JP7315243B2 - エクソソームの製造方法 - Google Patents
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Description
〔1〕(i)エクソソームを含む生体試料を限外濾過する工程、及び、(ii)工程(i)から得ることができる試料を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、を含む、エクソソームの製造方法。
〔2〕限外濾過における限外濾過フィルターが、タンジェンシャルフローフィルターである、〔1〕に記載の製造方法。
〔3〕限外濾過フィルターが、約0.06μm~約0.07μmのフィルター孔径を有する、〔2〕に記載の製造方法。
〔4〕前記タンジェンシャルフローフィルターが、約750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、〔2〕に記載の製造方法。
〔5〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用する陰イオン交換体が弱塩基性陰イオン交換体である、〔1〕に記載の製造方法。
〔6〕前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである、〔5〕に記載の製造方法。
〔7〕前記弱塩基性陰イオン交換体がフェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、〔5〕または〔6〕に記載の製造方法。
〔8〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行われるものである、〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の製造方法。
〔9〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、〔1〕~〔8〕のいずれかに記載の製造方法。
〔10〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7で行わるものである、〔1〕~〔9〕のいずれかに記載の製造方法。
〔11〕さらに、(iii)前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出液のゼータ電位を測定する工程を含む、〔1〕~〔10〕のいずれかに記載の製造方法。
〔12〕生体試料からエクソソームを製造する方法であって、
(i)生体試料に対して遠心分離を行って該試料から夾雑物を除去し、その後上清を得る工程、
(ii)工程(i)で得られた上清を限外濾過し、上清を濃縮する工程、及び、
(iii)工程(ii)で得られた濃縮液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、
を含む方法。
〔13〕工程(i)が、10,000×gで30分間の遠心分離を行うことを含む、〔12〕に記載の方法。
〔14〕限外濾過における限外濾過フィルターは、タンジェンシャルフローフィルターである、〔12〕に記載の方法。
〔15〕限外濾過フィルターが、約0.06μm~約0.07μmのフィルター孔径を有する、〔12〕に記載の方法。
〔16〕前記タンジェンシャルフローフィルターが、約750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、〔12〕に記載の方法。
〔17〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が、弱塩基性陰イオン交換体である、〔12〕に記載の方法。
〔18〕前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである、〔17〕に記載の方法。
〔19〕前記弱塩基性陰イオン交換体が、フェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、〔17〕または〔18〕に記載の方法。
〔20〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行わるものである、〔12〕~〔19〕のいずれかに記載の方法。
〔21〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、〔12〕~〔20〕のいずれかに記載の方法。
〔22〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7で行わるものである、〔12〕~〔21〕のいずれかに記載の方法。
〔23〕さらに、(iv)前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出液のゼータ電位を測定する工程を含む、〔12〕~〔22〕のいずれかに記載の製造方法。
〔24〕〔1〕~〔23〕のいずれかに記載の方法により製造されたエクソソームであって、直径が60nm未満の粒子及び220nmより大きい粒子が本質的に排除されているエクソソームを含むエクソソームペレット、または該エクソソームペレットが再懸濁された生理的溶液。
〔25〕陰イオン交換カラムクロマトグラフィーを備えることを特徴とする、生体試料からエクソソームを製造するシステム。
〔26〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用する陰イオン交換体が弱塩基性陰イオン交換体である、〔25〕に記載のシステム。
〔27〕前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである、〔26〕に記載のシステム。
〔28〕前記弱塩基性陰イオン交換体がフェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、〔26〕または〔27〕に記載のシステム。
〔29〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行わるものである、〔25〕~〔28〕のいずれかに記載のシステム。
〔30〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、〔25〕~〔29〕のいずれかに記載のシステム。
〔31〕前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7で行わるものである、〔25〕~〔30〕のいずれかに記載のシステム。
〔32〕さらに、限外濾過フィルターを備えることを特徴とする、〔25〕~〔31〕のいずれかに記載のシステム。
〔33〕限外濾過フィルターが、タンジェンシャルフローフィルターである、〔32〕に記載のシステム。
〔34〕限外濾過フィルターが、約0.06μm~約0.07μmのフィルター孔径を有する、〔32〕に記載のシステム。
〔35〕前記タンジェンシャルフローフィルターが、約750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、〔33〕に記載のシステム。
〔36〕さらに、遠心分離装置を備える、〔25〕~〔35〕のいずれかに記載のシステム。
〔37〕さらに、ゼータ電位測定装置を備える、〔25〕~〔36〕のいずれかに記載のシステム。
本発明を以下の実施例及び試験例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例及び試験例は説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
H-2Kd制限及び変異(m)ERK2 136-144ペプチド-特異的TCR(Vα10.1/Jα48及びVβ8.3/Dβ2.1/Jβ2.6)遺伝子を導入したDUC18マウスは、三重大学の実験動物施設で飼育し、8~10週齢で使用した。I-Ab制限及びOVA 323-339ペプチド-特異的TCR-遺伝子を組換えたOT-IIマウスは、Charles River社から購入した。本実験のプロトコールは、三重大学動物実験倫理審査委員会による承認(承認番号:23-8)を得た。HEK293、HEK293.2sus、Jurkat E6.1及びMolt-4は、American Type Culture Collection社から購入した。成人由来の骨髄MSCs(Mesenchymal Stem Cells、間葉系幹細胞)は、Lonza社から購入した。
EV枯渇ウシ胎児血清(dFCS)及び自己血漿は、超遠心分離(100,000×g、18時間)により調製した。非接着性HEK293.2susは、100 mLの三角フラスコ(Corning社)の中で、293 SFM II培地(ThermoFisher Scientific社)を用い、100 rpm及び8%CO2濃度及び5×105細胞/mLの条件下で培養した。HEK293、Jurkat E6.1及びMolt-4は、70 cm2の培養フラスコ(Corning社)の中、10%dFCSを添加したDMEM培地(和光純薬工業)またはAIM-V培地(Thermofisher Scientific社)を用い、5%CO2濃度の条件下で培養した。3日目または4日目毎に培養液を交換し、得られた培養上清をプールし、EVの調製に用いた。
培養上清を、まず10,000×gで20分間遠心分離し、得られる上清を0.45μm及び0.22μmのフィルターで濾過した後、濾液を超遠心分離機(SW28ローター:Beckman Coulter社)にかけた。超遠心分離は100,000×gで2時間行った。得られたEVを含有するペレットをPBSに懸濁し、100,000×gで再び遠心分離し、沈渣を0.5~2 mLのPBSに溶解した後、4℃で保存した。
培養上清の限外濾過は、mPES MidiKrosフィルターモジュール(MWCO 500 kDaまたは750 kDa:スペクトラム社)を用いた接線流濾過システム(KrosFlo Research IIi TIFFシステム、硅素チューブ#16(ACTUE1625N):スペクトラム社)で、約50 mL/分の導入流速で行った。培養上清を20倍以上に濃縮し、200 mL以上のPBSで置換した。得られた濃縮上清/PBSについて、EV数、直径及びタンパク質濃度を測定した後、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付した。
陰イオン交換クロマトグラフィーの担体として、DEAE-sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社)を使用した。DEAE-sepharoseカラム(ベッド容量8 cm3)を0.15 M NaClを含有する10 mM Tris-HCl(pH7.5)で平衡化した。MWCO 750 kDa限外濾過で濃縮したEV含有PBS溶液をカラムに充填し、カラム容積の3倍以上のTBSで洗浄した。NaClのリニアグラジエント(グラジエントメーカーにより作成した0.15 Mから0.8 Mまでの濃度勾配)によりDEAE-sepharoseと結合したEVを溶出し、各3.5 mLで分画した。次に、LAQUAtwin(Horiba Scientific社)を用いて各画分の電気伝導度を測定し、精確なNaCl濃度を算出した後、直ちに10 mM Tris-HCl(pH7.5)を含む生理食塩水溶液(0.15 M)に戻した。分画されたEV溶液を、粒子数及び粒子直径、タンパク質濃度、CD81発現のフローサイトメトリー解析、CD81のウェスタンブロット分析ならびにMSC貪食の測定に供した。
EVsのタンパク質濃度は、ビシンコニン酸(BCA)タンパク質アッセイキット(Pierce社)により、メーカー使用説明書に従って測定した。精製されたEVsの平均粒子数及び直径は、ナノ粒子トラッキング分析(NTA; LM10-HS:NanoSight社)により測定した。EV表面タンパク質は、フルオレセインフィコエリトリン(PE)結合抗CD81 mAb(5A6:Biolegend社)で染色したラテックスビーズ結合EVsの、FACS Cant II(BD)によるフローサイトメトリー解析により検出した。ポリスチレンラテックスビーズ(直径10μm)を、EV溶液と、0.1M 2-モルホリノエタンスルホン酸緩衝液中で、EV 3粒子/ビーズの比で混合し、回転シェーカーで2時間インキュベートした後、400 mMグリシンでブロックした。得られたラテックスビーズ結合EVsを、2%dFCS含むPBSで2回洗浄した。
メーカー(StemCell Technologies社)の使用説明書に従って、骨髄細胞フラッシュ大腿骨(大腿骨)からMSCを調製した。BALB/cマウスの10本の大腿骨の両端を切断し、乳鉢中の5 mL PBSに移し、乳棒で5分間穏やかに撹拌して粉砕し、できるだけ多くの赤色骨髄細胞を除去した。同様にして赤色骨髄細胞を5回除去した後、断片化した白色の大腿骨を集め、0.2%コラゲナーゼI型(シグマ社)を添加したPBSと共にインキュベートした。37℃の水浴中で40分間激しく振盪した後、MSCsを含む上清をPBSで3回洗浄した。ディッシュに接着したMSCsを、20%MSC刺激補助剤(StemCell Technology社)を添加したマウスMesenCult MSC基礎培地で30日間培養した。培地は隔日で交換した。20%の脂肪生成及び骨形成刺激補充剤を添加したMesenCult MSC基礎培地中で、2週間で70%コンフルエントとなったMSCを使用し、次いでOil Red O(Sigma-Aldrich社)で脂肪細胞を;Alizarin Red S(和光純薬工業)で骨細胞をそれぞれ染色し、得られたMSCsが脂肪細胞及び骨細胞に分化する可能性を測定した。ギムザ(和光純薬工業)で染色した後、MSC刺激補充剤を含有する培地で培養した一次MSCにおけるコロニー形成が観察された。PE結合抗CD140a及びFITC結合抗Sca-1 mAbs(いずれもBiolegend社)の両方を用いたフローサイトメトリー解析(FACScant II:BD、Biosciences社)により、培養された骨由来MSCsの純度は95%以上と確認された。
メーカーの使用説明書に従い、EVs (1 mg/mL タンパク質濃度)をPKH26 (Sigma-Aldrich社)で標識した。ヒト間葉系幹細胞(Lonza社)を12ウェルプレートの中で培養し、そこへPKH26で染色したEVs(5 μg/mL EV濃度)を加えて2時間培養した。フローサイトメトリー解析(FACS Cant II:BD)及び蛍光顕微鏡検査(DP73カメラを備え付けたBX53、オリンパス社)により、PKH26で染色したEVsの細胞による貪食を調べた。
効率的なEVsの濃縮における限外濾過及び培養上清からの不要タンパク質の除去
図4は、Spectrum Lab社より入手した孔径チャートを示す。これは、分子生物学的及び微生物学的スケールで共通事項を比較するための相対スケールを提供している。また、該チャートは、2次元のメトリック単位(μm及びnm)を3次元の分子量単位(kDa)に相関させる。エクソソームの直径は50 nmから200 nmと言われている。0.22 μmフィルター処理後の750 kDa MWCOの限外濾過膜で濃縮したエクソソームは、図で示すように、直径が50 nm-220 nmのすべてのエクソソームをカバーしうる。500 kDa MWCO限外濾過膜の使用での濃縮では、アポトーシス小体に含まれる、径が小さく機能性を持たない小胞の混在を避けられない。培養上清中の様々なEVsからエクソソームを濃縮するには、フィルター孔径約50 nm相当のMWCO 750 kDaフィルターでの限外濾過は非常に有用であろう。臨床においてMWCO 500 kDaフィルターを用いた限外濾過により、培養上清からEVを濃縮できることが他のグループから報告されている。そのため、我々は、750 kDaポア評価mPESフィルターモジュール(スペクトラム社)を用いて、エクソソームの漏出なしに220 nmで濾過した培養上清から不要な不溶性タンパク質を除去しながら、EVsを効果的に濃縮することができるかどうかについて調べた。
HEK293.3sus細胞は、数多く(1×1010粒子/mL培地)のEVsを生成した。そこで、まず、HEK293.2sus細胞の培養上清から得られた大量のEVsについてイオン交換カラムクロマトグラフィーを行った。該EV分離の過程において、最大2~5×1011のEVs粒子が8 cm3のDEAE-sepharose樹脂と結合することができることを明らかにした。NaClリニアグラジェントのデータを用いて、タンパク質濃度、粒子数、CD81発現及びRNA含量に基づくHEK293sus EVsの溶出プロファイルを図2に示す。付加された3×1011のEVsのほとんどすべてがカラムに結合し、100%回収された、これは、すべてのEVが負に帯電したものであることを示唆する。また、溶出液は、粒子数で4つのピークを持って溶出し、それぞれ画分I(フラクション(Fr).4~Fr.9)、画分II(Fr.10~12)、画分III(Fr.13~Fr.15)及び画分IV(Fr.16~Fr.18)とした。これらの画分I、II、III及びIVは、それぞれNaCl濃度:0.15 M~0.17 M、0.18 M~0.36 M、0.37 M~0.45 M及び0.46 M~0.52 Mの領域に対応した。EVマーカーとしてのCD81は、ピークIのEVsで強く発現し、画分II、III及びIVからのEVsは、CD81の発現は中程度であった。驚くべきことに、画分IIのEVs中には大量のRNAが含まれるが、これとは対照的に、画分I、III及びIVのEVsにはほとんどRNAが含まれないことが判明した。画分II の108 個のEVs当たりのRNA量は2.8 ngであった。これは、他の3画分よりも6~20倍高かった。マウスCD8+T細胞、マウスCD4+T細胞、hPBMCs、Jurkat細胞及びMolt-4細胞の培養上清を用いた別のクロマトグラフィーでも、HEK293.2sus EVsと類似した溶出プロファイルが得られた。以上のように、これまでエクソソームマーカーとして知られていたCD81の発現強度や、RNA含量、タンパク質含量は各フラクションで全く異なることが判明した (図2)。
粒子数、タンパク質濃度、CD81発現及びRNA含量の変動と同様に、MSCsのEV貪食容量は負の電荷によって異なる可能性がある。そのため、イオン交換クロマトグラフィーで得られた各画分からのHEK293.2sus EVsをPKH26で染色し、5×108粒子/mLの濃度でMSC培養液に添加した。驚くべきことに、Fr.12中のEVsのみがMSCsに積極的に貧食されたが、Fr.18中の EVを使用した場合にも、かなりの摂取が示された。これらの結果は、MSCsに容易に取り込まれるEV膜構造が一定のEV負電荷と相関することを示している。さらに、約0.4 MのNaCl(Fr.12)で溶出されたEVsは、細胞間の情報交換のためにRNAを大量に含む機能性エクソソームであると考えられる。一方、FR.18からのEVsは、強力な負電荷によりスカベンジャー受容体発現マクロファージによって分解される可能性がある。したがって、本エクソソーム製造方法では、機能を発現する前に分解されるエクソソームと、機能を発現するエクソソームを分離することが可能である。
エクソソームの分画
実施例1に記載された方法に従って、ヒトPBMCを11日間培養した培養上清からEVを調整した。得られたEVは、実施例1と同様に、フィルター孔径約50 nm相当のMWCO 750 kDaフィルターによる限外濾過により濃縮後、100 mLのDEAE-sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した。DEAEセファロースカラムからのEVの溶出は、NaClのリニアグラジエント(0.15 M~0.8 M)で行い、0.15 M~0.5 Mで溶出される全フラクションをプールした。実施例1に記載された方法に従って、DUC18マウスから得られたCD8+ T細胞を、7日間培養したの培養上清(4 L)よりEVを調製した。得られたEVは、実施例1と同様に、フィルター孔径約50 nm相当のMWCO 750 kDaフィルターによる限外濾過により濃縮後、100 mLのDEAE-sepharose Fast Flow(GEヘルスケア社)を用いた陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画した。DEAEセファロースカラムからのEVの溶出は、NaClのリニアグラジエント(0.15 M~0.8 M)または0.3 M及び0.5 M NaClのステップワイズで行った。リニアグラジエントでEVを溶出した溶出パターンを図5Aに、またステップワイズで溶出した溶出パターンを図5Bに示す。
図5A(NaClリニアグラジエント溶出)におけるFr.21(0.21~0.3 M NaClで溶出された画分)及びFr.26(0.38 M NaClで溶出された画分)のマウスCD8+ T細胞エクソソームのがん間質傷害活性を比較した。BALB/cマウスに皮下移植した2週間目のCMS5a腫瘍にそれぞれのフラクションのエクソソームを投与し、投与から3日後のCD140a+ Sca-1+の間葉系細胞で構成されるがん間質の存在を免疫組織染色で検討した。その結果、Fr.21(0.21~0.3 Mの間のNaCl濃度で溶出された画分)投与腫瘍は、間葉系のがん間質を失っていたが(図6A)、Fr.26(0.38 M NaClで溶出された画分)投与腫瘍は、間葉系のがん間質が保持されていた(図6B)。この結果から、陰イオン交換カラムクロマトグラフィーにおける溶出塩濃度によって、生物活性を保持するエクソソームと保持しないエクソソームを分離できることが示される。すなわち、上記限外濾過による濃縮後、濃縮液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付して分画することにより、機能性エクソソームと非機能性エクソソームとを分離することが可能であることが示される。
上記の結果に基づき、溶出操作が容易なNaClステップワイズ溶出により分画したエクソソームについて、生物学的特徴を比較した。使用したエクソソームは、図5Bにおいて、0.3 M NaCl溶出エクソソーム(0.3 M-Fr.3及び4)及び0.5 M NaCl溶出エクソソーム(0.5 M-Fr.3)である。
ナノ粒子トラッキング分析(NTA)により比較すると、平均粒子径は、0.3 M NaCl溶出エクソソームが155.8 nmであり、0.5 M NaCl溶出エクソソームは196 nmであった。また、0.3 M NaCl溶出エクソソームは粒子凝集が少ないのに対し、0.5 M NaCl溶出エクソソームでは粒子凝集が多いという結果が得られた(図7)。陰イオン交換クロマトグラフィーにおいて、溶出塩濃度を選ぶことにより、取得されるエクソソームの品質管理が可能であることが示される。適切な塩濃度は、エクソソームが由来する細胞種、動物種、及びイオン交換クロマトグラフィー条件などによって異なる可能性があるが、当業者であれば、溶出塩濃度と得られるエクソソーム品質とを予備的に検討することにより、容易に設定することができる。
ゼータ電位測定装置を用いて、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム溶出エクソソーム粒子のゼータ電位を、超遠心分離により調製したエクソソーム粒子(実施例1に記載の方法に従って調製)のゼータ電位と比較した。結果を図8に示す。陰イオン交換クロマトグラフィーカラム溶出エクソソームに比較して、超遠心分離により調製したエクソソームはゼータ電位幅が小さく凝集しやすい粒子であることが分かった(図8)。さらに陰イオン交換クロマトグラフィーにより溶出したエクソソームでは、上記の通り、0.3 M NaCl溶出エクソソームは凝集体が少なく、ゼータ電位幅が大きい。一方、0.5 M NaCl溶出エクソソームは、超遠心エクソソームと比較してゼータ電位幅が大きいが、0.3M NaCl溶出エクソソームと比較してゼータ電位幅が小さく、0.3M NaCl溶出エクソソームより凝集しやすいEVであることが示された(図8)。すなわち、エクソソームの粒子凝集の多さは、超遠心分離エクソソーム>0.5 M NaCl溶出エクソソーム>0.3 M NaCl溶出エクソソームとなり、この関係は、ゼータ電位の値と相関することが示される。すなわち、ゼータ電位閾値を予め設定することにより、エクソソームの品質管理または所要のエクソソームの選別が可能であることが示される。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラム溶出エクソソームに含まれるタンパク質を、SDS-PAGEにより分析した結果を図9に示す。SDS-PAGEによる分析法は、当業者には周知である。図9より、0.3 M NaCl溶出エクソソームと0.5 M NaCl溶出エクソソームとを比較すると、エクソソームに含まれるタンパク質の分布が明らかに相違した。この事実は、両エクソソームが、お互いに異なる物性を有することを示唆する。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラム溶出エクソソームについて、RMAの存在を検討した結果を図10に示す。図10Aは、0.3 M NaCl溶出エクソソーム及び0.5 M NaCl溶出エクソソーム中に含まれる全RNA(miRNA, tRNA, mRNA及びrRNA)のUV吸収スペクトルである。いずれのエクソソーム画分でも260 nm~270 nmにUV吸収が認められ、RNAが含まれることが示された。バイオアナライザ(Agilent社)によりRNAを分析した。その結果、0.3 M NaCl溶出エクソソーム及び0.5 M NaCl溶出エクソソームとも、低分子RNAを含むことが示された(図10B)。
陰イオン交換クロマトグラフィーカラム溶出エクソソーム(0.3 M NaCl溶出エクソソーム及び0.5 M NaCl溶出エクソソーム)ならびに超遠心分離エクソソーム(UC)を、DNase I処理した後、Exosomal DNA Extraction kit(101 Bio社)を用いてDNAを抽出し、UV吸収スペクトルを分析した。DNase Iで処理しないエクソソームについても同様にDNAを抽出し、UV吸収スペクトルを分析した。結果を図12に示す。DNase I処理したエクソソームは、「DNase I」で表示し、DNase Iで処理しないエクソソームは「-」で表示した。0.3 M NaCl溶出エクソソームと超遠心分離エクソソームには、DNase I処理に関わらず、260 nm~270 nmにUV吸収が認められず、DNAがほとんど含まれないことが示される。一方、0.5 M NaCl溶出エクソソーム及び超遠心分離エクソソームには、260 nm~270 nmにUV吸収が認められ、またDNase I処理の影響をほとんど受けないことから、0.5 M NaCl溶出エクソソーム及び超遠心分離エクソソームの外側にはDNAがほとんど存在せず、DNAは、エクソソーム内に含まれていることが示される。0.3 M NaCl溶出エクソソームにDNAがほとんど含まれないことは、DNAに対する自己抗体が生じるリスクが低いことを示す。
細胞傷害活性
実施例1に記載された方法に従って、ヒトPBMCsの培養上清を調製し、本発明の方法に従って、イオン交換カラム溶出ヒトT細胞(PBMC)エクソソーム(0.15 M~0.5 M NaClで溶出する全エクソソーム)を調製した。同様にして、ヒトがん細胞(MKN45)由来のイオン交換カラム溶出エクソソームを調製した。比較のために、実施例1に従って、ヒトPBMCsの培養上清より超遠心分離エクソソームを調製した。それぞれ2×104個のMKN45細胞及び肺がん由来CAF(cancer-associated fibroblast;がん間質線維芽細胞)を混合し、非付着性の24ウェルプレートに添加した(Day 0)。翌日(Day 1)に、腫瘍微小環境を模倣したスフェロイドが形成された。Day 1に、上記3種類のエクソソームをそれぞれ2μg/ウェルで添加し、Day 10でスフェロイドが崩壊するかどうか、すなわちCAF領域が消失するかどうかを観察した。結果を図13に示す。イオン交換カラム溶出ヒトT細胞エクソソームを添加すると、スフェロイドが崩壊した。しかしながら、イオン交換カラム溶出ヒトがん細胞エクソソームではスフェロイドの崩壊は認められず、また超遠心分離ヒトT細胞エクソソームでは、スフェロイドの崩壊は弱く認められるのみであった。細胞傷害活性において、イオン交換カラム溶出ヒトT細胞エクソソームは活性を維持しているが、超遠心分離ヒトT細胞エクソソームの活性は大幅に低下していることが分かる。
上記のイオン交換カラム溶出ヒトT細胞エクソソーム、イオン交換カラム溶出ヒトがん細胞エクソソームおよび超遠心分離エクソソームのマウスにおけるヒト腫瘍増殖抑制効果を比較した。それぞれ1.5×106個のNW-MEL-38がん細胞及びhTERT-MSC(Mesenchymal Stem Cells、間葉系幹細胞)と、上記と同様にして調製したイオン交換調製がん細胞(MKN45)エクソソーム、超遠心調製ヒトPBMCエクソソーム、またはイオン交換調製ヒトPBMCエクソソーム5μgとを混合し、ヌードマウスに皮下投与した。エクソソームを投与しない対照群として、NW-MEL-38がん細胞及びhTERT-MSC混合細胞移植群ならびにNW-MEL-38がん細胞のみの移植群を設定した。腫瘍増殖は、皮下移植後26日まで経時的に測定した。結果を図14に示す。NW-MEL-38がん細胞及びhTERT-MSCの混合細胞に基づく腫瘍増殖に対して、イオン交換カラム溶出ヒトがん細胞エクソソームは抑制作用を全く示さなかった。超遠心分離ヒトT細胞エクソソームを投与した場合では、弱い腫瘍増殖抑制作用が認められた。一方、イオン交換カラム溶出ヒトT細胞エクソソームを投与すると、腫瘍増殖速度は、がん細胞単独移植時の腫瘍増殖速度と同程度となり、強い腫瘍増殖抑制効果が観察された。これらの結果より、ヒトT細胞の培養上清を、MWCO 750 kDaフィルターによる限外濾過により濃縮後、陰イオン交換カラムから溶出することにより、機能的なエクソソームを調製できることが示された。
Claims (30)
- (i)エクソソームを含む生体試料を限外濾過する工程、及び、
(ii)工程(i)から得ることができる試料を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、
を含む、エクソソームの製造方法であって、限外濾過における限外濾過フィルターが、0.22μmのフィルター孔径及び750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、エクソソームの製造方法。 - 限外濾過における限外濾過フィルターが、タンジェンシャルフローフィルターである、請求項1に記載の製造方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用する陰イオン交換体が弱塩基性陰イオン交換体である、請求項1に記載の製造方法。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである,請求項3に記載の製造方法。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体がフェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、請求項3または4に記載の製造方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行わるものである、請求項1~5のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、請求項1~6のいずれか1項に記載の製造方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7 で行わるものである、請求項1~7のいずれか1項に記載の製造方法。
- さらに、(iii)前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出液のゼータ電位を測定する工程を含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の製造方法。
- 生体試料からエクソソームを製造する方法であって、
(i)生体試料に対して遠心分離を行って該試料から夾雑物を除去し、その後上清を得る工程、
(ii)工程(i)で得られた上清を限外濾過し、上清を濃縮する工程、及び、
(iii)工程(ii)で得られた濃縮液を陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに付す工程、
を含み、限外濾過における限外濾過フィルターが、0.22μmのフィルター孔径及び750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、エクソソームを製造する方法。 - 工程(i)が、10,000×gで30分間の遠心分離を行うことを含む、請求項10に記載の方法。
- 限外濾過における限外濾過フィルターは、タンジェンシャルフローフィルターである、請求項10に記載の方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用した陰イオン交換体が、弱塩基性陰イオン交換体である、請求項10に記載の方法。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである、請求項13に記載の方法。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体が、フェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、請求項13または14に記載の方法。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行わるものである、請求項10~15のいずれか1項に記載の方法。
- 該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、請求項10~16のいずれか1項に記載の方法。
- 該陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7で行わるものである、請求項10~17のいずれか1項に記載の方法。
- さらに、(iv)前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの溶出液のゼータ電位を測定する工程を含む、請求項10~18のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1~19のいずれか1項に記載の方法により製造されたエクソソームであって、直径が60nm未満の粒子及び220nmより大きい粒子が本質的に排除されているエクソソームを含むエクソソームペレット、または該エクソソームペレットが再懸濁された生理的溶液。
- 陰イオン交換カラムクロマトグラフィーおよび限外濾過フィルターを備えることを特徴とする、生体試料からエクソソームを製造するシステムであって、限外濾過フィルターが、0.22μmのフィルター孔径及び750 kDaの公称分画分子量(NMWC)を有する、エクソソームを製造するシステム。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーに使用する陰イオン交換体が弱塩基性陰イオン交換体である、請求項21に記載のシステム。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体が、疎水性相互作用及び疎水結合形成の双方に基づき選択性を保持するものである、請求項22に記載のシステム。
- 前記弱塩基性陰イオン交換体がフェニル基、アミド結合及びカルボキシル基を有するものである、請求項22または23に記載のシステム。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーが、0.15 M~0.8 MのNaClまたはKCl存在下で行わるものである、請求項21~24のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件が中性領域のpHで行わるものである、請求項21~25のいずれか1項に記載のシステム。
- 前記陰イオン交換カラムクロマトグラフィーのカラム条件がpH7.2~pH7.7で行わるものである、請求項21~26のいずれか1項に記載のシステム。
- 限外濾過フィルターが、タンジェンシャルフローフィルターである、請求項21に記載のシステム。
- さらに、遠心分離装置を備える、請求項21~28のいずれか1項に記載のシステム。
- さらに、ゼータ電位測定装置を備える、請求項21~29のいずれか1項に記載のシステム。
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