡使之重悬；
(5)将钨粉以50μl分装于无菌的EP管中，分装时注意不断混合以保持钨粉颗粒处于悬浮状态，分装后保存在-20℃。
所述亚精胺溶液制备方法为：
(1)将装有1g亚精胺的瓶子置于65℃水浴锅中加热使之融化；
(2)用移液枪取14μl溶液分装于无菌的1.5ml离心管中，-20℃储存待用。
所述DNA包裹钨粉微粒方法为：
(1)从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻；
(2)加入986μL无菌水，漩涡震荡混合；
(3)用1ml过滤器和过滤器滤头将溶液过滤到无菌的1.5ml离心管中，制成0.1mol/L亚精胺溶液；
(4)从冰箱中取出一管50μL的钨粉并使之解冻；
(5)沿装有钨粉的离心管管壁，加入5μl浓度为1μg/μL的DNA溶液，立即漩涡震荡使钨粉和DNA充分混合；
(6)然后将50μL 2.5mol/L CaCl2和20μL 0.1mol/L亚精胺加入到离心管管盖中，盖好盖子，颠倒离心管使CaCl2和亚精胺与钨粉颗粒混合，立刻漩涡震荡使所有组分充分混合；
(7)管子在冰上放置1min，然后于1957g离心不超过30s，使钨粉沉淀；
(8)去除上清液，加入250μL 100％乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后漩涡震荡，这个过程是洗涤包埋了DNA的钨粉颗粒；
(9)1957g离心不超过30s沉淀钨粉颗粒，去除上清，加入60μL 100％乙醇；
(10)漩涡震荡重悬钨粉颗粒，得到DNA包埋的钨粉微粒。
所述植物为：番茄、大豆、棉花、桑树、百脉根、花生、向日葵、番薯、马铃薯、苹果、烟草、薄荷、油菜、黄瓜或拟南芥。
植物原位愈伤组织的制备方法为：取生长健壮的植物去除顶端生长点，并不断去除腋芽生长点，伤口处形成愈伤组织。
愈伤组织原位分化成芽方法为：将低压基因枪轰击过的植物置于温室中，进行常规的苗期管理，20-30天，愈伤组织原位分化成芽，不同植物原位分化时间不同。
有益效果说明：
本发明采用自制、简易低压基因枪对植物进行遗传转化，具有如下优点：
1)无需进行植物离体组织培养，避免摸索复杂的组培条件，原位愈伤组织培养操作简单，对操作人员要求低；
2)自制简易低压基因枪，使用成本远低于传统基因枪，利于转基因技术的广泛推广与应用。
本发明构建了一种简便、高效的植物遗传转化方法，尤其是番茄遗传转化方法。利用该方法可以使尚未组培成功的植物品种快速建立转化体系，为研究植物再生的发育生物学提供了新的研究体系，为植物的遗传转化提供一个新的技术平台，可大大加快植物遗传转化相关产业发展。
附图说明
图1部分再生植株PCR检测结果
具体实施方式
下面具体实施方式是对本发明进行详细说明，下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
以下除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待的试剂及仪器，都可来自常规市售产品。
实施例1外源DNA准备
1.制备钨粉母液
(1)称40mg钨粉于1.5mlEP管中，加入1ml100％乙醇。
(2)漩涡震荡使钨粉充分混匀，离心使其沉淀。
(3)倒掉乙醇，重复步骤2两次。
(4)最后一次离心后，去除乙醇，加入1ml无菌水漩涡震荡使之重悬。
(5)将钨粉以50μl分装于无菌的EP管中，分装时注意不断混合以保持钨粉颗粒处于悬浮状态，分装后保存在-20℃。
2.亚精胺制备
(1)将装有1g亚精胺的瓶子置于65℃水浴锅中加热使之融化。
(2)用移液枪取14μl溶液分装于无菌的1.5ml离心管中，-20℃储存待用。
1.1.3钨粉微粒的包裹
(1)从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻。
(2)加入986μL无菌水，漩涡震荡混合。
(3)用1ml过滤器和小的过滤器滤头(Minisart 0.2μm过滤器，Sartorius)将溶液过滤到无菌的1.5ml离心管中，制成0.1mol/L亚精胺溶液。
(4)从冰箱中取出一管50μL的钨粉并使之解冻。
(5)沿装有钨粉的离心管管壁，加入5μl DNA(1μg/μL)，立即漩涡震荡使钨粉和DNA充分混合。
(6)然后将50μL 2.5mol/L CaCl2和20μL 0.1mol/L亚精胺加入到离心管管盖中，盖好盖子，颠倒离心管使CaCl2和亚精胺与钨粉颗粒混合(颠倒离心管之前不能让CaCl2和亚精胺与钨粉颗粒混合)，立刻漩涡震荡使所有组分充分混合。
(7)管子在冰上放置1min，然后于1957g离心不超过30s，使钨粉沉淀。
(8)去除上清液，加入250μL 100％乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后漩涡震荡，这个过程是洗涤包埋了DNA的钨粉颗粒。
(9)1957g离心不超过30s沉淀钨粉颗粒，去除上清，加入60μL 100％乙醇。
(10)漩涡震荡重悬钨粉颗粒。DNA包埋的钨粉微粒即微载体已制备完毕。
实施例2低压基因枪转化
(1)播种番茄microTOM种子35天后，选取长势相同、具有6片叶子的植株，水平去头。为防止去头伤口干燥，伤口处用保鲜膜密封。此后及时剔除萌发的腋芽。
(2)在轰击愈伤组织前，基因枪先空轰击两次。
(3)在枪头过滤网上滴加20μL DNA钨粉颗粒轰击愈伤组织，为提高DNA转化量，两次轰击以90°角转动番茄苗。枪头距离愈伤组织1cm。轰击压力为0.3MPa。(4)低压基因枪轰击后，继续剔除植株腋芽，直至去头伤口形成愈伤组织并分化丛生芽。
1.3再生芽的PCR检测
取再生芽叶片，CTAB法提取总DNA，用35s启动子的引物进行检测，上游引物为GCTCCTACAAATGCCATCA，下游引物为GATAGTGGGATTGTGCGTCA。PCR反应程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。
部分再生植株PCR检测结果如图1，其中1-5为本实施例检测样品，-为未转化microTOM的阴性对照，+为质粒阳性对照，M为DNA maker。部分检测样本可扩增出195bp条带，可初步说明本发明的方法可以实现外源基因的转化。
低压基因***备方法参考中国实用新型专利201020010285.4。
实施例3
1农杆菌介导与低压基因枪介导的番茄原位转化效果对比实验
1.1番茄受体的准备
播种番茄microTOM种子35天后，选取长势相同、具有6片叶子的植株，水平去头。为防止去头伤口干燥，伤口处用保鲜膜密封。此后及时剔除萌发的腋芽。
1.2农杆菌介导的原位转化
在平板上挑取农杆菌EHA105(含有pBI121质粒)单克隆，接种到含有50mg/L的利福平和50mg/L的卡那霉素2ml液体YEB培养基，28℃，250rpm培养1-2d直至OD600为0.6；取1ml菌液接入100mlYEB培养基中继续培养，直至OD600为0.5。将菌液离心，收集菌体，用MS液体培养基重悬。将重悬菌液滴加在10株番茄去头伤口上，每株滴加20ul。继续培养番茄，直至去头伤口形成愈伤组织并萌发丛生芽。
1.3低压基因枪介导的原位转化
在枪头过滤网上滴加20μL pBI121质粒钨粉颗粒，轰击10株番茄去头伤口。每个植株轰击两次，两次轰击以90°角转动番茄苗。枪头距离愈伤组织1cm，轰击压力为0.3MPa。低压基因枪轰击后，继续剔除植株腋芽，直至去头伤口形成愈伤组织并分化丛生芽。
1.4再生芽的PCR检测
取所有再生芽叶片，分别用CTAB法提取总DNA，用35s启动子的引物进行检测，上游引物为GCTCCTACAAATGCCATCA，下游引物为GATAGTGGGATTGTGCGTCA。PCR反应程序：94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环，最后72℃延伸10min。可以扩增出195bp条带的植株为转化成功植株。检测结果见表1。从表1可以看出，低压基因枪介导的番茄原位转化率为17.4％，明显高于农杆菌介导的方法。
表1低压基因枪与农杆菌介导的番茄原位转化效果
本发明通过非组培的方法，实现了番茄的原位再生，并使之与低压基因枪介导法相结合实现了番茄的遗传转化，转化效果明显优于传统的农杆菌介导的遗传转化，为实现各种植物快速、工厂化的再生与转化提供了一条捷径。
Claims (9)
1.一种低压基因枪介导植物原位转化方法，包括外源DNA准备、低压基因枪轰击植物原位愈伤组织、愈伤组织原位分化形成转基因再生芽，其特征在于，所述植物原位愈伤组织的获得方法包括如下步骤：1)植株水平去除顶端生长点；2)伤口处用保鲜膜密封；3)剔除萌发的腋芽。
2.根据权利要求1所述的低压基因枪介导植物原位转化方法，其特征在于所述外源DNA准备为：用外源DNA包埋钨粉微粒。
3.根据权利要求2所述的转化方法，所述外源DNA包埋钨粉微粒步骤包括：制备钨粉母液，制备亚精胺溶液，DNA包裹钨粉微粒。
4.根据权利要求1所述的转化方法，所述低压基因枪轰击植物原位愈伤组织的方法为：将用外源DNA包埋的钨粉微粒滴至枪口金属网表面，打开气阀，压缩气体急速进入枪管而形成一个冲击波，将枪口金属网上的DNA微粒射出进入植物愈伤组织。
5.根据权利要求4所述的方法，所述低压基因枪轰击植物原位愈伤组织的条件为：枪头距离愈伤组织1cm，轰击压力为0.3MPa。
6.根据权利要求3所述的转化方法，钨粉母液制备方法为：
(1)称40mg钨粉于1.5ml EP管中，加入1ml100％乙醇；
(2)漩涡震荡使钨粉充分混匀，离心使其沉淀；
(3)倒掉乙醇，重复步骤2两次；
(4)最后一次离心后，去除乙醇，加入1ml无菌水漩涡震荡使之重悬；
(5)将钨粉以50μl分装于无菌的EP管中，分装时注意不断混合以保持钨粉颗粒处于悬浮状态，分装后保存在-20℃。
7.根据权利要求3所述的转化方法，亚精胺溶液制备方法为：
(1)将装有1g亚精胺的瓶子置于65℃水浴锅中加热使之融化；
(2)用移液枪取14μl溶液分装于无菌的1.5ml离心管中，-20℃储存待用。
8.根据权利要求3所述的转化方法，DNA包裹钨粉微粒方法为：
(1)从冰箱中取出亚精胺，并使其解冻；
(2)加入986μL无菌水，漩涡震荡混合；
(3)用1ml过滤器和过滤器滤头将溶液过滤到无菌的1.5ml离心管中，制成0.1mol/L亚精胺溶液；
(4)从冰箱中取出一管50μL的钨粉并使之解冻；
(5)沿装有钨粉的离心管管壁，加入5μl浓度为1μg/μL的DNA溶液，立即漩涡震荡使钨粉和DNA充分混合；
(6)然后将50μL 2.5mol/L CaCl2和20μL 0.1mol/L亚精胺加入到离心管管盖中，盖好盖子，颠倒离心管使CaCl2和亚精胺与钨粉颗粒混合，立刻漩涡震荡使所有组分充分混合；
(7)管子在冰上放置1min，然后于1957g离心不超过30s，使钨粉沉淀；
(8)去除上清液，加入250μL 100％乙醇，用枪头轻轻吹打混匀，然后漩涡震荡，这个过程是洗涤包埋了DNA的钨粉颗粒；
(9)1957g离心不超过30s沉淀钨粉颗粒，去除上清，加入60μL 100％乙醇；
(10)漩涡震荡重悬钨粉颗粒，得到DNA包埋的钨粉微粒。
9.权利要求书1所述一种低压基因枪介导植物原位转化方法，所述植物为：番茄。
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